Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

मानव iPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके 3 डी कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों का निर्माण

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

यहां, हम 3 डी स्व-इकट्ठे कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों को उत्पन्न करने के लिए एक आसान-से-उपयोग पद्धति का वर्णन करते हैं जो पूर्व-विभेदित मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं से बना है। कार्डियक माइक्रोटिस्यूज उत्पन्न करने के लिए तकनीक की आवश्यकता वाले इस उपयोगकर्ता के अनुकूल और कम सेल को रोग मॉडलिंग और दवा के विकास के शुरुआती चरणों के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से मानव कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम), कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ), और एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) की पीढ़ी ने विभिन्न कार्डियोवैस्कुलर सेल प्रकारों के बीच जटिल इंटरप्ले का अध्ययन करने का एक अनूठा अवसर प्रदान किया है जो ऊतक विकास और बीमारी को चलाता है। कार्डियक ऊतक मॉडल के क्षेत्र में, कई परिष्कृत तीन आयामी (3 डी) दृष्टिकोण प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) का उपयोग करते हैं ताकि शारीरिक प्रासंगिकता और देशी ऊतक वातावरण की नकल की जा सके, जो बाहरी मैट्रिक्स और क्रॉसलिंकर्स के संयोजन के साथ होता है। हालांकि, ये प्रणालियां माइक्रोफैब्रिकेशन विशेषज्ञता के बिना बनाने के लिए जटिल हैं और आत्म-इकट्ठा करने के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता होती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इनमें से कई प्रणालियों में संवहनी कोशिकाओं और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स की कमी होती है जो मानव हृदय में 60% से अधिक गैर-मायोसाइट्स बनाते हैं। यहां हम आईपीएससी से कार्डियक माइक्रोटिस्यू बनाने के लिए सभी तीन कार्डियक सेल प्रकारों की व्युत्पत्ति का वर्णन करते हैं। यह सरल प्रतिकृति मोल्डिंग तकनीक कई हफ्तों के लिए मानक बहु-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में कार्डियक माइक्रोटिश्यू संस्कृति की अनुमति देती है। प्लेटफ़ॉर्म प्रारंभिक सीडिंग घनत्व के आधार पर माइक्रोटिश्यू आकारों पर उपयोगकर्ता-परिभाषित नियंत्रण की अनुमति देता है और अवलोकन योग्य कार्डियक माइक्रोटिश्यू संकुचन प्राप्त करने के लिए आत्म-असेंबली के लिए 3 दिनों से भी कम समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) के उपयोग के साथ एकल-सेल पूछताछ के लिए उच्च सेल व्यवहार्यता को बनाए रखते हुए कार्डियक माइक्रोटिस्यू को आसानी से पचाया जा सकता है। हम कल्पना करते हैं कि कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ का यह इन विट्रो मॉडल दवा की खोज और रोग मॉडलिंग में सत्यापन अध्ययन में तेजी लाने में मदद करेगा।

Introduction

कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान के क्षेत्र में दवा की खोज और रोग मॉडलिंग को नैदानिक रूप से प्रासंगिक नमूनों और अपर्याप्त ट्रांसलेशनल टूल्स 1 की कमी के कारण कई चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। अत्यधिक जटिल पूर्व-नैदानिक मॉडल या विट्रो एकल-सेल मॉडल में अतिसरलीकृत एक पुनरुत्पादक तरीके से pathophysiological स्थितियों का प्रदर्शन नहीं करते हैं। इसलिए, कई लघुकृत ऊतक-इंजीनियर प्लेटफ़ॉर्म अंतर को पाटने में मदद करने के लिए विकसित हुए हैं, एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से आवेदन में आसानी और ऊतक फ़ंक्शन 2,3 के वफादार पुनरावृत्ति के बीच संतुलन प्राप्त करने के लक्ष्य के साथ। प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के आगमन के साथ, ऊतक इंजीनियरिंग उपकरणों को अनुसंधान प्रश्नों का उत्तर देने के लिए अंतर्निहित हृदय रोग राज्य के साथ या बिना रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है4,5,6। हृदय के ऊतकों के समान सेलुलर संरचना के साथ इस तरह के ऊतक इंजीनियर मॉडल का उपयोग एक या कई सेल प्रकारों के व्यवहार में रोग संबंधी परिवर्तनों से प्रेरित कार्डियोटॉक्सिसिटी और शिथिलता के लिए परीक्षण करने के लिए दवा विकास प्रयासों में किया जा सकता है।

मानव आईपीएससी से व्युत्पन्न स्व-इकट्ठे माइक्रोटिस्यू या ऑर्गेनोइड्स तीन-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं जो लघु ऊतक जैसी असेंबली हैं जो उनके इन विवो समकक्षों के लिए कार्यात्मक समानताएं प्रदर्शित करती हैं। कई अलग-अलग दृष्टिकोण हैं जो आईपीएससी के निर्देशित भेदभाव के माध्यम से या भ्रूणीय निकायों के गठन के माध्यम से सीटू में ऑर्गेनोइड्स के गठन की अनुमति देते हैं। परिणामी ऑर्गेनोइड्स ऑर्गोजेनेटिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अपरिहार्य उपकरण है जो ऑर्गेनोजेनेसिस को चलाता है। हालांकि, विभिन्न प्रकार की कोशिका आबादी की उपस्थिति और स्व-संगठन में अंतर विभिन्न ऑर्गेनोइड्स 5 के बीच परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकता है। वैकल्पिक रूप से, पूर्व-विभेदित कोशिकाएं जो स्थानीय सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऊतक-विशिष्ट सेल प्रकारों के साथ माइक्रोटिस में स्वयं-इकट्ठी होती हैं, उत्कृष्ट मॉडल हैं, जहां स्व-इकट्ठे घटकों को अलग करना संभव है। विशेष रूप से मानव कार्डियक अनुसंधान में, बहुकोशिकीय घटकों के साथ 3 डी कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ का विकास चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है जब कोशिकाएं विभिन्न रोगी लाइनों या वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त होती हैं।

एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक, व्यक्तिगत, इन विट्रो मॉडल में सेल व्यवहार की हमारी यांत्रिक समझ में सुधार करने के लिए, आदर्श रूप से सभी घटक सेल प्रकारों को एक ही रोगी लाइन से प्राप्त किया जाना चाहिए। मानव हृदय के संदर्भ में, वास्तव में एक प्रतिनिधि कार्डियक इन विट्रो मॉडल प्रमुख सेल प्रकारों के बीच क्रॉसस्टॉक पर कब्जा कर लेगा, अर्थात्, कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम), एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी), और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (सीएफ) 6,7। मायोकार्डियम के वफादार पुनरावृत्ति के लिए न केवल बायोफिजिकल खिंचाव और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल उत्तेजना की आवश्यकता होती है, बल्कि सेल-सेल सिग्नलिंग भी होती है जो ईसी और सीएफ 8 जैसे सेल प्रकारों का समर्थन करने से उत्पन्न होती है। CFs extracellular मैट्रिक्स के संश्लेषण और ऊतक संरचना को बनाए रखने में शामिल हैं; और एक पैथोलॉजिकल स्थिति में, CFs फाइब्रोसिस को प्रेरित कर सकते हैं और CMs9 में विद्युत चालन को बदल सकते हैं। इसी तरह, ईसी पैराक्राइन सिग्नलिंग के माध्यम से सीएम के संकुचनशील गुणों को विनियमित कर सकते हैं और महत्वपूर्ण चयापचय मांगों की आपूर्ति कर सकते हैं। इसलिए, शारीरिक रूप से प्रासंगिक उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों को आयोजित करने की अनुमति देने के लिए सभी तीन प्रमुख सेल प्रकारों से बने मानव कार्डियक माइक्रोटिस्यूस की आवश्यकता है।

यहां, हम मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम), आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं (आईपीएससी-ईसी), और आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स (आईपीएससी-सीएफ) और समान कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों में उनकी 3 डी संस्कृति की व्युत्पत्ति द्वारा कार्डियक माइक्रोटिसस के निर्माण में एक बॉटम-अप दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। अनायास धड़कते हुए कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ उत्पन्न करने की इस सरल विधि का उपयोग रोग मॉडलिंग और हृदय शरीर विज्ञान की कार्यात्मक और यांत्रिक समझ के लिए दवाओं के तेजी से परीक्षण के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के बहुकोशिकीय कार्डियक माइक्रोटिश्यू प्लेटफार्मों को जीनोम संपादन तकनीकों के साथ शोषण किया जा सकता है ताकि पुरानी या तीव्र संस्कृति स्थितियों के तहत समय के साथ हृदय रोग की प्रगति का अनुकरण किया जा सके।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. मध्यम, अभिकर्मक, संस्कृति प्लेट तैयारी

  1. सेल संस्कृति के लिए सेल धोने का समाधान: कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 1x फॉस्फेट बफ़र्ड खारा (पीबीएस) या हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) का उपयोग करें।
  2. कार्डियोमायोसाइट्स विभेदन मीडिया
    1. 500 mL कार्डियोमायोसाइट्स बेसल माध्यम (RPMI 1640) में 10 mL पूरक (50x B27 प्लस इंसुलिन) जोड़कर भेदभाव मध्यम # 1 तैयार करें।
    2. 500 एमएल कार्डियोमायोसाइट्स बेसल माध्यम (आरपीएमआई 1640) में 10 एमएल पूरक (50x बी 27 माइनस इंसुलिन) जोड़कर भेदभाव मध्यम # 2 तैयार करें।
    3. 500 mL कार्डियोमायोसाइट्स बेसल माध्यम (RPMI 1640) माइनस ग्लूकोज में पूरक (50x B27 प्लस इंसुलिन) जोड़कर शुद्धिकरण मध्यम # 3 तैयार करें।
  3. एंडोथेलियल विकास मीडिया और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) अभिकर्मकों
    1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट किट के साथ एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम (ईजीएम) तैयार करें।
    2. गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) स्टॉक समाधान को रिंसिंग समाधान के साथ 1:20 तक पतला करके सेल पृथक्करण सॉर्टिंग बफर समाधान तैयार करें।
  4. कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव माध्यम: फाइब्रोब्लास्ट बेसल माध्यम (डीएमईएम-उच्च ग्लूकोज) और सीरम-फ्री फाइब्रोब्लास्ट लाइफ फैक्टर्स किट के साथ कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव माध्यम तैयार करें।
  5. कार्डियक माइक्रोटिश्यू निर्माण और रखरखाव माध्यम: कार्डियोमायोसाइट्स बेसल माध्यम (आरपीएमआई 1640) के साथ पूरक (50x बी 27 प्लस इंसुलिन) और 70/30 वी / वी% अनुपात में ईजीएम के साथ फ़िल्टर किए गए माध्यम को तैयार करें।
  6. छोटे अणु और विकास कारक स्टॉक समाधान
    1. सभी तीन सेल प्रकारों के विभेदन के लिए, GSK3-बीटा अवरोधक CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-मिथाइल-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile) के 200 μL ऐलीकोट तैयार करें; WNT अवरोधक IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; और विकास कारक बीटा (TGF-β) अवरोधक SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5)-5-5-yl)-5-5-yl-5-5-yl में वृद्धि कारक बीटा (TGF-β) अवरोधक SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5)-5-yl)-5-5-yl-5-5-yl में परिवर्तन।
    2. मानव iPSC-EC भेदभाव के लिए, बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF) (20 μg / mL), संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक 165 (VEGF165; 50 μg / mL), और हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (BMP4; 20 μg / mL) में 0.1% (w / v) बीएसए में अल्ट्राप्योर आसुत पानी में 100 μL एलीकोट तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें; लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एलीकोट को 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. IPSC-CM, IPSC-ECs, और iPSC-CFs के रखरखाव के लिए प्री-कोटिंग प्लेटें।
    1. एक 1: 200 अनुपात में DMEM / F12 में विकास कारक कम (जीएफआर) तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम को पतला करके iPSC-CM पुन: चढ़ाना के लिए बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों को तैयार करें। 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें और इसे कम से कम 2 से 4 घंटे के लिए सेट करने के लिए छोड़ दें।
    2. जिलेटिन के साथ प्री-कोट 6-वेल प्लेट या 10 सेमी डिश। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 2% जिलेटिन समाधान liquefy और पीबीएस में फ़िल्टर किए गए 0.2% (v / v) जिलेटिन को आवश्यकतानुसार उचित मात्रा में तैयार करें। उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए 0.2% जिलेटिन के 10 मिलीलीटर के साथ संस्कृति प्लेट को कोट करें।
      नोट: जिलेटिन प्लेटों का उपयोग MACS के बाद iPSC-CFs और iPSC-ECs दोनों के लिए किया जा सकता है।
  8. माइक्रोटिश्यू मोल्ड्स का निर्माण: एक सूखी 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में पीबीएस में 2% कम पिघलने वाले एगारोज़ समाधान तैयार करें। उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई पर agarose sterilize. कास्टिंग सिलिकॉन माइक्रो molds 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव, 15 मिनट के लिए 15 साई.
  9. पाचन, immunostaining, और प्रवाह cytometry के लिए समाधान
    1. माइक्रोटिश्यू पाचन के लिए, पीबीएस में डिस्पेज़ I (1 U / mL) और Liberase (3 U / mL) का एक एंजाइम पाचन बफर तैयार करें। इस घोल को बर्फ पर रखें।
    2. सेल और माइक्रोटिश्यू निर्धारण दोनों के लिए, 4.2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) युक्त बर्फ ठंडे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिक्सेशन अभिकर्मक का उपयोग करें।
    3. PERmeabilization के लिए PBS में 0.25% Triton X-100 और धोने के लिए 0.1% Tween-20 तैयार करें। समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) विश्लेषण के लिए, FACS बफर [PBS या HBSS 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ] तैयार करें और 4 °C पर स्टोर करें।
    5. इम्युनोस्टेनिंग के लिए, पीबीएस में 2% सामान्य बकरी / गधा / खरगोश सीरम तैयार करें। मेजबान के आधार पर सीरम प्रजातियों का चयन करें जिसमें एंटीबॉडी उठाए गए थे।

2. कार्डियक भेदभाव और शुद्धिकरण

नोट: कार्डियोमायोसाइट्स भेदभाव से पहले सभी आईपीएससी को ~ 75% से 80% confluency पर बनाए रखा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले आईपीएससी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से प्राप्त किए गए थे, जो स्टैनफोर्ड कार्डियोवैस्कुलर इंस्टीट्यूट (एससीवीआई) बायोबैंक में किए गए सेंडाई वायरस रीप्रोग्रामिंग का उपयोग करते थे।

  1. भेदभाव से पहले, संस्कृति आईपीएससी कालोनियों को पारित करने के लिए (पी 20)।
  2. 6-अच्छी तरह से प्लेट से आईपीएससी संस्कृति माध्यम को हटा दें और 2 एमएल पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
  3. दिन 0 पर, प्रत्येक अच्छी तरह से CHIR (6 μM अंतिम) के साथ 2 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम # 1 जोड़कर मेसेंडोडर्म प्रेरण शुरू करें। अंतिम एकाग्रता विभिन्न iPSC लाइनों के लिए 6 से 9 μM के बीच भिन्न हो सकती है। इसलिए, इष्टतम कार्डियक मेसोडर्म प्रेरण की पहचान करने के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट पर विभिन्न सीआईआर सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
  4. दिन 2 पर, प्रत्येक कुएं में ताजा 2 एमएल मध्यम # 1 के साथ बदलकर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  5. दिन 3 पर, कार्डियक-वंश विनिर्देश को प्रेरित करने के लिए WNT अवरोधक IWR-1-endo (5 μM) के साथ 2 mL भेदभाव मध्यम # 1 के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम को बदलें।
  6. दिन 5 पर, प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा 2 एमएल मध्यम # 1 के साथ माध्यम को बदलकर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  7. दिन 7 पर, प्रत्येक कुएं में 2 एमएल मध्यम # 2 के साथ मध्यम को बदलें। कार्डियोमायोसाइट्स की सहज पिटाई दिन 8-9 के रूप में जल्दी के रूप में मनाया जा सकता है। कुछ पंक्तियों के लिए, धड़कन कोशिकाएं दिन 11 के रूप में देर से दिखाई दे सकती हैं।
  8. भेदभाव संस्कृति के शुद्धिकरण के लिए, 10 वें दिन प्रत्येक कुएं में 2 एमएल माइनस ग्लूकोज मध्यम # 3 के साथ बदलें।
  9. दिन 13 पर, प्रत्येक कुएं में 2 एमएल प्लस ग्लूकोज मीडियम # 2 के साथ माध्यम को बदलकर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  10. दिन 16 पर, प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम # 3 के 2 मिलीलीटर के साथ शुद्धिकरण का दूसरा दौर करें।
  11. 2 एमएल प्लस ग्लूकोज मध्यम # 2 के साथ दिन 19 पर कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें।
  12. दिन 20 पर, कुओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ एक बार धोएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 1 एमएल 10x ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें। इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को अच्छी तरह से सतह से 15 सेकंड से कम समय के लिए एकल कोशिकाओं में उठाया जाता है और एंजाइम को बेअसर करने के लिए मध्यम # 2 की समान मात्रा के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ा जाता है। 270 x g पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन centrifuge.
  13. 3 mL मध्यम # 3 में सेल गोली resuspend. कोशिकाओं की गणना करें और एक नए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मध्यम लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में ~ 3 मिलियन कोशिकाओं की कुल प्लेट करने के लिए मध्यम # 3 की उचित मात्रा जोड़ें। फिर से चढ़ाना के बाद दूसरे दिन, माध्यम को ताजा 2 एमएल मध्यम # 2 के साथ बदलें, और ठंड या भविष्य के प्रयोगों के लिए कार्डियोमायोसाइट्स के ट्रिप्सिनाइजेशन तक हर दूसरे दिन 2 एमएल मध्यम # 2 के साथ फिर से भरें।

3. एंडोथेलियल सेल भेदभाव और MACS

  1. 75% से 80% iPSC confluency पर, पीबीएस के साथ प्लेट को धोएं, 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से।
  2. 6 μM CHIR के साथ 2 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम # 1 के साथ प्रतिस्थापित करके दिन 0 पर भेदभाव शुरू करें।
  3. दिन 2 पर, 2 μM CHIR के साथ भेदभाव मध्यम # 1 के 2 मिलीलीटर के साथ माध्यम को बदलें।
  4. दिन 4 पर, 20 एनजी बीएफजीएफ -2, 50 एनजी वीईजीएफ 165 और 20 एनजी बीएमपी 4 के साथ पूरक ईजीएम के 2 एमएल के साथ माध्यम को बदलें।
  5. दिन 6 से दिन 10 तक हर 2 दिन में विकास कारकों के साथ पूरक ईजीएम के 2 एमएल के साथ माध्यम बदलें। 8 μM एकाग्रता पर TGF π अवरोधक (SB431542) के अलावा एंडोथेलियल विस्तार को बढ़ावा देने और अन्य मेसेनकाइमल मूल सेल प्रकारों के भेदभाव को दबाने के लिए वैकल्पिक है।
  6. दिन 12 पर, पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोकर एमएसीएस के लिए कदम शुरू करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10x ट्रिप्सिन के 1 एमएल का उपयोग करके सेल पृथक्करण।
  7. पृथक्करण एंजाइम को बेअसर करने के लिए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ईजीएम माध्यम की एक समान मात्रा तैयार करें। 50 मिली शंक्वाकार ट्यूब पर एक 40 μm सेल छलनी रखें और छलनी के माध्यम से अलग सेल निलंबन पारित करें। प्रत्येक 2 से 3 अलग किए गए कुओं के लिए फ़िल्टर बदलें।
  8. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके 0.4% ट्रिपैन नीले रंग का उपयोग करके कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व ठंडा सेंट्रीफ्यूज सेट में 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन गोली.
  10. supernatant को छोड़ें और चरण 3.8 में कुल गणना के आधार पर सॉर्टिंग बफ़र की उपयुक्त मात्रा में सेल गोली resuspend।
    नोट:: प्रति 107 कुल कक्षों में सॉर्टिंग बफ़र का 80 μL जोड़ें।
  11. चुंबकीय मनका लेबलिंग के लिए, प्रति 107 कोशिकाओं में FcR ब्लॉकिंग अभिकर्मक के 20 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. CD144 या CD31 माइक्रोबीड्स प्रति 107 कोशिकाओं के 20 μL जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण। 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  13. लेबल की गई कोशिकाओं को धोने के लिए सॉर्टिंग बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व-ठंडा सेंट्रीफ्यूज सेट में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को 300 x g गोली मारें।
  14. सॉर्टिंग बफर के 3 एमएल में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें और इसे बर्फ पर छोड़ दें।
  15. विभाजक पायदान में स्तंभ रखकर एक चुंबकीय पृथक्करण स्तंभ तैयार करें।
  16. सॉर्टिंग बफर के 3 एमएल के साथ कुल्ला करके कॉलम को संतुलित करें और एक अपशिष्ट शंक्वाकार ट्यूब में प्रवाह को इकट्ठा करें।
  17. एक बार जब रिंसिंग बफर के माध्यम से बहता है, तो किसी भी clumps को तोड़ने और कॉलम पर सेल निलंबन लागू करने के लिए सेल निलंबन को अच्छी तरह से निलंबित कर दें।
  18. सेल निलंबन के माध्यम से प्रवाहित होने के बाद, किसी भी अनलेबल कोशिकाओं को हटाने के लिए तीन बार सॉर्टिंग बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम को धोएं।
  19. विभाजक से स्तंभ को निकालें और इसे CD144+ /CD31+ सेल क्षालन के लिए 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  20. कॉलम पर सॉर्टिंग बफर के 5 एमएल जोड़ें और तुरंत प्लंजर के साथ चुंबकीय रूप से लेबल की गई कोशिकाओं को फ्लश करें।
  21. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके 0.4% ट्रिपैन नीले रंग का उपयोग करके व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करें।
  22. 3 मिनट के लिए 300 x g पर एक पूर्व ठंडा सेंट्रीफ्यूज में सेल निलंबन centrifuge.
  23. चरण 3.21 में कुल गिनती के आधार पर TGF के 5-8 μM अवरोधक (SB431542) के साथ EGM की उचित मात्रा में सेल गोली को पुन: निलंबित करें।
  24. एक पूर्व लेपित 0.2% जिलेटिन प्लेट पर एक उपयुक्त सेल घनत्व (4 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2) पर इस मार्ग 0 (P0) कोशिकाओं को प्लेट करें।
  25. P0 और P1 के लिए, TGF के अवरोधक के साथ हर 2 दिनों में ताजा EGM के साथ माध्यम को फिर से भरना जारी रखें। P2 से, कोशिकाओं को एंडोथेलियल विकास माध्यम में TGF के बिना सुसंस्कृत किया जा सकता है।

4. कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव

  1. आईपीएससी को 90% से 95% confluent बनने की अनुमति दें; 1 एमएल पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोएं।
  2. 11 μM CHIR के साथ 2 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम # 1 जोड़कर दिन 0 पर भेदभाव शुरू करें। संवेदनशील आईपीएससी लाइनों के लिए, एकाग्रता 9-10 μM के बीच भिन्न हो सकती है।
  3. पहले दिन, प्लेट का निरीक्षण करें। प्लेट का पालन करने वाले ~ 30% से 40% कोशिकाओं के साथ महत्वपूर्ण सेल मृत्यु का निरीक्षण करना सामान्य है।
  4. दिन 3 पर, कार्डियक पूर्वजों के विस्तार को बढ़ावा देने के लिए 5 μM IWR-1-endo के साथ 2 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम # 1 जोड़ें।
  5. दिन 4 पर, माध्यम को कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट भेदभाव माध्यम के 2 एमएल के साथ बदलें। 16 वें दिन तक हर 2 दिनों में ताजा माध्यम के साथ बदलें।
  6. दिन 18 पर, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10x ट्रिप्सिन के 1 एमएल का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करें।
  7. सेल परत को अच्छी तरह से बाधित करें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 70 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को पास करें जिसमें 5% FBS के साथ पूरक DMEM / F12 माध्यम की समान मात्रा होती है।
  8. हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके 0.4% ट्रिपैन नीले रंग का उपयोग करके व्यवहार्य सेल संख्या निर्धारित करें।
  9. एक गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन सेंट्रीफ्यूज।
  10. पहले फिर से चढ़ाना के लिए, एक सेल घनत्व (6 x 104 कोशिकाओं / सेमी 2) पर विभेदन माध्यम और प्लेट की एक उपयुक्त मात्रा में सेल गोली को 0.2% जिलेटिन लेपित प्लेट पर 90% confluency तक पुन: निलंबित कर दिया।
  11. प्लेट को विभाजित करें और जिलेटिन लेपित प्लेटों पर 10% सीरम के साथ नियमित DMEM / F12 में कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स को बनाए रखें।

5. कार्डियक microtissue molds और सेल सीडिंग की कास्टिंग

  1. उबलने तक 100 मिलीलीटर कांच की बोतल में माइक्रोवेव में एगारोज़ को पिघलाएं। agarose बोतल स्प्रे और जैव सुरक्षा कैबिनेट में यह जगह है. agarose ~ 3 मिनट के लिए नीचे ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
  2. पिपेट 700 μL पिघला हुआ agarose के एक सिलिकॉन माइक्रो-मोल्ड में 9 x 9 सरणी. पिपेटिंग करते समय बुलबुले उत्पन्न करने से बचें।
  3. ध्यान से एक पूर्व ठंडा बर्फ ब्लॉक पर मोल्ड जगह agarose जेलेशन में तेजी लाने के लिए.
  4. सुनिश्चित करें कि एक बार जब एगारोज़ को जेल किया जाता है, तो यह पारभासी हो जाता है। ध्यान से माइक्रो मोल्ड के किनारों के चारों ओर मोड़ agarose प्रतिकृति ढीला करने के लिए. फिर, धीरे से सिलिकॉन माइक्रो मोल्ड से agarose प्रतिकृति अलग करने के लिए सभी पक्षों से प्रतिकृति छील.
  5. एक बाँझ 12-अच्छी तरह से प्लेट में 81 परिपत्र recesses (800 μm व्यास; 800 μm गहराई) युक्त agarose microtissue ट्रे स्थानांतरण।
  6. Agarose microtissue ट्रे के लिए PBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें और किसी भी फंसे बुलबुले या अनियमित आकार के कुओं के लिए माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
  7. 2 एमएल 70% इथेनॉल में agarose ट्रे को रातभर में डुबोएं, इसके बाद 1 घंटे के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में यूवी उपचार किया गया।
  8. उपयोग करने से पहले, 70% इथेनॉल को हटा दें और आसुत पानी और 2 एमएल पीबीएस के साथ अंतिम धोने के साथ दो बार धोएं।
  9. ट्रिप्सिनाइज़, बेअसर, और iPSC-CMs, iPSC-ECs, और iPSC-CFs की गिनती करें और सेल निलंबन को बर्फ पर रखें।
  10. अच्छी तरह से पीबीएस निकालें और recesses को छूने के बिना ध्यान से सेल सीडिंग कक्ष.
  11. एक नई ट्यूब में, 106 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए क्रमशः 7: 2: 1 अनुपात में आईपीएससी-सीएम, आईपीएससी-ईसी और आईपीएससी-सीएफ को मिलाएं। उच्च सेल घनत्व के परिणामस्वरूप बड़े माइक्रोटिस्यू होंगे।
    नोट:: 2 x 106 कक्षों / mL से अधिक न करें।
  12. ध्यान से सीडिंग कक्ष में सेल निलंबन dropwise के 200 μL जोड़ें.
  13. कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बसने की अनुमति दें।
  14. बस आंतरिक कक्ष की सतह को कवर करने के लिए agarose मोल्ड के आसपास microtissue निर्माण माध्यम जोड़ें।
  15. 24 घंटे के बाद, कोशिकाएं परिपत्र recesses में काफी हद तक इकट्ठा और कॉम्पैक्ट होती हैं। रखरखाव के लिए हर 2 दिनों में ताजा माध्यम के साथ बदलें।

6. निर्धारण और कोशिकाओं और कार्डियक microtissues के permeabilization immunostaining के लिए

  1. प्रत्येक व्यक्तिगत सेल प्रकारों के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम या जिलेटिन लेपित कक्ष स्लाइड (लगभग 2.5-3 x 105 कोशिकाओं / एमएल) पर कोशिकाओं को अलग से संस्कृति करें। कार्डियक माइक्रोटिस्यू को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में धीरे-धीरे उन्हें परिपत्र अवकाश से बाहर निकालकर एकत्र किया जा सकता है।
  2. माध्यम aspirate और 1 एमएल PBS के साथ कोशिकाओं या microtissues कुल्ला; उसके बाद, कक्ष स्लाइड के लिए 20 मिनट के लिए 4.2% पीएफए युक्त फिक्सेशन बफर के साथ तय करें और कमरे के तापमान पर microtissues के लिए 1 ज।
  3. पीएफए aspirate और कक्ष स्लाइड के लिए 5 से 7 मिनट के लिए और 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में microtissues के लिए 20 मिनट के लिए permeabilizing समाधान (PBS में 0.25% Triton X-100) के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: इस कदम के बाद से, नमूनों को धीरे से एक बेंचटॉप रॉकिंग प्लेटफ़ॉर्म पर हिलाया जा सकता है।
  4. permeabilizing समाधान aspirate और पीबीएस के 2 से 3 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला।
  5. कक्ष स्लाइड के लिए कम से कम 1 घंटे और माइक्रोटिश्यू के लिए 3 से 4 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान (2% से 5% सामान्य बकरी सीरम या गधा सीरम) के 500-1,000 μL के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. नमूने को कवर करने के लिए पर्याप्त ब्लॉकिंग समाधान में तैयार संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं या कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ को इनक्यूबेट करें। एंटी-कार्डियक ट्रोपोनिन-टी (सीटीएनटी 2) (1: 50), एंटी-सीडी 31 (1: 75), और एंटी-डीडीआर 2 / विमेंटिन (1: 50) के साथ चैंबर स्लाइड के लिए 1 घंटे के लिए और कार्डियक माइक्रोटिश्यूस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. प्रत्येक धोने और पीबीएस के साथ अंतिम धोने के बीच 5 मिनट के लिए 500 μL 0.1% Tween-20 के साथ कक्ष स्लाइड को तीन बार धोएं।
  8. कार्डियक माइक्रोटिस्यू के लिए, प्रत्येक धोने के बीच 20 मिनट की अवधि के साथ पांच बार 2 एमएल 0.1% ट्वीन -20 के साथ धोएं। एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए एक अंतिम धोने का चरण निष्पादित करें।
  9. confocal माइक्रोस्कोपी से पहले 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 μg / mL) के साथ कोशिकाओं या microtissues incubate।
  10. कार्डियक माइक्रोटिस्यू के लिए, 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और माइक्रोटिस्यू को जलमग्न करने के लिए पीबीएस जोड़ें।
  11. 3 डी इमेजिंग के लिए, माइक्रोटिस्यू के 20x या 40x तेल विसर्जन उद्देश्य लाभ केंद्र फोकस का उपयोग करके और प्रत्येक फ्लोरोफोर के लिए एक्सपोज़र पैरामीटर को समायोजित करें।
  12. एक Z-स्टैक प्राप्त करने के लिए, 5-10 μm स्लाइस अंतराल के साथ 100-200 μm की कुल इमेजिंग गहराई के साथ लाइव मोड में पहले और अंतिम निर्देशांक सेट करें।

7. कार्डियक microtissues के पाचन और प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. microtissues को पचाने के लिए, धीरे से मध्यम # 1 के साथ microtissues फ्लश परिपत्र recesses से बाहर एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में एक व्यापक बोर 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग कर.
  2. microtissues को व्यवस्थित करने और माध्यम को सावधानी से एस्पिरेट करने की अनुमति दें और 1 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं या माइक्रोटिस्यू को कुल्ला करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एंजाइम पाचन बफर के 200-300 μL जोड़ें। 10 मिनट पर, 1 मिनट के लिए माइक्रोटिसस को धीरे से मिलाएं और शेष समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फिर से इनक्यूबेट करें।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, एक नियमित रूप से 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए microtissues सख्ती से मिश्रण करने के लिए एक turbid सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए.
  4. एक बार जब माइक्रोटिश्यू को एकल कोशिकाओं में पर्याप्त रूप से पचाया जाता है, तो तुरंत 5% एफबीएस युक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन को बेअसर कर दें और 40 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को तनाव दें। कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर एकल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. Supernatant और resuspend 1 x 105-1 x 106 कोशिकाओं में FITC Annexin V और 100 μg / mL propidium आयोडाइड (PI) या बर्फ पर 10 मिनट के लिए 10 मिनट के लिए To-Pro3 मृत सेल बहिष्करण डाई के साथ बाध्यकारी बफर aspirate।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, सेल निलंबन के लिए एनेक्सिन बाइंडिंग बफर के 300 μL जोड़ें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक गोल नीचे FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें। चुनें fluorophores के लिए सही लेजर और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करें।
  7. निश्चित कोशिकाओं का उपयोग करके सेल सतह मार्करों के परिमाणीकरण के लिए, चरण 6.2 और 6.3 में वर्णित सेल पैलेट के निर्धारण और permeabilization का प्रदर्शन करें।
  8. permeabilization के बाद, सेल गोली कुल्ला और 1 ज के लिए संबंधित संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं incubate। सेल गोली को 4 एमएल एफएसीएस बफर (पीबीएस में 2% एफबीएस) में धोएं और 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं।
  9. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए 200-300 μL FACS बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
  10. एक unstained नमूने के साथ आगे और पक्ष तितर बितर गुणों को समायोजित करें और लेजर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए प्रत्येक fluorophore के लिए एक आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग करने पर विचार करें। डेटा विश्लेषण के लिए कम से कम 20,000 ईवेंट एकत्र करें.

8. अनायास धड़कन कार्डियक microtissues के संकुचन विश्लेषण प्रदर्शन

  1. कम से कम तीन धड़कनों को पकड़ने के लिए कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ के वीडियो रिकॉर्ड करें। रिकॉर्डिंग रिज़ॉल्यूशन को फ़्रेम दर >30 फ़्रेम प्रति सेकंड पर कम से कम 1280 x 720 पिक्सेल पर सेट करें और वीडियो को में सहेजें. AVI प्रारूप.
  2. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस लॉन्च करने के लिए एक MATLAB वातावरण में MotionGUI script11 चलाएँ।
  3. का पता लगाएं। वीडियो लोड करने के लिए अपने फ़ोल्डर में AVI फ़ाइल स्थान। उसके बाद, वह फ़्रेम दर दर्ज करें जिस पर वीडियो इनपुट पैनल में कैप्चर किया गया था.
  4. उन्नत इनपुट पैनल में, रिज़ॉल्यूशन और कैप्चर आवर्धन के आधार पर पिक्सेल आकार निर्दिष्ट किया जा सकता है.
  5. एक उपयुक्त मैक्रोब्लॉक पिक्सेल आकार निर्दिष्ट किया जा सकता है (डिफ़ॉल्ट 16) और माइक्रोटिस्सू संकुचन की ताकत के आधार पर एक पता लगाने योग्य पिक्सेल गति।
  6. पैरामीटर को समायोजित करने के बाद, विश्लेषण शुरू करने के लिए मोशन वैक्टर प्राप्त करें पर क्लिक करें।
  7. परिपत्र अवकाश में एकल microtissue के आसपास के क्षेत्रों को बाहर करने के लिए AOI रेडियो चुनें बटन के साथ रुचि के एक क्षेत्र का चयन करें।
  8. एक्स और वाई अक्षों पर पता लगाए गए गति के आधार पर एक माध्य संकुचन हीटमैप उत्पन्न करने के लिए फ़ंक्शन मैप टाइम Ave का उपयोग करें।
  9. पीक ट्रेसिंग डेटा के लिए, संकुचन और विश्राम चोटियों को स्वचालित रूप से मापने के लिए संकुचन डेटा प्राप्त करें फ़ंक्शन का उपयोग करें।
  10. कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात की स्थिति में, अधिकतम संकुचन वेग (नीले बिंदु) और अधिकतम विश्राम वेग (लाल त्रिकोण) को सही ढंग से एनोटेट करने के लिए एक चोटी की ऊंचाई और दूरी की सीमा लागू करें।
  11. सही थ्रेसहोल्ड सेट करने के बाद, बीट दर और बीट अंतराल के साथ संकुचन और विश्राम मान प्राप्त करने के लिए चोटियों का विश्लेषण करें का चयन करें।
  12. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कम से कम 25 अलग-अलग माइक्रोटिस्यूज़ से माप प्राप्त करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IPSC-व्युत्पन्न सीएम, ईसी और सीएफ के इम्यूनोस्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री लक्षण वर्णन
IPSC-CMs, iPSC-ECs, और iPSC-CFs से बने कार्डियक माइक्रोटिस्यू उत्पन्न करने के लिए, सभी तीन सेल प्रकारों को अलग-अलग किया जाता है और व्यक्तिगत रूप से विशेषता होती है। पिछले कई वर्षों में आईपीएससी के आईपीएससी-सीएम के इन विट्रो भेदभाव में सुधार हुआ है। हालांकि, आईपीएससी-सीएम की उपज और शुद्धता लाइन से लाइन-लाइन में भिन्न होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल 75% से अधिक शुद्ध आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करता है जो अनायास दिन 9 (चित्रा 1 ए) के आसपास धड़कना शुरू कर देता है। दिन 9 से दिन 14 तक आगे के शुद्धिकरण कदम आईपीएससी-सीएम शुद्धता को 80% से अधिक तक सुधार सकते हैं जैसा कि पहले वर्णित किया गया था। इसी तरह, उच्च-शुद्धता वाले आईपीएससी-ईसी को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 13,14 का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है जिसमें कई संवहनी विकास कारकों के अलावा शामिल हैं जो मेसोडर्म से उत्पन्न एंडोथेलियल पूर्वजों को 4-5 दिनों (चित्रा 1 बी) के आसपास ध्रुवीकृत करते हैं ताकि फेनोटाइपिक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित आईपीएससी-ईसी बनाया जा सके। iPSC-CFs उनके स्थान के आधार पर एक अत्यधिक विषम आबादी हैं और उनकी आकृति विज्ञान और बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन की अभिव्यक्ति के आधार पर विशेषता है। यहां, संशोधनों के साथ प्रकाशित प्रोटोकॉल 15,16,17 का उपयोग करते हुए, मानव आईपीएससी-सीएफ कार्डियक मेसोडर्म पूर्वज कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) से प्राप्त किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: विभेदन समयरेखा. (ए) आईपीएससी-सीएम, (बी) आईपीएससी-ईसी, और (सी) आईपीएससी-सीएफ भेदभाव समयरेखा के समग्र योजनाबद्ध, भेदभाव और शुद्धिकरण चरणों के बाद कोशिकाओं के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों के साथ। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

IPSC-CMs, iPSC-ECs, और iPSC-CFs की शुद्धता क्रमशः cTnT2, प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु (PECAM1/ CD31) और vimentin (VIM) का उपयोग करके immunostaining और flow cytometry द्वारा निर्धारित की गई थी (चित्रा 2A)। मात्रात्मक विश्लेषण ने एक शुद्ध आबादी को दिखाया जिसमें दिन 20 पर 90% से अधिक सीटीएनटी 2 कोशिकाएं होती हैं। CD31 मोतियों का उपयोग करके MACS के बाद 12 वें दिन प्राप्त iPSC-ECs को PECAM1 / CD31 एंडोथेलियल सेल सतह मार्कर के खिलाफ immunostaining के साथ पहचाना गया था। एमएसीएस ने अत्यधिक शुद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्पन्न किया जैसा कि पी 0 पर 95% से अधिक सीडी 31 + कोशिकाओं द्वारा स्पष्ट है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एंडोथेलियल कोशिकाओं की शुद्धता डी-भेदभाव के कारण उच्च मार्ग संख्या के साथ कम हो गई। इसी तरह, दिन 20 में, फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला कि 95% से अधिक आईपीएससी-सीएफ ने फाइब्रोब्लास्ट मार्कर वीआईएम (चित्रा 2 बी) व्यक्त किया।

Figure 2
चित्रा 2: Immunofluorescence और प्रवाह cytometry लक्षण वर्णन. (ए) [बाएं से दाएं पैनल] iPSC-CMs दिन 25 पर cTnT2 (cyan), iPSC-ECs PECAM1 / CD31 (हरे रंग) के साथ सना हुआ, iPSC-CFs VIM (लाल) के साथ सना हुआ है, और नाभिक DAPI (नीले) के साथ सना हुआ है। स्केल बार = 50 μm. (B) [बाएं से दाएं पैनल] फ्लो साइटोमेट्री परिमाणीकरण ने भेदभाव के बाद iPSC-CMs (91.8%), iPSC-ECs (98.1%), और iPSC-CFs (96.7%) की उच्च प्रतिशत शुद्धता दिखाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कार्डियक microtissue संस्कृतियों और आकार विश्लेषण के निर्माण
IPSC-CMs, iPSC-ECs, और iPSC-CFs के एकल सेल निलंबन को 7: 2: 1 अनुपात में मिश्रित किया गया था और ध्यान से निष्फल agarose प्रतिकृति मोल्ड (चित्रा 3A, B) के सेल सीडिंग कक्ष में वितरित किया गया था। कोशिकाएं समान रूप से 2 घंटे में परिपत्र recesses के अंदर बस गईं। दिन 3 के आसपास, स्व-इकट्ठे कोशिकाएं एक समान आकार में व्यवस्थित होती हैं जो अनायास कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ (चित्रा 3 सी) को हरा देती हैं। विभिन्न आकार के microtissues के सरणियों को अंतिम सेल घनत्व (चित्रा 3 डी, ई) ट्यूनिंग द्वारा गढ़ा जा सकता है। कार्डियक माइक्रोटिस्यूज 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व के साथ निर्मित है ~ 300-350 μm व्यास में, 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल व्यास में ~ 600 μm है, और 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल व्यास में 800 μm से अधिक है। माइक्रोटिश्यू असेंबली को 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व के साथ प्राप्त किया गया था, जिसका उपयोग आमतौर पर प्रयोगों के लिए किया जाता है। इन microtissue संस्कृतियों को 6 सप्ताह तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: बहुकोशिकीय कार्डियक माइक्रोटिस्यू उत्पन्न करने के लिए प्रतिकृति मोल्डिंग तकनीक। (ए) प्रतिकृति ढाला agarose माइक्रोवेल ट्रे (बी) iPSC-CM, iPSC-EC, और iPSC-CF मिश्रण स्व-असेंबली के लिए माइक्रोवेल के अंदर कब्जा कर लिया। स्केल बार 500 = μm. (C) माइक्रोग्राफ दिन 3 पर कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ के संघनन को दर्शाता है। स्केल बार = 500 μm. (D) कार्डियक माइक्रोटिश्यू आकार गठित प्रारंभिक सीडिंग घनत्व के साथ एक रैखिक संबंध दिखाते हैं, जिसमें उच्च सेल घनत्व होता है जिसके परिणामस्वरूप बड़े माइक्रोटिस्यू होते हैं। (ई) माइक्रोवेल सरणी में स्व-इकट्ठे कार्डियक माइक्रोटिस्यू को दर्शाने वाला एक प्रतिनिधि आंकड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एंजाइमेटिक पाचन के बाद इम्युनोस्टेनिंग और व्यवहार्यता
आईपीएससी-सीएम के लिए सीटीएनटी 2, आईपीएससी-ईसी के लिए सीडी 31, और आईपीएससी-सीएफ के लिए डीडीआर 2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके दिन 12 पोस्ट-फैब्रिकेशन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग ने कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ में एक अद्वितीय सेल वितरण का खुलासा किया। आईपीएससी-सीएम, सभी तीन सेल प्रकारों में से सबसे भारी, ने केंद्र पर कब्जा कर लिया, जबकि आईपीएससी-ईसी को पूरे माइक्रोटिस्यूज़ में इंटरस्पर्स किया गया था, और आईपीएससी-सीएफ को मुख्य रूप से परिधि पर कब्जा करने के लिए देखा गया था (चित्रा 4 ए)। Dispase I और Liberase TL का उपयोग करके प्राप्त किए गए माइक्रोटिश्यूज़ के छोटे और तेजी से पाचन के परिणामस्वरूप संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद 5% से कम एपोप्टोटिक कोशिकाओं के साथ समग्र अत्यधिक व्यवहार्य सेल अनुपात (चित्रा 4 बी, शीर्ष पैनल) हुआ। इसके बाद डोक्सोरुबिसिन के उच्च सांद्रता (5 μM) के लिए कार्डियक माइक्रोटिस्यूस का एक संक्षिप्त 1 एच एक्सपोजर हुआ, जो एक कीमोथेरेपी दवा है जो खुराक-निर्भर कार्डियोटॉक्सिसिटी (चित्रा 4 बी, नीचे पैनल) को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है।

Figure 4
चित्रा 4: कार्डियक माइक्रोटिश्यू का इम्यूनोस्टेनिंग और सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन। (ए) आईपीएससी-सीएम (सीटीएनटी 2), आईपीएससी-ईसी (सीडी 31), आईपीएससी-सीएफ (डीडीआर 2), और नाभिक (डीएपीआई) के लिए मानव कार्डियक माइक्रोटिश्यू की कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियां। स्केल बार = 200 μm. (बी) कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ के फ्लो साइटोमेट्री भूखंडों को एंजाइमेटिक रूप से एकल सेल निलंबन में पचाया जाता है और एनेक्सिन वी (एपोप्टोटिक मार्कर) और मृत सेल बहिष्करण डाई (टू-प्रो 3) के साथ दाग दिया जाता है। पचाए गए एकल सेल निलंबन ने <5% एपोप्टोटिक सेल आबादी (शीर्ष पैनल) के साथ एक उच्च सेल व्यवहार्यता (91%) दिखाई, एक एपोप्टोसिस-उत्प्रेरण कीमोथेरेपी दवा, डोक्सोरुबिसिन के साथ इलाज किए गए एकल सेल निलंबन की तुलना में, 5 μM एकाग्रता (नीचे पैनल) पर 1 घंटे के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कम्प्यूटेशनल संकुचन विश्लेषण
व्यक्तिगत कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ के संकुचन विश्लेषण को MATLAB-आधारित छवि विश्लेषण उपकरण की मदद से किया जा सकता है। अनायास पीटने वाले कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ की वीडियो रिकॉर्डिंग विश्लेषण के लिए 30 एफपीएस पर प्राप्त की गई थी। जैसा कि पहले वर्णित किया गया है11, ब्लॉक-मिलान विधि गति वैक्टर की समय श्रृंखला के रूप में अधिग्रहित कुल फ्रेम के लिए पिक्सेल के एक ब्लॉक के आंदोलन को कैप्चर करने के लिए मोशन ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म को नियोजित करती है। माइक्रोटिस्यू की संकुचनशीलता और वैक्टर के आंदोलन एक छद्म हीटमैप उत्पन्न करते हैं जो माइक्रोटिस्सू (चित्रा 5 ए) में माध्य या औसत संकुचन प्रोफ़ाइल को दर्शाता है। कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ की संकुचनशील गति सकारात्मक चोटियों को उत्पन्न करती है जिन्हें संकुचन वेग (नीले सर्कल), विश्राम वेग (लाल त्रिकोण) और बीट दर के रूप में मापा जाता है, जिनमें से अंतिम की गणना दो संकुचन चक्रों (चित्रा 5 बी) के बीच के समय के रूप में की जाती है। इसके अलावा, कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ की संकुचनशीलता संस्कृति में 4 सप्ताह (चित्रा 5 सी) में काफी बदलाव नहीं करती है।

Figure 5
चित्रा 5: कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ का संकुचन विश्लेषण( ए) फैब्रिकेशन के 1 सप्ताह बाद कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ के चरण कंट्रास्ट छवि और संकुचन मानचित्र। स्केल बार = 200 μm. (बी) कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ नियमित रूप से संकुचन और विश्राम प्रोफाइल और बीट दरों को दिखाते हैं। तालिका हरा दर, अधिकतम संकुचन, और विश्राम वेग के प्रतिनिधि मूल्यों को दर्शाती है। (सी) 4 सप्ताह तक कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ की दीर्घकालिक संस्कृति संकुचन मापदंडों (एन = 20 / समूह) को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पूर्व-विभेदित आईपीएससी-सीएम, आईपीएससी-ईसी, और आईपीएससी-सीएफ से कार्डियक माइक्रोटिसस उत्पन्न करने के लिए, कार्डियक माइक्रोटिस्यू के भीतर संपर्क-बाधित सेल संघनन के बाद सेल नंबरों के बेहतर नियंत्रण के लिए एक अत्यधिक शुद्ध संस्कृति प्राप्त करना आवश्यक है। हाल ही में, Giacomelli et. al.18 ने iPSC-CMs, iPSC-ECs, और iPSC-CFs का उपयोग करके कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ के निर्माण का प्रदर्शन किया है। वर्णित विधि का उपयोग करके उत्पन्न कार्डियक माइक्रोटिश्यूज़ में ~ 5,000 कोशिकाएं (70% आईपीएससी-सीएम, 15% आईपीएससी-ईसी, और 15% आईपीएससी-सीएफ) शामिल हैं। इस विधि में, कार्डियोमायोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं दोनों को सीडी 34 + मार्कर का उपयोग करके एंडोथेलियल पूर्वजों के अलगाव के बाद सह-विभेदित किया गया था। यहां वर्णित वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रति माइक्रोटिश्यू में 12,000 सेल (70% आईपीएससी-सीएम, 20% आईपीएससी-ईसी और 10% आईपीएससी-सीएफ) शामिल हैं, जो डाउनस्ट्रीम एकल सेल विश्लेषण के लिए प्रति निर्माण उच्च सेल संख्या उत्पन्न करते हैं। इसके अलावा, चूंकि सभी तीन सेल प्रकारों को अलग-अलग विभेदित किया जाता है, इसलिए सेल आबादी में सीमित विषमता होती है जो उपचार के लिए सेल-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए अद्वितीय है।

कार्डियोमायोसाइट्स भेदभाव के लिए, हमने और अन्य लोगों ने पहले रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके शुद्ध कार्डियोमायोसाइट्स की व्युत्पत्ति का प्रदर्शन किया है12,19,20। संक्षेप में, विभेदन मेसेन्डोडर्म प्रेरण के साथ शुरू होता है, इसके बाद WNT / β-कैटेनिन सिग्नलिंग का मॉडुलन होता है जो कार्डियक वंश विनिर्देश को बढ़ावा देता है। ग्लूकोज से वंचित माध्यम में कार्डियोमायोसाइट्स का आगे शुद्धिकरण गैर-कार्डियोमायोसाइट्स के उन्मूलन की अनुमति देता है। यहां, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि शुद्धिकरण माध्यम में लंबे समय तक संस्कृति कार्डियोमायोसाइट्स की गुणवत्ता को बाधित कर सकती है। हाल ही में प्रकाशित एक प्रोटोकॉल से पता चलता है कि प्रारंभिक चरण के कार्डियोमायोसाइट्स की प्रोलिफेरेटिव क्षमता का उपयोग बड़ी संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। मानव आईपीएससी-सीएम का विस्तार CHIR के पुन: परिचय के साथ प्रेरित होता है, जो प्रारंभिक प्रोलिफेरेटिव चरण 21 के दौरान एक शक्तिशाली माइटोजेन है। हालांकि सटीक आणविक तंत्र अभी भी अज्ञात है, यह तकनीक आईपीएससी-सीएम उपज में दस गुना या सौ गुना तक काफी सुधार कर सकती है। इसके अलावा, रोग मॉडलिंग के लिए आईपीएससी-सीएम की निष्ठा में सुधार करने के लिए, उन्हें इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, मैकेनिकल और संरचनात्मक परिपक्वता को बढ़ाने के लिए एक परिपक्वता माध्यम में सुसंस्कृत किया जा सकता है22। आईपीएससी-सीएम परिपक्वता तकनीकों का एक गहन अवलोकन कहीं और समीक्षा की जाती है23।

संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को विभिन्न शुद्धिकरण चर क्षमता13,24,25 के साथ प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च विभेदन दक्षता और MACS26 के साथ फेनोटाइपिक रूप से स्थिर iPSC-ECs का चयन प्रदान करता है। कार्यात्मक कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए विभेदन पद्धति WNT Pathway और Fibroblast growth factor (FGF) सिग्नलिंग के मॉडुलन का अनुसरण करती है ताकि iPSC-CFs17 उत्पन्न किया जा सके। विवो में CFs epicardium, endocardium, और तंत्रिका शिखा पूर्वजों 16,27,28,29 से उत्पन्न होते हैं। यहां, सीएफ वंश एक मध्यवर्ती के रूप में एपिकार्डियल कोशिकाओं को उत्पन्न किए बिना प्रतिबद्ध मेसोडर्मल कार्डियक पूर्वजों से उत्पन्न होता है। कुल मिलाकर, आईपीएससी-सीएम, आईपीएससी-ईसी और आईपीएससी-सीएफ उत्पन्न करने के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल फेनोटाइपिक विशेषताओं के आधार पर पुनरुत्पादन और उच्च शुद्धता की आसानी को ध्यान में रखते हैं। उच्च गुणवत्ता वाले microtissues प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक व्यक्तिगत सेल प्रकार के लिए >90% शुद्धता प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। सेलुलर फेनोटाइप में उच्च शुद्धता भी विभिन्न उपचारों के कारण सेलुलर प्रक्षेपवक्र में परिवर्तन का पता लगाना सुनिश्चित करेगी।

सभी तीन सेल प्रकारों की सफल व्युत्पत्ति के बाद, कोशिकाओं को परिपत्र recesses में कोशिकाओं के निपटान की अनुमति देने के लिए agarose सीडिंग कक्ष में सावधानीपूर्वक वितरित किया जाता है। महत्वपूर्ण मापदंडों में समरूप एकल सेल निलंबन प्राप्त करना और सेल समुच्चय या clumps को रोकना शामिल है जो कार्डियक माइक्रोटिस्यू के आकार वितरण में परिवर्तनशीलता का कारण बन सकता है। एक समग्र संरचना परिप्रेक्ष्य से, 3 डी निर्माण अक्सर पोषक तत्वों के प्रसार द्वारा सीमित होते हैं, और जैसे-जैसे सेल घनत्व बढ़ता है, निर्माणों का आकार और मोटाई भी रैखिक रूप से बढ़ जाती है। गोलाकार संरचनाओं के रूप में ऊतक इंजीनियर निर्माणों में आइसोट्रोपिक विसरणशीलता और कोर से सतह तक निश्चित दूरी के कारण एक समान पोषक तत्व खपत दर होती है30,31। माइक्रोटिश्यू का अंतिम आकार पोषक तत्वों की एकाग्रता ढाल और केंद्र में ऑक्सीजन प्रसार को निर्धारित करता है। एक स्थैतिक संस्कृति प्रणाली में, 350-400 μm से अधिक का निर्माण एक परिगलित सेल कोर का कारण बन सकता है जब समय की लंबी अवधि में सुसंस्कृत होता है। इसलिए, सीडिंग घनत्व पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। कार्डियक माइक्रोटिश्यू मॉडल की एक सीमा यह है कि यह कार्डियोमायोसाइट्स संरेखण की अनुमति नहीं देता है जो उन तरीकों द्वारा पेश किया जाता है जिनमें एकल कोशिकाओं का ज्यामितीय कारावास शामिल होता है। इसलिए, यादृच्छिक बहुआयामी सेलुलर असेंबली के कारण सारकोमेर संरेखण या लंबाई जैसे मापदंडों का परिमाणीकरण सीमित रहता है। सीमा के बावजूद, तकनीक हृदय कोशिकाओं पर दवा या छोटे अणु विषाक्तताओं के तेजी से खुराक-निर्भर मूल्यांकन की अनुमति देती है32। हाल के एक अध्ययन में, हमने माध्यमिक लौह अधिभार-प्रेरित कार्डियोमायोपैथी को मॉडल करने के लिए आईपीएससी-सीएम से बने 3 डी माइक्रोटिस्यू को नियोजित किया, और हमने लोहे के उपचार की उच्च एकाग्रता के कारण माइक्रोटिस्यू आकार में महत्वपूर्ण कमी देखी।

इम्युनोस्टेनिंग के संबंध में, 2 डी संस्कृतियों के विपरीत, लंबे समय तक permeabilization और प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन अवधि microtissues भर में एंटीबॉडी के प्रसार की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। पर्याप्त एंटीबॉडी प्रवेश के लिए इनक्यूबेशन समय को व्यास में ~ 400 μm से बड़े माइक्रोटिस्यूज़ के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक और महत्वपूर्ण पहलू गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए सीरम प्रोटीन के साथ लंबे समय तक अवरुद्ध कदम है। आमतौर पर, उच्च आईजीजी स्तर वाले एक अवरुद्ध सीरम को पसंद किया जाता है, जैसे कि बकरी या गधा सीरम। कार्डियक माइक्रोटिसस की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए, हमने संस्कृति अवधि में विशिष्ट सेल-सेल इंटरैक्शन और उनके रखरखाव में शामिल प्रोटीन के लिए जांच नहीं की है। सेलुलर फेनोटाइपिंग के लिए, माइक्रोटिसस को कम समय में पचाया जाना चाहिए ताकि उच्च सेल व्यवहार्यता और लक्ष्य बाह्य कोशिकीय एंटीजन के संरक्षण को सुनिश्चित किया जा सके। एक व्यापक बोर पिपेट टिप के साथ एंजाइमेटिक पाचन और यांत्रिक व्यवधान का एक संयोजन पाचन प्रक्रिया के दौरान माइक्रोटिसस के एक कुशल और हल्के उपचार के लिए अनुमति देता है। इस तेजी से पाचन प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त उच्च गुणवत्ता वाले व्यवहार्य एकल कोशिकाओं का उपयोग scRNA-seq34,35,36 की मदद से जटिल जैविक सेल-सेल इंटरैक्शन को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।

रूपात्मक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के अलावा, विट्रो में ऊतक असेंबली की प्रभावकारिता, विषाक्तता और रोग की स्थिति का आकलन करने के लिए कार्डियक माइक्रोटिस के कार्यात्मक गुणों का आकलन करना महत्वपूर्ण है। ऊतक संकुचन का मात्रात्मक विश्लेषण कार्डियक फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक प्रासंगिक पैरामीटर है। गति ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ संयुक्त कई गैर-इनवेसिव वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीकों ने फेनोटाइपिक विशेषताओं से जुड़े कार्डियक ऊतक संकुचन के एक मजबूत उपाय के साथ वास्तविक समय की निगरानी को सक्षम किया है। फेनोटाइप में परिवर्तनों को मापने के लिए, कार्डियक माइक्रोटिस्यूज़ को सिकुड़ने वाले मापदंडों में महत्वपूर्ण परिवर्तनों के बिना 4 सप्ताह तक विट्रो में बनाए रखा जा सकता है। अधिकांश सॉफ़्टवेयर एल्गोरिदम ऑप्टिकल-फ्लो और वेक्टर मैपिंग के सिद्धांतों पर काम करते हैं, जिन्हें वीडियो फ्रेम 11,37,38 की कैप्चर की गई श्रृंखला पर अधिरोपित किया जाता है। ऑप्टिकल प्रवाह विश्लेषण कलाकृतियों का पता लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं; इसलिए, उपयोगकर्ता को अनजाने में आसपास की गड़बड़ी से बचना चाहिए या कम करना चाहिए जिसके परिणामस्वरूप नमूना आंदोलन या माइक्रोस्कोप के चरण में प्रेषित कंपन हो सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संकुचन विश्लेषण माइक्रोटिस्यूज़ के निलंबित रूप के कारण निष्क्रिय तनाव या लोडिंग प्रभावों का पता नहीं लगा सकता है, पूर्व-परिभाषित कठोरता के लचीले पदों के बीच गठित माइक्रोटिसस के विपरीत। हालांकि, दोनों मामलों में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंजीनियर कार्डियक मांसपेशियों के ऊतकों के संकुचन प्रोफाइल एक अंग स्तर पर उत्पन्न संकुचन बलों को प्राप्त नहीं करते हैं। छवि-आधारित assays के मुख्य लाभ यह हैं कि वे गैर-विनाशकारी हैं और व्यापक अंशांकन के बिना तीव्र और पुरानी दवा जोखिम के माप की अनुमति देते हैं। इन उपकरणों को उपचार या अंतर्निहित आनुवंशिक बीमारियों के कारण कार्डियक संकुचन में परिवर्तन को मापने और ऊतक परिपक्वता रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न प्रकार के 2 डी और 3 डी प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है। इस माइक्रोटिश्यू मॉडल की भविष्य की जांच में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापों का संयोजन शामिल हो सकता है जो कैल्शियम- या वोल्टेज-संवेदनशील रंजक की एक साथ रिकॉर्डिंग की अनुमति देगा ताकि एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से एक सरणी में प्रत्येक माइक्रोटिश्यू की कई स्वतंत्र रिकॉर्डिंग प्राप्त की जा सके।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. Khloris Biosciences का एक सह-संस्थापक है, लेकिन इसमें कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है, क्योंकि यहां प्रस्तुत काम पूरी तरह से स्वतंत्र है। अन्य लेखकों ने कोई संघर्ष नहीं बताया है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी प्रतिक्रिया के लिए डॉ अमांडा चेस को धन्यवाद देते हैं। वित्त पोषण सहायता कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के तम्बाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (TRDRP), T29FT0380 (D.T.) और 27IR-0012 (J.C.W.) द्वारा प्रदान की गई थी; अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 20POST35210896 (H.K.) और 17MERIT33610009 (J.C.W.); और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851, और NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
  4. Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O. Engineering stem cell organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  5. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  6. Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
  7. Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
  8. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
  9. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  10. Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
  11. Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
  14. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  15. Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
  18. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  19. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
  20. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  21. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  22. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  23. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  24. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  25. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
  26. Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
  27. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
  28. Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
  29. Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
  30. McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
  31. Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
  32. Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
  33. Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
  34. Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
  35. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
  36. Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
  37. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
  38. Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).

Tags

Bioengineering अंक 169 आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट्स एंडोथेलियल कोशिकाओं fibroblasts microtissues आत्म विधानसभा
मानव iPSC-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके 3 डी कार्डियक माइक्रोटिश्यू सरणियों का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter