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Bioengineering

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Abstract

La generación de cardiomiocitos humanos (CM), fibroblastos cardíacos (CF) y células endoteliales (CE) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha brindado una oportunidad única para estudiar la compleja interacción entre diferentes tipos de células cardiovasculares que impulsa el desarrollo de tejidos y la enfermedad. En el área de los modelos de tejido cardíaco, varios enfoques tridimensionales sofisticados (3D) utilizan cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CM) para imitar la relevancia fisiológica y el entorno del tejido nativo con una combinación de matrices extracelulares y reticulantes. Sin embargo, estos sistemas son complejos de fabricar sin experiencia en microfabricación y requieren varias semanas para autoensamblarse. Lo más importante es que muchos de estos sistemas carecen de células vasculares y fibroblastos cardíacos que constituyen más del 60% de los no miocitos en el corazón humano. Aquí describimos la derivación de los tres tipos de células cardíacas a partir de iPSC para fabricar microtejidos cardíacos. Esta técnica de moldeo de réplica fácil permite el cultivo de microtinue cardíaco en placas de cultivo celular estándar de múltiples pocillos durante varias semanas. La plataforma permite el control definido por el usuario sobre los tamaños de microtejidos en función de la densidad de siembra inicial y requiere menos de 3 días para que el autoensamblaje logre contracciones observables de microtejidos cardíacos. Además, los microtejidos cardíacos se pueden digerir fácilmente mientras se mantiene una alta viabilidad celular para el interrogatorio de una sola célula con el uso de citometría de flujo y secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Prevemos que este modelo in vitro de microtejidos cardíacos ayudará a acelerar los estudios de validación en el descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades.

Introduction

El descubrimiento de fármacos y el modelado de enfermedades en el campo de la investigación cardiovascular se enfrentan a varios desafíos debido a la falta de muestras clínicamente relevantes y a herramientas traslacionales inadecuadas1. Los modelos preclínicos altamente complejos o los modelos unicelulares in vitro demasiado simplificados no presentan condiciones fisiopatológicas de manera reproducible. Por lo tanto, varias plataformas miniaturizadas de ingeniería tisular han evolucionado para ayudar a cerrar la brecha, con el objetivo de lograr un equilibrio entre la facilidad de aplicación de una manera de alto rendimiento y la recapitulación fiel de la función tisular2,3. Con el advenimiento de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), las herramientas de ingeniería de tejidos se pueden aplicar a células específicas del paciente con o sin estado de enfermedad cardiovascular subyacente para responder a las preguntas de investigación4,5,6. Tales modelos de ingeniería tisular con composición celular similar al tejido cardíaco podrían utilizarse en los esfuerzos de desarrollo de fármacos para probar la cardiotoxicidad y la disfunción inducidas por cambios patológicos en el comportamiento de uno o varios tipos de células.

Los microtejidos u organoides autoensamblados derivados de iPSCs humanas son estructuras tridimensionales (3D) que son ensamblajes en miniatura similares a tejidos que exhiben similitudes funcionales con sus contrapartes in vivo . Existen varios enfoques diferentes que permiten la formación de organoides in situ a través de la diferenciación dirigida de iPSCs o a través de la formación de cuerpos embrionarios4. Los organoides resultantes son una herramienta indispensable para estudiar los procesos morfogenéticos que impulsan la organogénesis. Sin embargo, la presencia de una variedad de poblaciones celulares y las diferencias en la autoorganización pueden conducir a la variabilidad en los resultados entre diferentes organoides5. Alternativamente, las células prediferenciadas que se autoensamblan en microtisajes con tipos de células específicas de tejidos para estudiar las interacciones célula-célula locales son excelentes modelos, donde es factible aislar los componentes autoensamblados. Particularmente en la investigación cardíaca humana, el desarrollo de microtejidos cardíacos 3D con componentes multicelulares ha demostrado ser un desafío cuando las células se derivan de diferentes líneas de pacientes o fuentes comerciales.

Para mejorar nuestra comprensión mecanicista de los comportamientos celulares en un modelo in vitro fisiológicamente relevante, personalizado, idealmente todos los tipos de células componentes deben derivarse de la misma línea de pacientes. En el contexto de un corazón humano, un modelo cardíaco in vitro verdaderamente representativo capturaría la diafonía entre los tipos de células predominantes, a saber, cardiomiocitos (CM), células endoteliales (CE) y fibroblastos cardíacos (CEF)6,7. La recapitulación fiel de un miocardio no solo requiere estiramiento biofísico y estimulación electrofisiológica, sino también señalización célula-célula que surge del soporte de tipos celulares como las CE y las CEF8. Los CF están involucrados en la síntesis de la matriz extracelular y el mantenimiento de la estructura del tejido; y en estado patológico, los CF pueden inducir fibrosis y alterar la conducción eléctrica en los CM9. Del mismo modo, las CE pueden regular las propiedades contráctiles de los CM a través de la señalización paracrina y el suministro de demandas metabólicas vitales10. Por lo tanto, existe la necesidad de microtejidos cardíacos humanos compuestos por los tres tipos principales de células para permitir que se realicen experimentos de alto rendimiento fisiológicamente relevantes.

Aquí, describimos un enfoque de abajo hacia arriba en la fabricación de microtejidos cardíacos mediante la derivación de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (iPSC-CM), células endoteliales derivadas de iPSC (iPSC-EC) y fibroblastos cardíacos derivados de iPSC (iPSC-CFs) y su cultivo 3D en matrices de microtissue cardíacos uniformes. Este método fácil de generar microtejidos cardíacos que laten espontáneamente se puede utilizar para el modelado de enfermedades y pruebas rápidas de medicamentos para la comprensión funcional y mecanicista de la fisiología del corazón. Además, tales plataformas de microtejidos cardíacos multicelulares podrían explotarse con técnicas de edición del genoma para emular la progresión de la enfermedad cardíaca a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo crónicas o agudas.

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Protocol

1. Medio, reactivo, preparación de placas de cultivo

  1. Solución de lavado celular para cultivo celular: Use solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio ni magnesio.
  2. Medios de diferenciación cardiomiocitaria
    1. Prepare el medio de diferenciación # 1 agregando un suplemento de 10 ml (50x B27 más insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640).
    2. Prepare el medio de diferenciación # 2 agregando un suplemento de 10 ml (50x B27 menos insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640).
    3. Prepare el medio de purificación # 3 agregando suplemento (50x B27 más insulina) a 500 ml de medio basal de cardiomiocitos (RPMI 1640) menos glucosa.
  3. Medios de crecimiento endotelial y reactivos de clasificación celular activados magnéticamente (MACS)
    1. Prepare el medio de crecimiento endotelial (EGM) con el kit de suplemento de medio de crecimiento de células endoteliales disponible comercialmente.
    2. Prepare la solución tampón de clasificación por separación celular diluyendo la solución madre de albúmina sérica bovina (BSA) a 1:20 con solución de enjuague.
  4. Medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos: Prepare el medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos con medio basal de fibroblastos (DMEM-glucosa alta) y el kit de factores de vida de fibroblastos sin suero.
  5. Medio de fabricación y mantenimiento de microtintas cardíacas: Preparar medio filtrado con medio basal cardiomiocítico (RPMI 1640) con suplemento (50x B27 más insulina) y EGM en proporción 70/30 v/v%.
  6. Soluciones de stock de moléculas pequeñas y factores de crecimiento
    1. Para la diferenciación de los tres tipos de células, preparar 200 μL de alícuotas de inhibidor de GSK3-beta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridinacarbonitrilo); Inhibidor de Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinil-benzamida; e inhibidor del factor de crecimiento transformador beta (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-il)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) a una concentración de 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).
    2. Para la diferenciación iPSC-EC humana, preparar alícuotas de 100 μL de factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) (20 μg/mL), factor de crecimiento endotelial vascular 165 (VEGF165; 50 μg/mL) y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4; 20 μg/mL) en BSA al 0,1% (p/v) en agua destilada ultrapura. Conservar las alícuotas a -20 °C; para el almacenamiento a largo plazo, las alícuotas se pueden almacenar a -80 °C durante un máximo de 1 año.
  7. Placas de pre-recubrimiento para el mantenimiento de iPSC-CMs, iPSC-ECs e iPSC-CFs.
    1. Prepare placas de 6 pocillos recubiertas de medio de matriz de membrana basal para el rechapado de iPSC-CM diluyendo el medio de matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido (GFR) en DMEM / F12 en una proporción de 1: 200. Agregue 2 ml de medio de matriz de membrana basal diluida a cada pocillo de la placa de 6 pocillos y déjelo reposar durante al menos 2 a 4 h.
    2. Cubra previamente el plato de 6 pocillos o el plato de 10 cm con gelatina. Licuar la solución de gelatina al 2% en un baño de agua a 37 °C y preparar gelatina filtrada al 0,2% (v/v) en PBS en un volumen apropiado según sea necesario. Cubra la placa de cultivo con 10 ml de gelatina al 0,2% durante al menos 30 min a 37 °C antes de su uso.
      NOTA: Las placas de gelatina se pueden utilizar tanto para iPSC-CFs como para iPSC-ECs después de MACS.
  8. Fabricación de moldes microtisulares: Preparar solución de agarosa de baja fusión al 2% en PBS en una botella de vidrio seca de 100 ml. Esterilizar la agarosa a 121 °C, 15 psi durante 20 min antes de su uso. Autoclave los micromoldes de silicona de fundición a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
  9. Soluciones para digestión, inmunotinción y citometría de flujo
    1. Para la digestión microtejicosa, prepare un tampón de digestión enzimática de Dispasa I (1 U/mL) y Liberase (3 U/mL) en PBS. Mantenga esta solución en hielo.
    2. Para la fijación celular y microtisular, utilice un reactivo de fijación disponible comercialmente en frío que contenga 4,2% de paraformaldehído (PFA).
    3. Preparar 0.25% Triton X-100 en PBS para permeabilización y 0.1% Tween-20 para lavados. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente.
    4. Para los análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), prepare el tampón FACS [PBS o HBSS con suero bovino fetal (FBS)] al 2%] y guárdelo a 4 °C.
    5. Para la inmunotinción, prepare un 2% de suero normal de cabra / burro / conejo en PBS. Elija la especie de suero en función del huésped en el que se criaron los anticuerpos.

2. Diferenciación y purificación cardíaca

NOTA: Todas las iPSC deben mantenerse en ~ 75% a 80% de confluencia antes de la diferenciación de cardiomiocitos. Las iPSC utilizadas para este protocolo se derivaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando la reprogramación del virus de Sendai realizada en el Biobanco del Instituto Cardiovascular de Stanford (SCVI).

  1. Antes de la diferenciación, el cultivo de iPSC colonias hasta el paso (P20).
  2. Retire el medio de cultivo iPSC de la placa de 6 pocillos y lave las células una vez con 2 ml de PBS.
  3. El día 0, comience la inducción del mesendodermo agregando 2 ml de diferenciación Medio # 1 con CHIR (6 μM final) en cada pozo. La concentración final puede variar entre 6 y 9 μM para diferentes líneas iPSC. Por lo tanto, se recomienda probar diferentes concentraciones de CHIR en una placa de 6 pocillos para identificar la inducción óptima del mesodermo cardíaco.
  4. El día 2, recupere las células reemplazando con 2 ml de medium # 1 fresco en cada pozo.
  5. En el día 3, reemplace el medio en cada pozo con el medio de diferenciación de 2 ml # 1 con el inhibidor de Wnt IWR-1-endo (5 μM) para inducir la especificación de linaje cardíaco.
  6. El día 5, recupere las células reemplazando el medio con el medio fresco de 2 ml # 1 en cada pozo.
  7. En el día 7, reemplace el medio con 2 ml de medio # 2 en cada pozo. El latido espontáneo de los cardiomiocitos se puede observar ya en el día 8-9. Para algunas líneas, las células que golpean pueden aparecer tan tarde como el día 11.
  8. Para la purificación del cultivo de diferenciación, reemplace con 2 ml menos glucosa Media # 3 en cada pozo el día 10.
  9. El día 13, recupere las células cambiando el medio con 2 ml más glucosa media # 2 en cada pozo.
  10. El día 16, realizar segunda ronda de purificación con 2 mL de Medio #3 en cada pozo.
  11. Recupere las células en el día 19 con 2 ml más glucosa Media # 2.
  12. El día 20, lave los pocillos una vez con 1 ml de PBS y disocie las células con 1 ml de tripsina 10x durante 6 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las células se levantan de la superficie del pozo en células individuales durante menos de 15 s y se agregan a un tubo cónico de 15 ml con el mismo volumen de Medio # 2 para neutralizar la enzima. Centrifugar la suspensión celular durante 3 min a 270 x g.
  13. Resuspend el pellet celular en 3 mL Medium #3. Cuente las células y agregue el volumen apropiado del Medio # 3 para platear un total de ~ 3 millones de células en cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos recubierta de medio de matriz de membrana basal. En el segundo día después de volver a emplatar, reemplace el medio con 2 mL Medium # 2 fresco y reponga con 2 mL Medium # 2 cada dos días hasta la tripsinización de cardiomiocitos para congelación o experimentos futuros.

3. Diferenciación de células endoteliales y MACS

  1. Con una confluencia de iPSC del 75% al 80%, lave la placa con PBS, 2 ml por pocillo.
  2. Comience la diferenciación en el día 0 reemplazando con 2 mL de diferenciación el Medio #1 con 6 μM CHIR.
  3. En el día 2, reemplace el medio con 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 2 μM CHIR.
  4. El día 4, reemplace el medio con 2 ml de EGM suplementado con 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 y 20 ng BMP4.
  5. Cambie el medio con 2 ml de EGM suplementado con factores de crecimiento cada 2 días desde el día 6 hasta el día 10. La adición de inhibidor de TGFβ (SB431542) a una concentración de 8 μM es opcional para promover la expansión endotelial y suprimir la diferenciación de otros tipos de células de origen mesenquimal.
  6. El día 12, comience los pasos para MACS enjuagando cada pozo con 1 ml de PBS seguido de disociación celular con 1 ml de 10x tripsina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos durante 8 minutos a 37 ° C.
  7. Preparar un volumen igual de medio EGM en un tubo cónico de 50 ml para neutralizar la enzima de disociación. Coloque un colador de células de 40 μm en el tubo cónico de 50 ml y pase la suspensión de células disociadas a través del colador. Cambie el filtro por cada 2 a 3 pozos disociados.
  8. Enumere el total de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  9. Pellet la suspensión celular a 300 x g durante 5 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
  10. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en el volumen apropiado de tampón de clasificación basado en el recuento total en el paso 3.8.
    NOTA: Agregue 80 μL de tampón de clasificación por cada 107 celdas totales.
  11. Para el etiquetado magnético de perlas, agregue 20 μL de reactivo de bloqueo de FcR por cada 107 células e incube durante 5 min.
  12. Añadir 20 μL de microperlas CD144 o CD31 por cada 107 células y mezclar bien. Incubar la suspensión celular en la oscuridad a 4 °C durante 15 min.
  13. Añadir 20 ml de tampón de clasificación para lavar las celdas marcadas y granular las células 300 x g durante 5 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
  14. Vuelva a suspender el pellet celular en 3 ml de tampón de clasificación y déjelo en hielo.
  15. Prepare una columna de separación magnética colocando la columna en la muesca del separador.
  16. Equilibre la columna enjuagando con 3 ml de tampón de clasificación y recoja el flujo en un tubo cónico de desechos.
  17. Una vez que el tampón de enjuague fluya a través de él, vuelva a suspender la suspensión celular a fondo para romper cualquier grupo y aplique la suspensión celular sobre la columna.
  18. Después de que la suspensión celular haya fluido, lave la columna con 3 ml de tampón de clasificación tres veces para eliminar las celdas sin etiquetar.
  19. Retire la columna del separador y colóquela en un tubo cónico de 15 ml para la elución de celdas CD144+/CD31+.
  20. Agregue 5 ml de búfer de clasificación a la columna e inmediatamente enjuague las celdas marcadas magnéticamente con el émbolo.
  21. Determine el número de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  22. Centrifugar la suspensión celular en una centrífuga preenfriada a 300 x g durante 3 min.
  23. Resuspend el pellet celular en volumen apropiado de EGM con 5-8 μM de inhibidor de TGFβ (SB431542) basado en el recuento total en el paso 3.21.
  24. Placa este pasaje 0 (P0) células a una densidad celular apropiada (4 x 104 células/cm2) en una placa de gelatina pre-recubierta al 0,2%.
  25. Para P0 y P1, continúe reponiendo el medio con EGM fresco cada 2 días con inhibidor de TGFβ. A partir de P2, las células se pueden cultivar en medio de crecimiento endotelial sin inhibidor de TGFβ.

4. Diferenciación de fibroblastos cardíacos

  1. Permitir que las iPSC se vuelvan 90% a 95% confluentes; lavar cada pozo con 1 ml de PBS.
  2. Comience la diferenciación en el día 0 agregando 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 11 μM CHIR. Para líneas iPSC sensibles, la concentración puede variar entre 9-10 μM.
  3. El día 1, observa el plato. Es normal observar una muerte celular significativa con ~ 30% a 40% de células adheridas a la placa.
  4. En el día 3, agregue 2 ml de diferenciación Medio # 1 con 5 μM IWR-1-endo para promover la expansión de los progenitores cardíacos.
  5. El día 4, reemplace el medio con 2 ml de medio de diferenciación de fibroblastos cardíacos. Reemplace con medio fresco cada 2 días hasta el día 16.
  6. El día 18, separe las células usando 1 ml de 10x tripsina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos durante 10 minutos a 37 ° C.
  7. Interrumpa la capa celular a fondo y pase la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml que contiene el mismo volumen de medio DMEM / F12 complementado con 5% FBS.
  8. Determine el número de células viables utilizando el azul de tripano al 0,4% utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
  9. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min para obtener un pellet.
  10. Para el primer re-recubrimiento, resuspender el pellet celular en un volumen apropiado de medio de diferenciación y placa a una densidad celular (6 x 104 celdas/cm2) en una placa recubierta de gelatina al 0,2% hasta una confluencia del 90%.
  11. Divida la placa y mantenga los fibroblastos cardíacos en DMEM / F12 regular con suero al 10% en placas recubiertas de gelatina.

5. Fundición de moldes microtisulares cardíacos y siembra celular

  1. Derretir la agarosa en un microondas en una botella de vidrio de 100 ml hasta que hierva. Rocíe la botella de agarosa y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Deje que la agarosa se enfríe durante ~ 3 min.
  2. Pipeta 700 μL de agarosa fundida en un micromolde de silicona de 9 x 9 matriz. Evite generar burbujas durante el pipeteo.
  3. Coloque cuidadosamente el molde en un bloque de hielo preenfriado para acelerar la gelificación de la agarosa.
  4. Asegúrese de que una vez que la agarosa se gelifica, se vuelve translúcida. Doble cuidadosamente alrededor de los bordes del micromolde para aflojar la réplica de agarosa. Luego, pele suavemente la réplica por todos lados para separar la réplica de agarosa del micromolde de silicona.
  5. Transfiera la bandeja de microtejido de agarosa que contiene 81 huecos circulares (800 μm de diámetro; 800 μm de profundidad) a una placa estéril de 12 pocillos.
  6. Agregue 2 ml de PBS a la bandeja de microtejido de agarosa e inspeccione bajo el microscopio si hay burbujas atrapadas o pozos de forma irregular.
  7. Sumergir la bandeja de agarosa en 2 ml de etanol al 70% durante la noche, seguido de un tratamiento UV en el gabinete de bioseguridad durante 1 h.
  8. Antes de su uso, retire el etanol al 70% y lave dos veces con agua destilada y un lavado final con 2 ml de PBS.
  9. Tripsinizar, neutralizar y contar iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CFs y colocar las suspensiones celulares en hielo.
  10. Retire el PBS del pozo y de la cámara de siembra celular con cuidado sin tocar los huecos.
  11. En un nuevo tubo, mezcle iPSC-CM, iPSC-ECs e iPSC-CFs en una proporción de 7:2:1, respectivamente, para lograr una densidad celular final de 106 células/ml. Las densidades celulares más altas darán como resultado microtisones más grandes.
    NOTA: No exceda de 2 x 106 celdas/ml.
  12. Agregue cuidadosamente los 200 μL de la suspensión celular en forma de gota en la cámara de siembra.
  13. Deje que las células se asienten a 37 °C en una incubadora de CO2 durante 2 h.
  14. Agregue un medio de fabricación de microtinua que rodea el molde de agarosa para cubrir la superficie de la cámara interior.
  15. Después de 24 h, las células se autoensamblan y compactan significativamente en los huecos circulares. Reemplace con medio fresco cada 2 días para mantenimiento.

6. Fijación y permeabilización de células y microtisones cardíacos para inmunotinción

  1. Para cada tipo de célula individual, cultive las células por separado en un medio de matriz de membrana basal o en portaobjetos de cámara recubiertos de gelatina (aproximadamente 2.5-3 x 105 células / ml). Los microtejidos cardíacos se pueden recolectar en un tubo cónico de 15 ml enjuagándolos suavemente de los huecos circulares.
  2. Aspire el medio y enjuague las células o microtejidos con 1 ml de PBS; a partir de entonces, fijar con el tampón de fijación que contiene 4,2% de PFA durante 20 min para los portaobjetos de la cámara y 1 h para microtemas a temperatura ambiente.
  3. Aspire el PFA y agregue 1 ml de solución permeabilizante (0.25% Triton X-100 en PBS) durante 5 a 7 min para portaobjetos de cámara y 20 min para microtisones en tubo cónico de 15 mL.
    NOTA: A partir de este paso, las muestras se pueden mecer suavemente en una plataforma basculante de sobremesa.
  4. Aspire la solución permeabilizante y enjuague una vez con 2 a 3 ml de PBS.
  5. Incubar las células con 500-1.000 μL de solución bloqueadora (2% a 5% de suero normal de cabra o suero de burro) durante al menos 1 h para los portaobjetos de cámara y de 3 a 4 h para los microtejidos.
  6. Incubar las células o microtejidos cardíacos con anticuerpos conjugados preparados en la solución bloqueante suficiente para cubrir la muestra. Incubar con troponina-T anticardíaca (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) y anti-DDR2/vimentina (1:50) durante 1 h para los portaobjetos de cámara y durante la noche a 4 °C para microtisones cardíacos.
  7. Lave los portaobjetos de la cámara tres veces con 500 μL 0.1% Tween-20 durante 5 min entre cada lavado y un lavado final con PBS.
  8. Para los microtejidos cardíacos, lavar con 2 mL 0.1% Tween-20 cinco veces con 20 min de duración entre cada lavado. Realice un paso de lavado final durante 20 minutos adicionales.
  9. Incubar las células o microtejidos con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) antes de la microscopía confocal.
  10. Para microtejidos cardíacos, transfiera cuidadosamente a un plato con fondo de vidrio de 35 mm y agregue PBS para sumergir los microtejidos.
  11. Para imágenes 3D, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 20x o 40x gana el foco central de la microtejiga y ajusta los parámetros de exposición para cada fluoróforo.
  12. Para obtener una pila Z, establezca la primera y la última coordenadas en modo Live con una profundidad total de imagen de 100-200 μm con un intervalo de corte de 5-10 μm.

7. Digestión de microtejidos cardíacos y preparación de células para citometría de flujo

  1. Para digerir los microtejidos, enjuague suavemente los microtesúmeros con Medium # 1 de los huecos circulares usando una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho en un tubo cónico de 15 ml.
  2. Deje que los microtejidos se asienten y aspiren el medio con cuidado y enjuague las células o microtejidos con 1 ml de PBS y agregue 200-300 μL de tampón de digestión enzimática durante 20 min a 37 ° C. A los 10 min, mezclar los microtejidos suavemente durante 1 min e incubar de nuevo a 37 °C durante el resto del tiempo.
  3. Después de la incubación, use una punta de pipeta regular de 1 ml para mezclar los microtejidos vigorosamente para obtener una suspensión de células turbias.
  4. Una vez que los microtejidos estén suficientemente digeridos en células individuales, neutralice inmediatamente la suspensión celular con 5 ml de medio que contenga un 5% de FBS y cuele la suspensión celular a través de un colador celular de 40 μm. Cuente el número total de células y centrífique la suspensión de una sola célula a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Aspire el sobrenadante y resuspenda 1 x 105-1 x 106 células en tampón de unión a anexinas de 100 μL con FITC Annexin V y 100 μg/mL de yoduro de propidio (PI) o tinte de exclusión de células muertas To-Pro3 durante 10 min en hielo.
  6. Después de la incubación, agregue 300 μL del tampón de unión a la anexina a la suspensión celular y transfiéralo a un tubo FACS de fondo redondo para el análisis de citometría de flujo. Utilice los láseres y filtros de emisión correctos para los fluoróforos seleccionados.
  7. Para la cuantificación de marcadores de superficie celular utilizando células fijas, realice la fijación y permeabilización del pellet celular como se describe en los pasos 6.2 y 6.3.
  8. Después de la permeabilización, enjuague el pellet celular e incube las células con los respectivos anticuerpos conjugados durante 1 h. Lave el pellet celular en tampón FACS de 4 ml (2% FBS en PBS) y centrífuga a 300 x g durante 3 min. Repita el paso de lavado dos veces.
  9. Resuspend las células en tampón FACS de 200-300 μL para el análisis de citometría de flujo.
  10. Ajuste las propiedades de dispersión hacia adelante y hacia el lado con una muestra no teñida y considere el uso de un control de isotipo para cada fluoróforo para ajustar los voltajes del láser. Recopile un mínimo de 20.000 eventos para el análisis de datos.

8. Realización de análisis de contracción de microtisones cardíacos que laten espontáneamente

  1. Grabe videos de microtisones cardíacos para capturar al menos tres latidos. Establezca la resolución de grabación en al menos 1280 x 720 píxeles a una velocidad de fotogramas >30 fotogramas por segundo y guarde el vídeo en . Formato AVI.
  2. Ejecute el script MotionGUI11 en un entorno de MATLAB para iniciar la interfaz de usuario.
  3. Busque el archivo . Ubicación del archivo AVI en su carpeta para cargar el video. Luego, ingrese la velocidad de fotogramas a la que se capturó el video en el panel Entrada.
  4. En el panel de entrada avanzada, se puede especificar un tamaño de píxel basado en la resolución y la ampliación de captura.
  5. Se puede especificar un tamaño de píxel de macrobloque adecuado (predeterminado 16) y un movimiento de píxel detectable dependiendo de la fuerza de contracción del microtejido.
  6. Después de ajustar los parámetros, haga clic en Obtener vectores de movimiento para comenzar el análisis.
  7. Seleccione una región de interés con el botón de opción Elegir AOI para excluir las áreas que rodean la microtinua única en el hueco circular.
  8. Utilice la función Map Time Ave para generar un mapa de calor de contracción media basado en el movimiento detectado en los ejes X e Y.
  9. Para obtener datos de seguimiento de picos, utilice la función Obtener datos de contracción para medir automáticamente los picos de contracción y relajación.
  10. En el caso de una baja relación señal-ruido, aplique un umbral de altura y distancia máxima para anotar correctamente la velocidad máxima de contracción (punto azul) y la velocidad máxima de relajación (triángulo rojo).
  11. Después de establecer los umbrales correctos, seleccione Analizar picos para obtener los valores de contracción y relajación con la velocidad de latido y el intervalo de latido.
  12. Obtener mediciones de un mínimo de 25 microtejidos individuales para análisis estadísticos.

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Representative Results

Caracterización de inmunotinción y citometría de flujo de CM, CE y CG derivados de iPSC
Para generar microtejidos cardíacos compuestos de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CEF, los tres tipos de células se diferencian y caracterizan individualmente. La diferenciación in vitro de iPSCs a iPSC-CMs ha mejorado en los últimos años. Sin embargo, el rendimiento y la pureza de los iPSC-CM difieren de una línea a otra. El protocolo actual produce más del 75% de iPSC-CM puros que espontáneamente comienzan a latir alrededor del día 9 (Figura 1A). Los pasos de purificación adicionales desde el día 9 hasta el día 14 pueden mejorar la pureza de iPSC-CM a más del 80% como se describió anteriormente12. Del mismo modo, se pueden generar iPSC-CE de alta pureza utilizando protocolos publicados previamente13,14 que incluyen la adición de varios factores de crecimiento vascular que polarizan los progenitores endoteliales que surgen del mesodermo alrededor de los días 4-5 (Figura 1B) para formar iPSC-CE fenotípicamente bien definidos. Los iPSC-CFs son una población altamente heterogénea en función de su ubicación y se caracterizan en función de su morfología y expresión de proteínas de la matriz extracelular. Aquí, utilizando protocolos publicados15,16,17 con modificaciones, los iPSC-CFs humanos se obtienen a partir de células progenitoras del mesodermo cardíaco (Figura 1C).

Figure 1
Figura 1: Línea de tiempo de diferenciación. Esquema general de (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC y (C) línea de tiempo de diferenciación de iPSC-CF con imágenes representativas de contraste de fase de las células después de los pasos de diferenciación y purificación. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La pureza de los iPSC-CMs, iPSC-ECs e iPSC-CFs se determinó mediante inmunotinción y citometría de flujo utilizando cTnT2, molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM1/CD31) y vimentina (VIM), respectivamente (Figura 2A). El análisis cuantitativo mostró una población purificada que contenía más del 90% de células cTnT2 en el día 20. Los iPSC-EC obtenidos en el día 12 después de MACS utilizando perlas CD31 se identificaron con inmunotinción contra el marcador de superficie de células endoteliales PECAM1/CD31. MACS produjo células endoteliales altamente puras, como lo demuestra más del 95% de células CD31 + en P0. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la pureza de las células endoteliales disminuyó con un mayor número de pasajes debido a la desdiferenciación. Del mismo modo, en el día 20, los análisis de citometría de flujo revelaron que más del 95% de iPSC-CF expresaron el marcador de fibroblastos VIM (Figura 2B).

Figure 2
Figura 2: Caracterización de inmunofluorescencia y citometría de flujo. (A) [Panel de izquierda a derecha] iPSC-CM en el día 25 teñidos con cTnT2 (cian), iPSC-ECs teñidos con PECAM1/CD31 (verde), iPSC-CFs teñidos con VIM (rojo) y núcleos teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. (B) [Panel de izquierda a derecha] La cuantificación de la citometría de flujo mostró un alto porcentaje de pureza de iPSC-CM (91,8%), iPSC-CE (98,1%) e iPSC-CF (96,7%) después de la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fabricación de cultivos de microtinuas cardíacas y análisis de tamaño
Las suspensiones unicelulares de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CF se mezclaron en una proporción de 7:2:1 y se dispensaron cuidadosamente en la cámara de siembra celular del molde de réplica de agarosa esterilizada (Figura 3A, B). Las celdas se asentaron uniformemente dentro de los huecos circulares en 2 h. Alrededor del día 3, las células autoensambladas se organizan en microtisones cardíacos espontáneos de tamaño uniforme (Figura 3C). Se pueden fabricar matrices de microtejidos de diferentes tamaños ajustando la densidad celular final (Figura 3D, E). Los microtejidos cardíacos fabricados con una densidad celular final de 1 x 106 células/ml tienen ~300-350 μm de diámetro, 2 x 106 células/ml tienen ~600 μm de diámetro y 4 x 106 células/ml tienen más de 800 μm de diámetro. El ensamblaje de microtejidos se obtuvo con una densidad celular de 1 x 106 células/ml, que se utiliza típicamente para experimentos. Estos cultivos de microtinua se pueden mantener en cultivo hasta por 6 semanas.

Figure 3
Figura 3: Técnica de moldeo de réplica para generar microtisones cardíacos multicelulares. (A) Réplica de bandejas de micropocillos de agarosa moldeadas de (B) mezclas iPSC-CM, iPSC-EC e iPSC-CF capturadas dentro de los micropocillos para autoensamblaje. Barra de escala 500 = μm. (C) Micrografía que muestra la compactación de los microtisones cardíacos en el día 3. Barra de escala = 500 μm. (D) Los tamaños de microtusas cardíacas formadas muestran una relación lineal con las densidades iniciales de siembra, con densidades celulares más altas que resultan en microtisones más grandes. (E) Una figura representativa que muestra los microtisones cardíacos autoensamblados en la matriz de micropocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Inmunotinción y viabilidad después de la digestión enzimática
La tinción de inmunofluorescencia del día 12 después de la fabricación utilizando anticuerpos contra cTnT2 para iPSC-CM, CD31 para iPSC-ECs y DDR2 para iPSC-CFs reveló una distribución celular única en microtemas cardíacos. Los iPSC-CM, el más pesado de los tres tipos de células, ocuparon el centro, mientras que los iPSC-EC se intercalaron a lo largo de los microtisones, y se observó que los iPSC-CEF ocupaban predominantemente la periferia (Figura 4A). La digestión corta y rápida de los microtejidos logrados con Dispasa I y Liberase TL dio como resultado una proporción celular general altamente viable (Figura 4B, panel superior) con menos del 5% de células apoptóticas después de 2 semanas en cultivo. Esto fue seguido por una breve exposición de 1 h de microtisones cardíacos a una alta concentración (5 μM) de doxorrubicina, un fármaco quimioterapéutico que se sabe que induce cardiotoxicidad dependiente de la dosis (Figura 4B, panel inferior).

Figure 4
Figura 4: Inmunotinción de microtejidos cardíacos y evaluación de la viabilidad celular. (A) Imágenes confocales de la pila Z de microtiso cardíaco humano teñido para iPSC-CMs (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CFs (DDR2) y núcleos teñidos con (DAPI). Barra de escala = 200 μm. (B) Diagramas de citometría de flujo de microtisones cardíacos digeridos enzimáticamente en suspensión unicelular y teñidos con Anexina V (marcador apoptótico) y colorante de exclusión de células muertas (To-Pro3). La suspensión unicelular digerida mostró una alta viabilidad celular (91%) con una población de células apoptóticas del <5% (panel superior), en comparación con la suspensión unicelular tratada con un fármaco quimioterapéutico inductor de apoptosis, doxorrubicina, durante 1 h a una concentración de 5 μM (panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis computacional de contractilidad
Los análisis de contractilidad de microtisones cardíacos individuales se pueden realizar con la ayuda de una herramienta de análisis de imágenes basada en MATLAB. Se obtuvieron grabaciones de video de microtisones cardíacos que latían espontáneamente a 30 fps para su análisis. Como se describió anteriormente11, el método de coincidencia de bloques emplea un algoritmo de seguimiento de movimiento para capturar el movimiento de un bloque de píxeles para los fotogramas totales adquiridos como una serie temporal de vectores de movimiento. La contractilidad de los microtejidos y el movimiento de los vectores generan un pseudomapa de calor que ilustra el perfil de contracción media o media a través del microtejido (Figura 5A). El movimiento contráctil de los microtejidos cardíacos genera picos positivos que se miden como velocidad de contracción (círculo azul), velocidad de relajación (triángulo rojo) y tasa de latido, el último de los cuales se calcula como el tiempo entre dos ciclos de contracción (Figura 5B). Además, la contractilidad de los microtejidos cardíacos no cambia significativamente durante 4 semanas en cultivo (Figura 5C).

Figure 5
Figura 5: Análisis de contracción de microtejidos cardíacos. (A) Imagen de contraste de fase y mapa de contracción de microtejidos cardíacos 1 semana después de la fabricación. Barra de escala = 200 μm. (B) Los microtejidos cardíacos muestran perfiles regulares de contracción y relajación y tasas de latido. La tabla muestra valores representativos de velocidad de latido, contracción máxima y velocidades de relajación. (C) El cultivo a largo plazo de microtejidos cardíacos durante un máximo de 4 semanas no influye significativamente en los parámetros de contractilidad (n = 20/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para generar microtejidos cardíacos a partir de iPSC-CM, iPSC-CE e iPSC-CC prediferenciados, es esencial obtener un cultivo altamente puro para un mejor control del número de células después de la compactación celular inhibida por contacto dentro de los microtejidos cardíacos. Recientemente, Giacomelli et. al.18 han demostrado la fabricación de microtejidos cardíacos utilizando iPSC-CMs, iPSC-ECs y iPSC-CFs. Los microtejidos cardíacos generados utilizando el método descrito consisten en ~ 5,000 células (70% iPSC-CM, 15% iPSC-EC y 15% iPSC-CFs). En este método, tanto los cardiomiocitos como las células endoteliales se co-diferenciaron seguidos de la separación de los progenitores endoteliales utilizando el marcador CD34+. El protocolo actual descrito aquí consiste en 12,000 células (70% iPSC-CM, 20% iPSC-EC y 10% iPSC-CFs) por microtiso, lo que produce un mayor número de células por construcción para análisis de células individuales aguas abajo. Además, dado que los tres tipos de células se diferencian por separado, existe una heterogeneidad limitada en las poblaciones celulares que es única para comprender las respuestas específicas de las células a los tratamientos.

Para la diferenciación de cardiomiocitos, nosotros y otros hemos demostrado previamente la derivación de cardiomiocitos puros utilizando condiciones de cultivo definidas químicamente12,19,20. Brevemente, la diferenciación comienza con la inducción del mesendodermo, seguida de la modulación de la señalización Wnt/β-catenina que promueve la especificación del linaje cardíaco. La purificación adicional de los cardiomiocitos en un medio privado de glucosa permite la eliminación de no cardiomiocitos. Aquí, es importante tener en cuenta que el cultivo prolongado en medio de purificación puede obstaculizar la calidad de los cardiomiocitos. Un protocolo publicado recientemente muestra que la capacidad proliferativa de los cardiomiocitos en etapa temprana se puede aprovechar para obtener un gran número de células. La expansión de los iPSC-CMs humanos se induce con la reintroducción de CHIR, un potente mitógeno durante la fase proliferativa temprana21. Aunque el mecanismo molecular preciso aún se desconoce, esta técnica puede mejorar significativamente el rendimiento de iPSC-CM en diez o cien veces. Además, para mejorar la fidelidad de los iPSC-CM para el modelado de enfermedades, se pueden cultivar en un medio de maduración para mejorar la maduración electrofisiológica, mecánica y estructural22. En otra parte se revisa una visión general exhaustiva de las técnicas de maduración de iPSC-CM23.

Las células endoteliales vasculares se han generado a partir de células madre pluripotentes con diferentes eficiencias variables de purificación13,24,25. El protocolo actual proporciona una alta eficiencia de diferenciación y selección de iPSC-ECs fenotípicamente estables con MACS26. La metodología de diferenciación para generar fibroblastos cardíacos funcionales sigue la modulación de la vía Wnt y la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) para generar iPSC-CFs17. In vivo Los LC se originan a partir de progenitores de epicardio, endocardio y cresta neural16,27,28,29. Aquí, el linaje de la FQ se genera a partir de progenitores cardíacos mesodérmicos comprometidos sin generar células epicárdicas como intermediario. En general, los protocolos descritos aquí para generar iPSC-CMs, iPSC-ECs e iPSC-CFs tienen en cuenta la facilidad de reproducibilidad y la alta pureza basada en características fenotípicas. Para obtener microtejidos de alta calidad, es importante obtener >90% de pureza para cada tipo de célula individual. Una mayor pureza en el fenotipo celular también asegurará la detección de cambios en la trayectoria celular debido a diferentes tratamientos.

Después de la derivación exitosa de los tres tipos de células, las células se dispensan cuidadosamente en la cámara de siembra de agarosa para permitir el asentamiento de las células en los recovecos circulares. Los parámetros críticos incluyen el logro de una suspensión homogénea de una sola célula y la prevención de agregados o grupos celulares que pueden causar variabilidad en la distribución del tamaño de los microtejidos cardíacos. Desde una perspectiva de estructura general, las construcciones 3D a menudo están limitadas por la difusión de nutrientes, y a medida que aumenta la densidad celular, el tamaño y el grosor de las construcciones también aumentan linealmente. Las construcciones de ingeniería tisular en forma de estructuras esféricas tienen una tasa de consumo de nutrientes uniforme debido a la difusividad isotrópica y la distancia fija desde el núcleo hasta la superficie30,31. El tamaño final de la microtejiga dicta el gradiente de concentración de nutrientes y la difusión de oxígeno al centro. En un sistema de cultivo estático, las construcciones de más de 350-400 μm pueden conducir a un núcleo celular necrótico cuando se cultivan durante períodos de tiempo más largos. Por lo tanto, se debe considerar cuidadosamente la densidad de siembra. Una limitación del modelo de microtinua cardíaca es que no permite la alineación de cardiomiocitos ofrecida por metodologías que implican el confinamiento geométrico de células individuales. Por lo tanto, la cuantificación de parámetros como la alineación o longitud del sarcómero sigue siendo limitada debido al ensamblaje celular multidimensional aleatorio. A pesar de la limitación, la técnica permite una rápida evaluación dosis-dependiente de toxicidades farmacológicas o de moléculas pequeñas en células cardiovasculares32. En un estudio reciente, empleamos microtisones 3D compuestos por iPSC-CM para modelar la miocardiopatía secundaria inducida por sobrecarga de hierro, y observamos una reducción significativa en el tamaño de la microtesidad debido a una alta concentración de tratamiento con hierro33.

Con respecto a la inmunotinción, a diferencia de los cultivos 2D, es necesaria una mayor permeabilización y duración de la incubación primaria de anticuerpos para permitir la difusión de anticuerpos a través de los microtejidos. El tiempo de incubación para una penetración adecuada de anticuerpos puede requerir una mayor optimización para microtejidos de más de ~ 400 μm de diámetro. Otro aspecto importante es el paso de bloqueo más largo con proteínas séricas para reducir la fluorescencia de fondo resultante de la unión no específica. Por lo general, se prefiere un suero bloqueador que contenga altos niveles de IgG, como el suero de cabra o burro. Con el fin de mantener la integridad estructural de los microtejidos cardíacos, no hemos sondeado proteínas involucradas en interacciones célula-célula específicas y su mantenimiento durante el período de cultivo. Para el fenotipado celular, los microtejidos deben digerirse durante un corto período de tiempo para garantizar una alta viabilidad celular y la preservación de los antígenos extracelulares objetivo. Una combinación de digestión enzimática y disrupción mecánica con una punta de pipeta de diámetro ancho permite un tratamiento eficiente y suave de los microtejidos durante el proceso de digestión. Las células individuales viables de alta calidad obtenidas a través de este protocolo de digestión rápida se pueden utilizar para dilucidar interacciones biológicas complejas célula-célula con la ayuda de scRNA-seq34,35,36.

Además de la caracterización morfológica y estructural, es importante evaluar las propiedades funcionales de los microtejidos cardíacos para evaluar la eficacia, la toxicidad y el estado de enfermedad del ensamblaje tisular in vitro. El análisis cuantitativo de la contracción tisular es un parámetro relevante para evaluar la función cardíaca. Varias técnicas de microscopía de video no invasivas combinadas con algoritmos de seguimiento de movimiento han permitido el monitoreo en tiempo real con una medida robusta de la contracción del tejido cardíaco vinculada a características fenotípicas. Para cuantificar los cambios en el fenotipo, los microtejidos cardíacos se pueden mantener in vitro hasta 4 semanas sin cambios significativos en los parámetros contráctiles. La mayoría de los algoritmos de software funcionan según los principios del flujo óptico y el mapeo vectorial, que se superponen sobre series capturadas de fotogramas de video11,37,38. El análisis de flujo óptico puede conducir a la detección de artefactos; por lo tanto, el usuario debe evitar o minimizar las perturbaciones inadvertidas circundantes que podrían dar lugar al movimiento de la muestra o vibraciones transmitidas a la etapa del microscopio. Cabe señalar que los análisis de contractilidad pueden no detectar efectos pasivos de tensión o carga debido a la forma suspendida de los microtejidos, a diferencia de los microtejidos formados entre postes flexibles de rigidez predefinida. Sin embargo, en ambos casos, es importante tener en cuenta que los perfiles de contracción de los tejidos musculares cardíacos modificados no logran las fuerzas de contracción generadas a nivel de órgano. Las principales ventajas de los ensayos basados en imágenes son que no son destructivos y permiten medir la exposición aguda y crónica a medicamentos sin una calibración extensa. Estas herramientas se pueden aplicar en una variedad de plataformas 2D y 3D para medir los cambios en la contractilidad cardíaca debido a tratamientos o enfermedades genéticas subyacentes, y para evaluar las estrategias de maduración de los tejidos. La investigación futura de este modelo de microtejiga puede implicar la combinación de mediciones electrofisiológicas que permitirán el registro simultáneo de colorantes sensibles al calcio o al voltaje para obtener múltiples registros independientes de cada microtejido en una matriz de alta eficiencia.

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Disclosures

J.C.W. es cofundador de Khloris Biosciences, pero no tiene intereses contrapuestos, ya que el trabajo presentado aquí es completamente independiente. Los otros autores no reportan conflictos.

Acknowledgments

Agradecemos a la Dra. Amanda Chase por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. El apoyo financiero fue proporcionado por el Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco (TRDRP) de la Universidad de California, T29FT0380 (D.T.) y 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) y 17MERIT33610009 (J.C.W.); y National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 y NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

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References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

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Bioingeniería Número 169 iPSC cardiomiocitos células endoteliales fibroblastos microtejidos autoensamblaje
Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales
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Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

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