Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Her beskriver vi en brugervenlig metode til at generere 3D-selvmonterede hjertemikrotissue-arrays sammensat af prædifferentierede humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller. Denne brugervenlige og lavcellekrævende teknik til at generere hjertemikrotiser kan implementeres til sygdomsmodellering og tidlige stadier af lægemiddeludvikling.

Abstract

Generering af humane kardiomyocytter (PM'er), hjertefibroblaster (CF'er) og endotelceller (EC'er) fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) har givet en unik mulighed for at studere det komplekse samspil mellem forskellige kardiovaskulære celletyper, der driver vævsudvikling og sygdom. Inden for hjertevævsmodeller bruger flere sofistikerede tredimensionelle (3D) tilgange inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (iPSC-PM'er) til at efterligne fysiologisk relevans og indfødt vævsmiljø med en kombination af ekstracellulære matricer og tværbindinger. Disse systemer er imidlertid komplekse at fremstille uden mikrofabrikationsekspertise og kræver flere uger at samle sig selv. Vigtigst af alt mangler mange af disse systemer vaskulære celler og hjertefibroblaster, der udgør over 60% af nonmyocytterne i det menneskelige hjerte. Her beskriver vi afledningen af alle tre hjertecelletyper fra iPSC'er til fremstilling af hjertemikrotiser. Denne lette replikastøbningsteknik tillader hjertemikrotissuekultur i standard multi-brøndcellekulturplader i flere uger. Platformen tillader brugerdefineret kontrol over mikrovævsstørrelser baseret på indledende såningstæthed og kræver mindre end 3 dage for selvmontering for at opnå observerbare hjertemikrovævskontraktioner. Desuden kan hjertemikrovævene let fordøjes, samtidig med at der opretholdes høj cellelevedygtighed til enkeltcelleforhør ved anvendelse af flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq). Vi forestiller os, at denne in vitro-model af hjertemikrotiser vil hjælpe med at fremskynde valideringsstudier inden for lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering.

Introduction

Lægemiddelopdagelse og sygdomsmodellering inden for kardiovaskulær forskning står over for flere udfordringer på grund af mangel på klinisk relevante prøver og utilstrækkelige translationelle værktøjer1. Meget komplekse prækliniske modeller eller overforenklede in vitro-enkeltcellemodeller udviser ikke patofysiologiske tilstande på en reproducerbar måde. Derfor har flere miniaturiserede vævskonstruerede platforme udviklet sig til at hjælpe med at bygge bro over kløften med det formål at opnå en balance mellem brugervenlighed på en måde med høj gennemstrømning og trofast rekapitulation af vævsfunktion2,3. Med fremkomsten af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) kan vævstekniske værktøjer anvendes på patientspecifikke celler med eller uden underliggende kardiovaskulær sygdomstilstand for at besvare forskningsspørgsmål4,5,6. Sådanne vævskonstruerede modeller med cellulær sammensætning svarende til hjertevævet kunne anvendes i lægemiddeludviklingsindsatsen for at teste for kardiotoksicitet og dysfunktion induceret af patologiske ændringer i adfærd hos en eller flere celletyper.

Selvsamlede mikrovæv eller organoider afledt af humane iPSC'er er tredimensionelle (3D) strukturer, der er miniaturevævslignende samlinger, der udviser funktionelle ligheder med deres in vivo-modstykker . Der er flere forskellige tilgange, der tillader dannelse af organoider in situ via rettet differentiering af iPSC'er eller gennem dannelse af embryoide kroppe4. De resulterende organoider er et uundværligt redskab til at studere morfogenetiske processer, der driver organogenese. Tilstedeværelsen af en række cellepopulationer og forskelle i selvorganisering kan imidlertid føre til variation i resultaterne mellem forskellige organoider5. Alternativt er prædifferentierede celler, der er selvsamlet til mikrovævssuer med vævsspecifikke celletyper for at studere lokale celle-celleinteraktioner, fremragende modeller, hvor det er muligt at isolere de selvmonterede komponenter. Især inden for human hjerteforskning har udviklingen af 3D-hjertemikrovæv med flercellede komponenter vist sig at være udfordrende, når celler stammer fra forskellige patientlinjer eller kommercielle kilder.

For at forbedre vores mekanistiske forståelse af celleadfærd i en fysiologisk relevant, personlig in vitro-model bør ideelt set alle komponentcelletyper udledes af den samme patientlinje. I forbindelse med et menneskeligt hjerte ville en virkelig repræsentativ hjerte-in vitro-model fange krydstalen blandt fremherskende celletyper, nemlig kardiomyocytter (CM'er), endotelceller (EF'er) og hjertefibroblaster (CF'er) 6,7. Den trofaste rekapitulation af et myokardium kræver ikke kun biofysisk strækning og elektrofysiologisk stimulering, men også cellecellesignalering, der stammer fra understøttende celletyper som ECs og CFs8. GF'er er involveret i syntesen af ekstracellulær matrix og opretholdelse af vævsstruktur; og i en patologisk tilstand kan CF'er fremkalde fibrose og ændre elektrisk ledning i CMs9. På samme måde kan EU'er regulere kontraktile egenskaber ved PM'er gennem parakrin signalering og levering af vitale metaboliske krav10. Derfor er der behov for humane hjertemikrovæv, der består af alle tre hovedcelletyper, for at gøre det muligt at udføre fysiologisk relevante eksperimenter med høj kapacitet.

Her beskriver vi en bottom-up-tilgang til fremstilling af hjertemikrovæv ved afledning af humane iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM'er), iPSC-afledte endotelceller (iPSC-EC'er) og iPSC-afledte hjertefibroblaster (iPSC-CF'er) og deres 3D-kultur i ensartede hjertemikrotissue-arrays. Denne letkøbte metode til at generere spontant slående hjertemikrovæv kan bruges til sygdomsmodellering og hurtig test af lægemidler til funktionel og mekanistisk forståelse af hjertefysiologi. Desuden kan sådanne multicellulære hjertemikrotissueplatforme udnyttes med genomredigeringsteknikker til at efterligne hjertesygdomsprogression over tid under kroniske eller akutte dyrkningsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medium, reagens, tilberedning af kulturplade

  1. Cellevaskeopløsning til cellekultur: Brug 1x fosfatbufret saltvand (PBS) eller Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) uden calcium eller magnesium.
  2. Kardiomyocytdifferentieringsmedier
    1. Forbered differentiering Medium # 1 ved at tilføje 10 ml supplement (50x B27 plus insulin) til 500 ml kardiomyocyt basal medium (RPMI 1640).
    2. Forbered differentiering Medium # 2 ved at tilføje 10 ml supplement (50x B27 minus insulin) til 500 ml kardiomyocyt basal medium (RPMI 1640).
    3. Forbered oprensningsmedium #3 ved at tilsætte supplement (50x B27 plus insulin) til 500 ml kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640) minus glukose.
  3. Endotelvækstmedier og magnetisk aktiverede cellesorteringsreagenser (MACS)
    1. Forbered endotelvækstmedium (EGM) med kommercielt tilgængeligt endotelcellevækstmedium supplement kit.
    2. Celleseparationssorteringsbufferopløsningen fremstilles ved fortynding af BSA-stamopløsning (bovin serumalbumin) til 1:20 med skylleopløsning.
  4. Hjertefibroblastdifferentieringsmedium: Forbered hjertefibroblastdifferentieringsmedium med fibroblast basal medium (DMEM-høj glukose) og serumfri fibroblast livsfaktorer kit.
  5. Fremstilling og vedligeholdelse af hjertemikrovæv: Forbered filtreret medium med kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640) med supplement (50x B27 plus insulin) og EGM i forholdet 70/30 v /v%.
  6. Stamopløsninger med lille molekyle og vækstfaktor
    1. Til differentiering af alle tre celletyper fremstilles 200 μL-alikvoter GSK3-betahæmmer CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorphenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridincarbonitril); Wnt-hæmmer IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamid; og transformerende vækstfaktor beta (TGF-β)-hæmmer SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) ved 10 mM koncentration i dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Til human iPSC-EC-differentiering fremstilles 100 μL-alikvoter af basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) (20 μg/ml), vaskulær endotelvækstfaktor 165 (VEGF165; 50 μg/ml) og knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4; 20 μg/ml) i 0,1 % (w/v) BSA i ultrarent destilleret vand. Alikvoterne opbevares ved -20 °C Ved langtidsopbevaring kan alikvoter opbevares ved -80 °C i op til 1 år.
  7. Forbelægningsplader til vedligeholdelse af iPSC-PM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er.
    1. Forbered kældermembranmatrix mellembelagte 6-brønds plader til iPSC-CM-genbelægning ved fortynding af vækstfaktor reduceret (GFR) kældermembranmatrixmedium i DMEM / F12 i forholdet 1:200. Tilsæt 2 ml fortyndet kældermembranmatrixmedium til hver brønd på 6-brøndspladen og lad den sætte sig i mindst 2 til 4 timer.
    2. Pre-coat 6-brønds plade eller 10 cm skål med gelatine. Flydende 2 % gelatineopløsning i et vandbad ved 37 °C og tilbered filtreret 0,2 % (v/v) gelatine i PBS i et passende volumen efter behov. Belæg kulturpladen med 10 ml 0,2% gelatine i mindst 30 minutter ved 37 °C inden brug.
      BEMÆRK: Gelatineplader kan bruges til både iPSC-CF'er og iPSC-EC'er efter MACS.
  8. Fremstilling af mikrovæveforme: Forbered 2% lavtsmeltende agaroseopløsning i PBS i en tør 100 ml glasflaske. Steriliser agarose ved 121 °C, 15 psi i 20 minutter før brug. Autoklaver de støbte silikone mikroforme ved 121 °C, 15 psi i 15 min.
  9. Løsninger til fordøjelse, immunsåbning og flowcytometri
    1. Til mikrovævefordøjelse fremstilles en enzymfordøjelsesbuffer af Dispase I (1 U/ml) og Liberase (3 U/ml) i PBS. Opbevar denne opløsning på is.
    2. Til både celle- og mikrovævsfiksering skal du bruge iskoldt kommercielt tilgængeligt fikseringsreagens indeholdende 4,2% paraformaldehyd (PFA).
    3. Forbered 0,25% Triton X-100 i PBS til permeabilisering og 0,1% Tween-20 til vask. Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur.
    4. Til fluorescensaktiverede cellesorteringsanalyser (FACS) fremstilles FACS-buffer [PBS eller HBSS med 2 % føtalt kvægserum (FBS)], som opbevares ved 4 °C.
    5. Til immunfædning skal du forberede 2% normalt gede-/æsel-/kaninserum i PBS. Vælg serumarten baseret på værten, hvor antistofferne blev rejst.

2. Hjertedifferentiering og oprensning

BEMÆRK: Alle iPSC'er skal opretholdes ved ~ 75% til 80% sammenløb før kardiomyocytdifferentiering. iPSC'er, der blev anvendt til denne protokol, blev afledt af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) ved hjælp af Sendai-virusprogrammering udført på Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Før differentiering, kultur iPSC kolonier op til passage (P20).
  2. Fjern iPSC-kulturmediet fra 6-brøndspladen, og vask cellerne en gang med 2 ml PBS.
  3. På dag 0 begynder mesendoderm-induktion ved at tilføje 2 ml differentieringsmedium #1 med CHIR (6 μM finale) i hver brønd. Den endelige koncentration kan variere mellem 6 og 9 μM for forskellige iPSC-linjer. Derfor anbefales det at teste forskellige CHIR-koncentrationer på en 6-brønds plade for at identificere optimal hjertemesoderminduktion.
  4. På dag 2 skal du genvinde cellerne ved at erstatte med frisk 2 ml medium # 1 i hver brønd.
  5. På dag 3 skal du udskifte medium i hver brønd med 2 ml differentieringsmedium medium # 1 med Wnt-hæmmer IWR-1-endo (5 μM) for at inducere hjerteafståelsesspecifikation.
  6. På dag 5 skal du genoprette cellerne ved at erstatte medium med frisk 2 ml medium # 1 i hver brønd.
  7. På dag 7 skal du udskifte medium med 2 ml Medium # 2 i hver brønd. Spontan slag af kardiomyocytter kan observeres allerede på dag 8-9. For nogle linjer kan slå celler forekomme så sent som dag 11.
  8. Til oprensning af differentieringskulturen skal du erstatte med 2 ml minus glucose Medium # 3 i hver brønd på dag 10.
  9. På dag 13 skal du genvinde cellerne ved at ændre mediet med 2 ml plus glukosemedium nr. 2 i hver brønd.
  10. På dag 16 skal du udføre anden rensningsrunde med 2 ml Medium #3 i hver brønd.
  11. Gendan cellerne på dag 19 med 2 ml plus glukose Medium # 2.
  12. På dag 20 vaskes brøndene en gang med 1 ml PBS og dissocieres cellerne ved hjælp af 1 ml 10x Trypsin i 6 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation løftes cellerne fra brøndoverfladen i enkeltceller i mindre end 15 s og tilsættes til 15 ml konisk rør med samme volumen medium # 2 for at neutralisere enzymet. Centrifugering af cellesuspensionen i 3 minutter ved 270 x g.
  13. Resuspend cellepillen i 3 ml Medium #3. Tæl cellerne og tilføj passende volumen af Medium # 3 til plade i alt ~ 3 millioner celler i hver brønd i en ny kældermembranmatrix medium belagt 6-brønds plade. På den anden dag efter genbelægning skal du udskifte mediet med frisk 2 ml medium # 2 og genopfylde med 2 ml medium # 2 hver anden dag indtil trypsinisering af kardiomyocytter til frysning eller fremtidige eksperimenter.

3. Endotelcelledifferentiering og MACS

  1. Ved 75% til 80% iPSC-sammenløb vaskes pladen med PBS, 2 ml pr. Brønd.
  2. Begynd differentiering på dag 0 ved at erstatte med 2 ml differentiering Medium #1 med 6 μM CHIR.
  3. På dag 2 skal du udskifte mediet med 2 ml differentieringsmedium #1 med 2 μM CHIR.
  4. På dag 4 skal du udskifte mediet med 2 ml EGM suppleret med 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 og 20 ng BMP4.
  5. Skift mediet med 2 ml EGM suppleret med vækstfaktorer hver anden dag fra dag 6 til dag 10. Tilsætning af TGFβ-hæmmer (SB431542) ved 8 μM-koncentration er valgfri for at fremme endoteludvidelse og undertrykke differentiering af andre mesenkymale oprindelsescelletyper.
  6. På dag 12 skal du begynde trin for MACS ved at skylle hver brønd med 1 ml PBS efterfulgt af cellesociation ved hjælp af 1 ml 10x Trypsin i hver brønd i en 6-brønds plade i 8 minutter ved 37 ° C.
  7. Forbered et lige stort volumen EGM-medium i et 50 ml konisk rør for at neutralisere dissociationsenzymet. Anbring en 40 μm cellesil på det 50 ml koniske rør og før den dissocierede cellesuspension gennem silen. Skift filteret for hver 2 til 3 dissocierede brønde.
  8. Opregne de samlede levedygtige celler ved hjælp af 0,4% Trypan blå ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
  9. Pellet cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter i en forkølet centrifuge indstillet til 4 °C.
  10. Kassér supernatanten, og resuspend cellepillen i et passende volumen sorteringsbuffer baseret på det samlede antal i trin 3.8.
    BEMÆRK: Tilføj 80 μL sorteringsbuffer pr. 107 celler i alt.
  11. Til magnetisk perlemærkning tilsættes 20 μL FcR-blokerende reagens pr. 107 celler og inkuberes i 5 minutter.
  12. Tilsæt 20 μL CD144 eller CD31 microbeads pr. 107 celler og bland godt. Inkuber cellesuspensionen i mørke ved 4 °C i 15 min.
  13. Tilsæt 20 ml sorteringsbuffer for at vaske de mærkede celler og pelletere cellerne 300 x g i 5 minutter i en forkølet centrifuge sat til 4 ° C.
  14. Resuspend cellepillen i 3 ml sorteringsbuffer og lad den stå på is.
  15. Forbered en magnetisk separationskolonne ved at placere søjlen i separatorhaket.
  16. Ligevægt kolonnen ved skylning med 3 ml sorteringsbuffer og opsaml strømmen igennem i et affaldskonisk rør.
  17. Når skyllebufferen strømmer igennem, skal du suspendere cellesuspensionen grundigt for at bryde eventuelle klumper og påføre cellesuspensionen på søjlen.
  18. Når cellesuspensionen er strømmet igennem, vaskes kolonnen med 3 ml sorteringsbuffer tre gange for at fjerne eventuelle umærkede celler.
  19. Fjern søjlen fra separatoren, og anbring den i et 15 ml konisk rør til CD144+/CD31+ celleeluering.
  20. Tilsæt 5 ml sorteringsbuffer på søjlen og skyl straks de magnetisk mærkede celler med stemplet.
  21. Bestem det levedygtige cellenummer ved hjælp af 0,4% Trypan blå ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
  22. Centrifugering af cellesuspensionen i en forkølet centrifuge ved 300 x g i 3 min.
  23. Resuspend cellepillen i passende volumen EGM med 5-8 μM TGFβ-hæmmer (SB431542) baseret på det samlede antal i trin 3.21.
  24. Plade denne passage 0 (P0) celler ved en passende celletæthed (4 x 104 celler / cm2) på en forbelagt 0,2% gelatineplade.
  25. For P0 og P1 skal du fortsætte med at genopfylde mediet med frisk EGM hver anden dag med TGFβ-hæmmer. Fra P2 kan celler dyrkes i endotelvækstmedium uden TGFβ-hæmmer.

4. Differentiering af hjertefibroblast

  1. Tillad iPSC'er at blive 90% til 95% sammenflydende; vask hver brønd med 1 ml PBS.
  2. Begynd differentiering på dag 0 ved at tilføje 2 ml differentiering Medium #1 med 11 μM CHIR. For følsomme iPSC-linjer kan koncentrationen variere mellem 9-10 μM.
  3. På dag 1 skal du observere pladen. Det er normalt at observere signifikant celledød med ~ 30% til 40% celler klæbet til pladen.
  4. På dag 3 tilsættes 2 ml differentieringsmedium nr. 1 med 5 μM IWR-1-endo for at fremme udvidelsen af hjertestamfarere.
  5. På dag 4 skal du udskifte mediet med 2 ml hjertefibroblastdifferentieringsmedium. Udskift med frisk medium hver anden dag indtil dag 16.
  6. På dag 18 skal cellerne løsnes ved hjælp af 1 ml 10x Trypsin i hver brønd i en 6-brønds plade i 10 minutter ved 37 ° C.
  7. Forstyrre cellelaget grundigt og føre cellesuspensionen gennem en 70 μm cellesil i et 50 ml konisk rør indeholdende lige volumen DMEM / F12 medium suppleret med 5% FBS.
  8. Bestem det levedygtige cellenummer ved hjælp af 0,4% Trypan blå ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
  9. Centrifugering af cellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter for at opnå en pellet.
  10. Til den første omplettering skal cellepillen resuspendes i et passende volumen differentieringsmedium og plade ved en celletæthed (6 x 104 celler / cm2) på en 0,2% gelatinebelagt plade indtil 90% sammenløb.
  11. Opdel pladen og oprethold hjertefibroblasterne i almindelig DMEM / F12 med 10% serum på gelatinebelagte plader.

5. Støbning af hjertemikrotisseforme og cellesåning

  1. Smelt agarose i en mikrobølgeovn i en 100 ml glasflaske, indtil den koger. Sprøjt agaroseflasken og læg den i biosikkerhedsskabet. Lad agarose køle af i ~3 minutter.
  2. Pipette 700 μL smeltet agarose i en silikone mikroform på 9 x 9 array. Undgå at generere bobler under pipettering.
  3. Anbring forsigtigt formen på en forkølet isblok for at fremskynde agarosegelering.
  4. Sørg for, at når agarose er geleret, bliver den gennemskinnelig. Bøj forsigtigt rundt om kanterne af mikroformen for at løsne agarosekopien. Skræl derefter forsigtigt replikaen fra alle sider for at løsne agarosekopien fra silikonemikroformen.
  5. Overfør agarosemikrotissuebakken indeholdende 81 cirkulære fordybninger (800 μm diameter; 800 μm dybde) til en steril 12-brønds plade.
  6. Tilsæt 2 ml PBS til agarosemikrovævsbakken og inspicér under mikroskopet for eventuelle fangede bobler eller uregelmæssige formede brønde.
  7. Nedsænk agarosebakken i 2 ml 70% ethanol natten over, efterfulgt af UV-behandling i biosikkerhedsskabet i 1 time.
  8. Før brug fjernes 70% ethanol og vaskes to gange med destilleret vand og en endelig vask med 2 ml PBS.
  9. Prøv atpsinisere, neutralisere og tælle iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er, og læg cellesuspensionerne på is.
  10. Fjern PBS fra brønden og cellesåkammeret forsigtigt uden at røre ved udsparingerne.
  11. I et nyt rør blandes iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er i henholdsvis 7: 2: 1-forhold for at opnå en endelig celletæthed på 106 celler / ml. Højere celletætheder vil resultere i større mikroproblemer.
    BEMÆRK: Overskrid ikke 2 x 106 celler/ml.
  12. Tilsæt forsigtigt 200 μL af cellesuspensionen dråbevis i såkammeret.
  13. Lad cellerne sætte sig ved 37 °C i en CO2-inkubator i 2 timer.
  14. Tilsæt mikrovævsfremstillingsmedium, der omgiver agaroseformen for bare at dække overfladen af det indre kammer.
  15. Efter 24 timer samler cellerne sig selv og komprimerer signifikant i de cirkulære udsparinger. Udskift med frisk medium hver anden dag til vedligeholdelse.

6. Fiksering og permeabilisering af celler og hjertemikrovæv til immunstaining

  1. For hver enkelt celletype dyrkes cellerne separat på kældermembranmatrixmedium eller gelatinebelagte kammerglider (ca. 2,5-3 x 105 celler/ml). Hjertemikrovæv kan opsamles i 15 ml konisk rør ved forsigtigt at skylle dem ud af de cirkulære udsparinger.
  2. Aspirer mediet og skyl cellerne eller mikrovævene med 1 ml PBS; derefter fastgøres med fikseringsbufferen indeholdende 4,2% PFA i 20 minutter for kammerrutsjebanerne og 1 time for mikrotiser ved stuetemperatur.
  3. Aspirer PFA og tilsæt 1 ml permeabiliserende opløsning (0,25% Triton X-100 i PBS) i 5 til 7 minutter for kammerdias og 20 min for mikroproblemer i 15 ml konisk rør.
    BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter kan prøverne forsigtigt vippes på en skråneplatform på bænken.
  4. Aspirer den permeabiliserende opløsning og skyl en gang med 2 til 3 ml PBS.
  5. Inkuber cellerne med 500-1.000 μL blokerende opløsning (2% til 5% normalt gedeserum eller æselserum) i mindst 1 time for kammerglider og 3 til 4 timer for mikrovævene.
  6. Inkubere cellerne eller hjertemikrovæverne med konjugerede antistoffer fremstillet i den blokerende opløsning, der er tilstrækkelig til at dække prøven. Inkuber med anti-hjerte Troponin-T (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) og anti-DDR2/Vimentin (1:50) i 1 time for kammeret glider og natten over ved 4 ° C for hjertemikrotiser.
  7. Vask kammerglider tre gange med 500 μL 0,1% Tween-20 i 5 minutter mellem hver vask og en sidste vask med PBS.
  8. For hjertemikroproblemerne vaskes med 2 ml 0,1% Tween-20 fem gange med 20 minutters varighed mellem hver vask. Udfør et sidste vasketrin i yderligere 20 minutter.
  9. Inkuber cellerne eller mikrovæverne med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 μg/ml) inden konfokalmikroskopi.
  10. For hjertemikrovæv skal du forsigtigt overføre til en 35 mm glasbundsskål og tilsætte PBS for at nedsænke mikrovæve.
  11. Til 3D-billeddannelse ved hjælp af en 20x eller 40x olienedsænkningsmålforøgelse centrerer fokus på mikrotissue og justerer eksponeringsparametre for hver fluorofor.
  12. For at opnå en Z-stack skal du indstille første og sidste koordinater i Live-tilstand med en samlet billeddybde på 100-200 μm med 5-10 μm skiveinterval.

7. Fordøjelse af hjertemikrotiser og forberedelse af celler til flowcytometri

  1. For at fordøje mikroproblemer skylles mikrotissuerne forsigtigt med Medium #1 ud af de cirkulære udsparinger ved hjælp af en bredboret 1 ml pipettespids i et 15 ml konisk rør.
  2. Lad mikrovævene sætte sig og aspirere mediet forsigtigt, og skyl cellerne eller mikroproblemerne med 1 ml PBS, og tilsæt 200-300 μL enzymfordøjelsesbuffer i 20 minutter ved 37 °C. Efter 10 minutter blandes mikrotisserne forsigtigt i 1 min og inkuberes igen ved 37 °C resten af tiden.
  3. Efter inkubation skal du bruge en almindelig 1 ml pipettespids til at blande mikroproblemerne kraftigt for at opnå en uklar cellesuspension.
  4. Når mikroproblemerne er tilstrækkeligt fordøjet i enkeltceller, neutraliseres cellesuspensionen straks med 5 ml medium indeholdende 5% FBS og spændes cellesuspensionen gennem en 40 μm cellesil. Det samlede antal celler og centrifugering af enkeltcellesuspensionen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  5. Aspirate supernatanten og resuspend 1 x 105-1 x 106 celler i 100 μL annexinbindende buffer med FITC Annexin V og 100 μg/ml propidiumiodid (PI) eller To-Pro3 dødcelle udelukkelsesfarvestof i 10 minutter på is.
  6. Efter inkubation tilsættes 300 μL af annexinbindingsbufferen til cellesuspensionen og overføres til et FACS-rør med rund bund til analyse af flowcytometri. Brug de korrekte lasere og emissionsfiltre til de udvalgte fluoroforer.
  7. Til kvantificering af celleoverflademarkører ved hjælp af faste celler udføres fiksering og permeabilisering af cellepillen som beskrevet i trin 6.2 og 6.3.
  8. Efter permeabilisering skylles cellepillen og inkuberes cellerne med respektive konjugerede antistoffer i 1 time. Vask cellepillen i 4 ml FACS-buffer (2% FBS i PBS) og centrifuge ved 300 x g i 3 minutter. Gentag vasketrinnet to gange.
  9. Resuspend cellerne i 200-300 μL FACS buffer til flow cytometri analyse.
  10. Juster spredningsegenskaberne fremad og på siden med en ikke-farvet prøve, og overvej at bruge en isotypekontrol for hver fluorofor til at justere laserspændingerne. Indsaml mindst 20.000 hændelser til dataanalyse.

8. Udførelse af sammentrækningsanalyser af spontant slående hjertemikrovæv

  1. Optag videoer af hjertemikrotiser for at fange mindst tre slag. Indstil optageopløsningen til mindst 1280 x 720 pixels ved billedhastighed >30 billeder i sekundet, og gem videoen i . AVI-format.
  2. Kør MotionGUI script11 i et MATLAB-miljø for at starte brugergrænsefladen.
  3. Find . AVI-filplacering i din mappe for at indlæse videoen. Indtast derefter den billedhastighed, hvormed videoen blev optaget i panelet Input.
  4. I panelet Avanceret indgang kan der angives en pixelstørrelse baseret på opløsningen og optagelsesforstørrelsen.
  5. En passende makroblokpixelstørrelse kan specificeres (standard 16) og en detekterbar pixelbevægelse afhængigt af styrken af mikrovævskontraktion.
  6. Når du har justeret parametrene, skal du klikke på Hent bevægelsesvektorer for at starte analysen.
  7. Vælg et område af interesse med alternativknappen Vælg AOI for at udelukke områder omkring det enkelte mikrovæv i den cirkulære fordybning.
  8. Brug funktionen Map Time Ave til at generere et gennemsnitligt sammentrækningsvarmekort baseret på bevægelse registreret på X- og Y-akser.
  9. For peak tracing-data skal du bruge funktionen Hent sammentrækningsdata til automatisk at måle sammentræknings- og afslapningstoppene.
  10. I tilfælde af et lavt signal-støj-forhold skal du anvende en tærskel for tophøjde og afstand for korrekt at kommentere den maksimale sammentrækningshastighed (blå prist) og den maksimale afslapningshastighed (rød trekant).
  11. Når du har indstillet de korrekte tærskler, skal du vælge Analysér toppe for at opnå sammentræknings- og afslapningsværdierne med slaghastighed og slaginterval.
  12. Få målinger fra mindst 25 individuelle mikrovæv til statistiske analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunostaining og flowcytometri karakterisering af iPSC-afledte PM'er, EP'er og CF'er
For at generere hjertemikrotiser sammensat af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er differentieres og karakteriseres alle tre celletyper individuelt. In vitro-differentieringen af iPSC'er til iPSC-CM'er er blevet forbedret i løbet af de seneste år. Udbyttet og renheden af iPSC-CM'er varierer imidlertid fra linje til linje. Den nuværende protokol giver over 75% rene iPSC-CM'er, der spontant begynder at slå omkring dag 9 (figur 1A). Yderligere oprensningstrin fra dag 9 til dag 14 kan forbedre iPSC-CM-renheden til over 80 % som tidligere beskrevet12. Tilsvarende kan iPSC-ECs med høj renhed genereres ved hjælp af tidligere offentliggjorte protokoller13,14, der inkluderer tilsætning af flere vaskulære vækstfaktorer, der polariserer endotelstamceller som følge af mesoderm omkring dag 4-5 (figur 1B) for at danne fænotypisk veldefinerede iPSC-ECs. iPSC-GF'er er en meget heterogen population baseret på deres placering og er karakteriseret ud fra deres morfologi og ekspression af ekstracellulære matrixproteiner. Her opnås humane iPSC-GF'er ved hjælp af offentliggjorte protokoller15,16,17 med modifikationer fra hjertemesoderm stamceller (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Tidslinje for differentiering. Overordnet skematisk oversigt over (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC og (C) iPSC-CF-differentieringstidslinje med repræsentative fasekontrastbilleder af celler efter differentierings- og oprensningstrin. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Renheden af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er blev bestemt ved henholdsvis immunostaining og flowcytometri under anvendelse af henholdsvis cTnT2, blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekyle (PECAM1/CD31) og vimentin (VIM) (figur 2A). Kvantitativ analyse viste en oprenset population indeholdende over 90% cTnT2-celler på dag 20. iPSC-EC'er opnået på dag 12 efter MACS ved anvendelse af CD31-perler blev identificeret med immunfarvning mod PECAM1/CD31 endotelcelleoverflademarkør. MACS gav meget rene endotelceller, som det fremgår af over 95% CD31 + -celler ved P0. Det skal dog bemærkes, at renheden af endotelceller faldt med højere passagetal på grund af dedifferentiering. Tilsvarende afslørede flowcytometrianalyser på dag 20, at over 95% iPSC-CF'er udtrykte fibroblastmarkøren VIM (figur 2B).

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescens og flowcytometri karakterisering. (A) [Venstre mod højre panel] iPSC-CM'er på dag 25 farvet med cTnT2 (cyan), iPSC-ECs farvet med PECAM1 / CD31 (grøn), iPSC-CF'er farvet med VIM (rød) og kerner farvet med DAPI (blå). Skalabjælke = 50 μm. (B) [Venstre mod højre panel] Kvantificering af flowcytometri viste en høj procent renhed af iPSC-CM'er (91,8%), iPSC-EC'er (98,1%) og iPSC-CF'er (96,7%) efter differentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Fremstilling af hjertemikrotissekulturer og størrelsesanalyser
Enkeltcellesuspensioner af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er blev blandet i forholdet 7: 2: 1 og omhyggeligt udleveret i cellesåkammeret i den steriliserede agarose-replikaform (figur 3A, B). Cellerne slog sig ensartet ned inde i de cirkulære udsparinger i 2 timer. Omkring dag 3 organiserer de selvmonterede celler sig i ensartet størrelse spontant slående hjertemikrotiser (figur 3C). Arrays af forskellige størrelser mikrotissuer kan fremstilles ved at indstille den endelige celletæthed (figur 3D,E). Hjertemikrovæv fremstillet med en endelig celletæthed på 1 x 106 celler / ml er ~ 300-350 μm i diameter, 2 x 106 celler / ml er ~ 600 μm i diameter, og 4 x 106 celler / ml er over 800 μm i diameter. Mikrovævssamling blev opnået med en celletæthed på 1 x 106 celler / ml, som typisk anvendes til eksperimenter. Disse mikrovævskulturer kan opretholdes i kultur i op til 6 uger.

Figure 3
Figur 3: Replika støbeteknik til generering af multicellulære hjertemikrovæv. (A) Replikastøbte agarosemikrobrøndbakker af (B) iPSC-CM,iPSC-EC og iPSC-CF-blandinger fanget inde i mikrobrøndene til selvmontering. Skalabjælke 500 = μm. (C) Mikrograf, der viser komprimering af hjertemikrotiser på dag 3. Skalastang = 500 μm. (D) Dannede hjertemikrovævsstørrelser viser et lineært forhold til indledende såningstætheder, hvor højere celletætheder resulterer i større mikroproblemer. (E) En repræsentativ figur, der viser de selvmonterede hjertemikrovæv i mikrobrøndarrayet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Immunstaining og levedygtighed efter enzymatisk fordøjelse
Immunofluorescensfarvning af dag 12 efter fabrikation ved hjælp af antistoffer mod cTnT2 til iPSC-CM'er, CD31 til iPSC-EC'er og DDR2 til iPSC-GF'er afslørede en unik cellefordeling i hjertemikrotiser. iPSC-CM'er, den tungeste af alle tre celletyper, besatte centret, mens iPSC-ECs blev spredt gennem mikroproblemerne, og iPSC-GF'er blev observeret overvejende at besætte periferien (figur 4A). Kort og hurtig fordøjelse af mikroproblemerne opnået ved hjælp af Dispase I og Liberase TL resulterede i en samlet meget levedygtig celleandel (figur 4B, toppanel) med mindre end 5% apoptotiske celler efter 2 uger i dyrkning. Dette blev efterfulgt af en kort 1 timers eksponering af hjertemikrotiser for en høj koncentration (5 μM) af Doxorubicin, et kemoterapeutisk lægemiddel, der vides at inducere dosisafhængig kardiotoksicitet (figur 4B, bundpanel).

Figure 4
Figur 4: Immunfarvning af hjertemikrotiser og vurdering af cellelevedygtighed. (A) Konfokale z-stack-billeder af humant hjertemikrotissue farvet til iPSC-CM'er (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CF'er (DDR2) og kerner farvet med (DAPI). Skalastang = 200 μm. (B) Flowcytometriplotter af hjertemikrotiser enzymatisk fordøjet i enkeltcellesuspension og farvet med Annexin V (apoptotisk markør) og dødcelleekselukkelsesfarvestof (To-Pro3). Fordøjet enkeltcellesuspension viste en høj cellelevedygtighed (91%) med <5% apoptotisk cellepopulation (toppanel) sammenlignet med enkeltcellesuspension behandlet med et apoptoseinducerende kemoterapeutisk lægemiddel, Doxorubicin, i 1 time ved 5 μM koncentration (nederste panel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Beregningsmæssig kontraktilitetsanalyse
Kontraktilitetsanalyser af individuelle hjertemikrotiser kan udføres ved hjælp af et MATLAB-baseret billedanalyseværktøj. Videooptagelser af spontant slående hjertemikrotiser blev opnået ved 30 fps til analyse. Som beskrevet tidligere11 anvender blokmatchningsmetoden bevægelsessporingsalgoritme til at registrere bevægelse af en blok pixels for de samlede rammer, der er erhvervet som en tidsserie af bevægelsesvektorer. Mikrovævernes kontraktilitet og vektorernes bevægelse genererer et pseudovarmekort, der illustrerer gennemsnitlig eller gennemsnitlig sammentrækningsprofil på tværs af mikrovævet (figur 5A). Kontraktil bevægelse af hjertemikroproblemerne genererer positive toppe, der måles som sammentrækningshastighed (blå cirkel), afslapningshastighed (rød trekant) og slaghastighed, hvoraf den sidste beregnes som tiden mellem to sammentrækningscyklusser (figur 5B). Desuden ændres hjertemikrovævenes kontraktilitet ikke signifikant over 4 uger i dyrkning (figur 5C).

Figure 5
Figur 5: Sammentrækningsanalyse af hjertemikrotiser. (A) Fasekontrastbillede og sammentrækningskort over hjertemikrotiser 1 uge efter fabrikation. Skalastang = 200 μm. (B) Hjertemikrovæv viser regelmæssige sammentræknings- og afslapningsprofiler og slaghastigheder. Tabellen viser repræsentative værdier af slaghastighed, maksimal sammentrækning og afslapningshastigheder. (C) Langvarig dyrkning af hjertemikrotiser i op til 4 uger påvirker ikke kontraktilitetsparametrene signifikant (n = 20/gruppe). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at generere hjertemikrotiser fra prædifferentierede iPSC-PM'er, iPSC-EC'er og iPSC-CF'er er det vigtigt at opnå en meget ren kultur for bedre kontrol af cellenumre efter kontakthæmmet cellekomprimering inden for hjertemikrovævene. For nylig, Giacomelli et. al.18 har demonstreret fremstilling af hjertemikrotiser ved hjælp af iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-GF'er. Hjertemikroproblemer genereret ved hjælp af den beskrevne metode består af ~ 5.000 celler (70% iPSC-CM'er, 15% iPSC-EC'er og 15% iPSC-CF'er). I denne metode blev både kardiomyocytter og endotelceller co-differentieret efterfulgt af adskillelse af endotelstamceller ved anvendelse af CD34+ markør. Den nuværende protokol, der er beskrevet her, består af 12.000 celler (70% iPSC-CM'er, 20% iPSC-EC'er og 10% iPSC-CF'er) pr. mikrotissue, hvilket giver højere celletal pr. konstruktion til downstream-enkeltcelleanalyser. Da alle tre celletyper differentieres separat, er der desuden begrænset heterogenitet i cellepopulationer, der er unik for at forstå cellespecifikke reaktioner på behandlinger.

For kardiomyocytdifferentiering har vi og andre tidligere demonstreret afledning af rene kardiomyocytter ved anvendelse af kemisk definerede dyrkningsbetingelser12,19,20. Kort fortalt begynder differentiering med mesendoderm-induktion efterfulgt af modulering af Wnt / β-catenin-signalering, der fremmer hjerteafstigelsesspecifikation. Yderligere oprensning af kardiomyocytterne i et glukoseberøvet medium tillader eliminering af ikke-kardiomyocytter. Her er det vigtigt at bemærke, at langvarig kultur i oprensningsmedium kan hæmme kvaliteten af kardiomyocytter. En nyligt offentliggjort protokol viser, at den proliferative kapacitet af kardiomyocytter i det tidlige stadium kan udnyttes til at opnå et stort antal celler. Udvidelsen af humane iPSC-CM'er induceres med genindførelse af CHIR, et potent mitogen i den tidlige proliferative fase21. Selvom den præcise molekylære mekanisme stadig er ukendt, kan denne teknik betydeligt forbedre iPSC-CM-udbyttet med ti gange eller hundrede gange. For at forbedre troskaben af iPSC-CM'er til sygdomsmodellering kan de desuden dyrkes i et modningsmedium for at forbedre elektrofysiologisk, mekanisk og strukturel modning22. En grundig oversigt over iPSC-CM modningsteknikker gennemgås andetsteds23.

Vaskulære endotelceller er blevet genereret fra pluripotente stamceller med forskellige oprensningsvariable effektivitetsgevinster13,24,25. Den nuværende protokol giver høj differentieringseffektivitet og udvælgelse af fænotypisk stabile iPSC-ECs med MACS26. Differentieringsmetoden til generering af funktionelle hjertefibroblaster følger modulering af Wnt-vejen og fibroblastvækstfaktoren (FGF), der signalerer for at generere iPSC-CFs17. In vivo GF'er stammer fra epikardi, endokardi og neurale kamfæstemænd16,27,28,29. Her genereres CF-slægten fra engagerede mesodermale hjerteforfædere uden at generere epikardialceller som et mellemprodukt. Samlet set tager de protokoller, der er beskrevet her for at generere iPSC-CM'er, iPSC-EC'er og iPSC-GF'er, hensyn til den lette reproducerbarhed og høje renhed baseret på fænotypiske egenskaber. For at opnå mikroproblemer af høj kvalitet er det vigtigt at opnå >90% renhed for hver enkelt celletype. Højere renhed i den cellulære fænotype vil også sikre påvisning af ændringer i cellulær bane på grund af forskellige behandlinger.

Efter vellykket afledning af alle tre celletyper udleveres cellerne omhyggeligt i agarosesåkammeret for at muliggøre bundfældning af cellerne i de cirkulære udsparinger. Kritiske parametre omfatter opnåelse af homogen enkeltcellesuspension og forebyggelse af celleaggregater eller klumper, der kan forårsage variation i størrelsesfordelingen af hjertemikrovævene. Fra et overordnet strukturperspektiv er 3D-konstruktioner ofte begrænset af diffusion af næringsstoffer, og efterhånden som celletætheden stiger, øges konstruktionernes størrelse og tykkelse også lineært. Vævskonstruerede konstruktioner i form af sfæriske strukturer har en ensartet næringsstofforbrugshastighed på grund af isotrop diffusivitet og fast afstand fra kernen til overfladen30,31. Den endelige størrelse af mikrotissue dikterer koncentrationsgradienten af næringsstoffer og iltdiffusion til midten. I et statisk kultursystem kan konstruktioner over 350-400 μm føre til en nekrotisk cellekerne, når de dyrkes over længere perioder. Derfor bør der tages nøje hensyn til såningstætheden. En begrænsning af hjertemikrotissuemodellen er, at den ikke tillader kardiomyocytjustering, der tilbydes af metoder, der involverer geometrisk indeslutning af enkeltceller. Derfor forbliver kvantificering af parametre som sarkomerejustering eller længde begrænset på grund af tilfældig flerdimensionel cellulær samling. På trods af begrænsningen muliggør teknikken hurtig dosisafhængig vurdering af lægemiddel- eller småmolekyletoksiciteter på kardiovaskulære celler32. I en nylig undersøgelse anvendte vi 3D-mikrovæv sammensat af iPSC-CM'er til at modellere sekundær jernoverbelastningsinduceret kardiomyopati, og vi observerede en signifikant reduktion i mikrotissuestørrelse på grund af en høj koncentration af jernbehandling33.

Med hensyn til immunfarvning er det i modsætning til 2D-kulturer nødvendigt med længere permeabilisering og primær antistofinkubationsvarighed for at muliggøre diffusion af antistoffer gennem mikroproblemerne. Inkubationstiden for tilstrækkelig antistofindtrængning kan kræve yderligere optimering for mikrotiser større end ~ 400 μm i diameter. Et andet vigtigt aspekt er det længere blokeringstrin med serumproteiner for at reducere baggrundsfluorescens som følge af ikke-specifik binding. Typisk foretrækkes et blokerende serum, der indeholder høje IgG-niveauer, såsom gede- eller æselserum. For at opretholde den strukturelle integritet af hjertemikrotissuerne har vi ikke undersøgt for proteiner, der er involveret i specifikke celle-celle-interaktioner og deres vedligeholdelse i løbet af kulturperioden. Til cellulær fænotyping skal mikrotissuerne fordøjes over en kort periode for at sikre høj cellelevedygtighed og bevarelse af mål ekstracellulære antigener. En kombination af enzymatisk fordøjelse og mekanisk forstyrrelse med en bredboret pipettespids muliggør en effektiv og mild behandling af mikroproblemerne under fordøjelsesprocessen. Levedygtige enkeltceller af høj kvalitet opnået gennem denne hurtige fordøjelsesprotokol kan bruges til at belyse komplekse biologiske celle-celleinteraktioner ved hjælp af scRNA-seq34,35,36.

Ud over morfologisk og strukturel karakterisering er det vigtigt at vurdere hjertemikrovævets funktionelle egenskaber for at vurdere vævssamlingens effektivitet, toksicitet og sygdomstilstand in vitro. Kvantitativ analyse af vævskontraktion er en relevant parameter til vurdering af hjertefunktionen. Flere ikke-invasive videomikroskopiteknikker kombineret med bevægelsessporingsalgoritmer har muliggjort overvågning i realtid med et robust mål for hjertevævskontraktion forbundet med fænotypiske egenskaber. For at kvantificere ændringerne i fænotypen kan hjertemikrovævene opretholdes in vitro i op til 4 uger uden væsentlige ændringer i kontraktile parametre. De fleste softwarealgoritmer arbejder på principperne om optisk flow og vektorkortlægning, som er overlejret over optagne serier af videorammer11,37,38. Den optiske strømningsanalyse kan føre til påvisning af artefakter; Derfor bør brugeren undgå eller minimere utilsigtede omgivende forstyrrelser, der kan resultere i prøvebevægelse eller vibrationer, der overføres til mikroskopets stadium. Det skal bemærkes, at kontraktilitetsanalyserne muligvis ikke detekterer passive spændings- eller belastningseffekter på grund af mikrotissuernes suspenderede form i modsætning til mikrovæv, der dannes mellem fleksible stolper med foruddefineret stivhed. I begge tilfælde er det imidlertid vigtigt at bemærke, at sammentrækningsprofilerne for konstrueret hjertemuskelvæv ikke opnår sammentrækningskræfter genereret på organniveau. De vigtigste fordele ved billedbaserede assays er, at de er ikke-destruktive og tillader måling af akut og kronisk lægemiddeleksponering uden omfattende kalibrering. Disse værktøjer kan anvendes over en række 2D- og 3D-platforme til at måle ændringer i hjertekontraktilitet på grund af behandlinger eller underliggende genetiske sygdomme og til at evaluere vævsmodningsstrategier. Fremtidig undersøgelse af denne mikrotissuemodel kan indebære at kombinere elektrofysiologiske målinger, der muliggør samtidig registrering af calcium- eller spændingsfølsomme farvestoffer for at opnå flere uafhængige optagelser af hvert mikrotissue i et array på en høj gennemstrømningsmåde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. er medstifter af Khloris Biosciences, men har ingen konkurrerende interesser, da det arbejde, der præsenteres her, er helt uafhængigt. De andre forfattere rapporterer ingen konflikter.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Amanda Chase for hendes nyttige feedback på manuskriptet. Finansieringsstøtte blev ydet af Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) fra University of California, T29FT0380 (D.T.) og 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) og 17MERIT33610009 (J.C.W.); og National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 og NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 169 iPSC kardiomyocytter endotelceller fibroblaster mikrovæv selvmontering
Fremstilling af 3D-hjertemikrovævarrays ved hjælp af humane iPSC-afledte kardiomyocytter, hjertefibroblaster og endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter