Summary
En öppen kärlfönstermetod med fluorescerande spårämnen ger tillräcklig upplösning för mätning av cochleärt blodflöde (CoBF). Metoden underlättar studien av strukturella och funktionella förändringar i CoBF i mus under normala och patologiska förhållanden.
Abstract
Transduktion av ljud är metaboliskt krävande, och mikrovaskulaturens normala funktion i sidoväggen är avgörande för att upprätthålla endokochleär potential, jontransport och vätskebalans. Olika former av hörselskador rapporteras involvera onormal mikrocirkulation i snäckan. Undersökning av hur cochleärt blodflöde (CoBF) patologi påverkar hörselfunktionen är utmanande på grund av bristen på genomförbara förhörsmetoder och svårigheten att komma åt innerörat. Ett öppet kärlfönster i den laterala cochleaväggen, i kombination med fluorescens intravital mikroskopi, har använts för att studera CoBF-förändringar in vivo, men mestadels hos marsvin och först nyligen i musen. Detta papper och tillhörande video beskriver den öppna kärl-fönstermetoden för att visualisera blodflödet i mussnäckan. Detaljer inkluderar 1) beredning av den fluorescerande märkta blodcellssuspensionen från möss; 2) konstruktion av ett öppet kärlfönster för intravital mikroskopi i en bedövad mus, och 3) mätning av blodflödeshastighet och volym med hjälp av en offline-inspelning av avbildningen. Metoden presenteras i videoformat för att visa hur man kan använda öppna fönstermetoden i mus för att undersöka strukturella och funktionella förändringar i den cochleära mikrocirkulationen under normala och patologiska förhållanden.
Introduction
Mikrocirkulationens normala funktion i den laterala cochleaväggen (som omfattar majoriteten av kapillärerna i spiralbandet och stria vascularis) är kritiskt viktigt för att upprätthålla hörselfunktionen1. Onormal CoBF är inblandad i patofysiologin hos många inre öronsjukdomar inklusive bullerinducerad hörselnedsättning, öronhydrops och presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9. Visualisering av intravital CoBF kommer att möjliggöra en bättre förståelse av kopplingarna mellan hörselfunktion och cochleär vaskulär patologi.
Även om komplexiteten och placeringen av snäckan i det temporala benet utesluter direkt visualisering och mätning av CoBF, har olika metoder utvecklats för bedömning av CoBF inklusive laser-dopplerflödesmetri (LDF)10,11,12, magnetisk resonanstomografi (MRI)13, fluorescens intravital mikroskopi (FIVM)14, fluorescensmikroskopi (FME)15, endoskopisk laserspektledkontrastavbildning (LSCI)16 och metoder baserade på injektion av märkta markörer och radioaktivt märkta mikrosfärer i blodomloppet (optisk mikroangografi, OMAG)17,18,19,20. Ingen av dessa metoder har dock möjliggjort absolut realtidsspårning av förändringar i CoBF in vivo, med undantag för FIVM. FIVM, i kombination med ett kärlfönster i den laterala cochleaväggen, är ett tillvägagångssätt som har använts och validerats hos marsvin under olika experimentella förhållanden av olika laboratorier 14,21,22.
En FIVM-metod etablerades framgångsrikt för att studera de strukturella och funktionella förändringarna i den cochleära mikrocirkulationen hos mus med hjälp av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-dextran som kontrastmedium och fluorescensfärgämne - antingen DiO (3, 3′-dioctadecyloxacarbocyaninperklorat, grönt) eller Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetrametylindokarbocyaninperklorat, rött)-för förmärkning av blodkroppar, visualisering av kärl och spårning av blodflödeshastighet. I denna studie har protokollet för denna metod beskrivits för avbildning och kvantifiering av förändringar i CoBF hos mus under normala och patologiska förhållanden (t.ex. efter bullerexponering). Denna teknik ger forskaren de verktyg som behövs för att undersöka de underliggande mekanismerna för CoBF relaterade till hörseldysfunktion och patologi i stria vascularis, särskilt när de appliceras tillsammans med lättillgängliga transgena musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta är en icke-överlevnadsoperation. Alla förfaranden som involverar användning av djur granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Oregon Health & Science University (IACUC godkännandenummer: TR01_IP00000968).
1. Beredning av de fluorescerande märkta blodkropparna
- Bedöva donatormössen (manliga C57BL/6J-möss i åldern ~6 veckor) med en intraperitoneal (i.p.) injektion av ketamin/xylazinlösning (5 ml/kg, se materialförteckningen).
OBS: Detta anestesiprotokoll är mycket tillförlitligt och upprätthåller systemiskt blodtryck. - Lägg musen på ryggen, öppna huden och exponera bröstkaviteten med pincett och dissekerande sax. Skär upp membranet, ta tag i bröstbenets botten med en sax, skär genom bröstkorgen och lyft för att exponera hjärtat. Samla 1 ml blod i heparin (15 IE/ml blod) vid hjärtpunktion och centrifugera vid 3 000 × g i 3 minuter vid 4 °C. Euthanize musen genom cervikal dislokation efter bloduppsamling.
- Ta bort plasman, tvätta blodcellpelleten med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och centrifugera 3x vid 3000 × g i 3 min vid 4 °C.
- Märk blodkropparna med 1 ml 20 mM DiO eller Dil i PBS och inkubera i mörker i 30 minuter vid rumstemperatur23,24.
- Centrifugera och tvätta de märkta blodkropparna med 1 ml PBS, centrifugera 3x vid 3000 × g i 3 min vid 4 °C och återsuspendera cellpelleten i 30% hematokrit med ~ 0,9 ml PBS (slutlig volym ~ 1,3 ml) före injektion.
2. Kirurgi för att skapa ett öppet fönster 25
- Förbered de sterila kirurgiska instrumenten och bildplattformen och placera en värmedyna under draperiet (figur 1A). Bedöva mössen (manliga C57BL/6J-möss i åldern ~6 veckor) enligt beskrivningen i steg 1.1 och kontrollera anestesidjupet genom att övervaka tassreflexen och den allmänna muskeltonen. Placera djuret på den varma värmedynan och håll rektaltemperaturen vid 37 °C.
- Placera djursvansen i CODATM-övervakningssystemet för övervakning av blodtryck och hjärtslag (se materialförteckningen). Registrera djurets systoliska blodtryck, diastoliska blodtryck och medelblodtryck (MBP) i bedövat tillstånd.
OBS: Ingen skillnad ses i djur MBP i bedövat och obedövat tillstånd (107 ± 11 mmHg jämfört med 97 ± 7 mmHg). Djurpulsen är stabil under bedövning, men lägre (fortfarande inom normalt intervall) än i icke-bedövat tillstånd (357 ± 12 bmp jämfört med 709 ± 3 bmp). En något ökad hjärtrytm bör förväntas hos djur som placeras i fasthållning26. - Öppna den vänstra tympaniska bullan via ett lateralt och ventralt tillvägagångssätt under ett stereomikroskop (se materialtabellen) och lämna det tympaniska membranet och ossiklarna intakta21.
- Gör ett snitt längs mittlinjen i djurets nacke med huvudet immobiliserat och placerat för att minimera rörelse (figur 1B). Ta bort den vänstra submandibulära körteln och bakre magen i den digastriska muskeln och cauterize.
OBS: Injicera buprenorfin subkutant med 0,05 mg/kg för att minska smärtan under operationen. - Leta reda på och exponera den beniga bullan genom att identifiera sternocleidomastoidmuskeln och ansiktsnerven som sträcker sig främre mot bulla.
- Öppna den beniga bullan med en 30 G-nål och ta försiktigt bort det omgivande benet med kirurgisk pincett för att ge en tydlig bild av snäckan och stapedialartären, med sin mediala marginal som ligger över kanten på den runda fönsternischen och kurar främre överlägsen mot det ovala fönstret (figur 1C, D).
OBS: Trakeotomi utförs för att hålla luftvägarna fria och bör endast göras när djuret har andningsproblem under operationen. I allmänhet har de flesta djuren under anestesi smidig andning. Men om djur fick trakeotomi under operationen, bör det registrerade blodflödet inte användas för någon jämförelse.
- Gör ett snitt längs mittlinjen i djurets nacke med huvudet immobiliserat och placerat för att minimera rörelse (figur 1B). Ta bort den vänstra submandibulära körteln och bakre magen i den digastriska muskeln och cauterize.
- Använd ett litet knivblad (specialfräst #16 skalpell) för att skrapa sidoväggsbenet vid mussnäckans topp-mittvridning, cirka 1,25 mm från toppen tills en tunn fläck är sprucken. Ta bort benflisorna med små trådkrokar (figur 1E).
- Täck kärlfönstret med en kapad täckskiva för att bevara normala fysiologiska förhållanden och ge en optisk vy för inspelning av fartygsbilder.
OBS: Alla procedurer ska utföras med försiktighet. Förutom att övervaka kroppstemperaturen bör djurets vitala tecken, inklusive blodtryck och hjärtslag, också övervakas under hela operationen.
3. Bildbehandling av CoBF enligt FIVM
- Gör ett ~ 1 cm snitt längs den högra saphenösa venen för att exponera kärlet (figur 1F).
- Infusera 100 μl av FITC-dextran-lösningen (2000 kDa, 40 mg/ml i PBS) och 100 μl av en blodcellssuspension (30% hematokrit) successivt in i djuret genom den saphenösa venen (figur 1G) för att möjliggöra visualisering av blodkärlen och spårning av blodflödeshastigheten.
- Observera blodflödet i realtid direkt på en videomonitor 5 minuter efter injektionen. Avbilda blodkärlen med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med ett mål för långt arbetsavstånd (W.D. 30,5 mm, 10x, 0,26 numerisk bländare) och ett lamphus som innehåller ett excitationsfilter med flera band och kompatibelt emissionsfilter (materialförteckning). Spela in videon med en högupplöst digital svartvit laddningskopplad enhetskamera (materialtabell) med 2 bilder / s). Skaffa mer än 350 bilder per video för att säkerställa framgångsrik analys av flödeshastigheten.
OBS: Blodkärl i både spiralbandet och stria vascularis kan avbildas genom att justera det optiska fokuset (Kompletterande video 1).
4. Videoanalys
- Mät kärldiametern med lämplig programvara (materialtabell) och bestäm avståndet mellan två fasta punkter över fartyget i de förvärvade bilderna.
- Beräkna blodflödeshastigheten från inspelade videoramar genom att spåra rörelsen hos märkta blodkroppari det rumsliga avståndet mellan bildplatser27.
- Öppna videon av blodflödet i programvaran (Fiji [ImageJ] användes i detta protokoll) och ställ in bildernas skala.
- Spåra de valda DiO-färgade blodkropparna med hjälp av spårningsfunktionen. Använd avståndet som cellerna har flyttat och tidsintervallet mellan bildrutorna i videon för automatisk beräkning av flödeshastigheten.
- Beräkna det volymetriska flödet (F) enligt följande ekvation: F = V × A. (V: hastighet; A: fartygets tvärsnittsarea).
5. Bullerexponering
- Placera djuren i trådnätburar. Utsätt dem för bredbandsbuller vid 120 dB ljudtrycksnivå i ett ljudexponeringsbås i 3 timmar och i ytterligare 3 timmar nästa dag.
OBS: Denna bullerexponeringsregim, som rutinmässigt används i detta laboratorium, ger permanent förlust av cochleär känslighet28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter kirurgisk exponering av de cochleära kapillärerna i sidoväggen (figur 1) var intravital högupplöst fluorescensmikroskopisk observation av Dil-märkta blodkroppar i FITC-dextran-märkta kärl möjlig genom ett öppet kärlfönster. Figur 2A är en representativ bild tagen under FIVM som visar kapillärerna i musens cochleära apex-mittvrid sidovägg. Lumina av dessa kärl synliggörs av fluorescensen av FITC-dextran blandad med plasma. Individuellt märkta blodkroppar som distribueras i kärlnätverket är också tydligt synliga i den här bilden. Två distinkta nätverk-kapillärer av spiralbandet och kapillärerna i stria vascularis-kännetecknas av plats (under ett upprätt mikroskop löper stria vascularis optiskt under spiralbandet, och det innehåller fler kapilläröglor och mindre kärl25). Båda kan bedömas för blodflöde med justering av det optiska fokuset. Som visas i figur 2B, C, är kärltätheten hos spiralbandet glesare än för stria vascularis.
Kärlfunktionen i den brusexponerade musmodellen jämfördes med kärlfunktionen i kontrollgruppen. CoBF-mätning gjordes 2 veckor efter bullerexponering. Figur 3A,B är representativa bilder som visar flödesmönstren i kontroll- och bullerexponerade grupper. Ett stört mönster av blodflödet sågs i den bullerexponerade gruppen (figur 3B). Avvikelserna inkluderade minskad kärldiameter (figur 3C) och ökad variation i kärldiameter (figur 3D). Som illustreras i figur 4A,B beräknades blodflödeshastigheterna i kontroll- och bullerexponerade grupper genom att spåra rutterna för de DiO-märkta blodkropparna (kompletterande video 2). Resultaten visar att blodhastighet och volym i den bullerexponerade gruppen var signifikant lägre än i kontrollgruppen (figur 4C, D). Dessa data indikerar att högt ljud särskilt påverkar blodcirkulationen och orsakar minskat och stört blodflöde.
Figur 1: Förberedelse av ett öppet kärlfönster för IVM-avbildning i mus. (A) Förberedelse av instrument och verktyg för operationen. (B) Den vänstra bullan exponerades via en lateral och ventral inflygning. (C) Snäckan exponerades efter att bullan tagits bort. (D) Förstorad bild av snäckan, från cirkeln i (C). (E) Ett öppet kärlfönster skapades vid den cochleära sidoväggens (låda) topp-mittvridning. (F och G) Intravenös infusion av FITC-dextran och märkta blodkroppar genom den saphenösa venen. Förkortningar: OW = ovalt fönster; RW = runt fönster; IVM = intravital mikroskopi; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av cochleära kapillärer i sidoväggen. (A) Dil-märkta blodkroppar (röd, pil) i stry-kärl märkta med FITC-dextran (grön). (B) DiO-märkta blodkroppar (gröna) i spiralbandskärl märkta med FITC-dextran (pilar, grön). Observera att fartygen är glesa. (C) DiO-märkta blodkroppar (gröna) i stryvekärl märkta med FITC-dextran (grön). Observera att fartygen är tätare. Skalstreck: 50 μm och 100 μm. Förkortningar: Dil = 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanin perklorat; FITC = fluoresceinisotiocyanat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förändring av kärldiametern i stria två veckor efter bullerexponering. (A och B) Representativa bilder av blodcirkulationen efter märkning av kärl med FITC-dextran (grön) och blodkroppar med DiO (grön) i kontroll- och bullerexponerade (NE) grupper med högupplöst IVM. C) Medeldiameter beräknad för kontroll- och NE-grupper. Jämfört med kontrollgruppen reducerades kärldiametern i den bullerexponerade gruppen. (n = 18, t (34) = 2,880, **p = 0,007, Studentens t-test, medelvärde ± standardavvikelse [SD]). (D) Varians av kärldiameter i kontroll- och NE-grupper. Kärldiametern varierade mycket mer i NE-gruppen än i kontrollgruppen. (n = 6, t (10) = 6,630, ****p < 0,0001, Studentens t-test, medelvärde ± SD). Skalstreck: 100 μm. Förkortningar: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate; FITC = fluoresceinisotiocyanat; IVM = intravital mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Blodflödesförändringar i stria två veckor efter bullerexponering. (A och B) Representativa bilder visar spårningsvägarna (röda, gröna och blå linjer) för DiO-märkta blodkroppar (gröna) för mätning av blodflödeshastighet i kontroll- och bullerexponerade grupper. (C och D) Blodflödeshastighet (μm/s) respektive volymetrisk flödeshastighet (μm3/s) beräknades för kontroll- respektive bullerexponerade grupper. Blodflödet och den volymetriska flödeshastigheten i den bullerexponerade gruppen var lägre än i kontrollgruppen (n = 54,t hastighet (106) = 19,705, ****p hastighet < 0,0001; t volym (106) = 15.342, ****pvolym < 0.0001, Studentens t-test, medelvärde ± standardavvikelse). Skala staplar: 100 μm. Förkortningar: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate1; FITC = fluoresceinisotiocyanat; NE 2W = två veckors bullerexponering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: Blodkärl i både spiralbandet och stria vascularis. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: Spåra rutterna för DiO-märkta blodkropparför beräkning av blodflödeshastigheterna hos ett kontrolldjur. Förkortningar: DiO = 3, 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats visar hur kapillärer i den cochleära sidoväggen (och i stria vascularis) i en musmodell kan visualiseras med fluoroformärkning i ett öppet kärlfönsterberedning under ett FIVM-system. Musmodell används ofta och föredras som en däggdjursmodell för att undersöka människors hälsa och sjukdom. Protokollet som beskrivs här är ett genomförbart tillvägagångssätt för avbildning och undersökning av CoBF i musens sidovägg (särskilt i stria vascularis) med hjälp av ett öppet kärlfönster under FIVM-system Metoden ger tillräcklig upplösning för att bestämma blodflödeshastigheten och volymen med hjälp av fluorescensmärkta blodkroppar som spårämne (som visas i figur 3 & Figur 4 ). Detta tillvägagångssätt kan användas för flera olika applikationer, såsom bedömning av vaskulär permeabilitet och undersökning av pericytkontraktilitet och spårning av cirkulerande benmärgscellsmigration25. Akuta förändringar i CoBF som svar på trauma, infektion, buller, främmande kroppar, ototoxiska läkemedel eller andra medel som påverkar sidoväggen kan också övervakas i realtid25,29.
Under de senaste decennierna etablerades flera relativt icke-invasiva metoder för att bedöma CoBF utan att ta bort den cochleära benväggen, inklusive LDF, MRI, OMAG, endoskopisk LSCI, endoskopisk FME och injektion av mikrosfärer i blodplasman. Ingen av dessa metoder kan dock användas för att utvärdera den absoluta flödeshastigheten i enskilda fartyg. Till exempel kan icke-invasiv endoskopisk FME endast användas för att avbilda begränsade regioner nära det runda fönstret men inte blodflödet i stria vascularis. Blodcirkulationen i stria vascularis har dock avgörande roller för att upprätthålla EP, jontransport och endolymfatisk vätskebalans, allt viktigt för hörselkänslighet (Zhang et al., 2021). OMAG är också användbart för visualisering av blodflödet i den intakta cochlea, men upplösningen är för dålig för att avbilda enskilda kapillärer i stria vascularis av en musmodell19.
Ett öppet kärlfönster, tillsammans med en FIVM, möjliggör visualisering i realtid av blodflödet i den cochleära sidoväggen och mätning av kärldiameter och blodflödeshastighet i de registrerade regionerna. IVM-systemet har flera fördelar jämfört med andra metoder. Till exempel kan djuret bekvämt placeras och manipuleras efter behov. Det finns flexibilitet att justera kontrasten mellan fluorescensmärkt plasma och blodkroppar för att optimera visualisering av vaskulär arkitektur och markera relevanta strukturer. De olika molekylvikterna för FITC-konjugerade spårämnen kan också väljas för att optimera utvärderingen av vaskulär permeabilitet. e Valet av om man ska använda Dil (lex = 550 nm; lem = 564 nm) eller Dio (lex = 484 nm; lem = 501 nm) för att märka blodkropparna, i motsats till FITC-dextran som används för att märka plasma, bestäms av experimentmål. I allmänhet ger Dil bättre kontrast för visualisering av kärllumen och enskilda blodkroppar, medan Dio föredras när samtidig avbildning används för visualisering av blodkroppar och lumen i samma förvärvskanal. Dessutom uppnås spårning bäst med ett litet antal märkta celler eftersom fluorescens av blodceller kommer att maskera kärlets lumenfluorescens om alla blodkroppar i kärlet är märkta21. Dessutom bör försiktighet iakttas för att begränsa mängden lösning som administreras till blod, för att minimera utspädning och viskositetsrelaterade blodflödesförändringar i cochlea30.
Sammantaget är denna metod robust och kan användas för att undersöka strukturella och funktionella förändringar i CoBF under normala och patologiska tillstånd som inflammation, buller och åldrande. Viktigt är att en konstant och normal EP kan bibehållas under operationen, vilket indikerar att proceduren är ofarlig för cochleafunktionen när den utförs noggrant nog25. En framgångsrik etablering av det öppna kärlfönstret kräver dock en hög grad av kirurgisk skicklighet. Till exempel måste man vara försiktig när man tar bort benet i den cochleära sidoväggen för att förhindra förlust av perilymfatisk vätska och mikroskada på det yttre skiktet av det cochleära spiralbandet. Dessa kan påverka cochleär homeostas negativt och äventyra avbildningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) och Medical Research Foundation från Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X.
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al.
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A.
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
