Summary
Un approccio a finestra vaso aperta che utilizza traccianti fluorescenti fornisce una risoluzione sufficiente per la misurazione del flusso sanguigno cocleare (CoBF). Il metodo facilita lo studio dei cambiamenti strutturali e funzionali del CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche.
Abstract
La trasduzione del suono è metabolicamente impegnativa e la normale funzione della microvascolarizzazione nella parete laterale è fondamentale per mantenere il potenziale endococleare, il trasporto ionico e l'equilibrio dei fluidi. Diverse forme di disturbi dell'udito sono segnalati per coinvolgere la microcircolazione anormale nella coclea. L'indagine su come la patologia del flusso sanguigno cocleare (CoBF) influisce sulla funzione uditiva è impegnativa a causa della mancanza di metodi di interrogazione fattibili e della difficoltà di accesso all'orecchio interno. Una finestra aperta del vaso nella parete cocleare laterale, combinata con la microscopia intravitale a fluorescenza, è stata utilizzata per studiare i cambiamenti di CoBF in vivo, ma soprattutto nella cavia e solo recentemente nel topo. Questo documento e il video associato descrivono il metodo della finestra del vaso aperto per visualizzare il flusso sanguigno nella coclea del topo. I dettagli includono 1) preparazione della sospensione di cellule del sangue marcata con fluorescenza dai topi; 2) costruzione di una finestra vasale aperta per microscopia intravitale in un topo anestetizzato e 3) misurazione della velocità e del volume del flusso sanguigno utilizzando una registrazione offline dell'imaging. Il metodo è presentato in formato video per mostrare come utilizzare l'approccio a finestra aperta nel topo per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel microcircolo cocleare in condizioni normali e patologiche.
Introduction
La normale funzione del microcircolo nella parete cocleare laterale (che comprende la maggior parte dei capillari nel legamento a spirale e nella stria vascolare) è di fondamentale importanza per il mantenimento della funzione uditiva1. Il CoBF anormale è implicato nella fisiopatologia di molti disturbi dell'orecchio interno, tra cui la perdita dell'udito indotta dal rumore, l'idrope dell'orecchio e la presbiacusia 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualizzazione del CoBF intravitale consentirà una migliore comprensione dei legami tra funzione uditiva e patologia vascolare cocleare.
Sebbene la complessità e la posizione della coclea all'interno dell'osso temporale precludano la visualizzazione diretta e la misurazione del CoBF, sono stati sviluppati vari metodi per la valutazione del CoBF tra cui la flussimetria laser-doppler (LDF)10,11,12, la risonanza magnetica (MRI)13, la microscopia intravitale a fluorescenza (FIVM)14, la microendoscopia a fluorescenza (FME)15, l'imaging endoscopico a contrasto laser speckle (LSCI)16 , e approcci basati sull'iniezione di marcatori marcati e microsfere marcate radioattivamente nel flusso sanguigno (microangiografia ottica, OMAG)17,18,19,20. Tuttavia, nessuno di questi metodi ha consentito il monitoraggio assoluto in tempo reale delle variazioni del CoBF in vivo, ad eccezione di FIVM. FIVM, in combinazione con una finestra del vaso nella parete cocleare laterale, è un approccio che è stato utilizzato e validato in cavie in diverse condizioni sperimentali da vari laboratori 14,21,22.
È stato stabilito con successo un metodo FIVM per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nella microcircolazione cocleare nel topo utilizzando isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano come mezzo di contrasto e un colorante di fluorescenza - DiO (3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato, verde) o Dil (1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato, rosso) - per premarcare le cellule del sangue, visualizzare i vasi e monitorare la velocità del flusso sanguigno. Nel presente studio, il protocollo di questo metodo è stato descritto per l'imaging e la quantificazione dei cambiamenti nel CoBF nel topo in condizioni normali e patologiche (come dopo l'esposizione al rumore). Questa tecnica fornisce al ricercatore gli strumenti necessari per studiare i meccanismi alla base del CoBF correlati alla disfunzione uditiva e alla patologia nella stria vascolare, specialmente se applicata in combinazione con modelli murini transgenici prontamente disponibili.
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Protocol
NOTA: Questo è un intervento chirurgico di non sopravvivenza. Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state esaminate e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Oregon Health & Science University (numero di approvazione IACUC: TR01_IP00000968).
1. Preparazione delle cellule del sangue marcate con fluorescenza
- Anestetizzare i topi donatori (topi maschi C57BL/6J di età ~6 settimane) con un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di soluzione anestetica ketamina/xilazina (5 ml/kg, vedere la Tabella dei Materiali).
NOTA: Questo protocollo di anestesia è molto affidabile e mantiene la pressione sanguigna sistemica. - Appoggiare il mouse sulla schiena, aprire la pelle ed esporre la cavità toracica usando pinzette e forbici da dissezione. Tagliare il diaframma, afferrare alla base dello sterno usando le forbici a morsetto, tagliare la gabbia toracica e sollevare per esporre il cuore. Raccogliere 1 mL di sangue nell'eparina (15 UI/mL di sangue) mediante puntura cardiaca e centrifugare a 3.000 × g per 3 minuti a 4 °C. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale dopo la raccolta del sangue.
- Rimuovere il plasma, lavare il pellet delle cellule del sangue con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C.
- Etichettare le cellule del sangue con 1 mL di 20 mM DiO o Dil in PBS e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente23,24.
- Centrifugare e lavare le cellule del sangue marcate con 1 mL di PBS, centrifugare 3 volte a 3000 × g per 3 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in ematocrito al 30% con ~0,9 mL di PBS (volume finale ~1,3 mL) prima dell'iniezione.
2. Intervento chirurgico per creare una finestra aperta 25
- Preparare gli strumenti chirurgici sterili e la piattaforma di imaging e posizionare una piastra riscaldante sotto il drappo (Figura 1A). Anestetizzare i topi (topi maschi C57BL / 6J di età ~ 6 settimane) come descritto al punto 1.1 e controllare la profondità dell'anestesia monitorando il riflesso della zampa e il tono muscolare generale. Posizionare l'animale sul termoforo caldo e mantenere la temperatura rettale a 37 °C.
- Posizionare la coda dell'animale nel sistema di monitoraggio CODATM per monitorare la pressione sanguigna e il battito cardiaco (vedere la tabella dei materiali). Registrare la pressione arteriosa sistolica dell'animale, la pressione sanguigna diastolica e la pressione sanguigna media (MBP) nella condizione anestetizzata.
NOTA: Nessuna differenza è osservata nella MBP animale nello stato anestetizzato e non anestetizzato (107 ± 11 mmHg vs 97 ± 7 mmHg). La frequenza cardiaca animale è stabile sotto anestesia, anche se inferiore (ancora entro il range di normalità) rispetto alla condizione non anestetizzata (357 ± 12 bmp vs 709 ± 3 bmp). Un leggero aumento del battito cardiaco dovrebbe essere previsto negli animali posti in contenzione26. - Aprire la bolla timpanica sinistra tramite un approccio laterale e ventrale al microscopio stereoscopico (vedi la Tabella dei Materiali), lasciando intatta la membrana timpanica e gli ossicini21.
- Fare un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata e posizionata per ridurre al minimo il movimento (Figura 1B). Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare.
NOTA: iniettare per via sottocutanea buprenorfina a 0,05 mg/kg per ridurre il dolore durante l'intervento chirurgico. - Localizzare ed esporre la bulla ossea identificando il muscolo sternocleidomastoideo e il nervo facciale che si estende anteriormente verso la bolla.
- Aprire la bolla ossea con un ago da 30 G e rimuovere con attenzione l'osso circostante con una pinzetta chirurgica per fornire una visione chiara della coclea e dell'arteria stapediale, con il margine mediale che giace oltre il bordo della nicchia rotonda della finestra e scorre anteriore-superiore verso la finestra ovale (Figura 1C, D).
NOTA: La tracheotomia viene eseguita per mantenere le vie aeree libere e deve essere eseguita solo quando l'animale ha un problema respiratorio durante l'intervento chirurgico. In generale, la maggior parte degli animali sotto anestesia ha una respirazione regolare. Tuttavia, se gli animali hanno ricevuto una tracheotomia durante l'intervento chirurgico, il flusso sanguigno registrato non deve essere utilizzato per alcun confronto.
- Fare un'incisione lungo la linea mediana del collo dell'animale con la testa immobilizzata e posizionata per ridurre al minimo il movimento (Figura 1B). Rimuovere la ghiandola sottomandibolare sinistra e la pancia posteriore del muscolo digastrico e cauterizzare.
- Utilizzare una piccola lama di coltello (bisturi #16 fresato su misura) per raschiare l'osso della parete laterale all'apice-giro medio della coclea del topo, a circa 1,25 mm dall'apice fino a quando non si rompe un punto sottile. Rimuovere i trucioli ossei con piccoli ganci metallici (Figura 1E).
- Coprire la finestra della nave con un coprislip tagliato per preservare le normali condizioni fisiologiche e fornire una vista ottica per la registrazione delle immagini della nave.
NOTA: tutte le procedure devono essere eseguite con cautela. Oltre a monitorare la temperatura corporea, anche i segni vitali dell'animale, tra cui la pressione sanguigna e il battito cardiaco, devono essere monitorati durante l'intervento chirurgico.
3. Imaging di CoBF sotto FIVM
- Fare un'incisione di ~ 1 cm lungo la vena safena destra per esporre il vaso (Figura 1F).
- Infondere successivamente nell'animale 100 μL della soluzione di destrano FITC (2000 kDa, 40 mg/mL in PBS) e 100 μL di sospensione di cellule del sangue (ematocrito al 30%) attraverso la vena safena (Figura 1G) per consentire la visualizzazione dei vasi sanguigni e il monitoraggio della velocità del flusso sanguigno.
- Osservare il flusso sanguigno in tempo reale direttamente su un monitor video 5 minuti dopo l'iniezione. Immagini dei vasi sanguigni utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo a lunga distanza di lavoro (W.D.) (W.D. 30,5 mm, 10x, apertura numerica 0,26) e un alloggiamento della lampada contenente un filtro di eccitazione a banda multipla e un filtro di emissione compatibile (Table of Materials). Registrare il video utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione in bianco e nero ad accoppiamento di carica (Table of Materials) a 2 fotogrammi / s). Acquisisci più di 350 immagini per video per garantire un'analisi corretta della velocità del flusso.
NOTA: I vasi sanguigni sia del legamento a spirale che della stria vascolare possono essere visualizzati regolando la messa a fuoco ottica (video supplementare 1).
4. Analisi video
- Misurare il diametro del recipiente utilizzando un software appropriato (Table of Materials) e determinare la distanza tra due punti fissi attraverso il recipiente nelle immagini acquisite.
- Calcolare la velocità del flusso sanguigno dai fotogrammi video acquisiti tracciando il movimento delle cellule del sangue marcate nella distanza spaziale tra le posizioni delle immagini27.
- Apri il video del flusso sanguigno nel software (Fiji [ImageJ] è stato utilizzato in questo protocollo) e imposta la scala delle immagini.
- Tenere traccia delle cellule del sangue colorate con DiO selezionate utilizzando la funzione di tracciamento. Utilizzare la distanza spostata dalle celle e l'intervallo di tempo tra i fotogrammi dell'immagine nel video per il calcolo automatico della velocità del flusso.
- Calcolare la portata volumetrica (F) secondo la seguente equazione: F = V × A. (V: velocità; A: area della sezione trasversale della nave).
5. Esposizione al rumore
- Metti gli animali in gabbie di rete metallica. Esporli al rumore a banda larga a 120 dB di pressione sonora in una cabina di esposizione sonora per 3 ore e per altre 3 ore il giorno successivo.
NOTA: Questo regime di esposizione al rumore, abitualmente utilizzato in questo laboratorio, produce una perdita permanente della sensibilità cocleare28.
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Representative Results
Dopo l'esposizione chirurgica dei capillari cocleari nella parete laterale (Figura 1), l'osservazione microscopica a fluorescenza intravitale ad alta risoluzione delle cellule del sangue marcate con Dil in vasi marcati con FITC era fattibile attraverso una finestra aperta del vaso. La Figura 2A è un'immagine rappresentativa scattata sotto FIVM che mostra i capillari della parete laterale dell'apice cocleare del topo. La lumina di questi vasi è resa visibile dalla fluorescenza del camerano FITC miscelato con il plasma. Anche le cellule del sangue etichettate individualmente distribuite nella rete vascolare sono chiaramente visibili in questa immagine. Due reti distinte - capillari del legamento a spirale e capillari della stria vasculare - si distinguono per posizione (al microscopio verticale, la stria vascolare corre otticamente sotto il legamento a spirale e contiene più anse capillari e vasi più piccoli25). Entrambi possono essere valutati per il flusso sanguigno con regolazione della messa a fuoco ottica. Come mostrato nella figura 2B, C, la densità vasale del legamento a spirale è più scarsa di quella della stria vascolare.
La funzione vascolare nel modello murino esposto al rumore è stata confrontata con la funzione vascolare nel gruppo di controllo. La misurazione del CoBF è stata effettuata 2 settimane dopo l'esposizione al rumore. Le figure 3A,B sono immagini rappresentative che mostrano i modelli di flusso nei gruppi di controllo e esposti al rumore. Un modello disturbato di flusso sanguigno è stato osservato nel gruppo esposto al rumore (Figura 3B). Le anomalie includevano la riduzione del diametro del recipiente (Figura 3C) e una maggiore variazione del diametro del recipiente (Figura 3D). Come illustrato nella Figura 4A,B, le velocità del flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore sono state calcolate monitorando le rotte delle cellule del sangue marcate con DiO (video supplementare 2). I risultati mostrano che la velocità e il volume del sangue nel gruppo esposto al rumore erano significativamente inferiori rispetto al gruppo di controllo (Figura 4C, D). Questi dati indicano che il suono forte influisce notevolmente sulla circolazione sanguigna e causa un flusso sanguigno ridotto e disturbato.
Figura 1: Preparazione di una finestra vaso aperta per l'imaging IVM nel topo. (A) Preparazione di strumenti e strumenti per l'intervento chirurgico. (B) La bulla sinistra era esposta tramite un approccio laterale e ventrale. (C) La coclea è stata esposta dopo aver rimosso la bolla. (D) Immagine ingrandita della coclea, dal cerchio in (C). (E) È stata creata una finestra aperta del vaso all'apice-metà della parete laterale cocleare (riquadro). (F e G) Infusione endovenosa di FITC-destrano e cellule del sangue marcate attraverso la vena safena. Abbreviazioni: OW = finestra ovale; RW = finestra rotonda; IVM = microscopia intravitale; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative dei capillari cocleari nella parete laterale. (A) Cellule del sangue marcate con dil (rosso, freccia) in vasi tritali marcati con destrano FITC (verde). (B) Cellule del sangue marcate con DiO (verde) in vasi legamentosi a spirale marcati con destrano FITC (frecce, verde). Si noti che le navi sono scarse. (C) Cellule del sangue marcate con DiO (verde) in vasi tritriali marcati con destrano FITC (verde). Si noti che i vasi sono più densi. Barre della scala: 50 μm e 100 μm. Abbreviazioni: Dil = 1,1-diottadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina perclorato; DiO = 3, 3′-diottadecilossocarbocianina perclorato; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Variazione del diametro del recipiente nella stria due settimane dopo l'esposizione al rumore. (A e B) Immagini rappresentative della circolazione sanguigna dopo aver marcato vasi con destrano FITC (verde) e cellule del sangue con DiO (verde) nei gruppi di controllo ed esposti al rumore (NE) con IVM ad alta risoluzione. C) Diametro medio del recipiente calcolato per i gruppi di controllo e NE. Rispetto al gruppo di controllo, il diametro del recipiente è stato ridotto nel gruppo esposto al rumore. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, test t di Student, media ± deviazione standard [SD]). (D) Varianza del diametro del recipiente nei gruppi di controllo e NE. Il diametro del vaso variava molto di più nel gruppo NE che nel gruppo di controllo. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, test t di Student, media ± DS). Barre della scala: 100 μm. Abbreviazioni: DiO = 3, 3′-dioctadecilossocarbocianina perclorato; FITC = isotiocianato di fluoresceina; IVM = microscopia intravitale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Variazioni del flusso sanguigno nella stria due settimane dopo l'esposizione al rumore. (A e B) Le immagini rappresentative mostrano i percorsi di tracciamento (linee rosse, verdi e blu) delle cellule del sangue marcate con DiO (verde) per la misurazione della velocità del flusso sanguigno nei gruppi di controllo e esposti al rumore. (C e D) La velocità del flusso sanguigno (μm/s) e la portata volumetrica (μm3/s) sono state calcolate rispettivamente per i gruppi di controllo e di esposizione al rumore. La portata sanguigna e la portata volumetrica nel gruppo esposto al rumore erano inferiori rispetto al gruppo di controllo (n = 54,t velocità (106) = 19,705, velocità ****p < 0,0001; volumet (106) = 15,342, volume ****p < 0,0001, test t di Student, deviazione media ± standard). Barre scala: 100 μm. Abbreviazioni: DiO = 3, 3′-dioctadecilossocarbocianina perclorato1; FITC = isotiocianato di fluoresceina; NE 2W = esposizione al rumore di due settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video supplementare 1: Vasi sanguigni sia del legamento a spirale che della stria vascolare. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Tracciamento delle vie delle cellule del sangue marcate con DiOper il calcolo delle velocità del flusso sanguigno in un animale di controllo. Abbreviazioni: DiO = 3, 3′-dioctadeciloxacarbocianina perclorato. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo articolo dimostra come i capillari nella parete laterale cocleare (e nella stria vascularis) di un modello murino possono essere visualizzati con l'etichettatura fluoroforica in una preparazione di finestra del vaso aperta sotto un sistema FIVM. Il modello murino è ampiamente utilizzato e preferito come modello di mammifero per studiare la salute e le malattie umane. Il protocollo qui descritto è un approccio fattibile per l'imaging e lo studio del CoBF nella parete laterale del topo (in particolare nella stria vascolare) utilizzando una finestra del vaso aperta sotto il sistema FIVM Il metodo fornisce una risoluzione sufficiente per determinare la velocità e il volume del flusso sanguigno utilizzando cellule del sangue marcate con fluorescenza come tracciante (come mostrato in Figura 3 e Figura 4 ). Questo approccio può essere utilizzato per diverse applicazioni, come la valutazione della permeabilità vascolare e l'esame della contrattilità dei periciti e il monitoraggio della migrazione delle cellule del midollo osseo circolanti25. Le variazioni acute del CoBF in risposta a traumi, infezioni, rumore, corpi estranei, farmaci ototossici o altri agenti che colpiscono la parete laterale possono anche essere monitorate in tempo reale25,29.
Nei decenni passati sono stati stabiliti diversi metodi relativamente non invasivi per valutare il CoBF senza rimuovere la parete ossea cocleare, tra cui LDF, MRI, OMAG, L'LSCI endoscopico, l'FME endoscopico e l'iniezione di microsfere nel plasma sanguigno. Tuttavia, nessuno di questi approcci può essere utilizzato per valutare la portata assoluta nei singoli recipienti. Ad esempio, la FME endoscopica non invasiva può essere utilizzata solo per visualizzare regioni limitate vicino alla finestra rotonda, ma non il flusso sanguigno nella stria vascolare. Tuttavia, la circolazione sanguigna nella stria vascolare ha ruoli cruciali nel mantenimento dell'EP, del trasporto ionico e dell'equilibrio dei liquidi endolinfatici, tutti essenziali per la sensibilità uditiva (Zhang et al., 2021). OMAG è utile anche per la visualizzazione del flusso sanguigno nella coclea intatta, tuttavia, la risoluzione è troppo scarsa per l'imaging di singoli capillari nella stria vascolare di un modello murino19.
Una finestra vasiera aperta, in combinazione con un FIVM, consente la visualizzazione in tempo reale del flusso sanguigno nella parete laterale cocleare e la misurazione del diametro vascolare e della velocità del flusso sanguigno nelle regioni registrate. Il sistema IVM presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi. Ad esempio, l'animale può essere comodamente posizionato e manipolato secondo necessità. C'è flessibilità per regolare il contrasto del plasma marcato con fluorescenza e delle cellule del sangue per ottimizzare la visualizzazione dell'architettura vascolare ed evidenziare le strutture rilevanti. I diversi pesi molecolari dei traccianti coniugati con FITC possono anche essere selezionati per ottimizzare la valutazione della permeabilità vascolare. La scelta se utilizzare Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) o Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) per etichettare le cellule del sangue, a differenza del FITC-destrano utilizzato per etichettare il plasma, è determinata dagli obiettivi dell'esperimento. In generale, Dil fornisce un contrasto migliore per la visualizzazione del lume del vaso e delle singole cellule del sangue, mentre Dio è preferito quando l'imaging simultaneo viene utilizzato per la visualizzazione di cellule del sangue e lume nello stesso canale di acquisizione. Inoltre, il monitoraggio è meglio realizzato con un piccolo numero di cellule marcate poiché la fluorescenza delle cellule del sangue maschererà la fluorescenza del lume del vaso se tutte le cellule del sangue nel vaso sono etichettate21. Inoltre, si deve prestare attenzione per limitare la quantità di soluzione somministrata al sangue, per ridurre al minimo la diluizione e le variazioni del flusso sanguigno correlate alla viscosità nella coclea30.
Nel complesso, questo metodo è robusto e può essere utilizzato per studiare i cambiamenti strutturali e funzionali nel CoBF in condizioni normali e patologiche come infiammazione, rumore e invecchiamento. È importante sottolineare che un EP costante e normale può essere mantenuto durante l'intervento chirurgico, indicando che la procedura è innocua per la funzione cocleare se eseguita con sufficiente attenzione25. Tuttavia, l'istituzione di successo della finestra del vaso aperta richiede un alto grado di abilità chirurgica. Ad esempio, è necessario prestare attenzione nella rimozione dell'osso della parete laterale cocleare per prevenire la perdita di liquido perilinfatico e microlesioni allo strato esterno del legamento a spirale cocleare. Questi potrebbero influire negativamente sull'omeostasi cocleare e compromettere l'imaging.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata da NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) e Medical Research Foundation della Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
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