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Bioengineering

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Abstract

A geração de cardiomiócitos humanos (CMs), fibroblastos cardíacos (CFs) e células endoteliais (CE) de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) proporcionou uma oportunidade única para estudar a interação complexa entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsionam o desenvolvimento de tecidos e doenças. Na área de modelos de tecido cardíaco, várias abordagens tridimensionais sofisticadas (3D) usam cardiomiócitos pluripotentes induzidos derivados de células-tronco (iPSC-CMs) para imitar relevância fisiológica e ambiente de tecido nativo com uma combinação de matrizes extracelulares e crosslinkers. No entanto, esses sistemas são complexos para fabricar sem experiência em microfabização e requerem várias semanas para se auto-montar. Mais importante, muitos desses sistemas não possuem células vasculares e fibroblastos cardíacos que compõem mais de 60% dos não-miócitos no coração humano. Aqui descrevemos a derivação de todos os três tipos de células cardíacas de iPSCs para fabricar microtissues cardíacas. Esta técnica de moldagem de réplica fácil permite a cultura de microtissue cardíaco em placas de cultura celular multi-bem padrão por várias semanas. A plataforma permite o controle definido pelo usuário sobre tamanhos de microtissue com base na densidade inicial de semeadura e requer menos de 3 dias para que a automontagem atinja contrações microtissuas cardíacas observáveis. Além disso, as microtissues cardíacas podem ser facilmente digeridas, mantendo alta viabilidade celular para interrogatório unicelular com o uso de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Imaginamos que este modelo in vitro de microtissues cardíacas ajudará a acelerar os estudos de validação na descoberta de medicamentos e modelagem de doenças.

Introduction

A descoberta de medicamentos e a modelagem de doenças no campo da pesquisa cardiovascular enfrentam diversos desafios devido à falta de amostras clinicamente relevantes e ferramentas translacionais inadequadas1. Modelos pré-clínicos altamente complexos ou supersimplificados em modelos de célula única in vitro não apresentam condições fisiocessiológicas de forma reprodutível. Portanto, várias plataformas miniaturizadas projetadas em tecido evoluíram para ajudar a preencher a lacuna, com o objetivo de alcançar um equilíbrio entre a facilidade de aplicação de forma de alta produtividade e a recapitulação fiel da função tecidual2,3. Com o advento da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), as ferramentas de engenharia de tecidos podem ser aplicadas a células específicas do paciente com ou sem estado de doenças cardiovasculares subjacentes para responder a perguntas de pesquisa4,5,6. Tais modelos de tecido projetado com composição celular semelhante ao tecido cardíaco poderiam ser utilizados em esforços de desenvolvimento de medicamentos para testar para cardiotoxicidade e disfunção induzida por alterações patológicas no comportamento de um ou vários tipos de células.

Microtissues auto-montados ou organoides derivados de iPSCs humanos são estruturas tridimensionais (3D) que são conjuntos em miniatura semelhantes a tecidos que exibem semelhanças funcionais com suas contrapartes in vivo. Existem várias abordagens diferentes que permitem a formação de organoides in situ via diferenciação direcionada de iPSCs ou através da formação de corpos embrióides4. Os organoides resultantes são uma ferramenta indispensável para estudar processos morfogenéticos que impulsionam a organogênese. No entanto, a presença de uma variedade de populações celulares e diferenças na auto-organização podem levar à variabilidade nos desfechos entre diferentes organoides5. Alternativamente, células pré-diferenciadas que são auto-montadas em microtissues com tipos de células específicas do tecido para estudar interações células locais são excelentes modelos, onde é viável isolar os componentes auto-montados. Particularmente em pesquisas cardíacas humanas, o desenvolvimento de microtissues cardíacas 3D com componentes multicelulares provou ser desafiador quando as células são derivadas de diferentes linhas de pacientes ou fontes comerciais.

Para melhorar nossa compreensão mecanicista dos comportamentos celulares em um modelo fisiologicamente relevante, personalizado e in vitro, idealmente todos os tipos de células componentes devem ser derivados da mesma linha de pacientes. No contexto de um coração humano, um modelo in vitro cardíaco verdadeiramente representativo capturaria o crosstalk entre tipos de células predominantes, ou seja, cardiomócitos (CMs), células endoteliais (CE) e fibroblastos cardíacos (CFs)6,7. A recapitulação fiel de um miocárdio não requer apenas alongamento biofísico e estimulação eletrofisiológica, mas também sinalização celular-célula que surge de tipos celulares de suporte como ECs e CFs8. Os CFs estão envolvidos na síntese da matriz extracelular e na manutenção da estrutura tecidual; e em estado patológico, os CFs podem induzir a fibrose e alterar a condução elétrica nos CMs9. Da mesma forma, as CE podem regular propriedades contratuais de CMs através de sinalização paracrina e fornecimento de demandas metabólicas vitais10. Portanto, há a necessidade de microtissues cardíacas humanas compostas por todos os três principais tipos de células para permitir que experimentos fisiologicamente relevantes de alta produtividade sejam realizados.

Aqui, descrevemos uma abordagem inferior na fabricação de microtissues cardíacas por derivação de cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs), células endoteliais derivadas do iPSC (iPSC-ECs) e fibroblastos cardíacos derivados do iPSC (iPSC-CFs) e sua cultura 3D em microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de gerar microtissues cardíacas espontaneamente pode ser utilizado para modelagem de doenças e testes rápidos de drogas para compreensão funcional e mecanicista da fisiologia cardíaca. Além disso, tais plataformas multicelulares de microtissue cardíacas poderiam ser exploradas com técnicas de edição de genomas para emular a progressão de doenças cardíacas ao longo do tempo sob condições crônicas ou agudas de cultura.

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Protocol

1. Meio, reagente, preparação de placas de cultura

  1. Solução de lavagem celular para cultura celular: Use 1x salina tamponada de fosfato (PBS) ou solução de sal balanceada Hanks (HBSS) sem cálcio ou magnésio.
  2. Mídia de diferenciação de cardiomiocócito
    1. Prepare a diferenciação Média #1 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 mais insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
    2. Prepare a diferenciação Média #2 adicionando suplemento de 10 mL (50x B27 menos insulina) a 500 mL de meio basal cardiomiócito (RPMI 1640).
    3. Prepare a purificação Média #3 adicionando suplemento (50x B27 mais insulina) a 500 mL cardiomiocócito meio basal (RPMI 1640) menos glicose.
  3. Os reagentes de classificação celular ativados por endoteliais e a triagem celular ativada por magnético (MACS)
    1. Prepare o meio de crescimento endotelial (EGM) com kit de suplemento de crescimento celular endotelial disponível comercialmente.
    2. Prepare a solução de tampão de separação celular diluindo a solução de estoque de gândia bovina (BSA) para 1:20 com solução de lavagem.
  4. Meio de diferenciação de fibroblasto cardíaco: Prepare o meio de diferenciação do fibroblasto cardíaco com meio basal fibroblasto (glicose dMEM-alta) e kit fatores de vida fibroblasto sem soro.
  5. Meio de fabricação e manutenção de microtissue cardíaca: Prepare o meio filtrado com meio basal cardiomiócito (RPMI 1640) com suplemento (50x B27 mais insulina) e EGM na proporção 70/30 v/v%.
  6. Pequenas moléculas e soluções de estoque de fatores de crescimento
    1. Para diferenciação dos três tipos de células, preparar 200 alíquotas μL do inibidor GSK3-beta CHIR 99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrila); Inibidor Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamida; e transformador fator de crescimento beta (TGF-β) inibidor SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) a 10 mM de concentração em sulfóxido de dimetila (DMSO).
    2. Para diferenciação iPSC-CE humana, prepare 100 μL aliquots de fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) (20 μg/mL), fator de crescimento endotelial vascular 165 (VEGF165; 50 μg/mL), e proteína morfogenética óssea 4 (BMP4; 20 μg/mL) em 0,1% (w/v) BSA em água ultrapurada. Armazene as alíquotas a -20 °C; para armazenamento a longo prazo, as alíquotas podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 ano.
  7. Placas de pré-revestimento para manutenção de iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs.
    1. Prepare a matriz de membrana do porão com placas de 6 poços revestidas de 6 poços para replacamento iPSC-CM diluindo o meio da matriz da membrana do porão (GFR) em DMEM/F12 em uma proporção de 1:200. Adicione 2 mL de matriz de membrana diluída ao meio de cada poço da placa de 6 poços e deixe-a definida por pelo menos 2 a 4 horas.
    2. Pré-reveste placa de 6-bem ou 10 cm prato com gelatina. Liquefate 2% solução de gelatina em um banho de água a 37 °C e prepare gelatina filtrada de 0,2% (v/v) em PBS em um volume apropriado, conforme necessário. Cubra a placa de cultura com 10 mL de gelatina de 0,2% por pelo menos 30 min a 37 °C antes de usar.
      NOTA: As placas de gelatina podem ser usadas tanto para iPSC-CFs quanto para iPSC-CEs após MACS.
  8. Fabricação de moldes microtissue: Prepare a solução de agarose de fusão 2% baixa em PBS em uma garrafa de vidro seca de 100 mL. Esterilize a agarose a 121 °C, 15 psi por 20 minutos antes de ser usada. Autoclave os micro-moldes de silicone de fundição a 121 °C, 15 psi por 15 min.
  9. Soluções para digestão, imunostaining e citometria de fluxo
    1. Para digestão de microtissue, prepare um tampão de digestão enzimática de Dispase I (1 U/mL) e Liberase (3 U/mL) em PBS. Mantenha esta solução no gelo.
    2. Para fixação celular e microtissue, use reagente de fixação comercialmente disponível no gelo contendo 4,2% de paraformaldeído (PFA).
    3. Prepare 0,25% Triton X-100 em PBS para permeabilização e 0,1% Tween-20 para lavagens. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente.
    4. Para análises de triagem celular ativada por fluorescência (FACS), prepare o tampão FACS [PBS ou HBSS com 2% de soro bovino fetal (FBS)] e armazene a 4 °C.
    5. Para imunostaining, prepare 2% de soro normal de cabra/burro/coelho na PBS. Escolha as espécies de soro com base no hospedeiro em que os anticorpos foram criados.

2. Diferenciação cardíaca e purificação

NOTA: Todos os iPSCs devem ser mantidos em ~75% a 80% de confluência antes da diferenciação do cardiomiócito. Os iPSCs utilizados para este protocolo foram derivados de células mononucleares periféricas (PBMCs) utilizando reprogramação do vírus Sendai realizada no Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.

  1. Antes da diferenciação, colônias de cultura iPSC até a passagem (P20).
  2. Remova o meio de cultura iPSC da placa de 6 poços e lave as células uma vez com PBS de 2 mL.
  3. No dia 0, inicie a indução de mesendoderm adicionando 2 mL de diferenciação Média #1 com CHIR (final de 6 μM) em cada poço. A concentração final pode variar entre 6 a 9 μM para diferentes linhas iPSC. Assim, recomenda-se testar diferentes concentrações de CHIR em uma placa de 6 poços para identificar a indução ideal de mesoderm cardíaco.
  4. No dia 2, recupere as células substituindo por um novo 2 mL Médio #1 em cada poço.
  5. No dia 3, substitua o meio em cada poço com 2 mL de diferenciação Média #1 com inibidor Wnt IWR-1-endo (5 μM) para induzir especificação de linhagem cardíaca.
  6. No dia 5, recupere as células substituindo o meio por um meio fresco de 2 mL médio #1 em cada poço.
  7. No dia 7, substitua o meio por 2 mL Médio #2 em cada poço. O espancamento espontâneo de cardiomiócitos pode ser observado já no dia 8-9. Para algumas linhas, as células de espancamento podem aparecer até o dia 11.
  8. Para purificação da cultura de diferenciação, substitua por 2 mL menos glicose Média #3 em cada poço no dia 10.
  9. No dia 13, recupere as células alterando o meio com 2 mL mais glicose Média #2 em cada poço.
  10. No dia 16, realize a segunda rodada de purificação com 2 mL de Medium #3 em cada poço.
  11. Recupere as células no dia 19 com 2 mL mais glicose Média #2.
  12. No dia 20, lave os poços uma vez com 1 mL PBS e dissocia as células usando 1 mL 10x Trypsin por 6 min a 37 °C. Após a incubação, as células são retiradas da superfície do poço em células únicas por menos de 15 s e adicionadas a tubo cônico de 15 mL com igual volume de Medium #2 para neutralizar a enzima. Centrifugar a suspensão celular por 3 min a 270 x g.
  13. Resuspense a pelota de célula em 3 mL Médio #3. Conte as células e adicione o volume apropriado de Medium #3 para emplacar um total de ~3 milhões de células em cada poço de uma nova matriz de membrana de porão com placa de 6 poços. No segundo dia após o replato, substitua o meio por um médio fresco de 2 mL médio #2 e reabasteça com 2 mL Médio #2 a cada dois dias até a experimentação de cardiomiócitos para congelamento ou experiências futuras.

3. Diferenciação celular endotelial e MACS

  1. A 75% a 80% de confluência iPSC, lave a placa com PBS, 2 mL por poço.
  2. Comece a diferenciação no dia 0 substituindo por 2 mL de diferenciação Médio #1 com 6 μM CHIR.
  3. No dia 2, substitua o meio por 2 mL de diferenciação Média #1 por 2 μM CHIR.
  4. No dia 4, substitua o médio por 2 mL de EGM complementado por 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 e 20 ng BMP4.
  5. Mude o médio com 2 mL de EGM complementado com fatores de crescimento a cada 2 dias do dia 6 ao dia 10. A adição do inibidor TGFβ (SB431542) na concentração de 8 μM é opcional para promover a expansão endotelial e suprimir a diferenciação de outros tipos de células de origem mesenquimal.
  6. No dia 12, inicie etapas para MACS enxaguando cada poço com 1 mL de PBS seguido de dissociação celular usando 1 mL de 10x Trypsin em cada poço de uma placa de 6 poços por 8 min a 37 °C.
  7. Prepare um volume igual de meio EGM em um tubo cônico de 50 mL para neutralizar a enzima de dissociação. Coloque um coador de células de 40 μm no tubo cônico de 50 mL e passe a suspensão celular dissociada através do coador. Troque o filtro para cada poço dissociado de 2 a 3.
  8. Enumerar as células viáveis totais usando 0,4% azul Tripano usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
  9. Pelota a suspensão da célula a 300 x g por 5 min em um conjunto de centrífuga pré-resfriada a 4 °C.
  10. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de célula em volume apropriado de tampão de classificação com base na contagem total da etapa 3.8.
    NOTA: Adicione 80 μL de tampão de classificação por 107 células totais.
  11. Para rotulagem de contas magnéticas, adicione 20 μL de reagente de bloqueio de FcR por 107 células e incubar por 5 minutos.
  12. Adicione 20 μL de Microesferas CD144 ou CD31 por 107 células e misture bem. Incubar a suspensão da célula no escuro a 4 °C por 15 min.
  13. Adicione 20 mL de tampão de classificação para lavar as células rotuladas e pelotar as células 300 x g por 5 min em um conjunto de centrífuga pré-resfriado a 4 °C.
  14. Resuspenda a pelota de célula em 3 mL de tampão de classificação e deixe-a no gelo.
  15. Prepare uma coluna de separação magnética colocando a coluna no entalhe separador.
  16. Equilibre a coluna enxaguando com 3 mL de tampão de classificação e colete o fluxo através de um tubo cônico de resíduos.
  17. Uma vez que o tampão de lavagem flua, resuspense a suspensão da célula completamente para quebrar qualquer aglomerado e aplicar a suspensão da célula na coluna.
  18. Depois que a suspensão da célula fluir, lave a coluna com 3 mL de tampão de classificação três vezes para remover quaisquer células não rotuladas.
  19. Remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo cônico de 15 mL para eluição celular CD144+/CD31+.
  20. Adicione 5 mL de tampão de classificação na coluna e lave imediatamente as células magneticamente rotuladas com o êmbolo.
  21. Determine o número de celular viável usando 0,4% azul Trypan usando um hemótmetro ou um contador de células automatizado.
  22. Centrifugar a suspensão celular em uma centrífuga pré-resfriada a 300 x g por 3 min.
  23. Resuspenja a pelota celular em volume apropriado de EGM com 5-8 μM de inibidor TGFβ (SB431542) com base na contagem total na etapa 3.21.
  24. Abo chapa esta passagem 0 (P0) células em uma densidade celular apropriada (4 x 104 células/cm2) em uma placa de gelatina pré-revestida de 0,2%.
  25. Para P0 e P1, continue reabastecendo o meio com EGM fresco a cada 2 dias com inibidor TGFβ. A partir de P2, as células podem ser cultivadas em meio de crescimento endotelial sem inibidor TGFβ.

4. Diferenciação do fibroblasto cardíaco

  1. Permitir que os iPSCs se tornem 90% a 95% confluentes; lavar cada poço com 1 mL PBS.
  2. Comece a diferenciação no dia 0 adicionando 2 mL de diferenciação Média #1 com 11 μM CHIR. Para linhas sensíveis do iPSC, a concentração pode variar entre 9-10 μM.
  3. No primeiro dia, observe a placa. É normal observar morte celular significativa com ~30% a 40% de células aderidas à placa.
  4. No dia 3, adicione 2 mL de diferenciação Médio #1 com 5 μM IWR-1-endo para promover a expansão de progenitores cardíacos.
  5. No dia 4, substitua o meio por 2 mL de meio de diferenciação de fibroblasto cardíaco. Substitua por meio fresco a cada 2 dias até o dia 16.
  6. No dia 18, desprendem as células usando 1 mL de 10x Trypsin em cada poço de uma placa de 6 poços por 10 min a 37 °C.
  7. Interrompa completamente a camada celular e passe a suspensão da célula através de um coador de células de 70 μm em um tubo cônico de 50 mL contendo igual volume de médio DMEM/F12 complementado com 5% de FBS.
  8. Determine o número de celular viável usando 0,4% azul Trypan usando um hemótmetro ou um contador de células automatizado.
  9. Centrifugar a suspensão da célula a 300 x g por 5 min para obter uma pelota.
  10. Para o primeiro replato, resuspenque a pelota celular em um volume apropriado de meio de diferenciação e placa em uma densidade celular (6 x 104 células/cm2) em uma placa revestida de gelatina de 0,2% até 90% de confluência.
  11. Divida a placa e mantenha os fibroblastos cardíacos em DMEM/F12 regulares com 10% de soro em placas revestidas de gelatina.

5. Fundição de moldes de microtissue cardíacos e semeadura celular

  1. Derreta a agarose em um micro-ondas em uma garrafa de vidro de 100 mL até ferver. Pulverize a garrafa de agarose e coloque-a no armário de biossegurança. Deixe a agarose esfriar por ~3 min.
  2. Pipeta 700 μL de agarose derretida em um micro-molde de silicone de 9 x 9 matriz. Evite gerar bolhas durante a pipetação.
  3. Coloque cuidadosamente o molde em um bloco de gelo pré-resfriado para acelerar a gárose.
  4. Certifique-se de que uma vez que a agarose é gelada, ela se torna translúcida. Dobre cuidadosamente as bordas do microfoto para soltar a réplica da ágarose. Em seguida, descasque suavemente a réplica de todos os lados para separar a réplica da ágarose do micro-molde de silicone.
  5. Transfira a bandeja de microtissue agarose contendo 81 recessos circulares (800 μm de diâmetro; 800 μm de profundidade) em uma placa estéril de 12 poços.
  6. Adicione 2 mL de PBS à bandeja de microtesue agarose e inspecione sob o microscópio para quaisquer bolhas presas ou poços de forma irregular.
  7. Submergir a bandeja de agarose em 2 mL 70% de etanol durante a noite, seguido pelo tratamento UV no gabinete de biossegurança por 1h.
  8. Antes de usar, retire o etanol de 70% e lave duas vezes com água destilada e uma lavagem final com PBS de 2 ml.
  9. Trypsinize, neutralize e conte iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs e coloque as suspensões celulares no gelo.
  10. Remova o PBS do poço e da câmara de semeadura celular cuidadosamente sem tocar nos recessos.
  11. Em um novo tubo, misture iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs na proporção 7:2:1, respectivamente, para alcançar uma densidade celular final de 106 células/mL. Maiores densidades celulares resultarão em microtissues maiores.
    NOTA: Não exceda 2 x 106 células/mL.
  12. Adicione cuidadosamente os 200 μL da suspensão da célula em gota na câmara de semeadura.
  13. Deixe as células se instalarem a 37 °C em uma incubadora de CO2 por 2h.
  14. Adicione meio de fabricação de microtissue ao redor do molde de agarose para cobrir apenas a superfície da câmara interna.
  15. Após 24 horas, as células se auto-montam e compactam significativamente nos recessos circulares. Substitua por meio fresco a cada 2 dias para manutenção.

6. Fixação e permeabilização de células e microtissues cardíacas para imunossuagem

  1. Para cada tipo de célula individual, cultue as células separadamente em lâminas de câmara revestidas de membrana do porão ou lâminas de câmara revestidas de gelatina (aproximadamente 2,5-3 x 105 células/mL). Microtissues cardíacas podem ser coletadas em tubo cônico de 15 mL, expulsando-as suavemente dos recessos circulares.
  2. Aspirar o meio e enxaguar as células ou microtissues com 1 mL PBS; depois disso, fixe com o tampão de fixação contendo 4,2% pfa para 20 min para os slides da câmara e 1h para microtissues à temperatura ambiente.
  3. Aspire o PFA e adicione 1 mL de solução permeabilizante (0,25% Triton X-100 em PBS) por 5 a 7 min para lâminas de câmara e 20 min para microtissues em tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: A partir deste passo em diante, as amostras podem ser suavemente balançadas em uma plataforma de balanço de bancada.
  4. Aspire a solução de permeabilização e enxágue uma vez com 2 a 3 mL de PBS.
  5. Incubar as células com 500-1.000 μL de solução de bloqueio (soro de cabra ou soro de burro normal de 2% a 5% normal) por pelo menos 1h para os slides da câmara e 3 a 4 horas para os microtissues.
  6. Incubar as células ou microtissues cardíacas com anticorpos conjugados preparados na solução de bloqueio suficiente para cobrir a amostra. Incubar com troponina anti-cardíaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) e anti-DDR2/Vimentina (1:50) para 1h para os slides da câmara e durante a noite a 4 °C para microtissues cardíacas.
  7. Lave os slides da câmara três vezes com 500 μL 0,1% Tween-20 por 5 minutos entre cada lavagem e uma lavagem final com PBS.
  8. Para os microtissues cardíacos, lave com 2 mL 0,1% Tween-20 cinco vezes com 20 minutos de duração entre cada lavagem. Faça uma etapa final de lavagem por mais 20 minutos.
  9. Incubar as células ou microtissues com 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 μg/mL) antes da microscopia confocal.
  10. Para microtissues cardíacas, transfira cuidadosamente para uma placa de fundo de vidro de 35 mm e adicione PBS para submergir microtissues.
  11. Para imagens 3D, o uso de um objetivo de imersão de óleo de 20x ou 40x ganha foco central do microtissue e ajusta parâmetros de exposição para cada fluoróforo.
  12. Para obter uma pilha Z, defina as primeiras e últimas coordenadas no modo Live com uma profundidade total de imagem de 100-200 μm com intervalo de fatia de 5-10 μm.

7. Digestão de microtissues cardíacas e preparação de células para citometria de fluxo

  1. Para digerir microtissues, lave suavemente os microtissues com o Medium #1 dos recessos circulares usando uma ponta de pipeta de 1 mL larga em um tubo cônico de 15 mL.
  2. Permita que os microtissues se assentam e aspirem o meio cuidadosamente e enxágue as células ou microtissues com PBS de 1 mL e adicione 200-300 μL de tampão de digestão enzimática por 20 min a 37 °C. Em 10 min, misture os microtissues suavemente por 1 min e incubar novamente a 37 °C pelo resto do tempo.
  3. Após a incubação, use uma dica regular de pipeta de 1 mL para misturar os microtissues vigorosamente para obter uma suspensão de célula turva.
  4. Uma vez que as microtissues sejam suficientemente digeridas em células únicas, neutralize imediatamente a suspensão celular com 5 mL de meio contendo 5% de FBS e coe a suspensão celular através de um coador de células de 40 μm. Conte o número total de células e centrifugar a suspensão de célula única a 300 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Aspire as células de liga de anexo supernante e resuspend 1 x 105-1 x 106 em tampão de ligação de anexo de 100 μL com anexo FITC V e 100 μg/mL de iodida (PI) ou corante de exclusão celular morta To-Pro3 por 10 minutos no gelo.
  6. Após a incubação, adicione 300 μL do tampão de ligação de anexo à suspensão da célula e transfira para um tubo FACS de fundo redondo para análise de citometria de fluxo. Use os lasers corretos e filtros de emissão para os fluoroforos selecionados.
  7. Para quantificação de marcadores de superfície celular utilizando células fixas, realize a fixação e permeabilização da pelota celular conforme descrito nas etapas 6.2 e 6.3.
  8. Após a permeabilização, enxágue a pelota celular e incuba as células com os respectivos anticorpos conjugados por 1h. Lave a pelota celular em tampão FACS de 4 mL (2% FBS em PBS) e centrífuga a 300 x g por 3 min. Repita o passo de lavagem duas vezes.
  9. Resuspend as células em 200-300 μL FACS buffer para análise de citometria de fluxo.
  10. Ajuste as propriedades de dispersão dianteira e lateral com uma amostra não manchada e considere usar um controle isótipo para cada fluoróforo para ajustar as tensões a laser. Colete um mínimo de 20.000 eventos para análise de dados.

8. Realizando análises de contração de microtissues cardíacas que batem espontaneamente

  1. Grave vídeos de microtissues cardíacas para capturar pelo menos três batidas. Defina a resolução de gravação para pelo menos 1280 x 720 pixels à taxa de quadros >30 quadros por segundo e salve o vídeo em . Formato AVI.
  2. Execute o script MotionGUI11 em um ambiente MATLAB para iniciar a interface do usuário.
  3. Encontre o. Localização do arquivo AVI em sua pasta para carregar o vídeo. Em seguida, digite a taxa de quadros em que o vídeo foi capturado no painel De entrada.
  4. No painel de entrada avançado, um tamanho de pixel pode ser especificado com base na resolução e na ampliação da captura.
  5. Um tamanho de pixel de macrobloco adequado pode ser especificado (padrão 16) e um movimento de pixel detectável dependendo da força da contração de microtissue.
  6. Depois de ajustar os parâmetros, clique em Obter vetores de movimento para iniciar a análise.
  7. Selecione uma região de interesse com o botão de rádio Choose AOI para excluir áreas ao redor do microtissue único no recesso circular.
  8. Use a função Map Time Ave para gerar um mapa de calor de contração média baseado no movimento detectado em eixos X e Y.
  9. Para dados de rastreamento de pico, use a função Obter Dados de Contração para medir automaticamente os picos de contração e relaxamento.
  10. No caso de uma baixa relação sinal-ruído, aplique um limiar de altura e distância de pico para anotar corretamente a velocidade máxima de contração (ponto azul) e velocidade máxima de relaxamento (triângulo vermelho).
  11. Depois de definir os limites corretos, selecione Analisar picos para obter os valores de contração e relaxamento com taxa de batida e intervalo de batida.
  12. Obter medições de um mínimo de 25 microtissues individuais para análises estatísticas.

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Representative Results

Caracterização de icometria e citometria de fluxo de CMs, CEs e CFs derivados do iPSC
Para gerar microtissues cardíacas compostas por iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs, todos os três tipos de células são diferenciados e caracterizados individualmente. A diferenciação in vitro de iPSCs para iPSC-CMs melhorou nos últimos anos. No entanto, o rendimento e a pureza dos iPSC-CMs diferem de linha para linha. O protocolo atual produz mais de 75% de iPSC-CMs puros que começam a bater espontaneamente por volta do dia 9 (Figura 1A). Outras etapas de purificação do dia 9 ao dia 14 podem melhorar a pureza do iPSC-CM para mais de 80% como descrito anteriormente12. Da mesma forma, iPSC-CEs de alta pureza podem ser gerados usando protocolos publicados anteriormente13,14 que incluem a adição de vários fatores de crescimento vascular que polarizam progenitores endoteliais decorrentes do mesoderme por volta dos dias 4-5 (Figura 1B) para formar iPSC-CE fenotipicamente bem definidos. IPSC-CFs são uma população altamente heterogrógena com base em sua localização e são caracterizados com base em sua morfologia e expressão de proteínas de matriz extracelular. Aqui, utilizando protocolos publicados15,16,17 com modificações, os iPSC-CFs humanos são obtidos a partir de células progenitoras de mesoderme cardíaco (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Cronograma de diferenciação. Cronograma global de (A) iPSC-CM, (B) iPSC-CE e (C) linha do tempo de diferenciação iPSC-CF com imagens representativas de contraste de fase das células após etapas de diferenciação e purificação. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A pureza dos iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs foram determinadas por imunostaining e citometria de fluxo utilizando cTnT2, molécula de adesão celular endotelial plaquetária (PECAM1/CD31) e vimentina (VIM), respectivamente (Figura 2A). A análise quantitativa mostrou uma população purificada contendo mais de 90% de células cTnT2 no dia 20. IPSC-CEs obtidos no dia 12 após macs usando contas CD31 foram identificados com imunostaining contra PECAM1/CD31 marcador de superfície celular endotelial. MacS produziu células endoteliais altamente puras, como evidenciado por mais de 95% das células CD31+ em P0. No entanto, deve-se notar que a pureza das células endoteliais diminuiu com maior número de passagens devido à deseferimento. Da mesma forma, no dia 20, análises de citometria de fluxo revelaram que mais de 95% dos iPSC-CFs expressaram o marcador de fibroblasto VIM (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Caracterização da imunofluorescência e citometria de fluxo. (A) [Painel da esquerda para direita] iPSC-CMs no dia 25 manchados com cTnT2 (ciano), iPSC-ECs manchados com PECAM1/CD31 (verde), iPSC-CFs manchados com VIM (vermelho) e núcleos manchados com DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. (B) [Painel da esquerda para a direita] A quantificação da citometria de fluxo mostrou alta pureza percentual de iPSC-CMs (91,8%), iPSC-CEs (98,1%) e iPSC-CFs (96,7%) após diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fabricação de culturas microtissue cardíacas e análises de tamanho
As suspensões de células únicas de iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs foram misturadas na proporção 7:2:1 e cuidadosamente dispensadas na câmara de semeadura celular do molde de réplica de agarose esterilizada (Figura 3A,B). As células se estabeleceram uniformemente dentro dos recessos circulares em 2 h. Por volta do dia 3, as células auto-montadas se organizam em microtissues cardíacas de tamanho uniforme (Figura 3C). Matrizes de microtissues de diferentes tamanhos podem ser fabricadas afinando a densidade celular final (Figura 3D,E). Microtissues cardíacas fabricados com uma densidade celular final de 1 x 106 células/mL tem ~300-350 μm de diâmetro, 2 x 106 células/mL tem ~600 μm de diâmetro, e 4 x 106 células/mL tem mais de 800 μm de diâmetro. O conjunto de microtissue foi obtido com uma densidade celular de 1 x 106 células/mL, que é tipicamente usado para experimentos. Essas culturas microtissue podem ser mantidas na cultura por até 6 semanas.

Figure 3
Figura 3: Técnica de moldagem de réplica para gerar microtissues cardíacas multicelulares. (A) Réplica de bandejas de microwell agarose moldadas de (B) iPSC-CM, iPSC-EC e misturas iPSC-CF capturadas dentro dos microwells para auto-montagem. Barra de escala 500 = μm. (C) Micrografo mostrando compactação de microtissues cardíacas no dia 3. Barra de escala = 500 μm. (D) Tamanhos de microtissue cardíaco formados mostram uma relação linear com as densidades iniciais de semeadura, com maiores densidades celulares resultando em microtissues maiores. (E) Uma figura representativa mostrando os microtissues cardíacos auto-montados na matriz de microwell. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imunostaining e viabilidade após digestão enzimática
A coloração da imunofluorescência do dia 12 pós-fabricação usando anticorpos contra cTnT2 para iPSC-CMs, CD31 para iPSC-ECs e DDR2 para iPSC-CFs revelou uma distribuição celular única em microtissues cardíacas. IPSC-CMs, o mais pesado dos três tipos de células, ocuparam o centro, enquanto os iPSC-CE foram intercalados em todas as microtissues, e os iPSC-CFs foram observados para ocupar predominantemente a periferia (Figura 4A). A digestão curta e rápida das microtissues alcançadas usando Dispase I e Liberase TL resultou em proporção celular altamente viável (Figura 4B, painel superior) com menos de 5% de células apoptóticas após 2 semanas de cultura. Isso foi seguido por uma breve exposição de 1 h de microtissues cardíacas a uma alta concentração (5 μM) de Doxorubicina, uma droga quimioterápica que é conhecida por induzir cardiotoxicidade dependente de dose (Figura 4B, painel inferior).

Figure 4
Figura 4: Imunostaining de microtissues cardíacas e avaliação da viabilidade celular. (A) Imagens confocal z-stack de microtissue cardíaca humana manchadas para iPSC-CMs (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CFs (DDR2) e núcleos manchados com (DAPI). Barra de escala = 200 μm. (B) Parcelas de citometria de fluxo de microtissues cardíacas enzimáticas digeridas em suspensão celular única e manchadas com anexo V (marcador apoptótico) e corante de exclusão celular morta (To-Pro3). A suspensão celular única digerida mostrou uma alta viabilidade celular (91%) com <5% de população celular apoptótica (painel superior), em comparação com a suspensão de célula única tratada com uma droga quimioterápico indutora de apoptose, Doxorubicina, para 1 h a 5 μM de concentração (painel inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de contrailidade computacional
As análises de contratilidade de microtissues cardíacas individuais podem ser realizadas com a ajuda de uma ferramenta de análise de imagem baseada em MATLAB. Gravações de vídeo de microtissues cardíacas que batiam espontaneamente foram obtidas a 30 fps para análise. Como descrito anteriormente11, o método de correspondência de blocos emprega algoritmo de rastreamento de movimento para capturar o movimento de um bloco de pixels para os quadros totais adquiridos como uma série de vetores de movimento. A contratilidade dos microtissues e o movimento dos vetores geram um pseudo heatmap que ilustra o perfil de contração média ou média através do microtissue (Figura 5A). O movimento contractile das microtissues cardíacas gera picos positivos que são medidos como velocidade de contração (círculo azul), velocidade de relaxamento (triângulo vermelho) e taxa de batida, o último dos quais é calculado como o tempo entre dois ciclos de contração (Figura 5B). Além disso, a contratilidade das microtissues cardíacas não muda significativamente ao longo de 4 semanas na cultura (Figura 5C).

Figure 5
Figura 5: Análise de contração de microtissues cardíacas. (A) Imagem de contraste de fase e mapa de contração de microtissues cardíacas 1 semana após a fabricação. Barra de escala = 200 μm. (B) Microtissues cardíacas apresentam perfis regulares de contração e relaxamento e taxas de batida. Tabela mostra valores representativos de taxa de batida, contração máxima e velocidades de relaxamento. (C) A cultura de longo prazo dos microtissues cardíacos por até 4 semanas não influencia significativamente os parâmetros de contratilidade (n = 20/grupo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Para gerar microtissues cardíacas a partir de iPSC-CMs pré-diferenciados, iPSC-CEs e iPSC-CFs, é essencial obter uma cultura altamente pura para um melhor controle dos números celulares após a compactação celular inibida pelo contato dentro das microtissues cardíacas. Recentemente, Giacomelli et. al.18 demonstraram a fabricação de microtissues cardíacas utilizando iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs. As microtissues cardíacas geradas usando o método descrito consistem em ~5.000 células (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-CEs e 15% iPSC-CFs). Neste método, tanto cardiomiócitos quanto células endoteliais foram co-diferenciados seguidos pela separação de progenitores endoteliais utilizando marcador CD34+. O protocolo atual descrito aqui consiste em 12.000 células (70% iPSC-CMs, 20% iPSC-CEs e 10% iPSC-CFs) por microtissue, o que produz maior número de células por construção para análises de células a jusante. Além disso, uma vez que todos os três tipos de células são diferenciados separadamente, há heterogeneidade limitada em populações celulares que é única para entender respostas específicas das células aos tratamentos.

Para a diferenciação do cardiomiócito, nós e outros já demonstramos anteriormente a derivação de cardiomiócitos puros utilizando condições culturais quimicamente definidas12,19,20. Resumidamente, a diferenciação começa com a indução de mesendoderm, seguida pela modulação da sinalização Wnt/β-catenin que promove a especificação de linhagem cardíaca. A purificação adicional dos cardiomiócitos em um meio privado de glicose permite a eliminação de não cardiomócitos. Aqui, é importante notar que a cultura prolongada no meio de purificação pode dificultar a qualidade dos cardiomiócitos. Um protocolo publicado recentemente mostra que a capacidade proliferativa de cardiomiócitos em estágio inicial pode ser aproveitada para obter um grande número de células. A expansão dos iPSC-CMs humanos é induzida com a reintrodução do CHIR, um mitogênio potente durante a fase proliferativa inicial21. Embora o mecanismo molecular preciso ainda seja desconhecido, essa técnica pode melhorar significativamente o rendimento do iPSC-CM em dez vezes ou cem vezes. Além disso, para melhorar a fidelidade dos iPSC-CMs para modelagem de doenças, eles podem ser cultivados em meio de maturação para melhorar a maturação eletrofisiológica, mecânica e estrutural22. Uma visão geral completa das técnicas de maturação iPSC-CM é revisada em outros lugares23.

Células endoteliais vasculares foram geradas a partir de células-tronco pluripotentes com diferentes eficiências variáveis de purificação13,24,25. O protocolo atual fornece alta eficiência de diferenciação e seleção de iPSC-CE fenotipicamente estáveis com MACS26. A metodologia de diferenciação para gerar fibroblastos cardíacos funcionais segue a modulação da sinalização do fator de crescimento da via Wnt e do fibroblasto (FGF) para gerar iPSC-CFs17. In vivo Os CFs são originários de progenitores de epicárdio, endocárdio e crista neural16,27,28,29. Aqui, a linhagem CF é gerada a partir de progenitores cardíacos mesodérmicos comprometidos sem gerar células epicardiais como intermediários. No geral, os protocolos descritos aqui para gerar iPSC-CMs, iPSC-CEs e iPSC-CFs levam em conta a facilidade de reprodutibilidade e alta pureza com base em características fenotípicas. Para obter microtissues de alta qualidade, é importante obter > 90% de pureza para cada tipo de célula individual. Maior pureza no fenótipo celular também garantirá a detecção de alterações na trajetória celular devido a diferentes tratamentos.

Após a derivação bem sucedida dos três tipos de células, as células são cuidadosamente dispensadas na câmara de semeadura agarose para permitir a fixação das células nos recessos circulares. Parâmetros críticos incluem alcançar suspensão celular única homogênea e prevenir agregados celulares ou aglomerados que possam causar variabilidade na distribuição de tamanho dos microtissues cardíacos. Do ponto de vista geral da estrutura, os construtos 3D são muitas vezes limitados pela difusão de nutrientes, e à medida que a densidade celular aumenta, o tamanho e a espessura dos construtos também aumentam linearmente. Construções de tecido projetada na forma de estruturas esféricas têm uma taxa uniforme de consumo de nutrientes devido à difusividade isotrópica e distância fixa do núcleo até a superfície30,31. O tamanho final do microtissue dita o gradiente de concentração de nutrientes e difusão de oxigênio para o centro. Em um sistema de cultura estática, construções acima de 350-400 μm podem levar a um núcleo celular necrosado quando cultivados por períodos mais longos de tempo. Por isso, deve-se considerar cuidadosamente a densidade de semeadura. Uma limitação do modelo microtissue cardíaco é que ele não permite o alinhamento do cardiomiócito oferecido por metodologias que envolvem o confinamento geométrico de células únicas. Assim, a quantificação de parâmetros como alinhamento ou comprimento de sarcomere permanece limitada devido ao conjunto celular multidimensional aleatório. Apesar da limitação, a técnica permite uma rápida avaliação dependente de doses de toxicidades de drogas ou pequenas moléculas em células cardiovasculares32. Em um estudo recente, empregamos microtissues 3D compostas de iPSC-CMs para modelar cardiomiopatia induzida por sobrecarga de ferro secundária, e observamos uma redução significativa no tamanho dos microtissue devido a uma alta concentração de tratamento de ferro33.

No que diz respeito à imunostenção, ao contrário das culturas 2D, é necessária maior permeabilização e maior duração da incubação de anticorpos para permitir a difusão de anticorpos em todas as microtissues. O tempo de incubação para penetração adequada de anticorpos pode exigir maior otimização para microtissues maiores que ~400 μm de diâmetro. Outro aspecto importante é a etapa de bloqueio mais longa com proteínas séricos para reduzir a fluorescência de fundo resultante de ligação não específica. Normalmente, é preferido um soro de bloqueio contendo altos níveis de IgG, como soro de cabra ou burro. Para manter a integridade estrutural dos microtissues cardíacos, não sondamos proteínas envolvidas em interações células-células específicas e sua manutenção durante o período de cultura. Para fenotipagem celular, as microtissues devem ser digeridas por um curto período de tempo para garantir alta viabilidade celular e preservação de antígenos extracelulares alvo. Uma combinação de digestão enzimática e interrupção mecânica com uma ponta de pipeta larga permite um tratamento eficiente e leve das microtissues durante o processo de digestão. Células únicas viáveis de alta qualidade obtidas através deste protocolo de digestão rápida podem ser usadas para elucidar interações células biológicas complexas com a ajuda de scRNA-seq34,35,36.

Além da caracterização morfológica e estrutural, é importante avaliar as propriedades funcionais dos microtissues cardíacos para avaliar a eficácia, toxicidade e estado da doença do conjunto tecidual in vitro. A análise quantitativa da contração tecidual é um parâmetro relevante para avaliar a função cardíaca. Várias técnicas não invasivas de microscopia de vídeo combinadas com algoritmos de rastreamento de movimento permitiram o monitoramento em tempo real com uma medida robusta de contração do tecido cardíaco ligada a características fenotípicas. Para quantificar as alterações no fenótipo, as microtissues cardíacas podem ser mantidas in vitro por até 4 semanas sem alterações significativas nos parâmetros contratuais. A maioria dos algoritmos de software trabalha nos princípios do fluxo óptico e mapeamento vetorial, que são sobrepostos sobre séries capturadas de quadros de vídeo11,37,38. A análise do fluxo óptico pode levar à detecção de artefatos; portanto, o usuário deve evitar ou minimizar distúrbios ao redor inadvertidos que possam resultar em movimento amostral ou vibrações transmitidas ao estágio do microscópio. Deve-se notar que as análises de contratilidade não podem detectar tensões passivas ou efeitos de carregamento devido à forma suspensa das microtissues, em contraste com microtissues formadas entre postos flexíveis de rigidez pré-definida. No entanto, em ambos os casos, é importante notar que os perfis de contração dos tecidos musculares cardíacos projetados não alcançam forças de contração geradas a nível de órgão. As principais vantagens dos ensaios baseados em imagens são que eles não são destrutivos e permitem a medição da exposição aguda e crônica de drogas sem calibração extensiva. Essas ferramentas podem ser aplicadas ao longo de uma variedade de plataformas 2D e 3D para medir alterações na contralidade cardíaca devido a tratamentos ou doenças genéticas subjacentes, e para avaliar estratégias de maturação tecidual. A investigação futura deste modelo microtissue pode envolver a combinação de medidas eletrofisiológicas que permitirão o registro simultâneo de corantes sensíveis a cálcio ou tensão para obter múltiplas gravações independentes de cada microtissue em uma matriz de alto rendimento.

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Disclosures

J.C.W. é co-fundador da Khloris Biosciences, mas não tem interesses concorrentes, pois o trabalho aqui apresentado é completamente independente. Os outros autores não relatam conflitos.

Acknowledgments

Agradecemos à Dra. O apoio ao financiamento foi fornecido pelo Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco (TRDRP) da Universidade da Califórnia, T29FT0380 (D.T.) e 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) e 17MERIT33610009 (J.C.W.); e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 e NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

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References

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Bioengenharia Edição 169 iPSC cardiomiócitos células endoteliais fibroblastos microtissues auto-montagem
Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais
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Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

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