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Bioengineering

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de médicaments.

Abstract

La génération de cardiomyocytes humains (CM), de fibroblastes cardiaques (FC) et de cellules endothéliales (CE) à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a fourni une occasion unique d’étudier l’interaction complexe entre différents types de cellules cardiovasculaires qui stimulent le développement tissulaire et la maladie. Dans le domaine des modèles de tissus cardiaques, plusieurs approches tridimensionnelles (3D) sophistiquées utilisent des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-CM) pour imiter la pertinence physiologique et l’environnement tissulaire natif avec une combinaison de matrices extracellulaires et de réticulants. Cependant, ces systèmes sont complexes à fabriquer sans expertise en microfabrication et nécessitent plusieurs semaines pour s’auto-assembler. Plus important encore, beaucoup de ces systèmes manquent de cellules vasculaires et de fibroblastes cardiaques qui représentent plus de 60% des non-myocytes dans le cœur humain. Nous décrivons ici la dérivation des trois types de cellules cardiaques à partir des CSPi pour fabriquer des microtissus cardiaques. Cette technique de moulage de réplique facile permet la culture de microtissus cardiaques dans des plaques de culture cellulaire multi-puits standard pendant plusieurs semaines. La plate-forme permet un contrôle défini par l’utilisateur sur la taille des microtissus en fonction de la densité d’ensemencement initiale et nécessite moins de 3 jours pour l’auto-assemblage afin d’obtenir des contractions observables du microtissu cardiaque. En outre, les microtissus cardiaques peuvent être facilement digérés tout en maintenant une viabilité cellulaire élevée pour l’interrogation unicellulaire grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux et du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Nous envisageons que ce modèle in vitro de microtissus cardiaques aidera à accélérer les études de validation dans la découverte de médicaments et la modélisation de la maladie.

Introduction

La découverte de médicaments et la modélisation des maladies dans le domaine de la recherche cardiovasculaire sont confrontées à plusieurs défis en raison d’un manque d’échantillons cliniquement pertinents et d’outils translationnels inadéquats1. Les modèles précliniques très complexes ou les modèles unicellulaires in vitro trop simplifiés ne présentent pas de conditions physiopathologiques reproductibles. Par conséquent, plusieurs plates-formes miniaturisées d’ingénierie tissulaire ont évolué pour aider à combler l’écart, dans le but d’atteindre un équilibre entre la facilité d’application à haut débit et la récapitulation fidèle de la fonction tissulaire2,3. Avec l’avènement de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), les outils d’ingénierie tissulaire peuvent être appliqués à des cellules spécifiques au patient avec ou sans état de maladie cardiovasculaire sous-jacent pour répondre aux questions de recherche4,5,6. De tels modèles d’ingénierie tissulaire avec une composition cellulaire similaire au tissu cardiaque pourraient être utilisés dans les efforts de développement de médicaments pour tester la cardiotoxicité et le dysfonctionnement induits par des changements pathologiques dans le comportement d’un ou de plusieurs types de cellules.

Les microtissus ou organoïdes auto-assemblés dérivés d’iPSC humains sont des structures tridimensionnelles (3D) qui sont des assemblages miniatures ressemblant à des tissus présentant des similitudes fonctionnelles avec leurs homologues in vivo . Il existe plusieurs approches différentes qui permettent la formation d’organoïdes in situ via la différenciation dirigée des CSPi ou par la formation de corps embryoïdes4. Les organoïdes qui en résultent sont un outil indispensable pour étudier les processus morphogénétiques qui conduisent l’organogenèse. Cependant, la présence d’une variété de populations cellulaires et les différences d’auto-organisation peuvent entraîner une variabilité des résultats entre différents organoïdes5. Alternativement, les cellules prédé différenciées qui sont auto-assemblées en microtissus avec des types de cellules spécifiques aux tissus pour étudier les interactions cellules-cellules locales sont d’excellents modèles, où il est possible d’isoler les composants auto-assemblés. En particulier dans la recherche cardiaque humaine, le développement de microtissus cardiaques 3D avec des composants multicellulaires s’est avéré difficile lorsque les cellules sont dérivées de différentes lignées de patients ou de sources commerciales.

Pour améliorer notre compréhension mécaniste des comportements cellulaires dans un modèle in vitro physiologiquement pertinent et personnalisé, idéalement, tous les types de cellules constitutives devraient être dérivés de la même lignée de patients. Dans le contexte d’un cœur humain, un modèle cardiaque in vitro vraiment représentatif capturerait la diaphonie entre les types de cellules prédominants, à savoir les cardiomyocytes (CM), les cellules endothéliales (CE) et les fibroblastes cardiaques (FC)6,7. La récapitulation fidèle d’un myocarde nécessite non seulement un étirement biophysique et une stimulation électrophysiologique, mais également une signalisation cellule-cellule qui découle de types cellulaires de soutien tels que les CE et les CF8. Les FC sont impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire et le maintien de la structure tissulaire; et dans un état pathologique, les FC peuvent induire une fibrose et altérer la conduction électrique dans les CMs9. De même, les CE peuvent réguler les propriétés contractiles des CM par la signalisation paracrine et l’approvisionnement en demandes métaboliques vitales10. Par conséquent, il est nécessaire que des microtissus cardiaques humains composés des trois principaux types de cellules permettent de mener des expériences à haut débit physiologiquement pertinentes.

Ici, nous décrivons une approche ascendante dans la fabrication de microtissus cardiaques par dérivation de cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC (iPSC-CM), de cellules endothéliales dérivées de l’iPSC (iPSC-EC) et de fibroblastes cardiaques dérivés de l’iPSC (iPSC-CFs) et leur culture 3D dans des réseaux de microtissus cardiaques uniformes. Cette méthode facile de génération de microtissus cardiaques spontanés peut être utilisée pour la modélisation de la maladie et le test rapide de médicaments pour la compréhension fonctionnelle et mécaniste de la physiologie cardiaque. En outre, de telles plateformes de microtissus cardiaque multicellulaires pourraient être exploitées avec des techniques d’édition du génome pour émuler la progression de la maladie cardiaque au fil du temps dans des conditions de culture chroniques ou aiguës.

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Protocol

1. Préparation du milieu, du réactif, de la plaque de culture

  1. Solution de lavage cellulaire pour la culture cellulaire: Utilisez 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline équilibrée hanks (HBSS) sans calcium ni magnésium.
  2. Milieux de différenciation cardiomyocytaire
    1. Préparer le milieu de différenciation #1 en ajoutant un supplément de 10 mL (50x B27 plus insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640).
    2. Préparer le milieu de différenciation #2 en ajoutant un supplément de 10 mL (50x B27 moins insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640).
    3. Préparer le milieu de purification #3 en ajoutant un supplément (50x B27 plus insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640) moins le glucose.
  3. Milieux de croissance endothéliaux et réactifs de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS)
    1. Préparez le milieu de croissance endothélial (EGM) avec le kit de supplément de milieu de croissance des cellules endothéliales disponible dans le commerce.
    2. Préparer la solution tampon de tri de séparation cellulaire en diluant la solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 1:20 avec une solution de rinçage.
  4. Milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques: Préparez le milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques avec le milieu basal des fibroblastes (DMEM-glucose élevé) et le kit Serum-Free Fibroblast Life Factors.
  5. Milieu de fabrication et d’entretien du microtissu cardiaque : Préparer le milieu filtré avec le milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640) avec supplément (50x B27 plus insuline) et EGM dans un rapport de 70/30 v/v%.
  6. Solutions de petites molécules et de facteurs de croissance
    1. Pour la différenciation des trois types de cellules, préparer 200 μL aliquotes de l’inhibiteur GSK3-bêta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophényl)-5-(5-méthyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]éthyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile); Inhibiteur de Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; et inhibiteur du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide) à une concentration de 10 mM dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
    2. Pour la différenciation iPSC-EC humaine, préparer 100 μL d’aliquotes de facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF) (20 μg/mL), de facteur de croissance endothélial vasculaire 165 (VEGF165; 50 μg/mL) et de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4; 20 μg/mL) dans 0,1 % (p/v) de BSA dans de l’eau distillée ultrapure. Conserver les aliquotes à -20 °C; pour un stockage à long terme, les aliquotes peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à 1 an.
  7. Plaques de pré-revêtement pour la maintenance des iPSC-CM, iPSC-CE et iPSC-FC.
    1. Préparer des plaques de 6 puits revêtues de milieu de matrice de membrane basale pour le replaçage iPSC-CM en diluant le milieu de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (DFG) dans DMEM/F12 dans un rapport de 1:200. Ajouter 2 mL de milieu matriciel à membrane basale diluée à chaque puits de la plaque à 6 puits et laisser reposer pendant au moins 2 à 4 h.
    2. Pré-enduire une assiette de 6 puits ou un plat de 10 cm avec de la gélatine. Liquéfiez une solution de gélatine à 2 % au bain-marie à 37 °C et préparez de la gélatine filtrée à 0,2 % (v/v) dans du PBS dans un volume approprié au besoin. Enduire la plaque de culture de 10 mL de 0,2 % de gélatine pendant au moins 30 min à 37 °C avant utilisation.
      REMARQUE: Les plaques de gélatine peuvent être utilisées pour les iPSC-CFs et les iPSC-ECs après MACS.
  8. Fabrication de moules à microtissu : Préparer une solution d’agarose à faible teneur en fusion à 2 % dans du PBS dans une bouteille sèche en verre de 100 ml. Stériliser l’agarose à 121 °C, 15 psi pendant 20 min avant utilisation. Autoclavez les micro-moules en silicone coulé à 121 °C, 15 psi pendant 15 min.
  9. Solutions pour la digestion, l’immunocoloration et la cytométrie en flux
    1. Pour la digestion par microtissus, préparer un tampon de digestion enzymatique de Dispase I (1 U/mL) et de Liberase (3 U/mL) dans le PBS. Gardez cette solution sur la glace.
    2. Pour la fixation des cellules et des microtissus, utilisez un réactif de fixation glacé disponible dans le commerce contenant 4,2 % de paraformaldéhyde (PFA).
    3. Préparer 0,25 % de Triton X-100 dans pbS pour la perméabilisation et 0,1 % de Tween-20 pour les lavages. La solution peut être conservée à température ambiante.
    4. Pour les analyses de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), préparer le tampon FACS [PBS ou HBSS avec 2% de sérum fœtal bovin (FBS)] et conserver à 4 °C.
    5. Pour l’immunocoloration, préparez 2% de sérum normal de chèvre / âne / lapin dans pbS. Choisissez l’espèce sérique en fonction de l’hôte dans lequel les anticorps ont été élevés.

2. Différenciation et purification cardiaques

REMARQUE: Tous les CSPi doivent être maintenus à ~ 75% à 80% de confluence avant la différenciation des cardiomyocytes. Les CSPi utilisés pour ce protocole ont été dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à l’aide de la reprogrammation du virus sendai effectuée à la biobanque du Stanford Cardiovascular Institute (SCVI).

  1. Avant la différenciation, la culture des colonies iPSC jusqu’au passage (P20).
  2. Retirez le milieu de culture iPSC de la plaque à 6 puits et lavez les cellules une fois avec 2 mL de PBS.
  3. Le jour 0, commencez l’induction du mésendoderme en ajoutant 2 mL de milieu de différenciation #1 avec CHIR (6 μM final) dans chaque puits. La concentration finale peut varier entre 6 et 9 μM pour différentes lignées iPSC. Par conséquent, il est recommandé de tester différentes concentrations de CHIR sur une plaque de 6 puits pour identifier l’induction optimale du mésoderme cardiaque.
  4. Le jour 2, récupérez les cellules en les remplaçant par du milieu frais de 2 mL #1 dans chaque puits.
  5. Le jour 3, remplacer le milieu dans chaque puits par 2 mL de différenciation Du milieu #1 par l’inhibiteur de Wnt IWR-1-endo (5 μM) pour induire la spécification de la lignée cardiaque.
  6. Le jour 5, récupérez les cellules en remplaçant le milieu par du milieu frais de 2 mL #1 dans chaque puits.
  7. Le jour 7, remplacez le milieu par 2 mL de milieu #2 dans chaque puits. Des battements spontanés de cardiomyocytes peuvent être observés dès les jours 8-9. Pour certaines lignes, les cellules battantes peuvent apparaître aussi tard que le jour 11.
  8. Pour la purification de la culture de différenciation, remplacer par 2 mL moins le milieu de glucose #3 dans chaque puits le jour 10.
  9. Le jour 13, récupérez les cellules en changeant le milieu avec 2 mL plus le glucose Medium #2 dans chaque puits.
  10. Le jour 16, effectuez une deuxième série de purification avec 2 mL de medium #3 dans chaque puits.
  11. Récupérez les cellules le jour 19 avec 2 mL plus glucose Medium #2.
  12. Le jour 20, lavez les puits une fois avec 1 mL de PBS et dissociez les cellules à l’aide de 1 mL 10x trypsine pendant 6 min à 37 °C. Après l’incubation, les cellules sont soulevées de la surface du puits en cellules individuelles pendant moins de 15 s et ajoutées à un tube conique de 15 mL avec un volume égal de milieu #2 pour neutraliser l’enzyme. Centrifuger la suspension de la cellule pendant 3 min à 270 x g.
  13. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de 3 mL #3. Comptez les cellules et ajoutez le volume approprié de milieu #3 pour plaquer un total d’environ 3 millions de cellules dans chaque puits d’une nouvelle matrice de membrane basale recouverte d’une plaque de 6 puits revêtue de matrice basale. Le deuxième jour après le replacage, remplacez le milieu par du milieu frais de 2 mL #2 et reconstituez-le avec 2 mL de milieu n ° 2 tous les deux jours jusqu’à la trypsinisation des cardiomyocytes pour la congélation ou de futures expériences.

3. Différenciation des cellules endothéliales et MACS

  1. À une confluence iPSC de 75 % à 80 %, laver la plaque avec du PBS, 2 mL par puits.
  2. Commencez la différenciation au jour 0 en remplaçant par 2 mL de différenciation Le milieu #1 avec 6 μM CHIR.
  3. Le jour 2, remplacez le milieu par 2 mL de différenciation Milieu #1 par 2 μM CHIR.
  4. Le jour 4, remplacez le milieu par 2 mL d’EGM complétés par 20 ng de bFGF-2, 50 ng de VEGF165 et 20 ng de BMP4.
  5. Changer le milieu avec 2 mL d’EGM complété par des facteurs de croissance tous les 2 jours du jour 6 au jour 10. L’ajout d’inhibiteur de TGFβ (SB431542) à une concentration de 8 μM est facultatif pour favoriser l’expansion endothéliale et supprimer la différenciation d’autres types de cellules d’origine mésenchymateuse.
  6. Le jour 12, commencez les étapes pour macS en rinçant chaque puits avec 1 mL de PBS suivi d’une dissociation cellulaire en utilisant 1 mL de 10x trypsine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pendant 8 min à 37 °C.
  7. Préparer un volume égal de milieu EGM dans un tube conique de 50 mL pour neutraliser l’enzyme de dissociation. Placez une passoire cellulaire de 40 μm sur le tube conique de 50 mL et passez la suspension cellulaire dissociée à travers la crépine. Changez le filtre pour chaque 2 à 3 puits dissociés.
  8. Dénombrer le total des cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de Trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  9. Pastillez la suspension de la cellule à 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse pré-refroidie réglée à 4 °C.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume approprié de tampon de tri en fonction du nombre total à l’étape 3.8.
    REMARQUE: Ajouter 80 μL de tampon de tri pour 107 cellules au total.
  11. Pour le marquage magnétique des billes, ajouter 20 μL de réactif fcr bloquant par 107 cellules et incuber pendant 5 min.
  12. Ajouter 20 μL de microbilles CD144 ou CD31 par 107 cellules et bien mélanger. Incuber la suspension cellulaire dans l’obscurité à 4 °C pendant 15 min.
  13. Ajouter 20 mL de tampon de tri pour laver les cellules étiquetées et granuler les cellules 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse pré-refroidie réglée à 4 °C.
  14. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de tampon de tri et laissez-la sur la glace.
  15. Préparez une colonne de séparation magnétique en plaçant la colonne dans l’encoche du séparateur.
  16. Équilibrez la colonne en rinçant avec 3 mL de tampon de tri et collectez le flux dans un tube conique de déchets.
  17. Une fois que le tampon de rinçage est passé, remettez soigneusement en suspension la suspension cellulaire pour briser les amas et appliquez la suspension cellulaire sur la colonne.
  18. Une fois que la suspension cellulaire a coulé, lavez la colonne avec 3 mL de tampon de tri trois fois pour éliminer les cellules non étiquetées.
  19. Retirez la colonne du séparateur et placez-la dans un tube conique de 15 mL pour l’élution des cellules CD144+/CD31+.
  20. Ajoutez 5 mL de tampon de tri sur la colonne et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement avec le piston.
  21. Déterminez le nombre de cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  22. Centrifuger la suspension de la cellule dans une centrifugeuse pré-refroidie à 300 x g pendant 3 min.
  23. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié d’EGM avec 5 à 8 μM d’inhibiteur de TGFβ (SB431542) en fonction du nombre total à l’étape 3.21.
  24. Plaquer ce passage 0 (P0) de cellules à une densité cellulaire appropriée (4 x 104 cellules/cm2) sur une plaque de gélatine pré-enduite à 0,2%.
  25. Pour P0 et P1, continuer à reconstituer le milieu avec de l’EGM frais tous les 2 jours avec un inhibiteur de TGFβ. À partir de P2, les cellules peuvent être cultivées dans un milieu de croissance endothélial sans inhibiteur de TGFβ.

4. Différenciation des fibroblastes cardiaques

  1. Permettre aux CSPi de devenir confluents à 90 % à 95 %; laver chaque puits avec 1 mL de PBS.
  2. Commencez la différenciation au jour 0 en ajoutant 2 mL de différenciation Milieu #1 avec 11 μM CHIR. Pour les raies iPSC sensibles, la concentration peut varier entre 9 et 10 μM.
  3. Le jour 1, observez la plaque. Il est normal d’observer une mort cellulaire importante avec ~ 30% à 40% de cellules adhérées à la plaque.
  4. Le jour 3, ajouter 2 mL de milieu de différenciation #1 avec 5 μM IWR-1-endo pour favoriser l’expansion des progéniteurs cardiaques.
  5. Le jour 4, remplacez le milieu par 2 mL de milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques. Remplacer par du milieu frais tous les 2 jours jusqu’au jour 16.
  6. Le jour 18, détachez les cellules à l’aide de 1 mL de 10x trypsine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pendant 10 min à 37 °C.
  7. Perturbez complètement la couche cellulaire et faites passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL contenant un volume égal de milieu DMEM/F12 complété par 5% de FBS.
  8. Déterminez le nombre de cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  9. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille.
  10. Pour le premier replacage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu de différenciation et la plaque à une densité cellulaire (6 x 104 cellules/cm2) sur une plaque enduite de gélatine à 0,2 % jusqu’à 90 % de confluence.
  11. Divisez la plaque et maintenez les fibroblastes cardiaques dans le DMEM / F12 régulier avec 10% de sérum sur des plaques enduites de gélatine.

5. Coulée de moisissures de microtissus cardiaque et ensemencement cellulaire

  1. Faire fondre l’agarose au micro-ondes dans une bouteille en verre de 100 ml jusqu’à ébullition. Vaporisez le flacon d’agarose et placez-le dans l’armoire de biosécurité. Laissez l’agarose refroidir pendant environ 3 min.
  2. Pipette 700 μL d’agarose fondue dans un micro-moule en silicone de 9 x 9 array. Évitez de générer des bulles pendant le pipetage.
  3. Placez soigneusement le moule sur un bloc de glace pré-refroidi pour accélérer la gélification de l’agarose.
  4. Assurez-vous qu’une fois que l’agarose est gélifiée, elle devient translucide. Pliez soigneusement les bords du micro-moule pour desserrer la réplique d’agarose. Ensuite, pelez doucement la réplique de tous les côtés pour détacher la réplique d’agarose du micro-moule en silicone.
  5. Transférer le plateau de microtissu d’agarose contenant 81 renfoncements circulaires (800 μm de diamètre; 800 μm de profondeur) dans une plaque stérile de 12 puits.
  6. Ajouter 2 mL de PBS au plateau de microtissu d’agarose et inspecter au microscope les bulles piégées ou les puits de forme irrégulière.
  7. Immergez le plateau d’agarose dans 2 mL d’éthanol à 70% pendant la nuit, puis le traitement UV dans l’armoire de biosécurité pendant 1 h.
  8. Avant utilisation, retirer l’éthanol à 70 % et laver deux fois à l’eau distillée et un lavage final avec 2 mL de PBS.
  9. Trypsiniser, neutraliser et compter les iPSC-CM, iPSC-ECs et iPSC-CFs et placer les suspensions cellulaires sur la glace.
  10. Retirez soigneusement le PBS du puits et de la chambre d’ensemencement cellulaire sans toucher les renfoncements.
  11. Dans un nouveau tube, mélangez des iPSC-CM, des iPSC-CE et des iPSC-FC dans un rapport de 7:2:1, respectivement, pour obtenir une densité cellulaire finale de 106 cellules/mL. Des densités cellulaires plus élevées entraîneront des microtissus plus importants.
    REMARQUE: Ne pas dépasser 2 x 106 cellules / mL.
  12. Ajouter soigneusement les 200 μL de la suspension cellulaire goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement.
  13. Laisser les cellules se déposer à 37 °C dans un incubateur à CO2 pendant 2 h.
  14. Ajouter un milieu de fabrication de microtissue entourant le moule d’agarose pour recouvrir simplement la surface de la chambre intérieure.
  15. Après 24 h, les cellules s’auto-assemblent et se compactent de manière significative dans les renfoncements circulaires. Remplacer par un milieu frais tous les 2 jours pour l’entretien.

6. Fixation et perméabilisation des cellules et des microtissus cardiaques pour l’immunocoloration

  1. Pour chaque type de cellule, cultivez les cellules séparément sur un milieu de matrice de membrane basale ou des lames de chambre revêtues de gélatine (environ 2,5 à 3 x 105 cellules/mL). Les microtissus cardiaques peuvent être recueillis dans un tube conique de 15 mL en les rinçant doucement hors des renfoncements circulaires.
  2. Aspirer le milieu et rincer les cellules ou les microtissus avec 1 mL de PBS; par la suite, fixer avec le tampon de fixation contenant 4,2% de PFA pendant 20 min pour les glissières de la chambre et 1 h pour les microtissues à température ambiante.
  3. Aspirer le PFA et ajouter 1 mL de solution perméabilisante (0,25% de Triton X-100 dans pbS) pendant 5 à 7 min pour les lames de chambre et 20 min pour les microtissues dans un tube conique de 15 mL.
    REMARQUE: À partir de cette étape, les échantillons peuvent être doucement bercés sur une plate-forme à bascule de paillasse.
  4. Aspirer la solution perméabilisante et rincer une fois avec 2 à 3 mL de PBS.
  5. Incuber les cellules avec 500-1 000 μL de solution bloquante (2% à 5% de sérum de chèvre normal ou de sérum d’âne) pendant au moins 1 h pour les lames de chambre et 3 à 4 h pour les microtissus.
  6. Incuber les cellules ou les microtissus cardiaques avec des anticorps conjugués préparés dans la solution bloquante suffisante pour couvrir l’échantillon. Incuber avec de la troponine-T (cTnT2) anti-cardiaque (1:50), de l’anti-CD31 (1:75) et de l’anti-DDR2/Vimentin (1:50) pendant 1 h pour les lames de la chambre et pendant la nuit à 4 °C pour les microtissus cardiaques.
  7. Lavez les glissières de la chambre trois fois avec 500 μL 0,1% Tween-20 pendant 5 min entre chaque lavage et un lavage final avec PBS.
  8. Pour les microtissus cardiaques, laver avec 2 mL 0,1% Tween-20 cinq fois avec une durée de 20 min entre chaque lavage. Effectuez une dernière étape de lavage pendant 20 minutes supplémentaires.
  9. Incuber les cellules ou les microtissus avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) avant la microscopie confocale.
  10. Pour les microtissus cardiaques, transférer soigneusement dans une parabole inférieure en verre de 35 mm et ajouter du PBS pour immerger les microtissus.
  11. Pour l’imagerie 3D, à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 20x ou 40x, le centre de mise au point du microtissu et ajuste les paramètres d’exposition pour chaque fluorophore.
  12. Pour obtenir une pile Z, définissez les première et dernière coordonnées en mode Live avec une profondeur d’imagerie totale de 100-200 μm avec un intervalle de tranche de 5-10 μm.

7. Digestion des microtissus cardiaques et préparation des cellules pour la cytométrie en flux

  1. Pour digérer les microtissus, rincez doucement les microtissues avec le médium #1 hors des renfoncements circulaires à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL à large alésage dans un tube conique de 15 mL.
  2. Laisser les microtissus se déposer et aspirer soigneusement le milieu et rincer soigneusement les cellules ou les microtissus avec 1 mL de PBS et ajouter 200-300 μL de tampon de digestion enzymatique pendant 20 min à 37 °C. A 10 min, mélanger doucement les microtissus pendant 1 min et incuber à nouveau à 37 °C pour le reste du temps.
  3. Après l’incubation, utilisez une pointe de pipette régulière de 1 mL pour mélanger vigoureusement les microtissus afin d’obtenir une suspension cellulaire trouble.
  4. Une fois que les microtissus sont suffisamment digérés en cellules individuelles, neutralisez immédiatement la suspension cellulaire avec 5 mL de milieu contenant 5% de FBS et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 μm. Compter le nombre total de cellules et centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension 1 x 105-1 x 106 cellules dans un tampon de liaison à l’annexine de 100 μL avec l’annexine V du FITC et 100 μg/mL d’iodure de propidium (PI) ou de colorant d’exclusion des cellules mortes To-Pro3 pendant 10 min sur glace.
  6. Après l’incubation, ajouter 300 μL du tampon de liaison à l’annexine à la suspension cellulaire et transférer dans un tube FACS à fond rond pour l’analyse par cytométrie en flux. Utilisez les lasers et les filtres d’émission appropriés pour les fluorophores sélectionnés.
  7. Pour la quantification des marqueurs de surface cellulaire à l’aide de cellules fixes, effectuer la fixation et la perméabilisation de la pastille cellulaire comme décrit aux étapes 6.2 et 6.3.
  8. Après la perméabilisation, rincer la pastille cellulaire et incuber les cellules avec les anticorps conjugués respectifs pendant 1 h. Laver la pastille de cellule dans un tampon FACS de 4 mL (2% FBS en PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 3 min. Répétez l’étape de lavage deux fois.
  9. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS de 200 à 300 μL pour l’analyse par cytométrie en flux.
  10. Ajustez les propriétés de diffusion vers l’avant et latérale avec un échantillon non coloré et envisagez d’utiliser un contrôle d’isotype pour chaque fluorophore afin d’ajuster les tensions laser. Collectez un minimum de 20 000 événements pour l’analyse des données.

8. Effectuer des analyses de contraction de microtissus cardiaques battant spontanément

  1. Enregistrez des vidéos de microtissus cardiaques pour capturer au moins trois battements. Réglez la résolution d’enregistrement sur au moins 1280 x 720 pixels à une fréquence d’images >30 images par seconde et enregistrez la vidéo dans . Format AVI.
  2. Exécutez le script MotionGUI11 dans un environnement MATLAB pour lancer l’interface utilisateur.
  3. Trouvez le fichier . Emplacement du fichier AVI dans votre dossier pour charger la vidéo. Ensuite, entrez la fréquence d’images à laquelle la vidéo a été capturée dans le panneau de saisie.
  4. Dans le panneau de saisie avancé, une taille de pixel peut être spécifiée en fonction de la résolution et du grossissement de la capture.
  5. Une taille de pixel macrobloc appropriée peut être spécifiée (16 par défaut) et un mouvement de pixel détectable en fonction de la force de la contraction du microtissu.
  6. Après avoir ajusté les paramètres, cliquez sur Obtenir des vecteurs de mouvement pour commencer l’analyse.
  7. Sélectionnez une région d’intérêt à l’aide de la case d’option Choisir un AOI pour exclure les zones entourant la microtissue unique dans le renfoncement circulaire.
  8. Utilisez la fonction Map Time Ave pour générer une carte thermique de contraction moyenne basée sur le mouvement détecté sur les axes X et Y.
  9. Pour les données de suivi des pics, utilisez la fonction Obtenir les données de contraction pour mesurer automatiquement les pics de contraction et de relaxation.
  10. En cas de faible rapport signal/bruit, appliquez un seuil de hauteur et de distance de crête pour annoter correctement la vitesse de contraction maximale (point bleu) et la vitesse de relaxation maximale (triangle rouge).
  11. Après avoir défini les seuils corrects, sélectionnez Analyser les pics pour obtenir les valeurs de contraction et de relaxation avec la vitesse de battement et l’intervalle de battement.
  12. Obtenez des mesures à partir d’un minimum de 25 microtissus individuels pour des analyses statistiques.

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Representative Results

Caractérisation par immunocoloration et cytométrie en flux des CM, CE et FC dérivés de l’iPSC
Pour générer des microtissus cardiaques composés d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC, les trois types de cellules sont différenciés et caractérisés individuellement. La différenciation in vitro des CSPi en cSPi-MC s’est améliorée au cours des dernières années. Cependant, le rendement et la pureté des iPSC-CM diffèrent d’une ligne à l’autre. Le protocole actuel produit plus de 75 % d’iPSC-CM purs qui commencent spontanément à battre vers le jour 9 (Figure 1A). D’autres étapes de purification du jour 9 au jour 14 peuvent améliorer la pureté de l’iPSC-CM à plus de 80%, comme décrit précédemment12. De même, des iPSC-EC de haute pureté peuvent être générés à l’aide de protocoles précédemment publiés13,14 qui incluent l’ajout de plusieurs facteurs de croissance vasculaire qui polarisent les progéniteurs endothéliaux provenant du mésoderme vers les jours 4-5 (Figure 1B) pour former des iPSC-EC phénotypiquement bien définis. Les iPSC-CF sont une population très hétérogène en fonction de leur emplacement et sont caractérisés en fonction de leur morphologie et de l’expression des protéines de la matrice extracellulaire. Ici, en utilisant des protocoles publiés15,16,17 avec des modifications, les iPSC-CF humains sont obtenus à partir de cellules progénitrices du mésoderme cardiaque (Figure 1C).

Figure 1
Figure 1 : Chronologie de la différenciation. Schéma global de la chronologie de différenciation (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC et (C) iPSC-CF avec des images de contraste de phase représentatives des cellules après les étapes de différenciation et de purification. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

La pureté des iPSC-CM, iPSC-ECs et iPSC-CF a été déterminée par immunocoloration et cytométrie en flux à l’aide de cTnT2, de la molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires (PECAM1/CD31) et de la vimentine (VIM), respectivement (Figure 2A). L’analyse quantitative a montré une population purifiée contenant plus de 90% de cellules cTnT2 au jour 20. Les iPSC-CE obtenus au jour 12 après MACS à l’aide de billes CD31 ont été identifiés avec immunocoloration contre le marqueur de surface des cellules endothéliales PECAM1/CD31. MacS a produit des cellules endothéliales très pures, comme en témoignent plus de 95% de cellules CD31+ à P0. Cependant, il faut noter que la pureté des cellules endothéliales a diminué avec des nombres de passage plus élevés en raison de la dédifférenciation. De même, au jour 20, les analyses de cytométrie en flux ont révélé que plus de 95 % des iPSC-CF exprimaient le marqueur de fibroblastes VIM (Figure 2B).

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation de l’immunofluorescence et de la cytométrie en flux. (A) [Panneau de gauche à droite] iPSC-CM au jour 25 coloré avec cTnT2 (cyan), iPSC-ECs coloré avec PECAM1/CD31 (vert), iPSC-CFs coloré avec VIM (rouge) et noyaux colorés avec DAPI (bleu). Barre d’échelle = 50 μm. (B) [Panneau de gauche à droite] La quantification par cytométrie en flux a montré un pourcentage élevé de pureté des iPSC-CM (91,8%), des iPSC-CE (98,1%) et des iPSC-FC (96,7%) après différenciation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fabrication de cultures de microtissus cardiaques et analyses de taille
Des suspensions unicellulaires d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC ont été mélangées dans un rapport de 7:2:1 et soigneusement distribuées dans la chambre d’ensemencement cellulaire de la moisissure réplique d’agarose stérilisée (Figure 3A,B). Les cellules se sont uniformément déposées à l’intérieur des renfoncements circulaires en 2 h. Vers le jour 3, les cellules auto-assemblées s’organisent en microtissus cardiaques spontanés de taille uniforme (Figure 3C). Des réseaux de microtissus de différentes tailles peuvent être fabriqués en réglant la densité cellulaire finale (Figure 3D,E). Les microtissus cardiaques fabriqués avec une densité cellulaire finale de 1 x 106 cellules/mL est d’environ 300-350 μm de diamètre, 2 x 106 cellules/mL est d’environ 600 μm de diamètre et 4 x 106 cellules/mL de plus de 800 μm de diamètre. L’assemblage de microtissus a été obtenu avec une densité cellulaire de 1 x 106 cellules / mL, qui est généralement utilisée pour les expériences. Ces cultures de microtissues peuvent être maintenues en culture jusqu’à 6 semaines.

Figure 3
Figure 3 : Technique de moulage de réplique pour générer des microtissus cardiaques multicellulaires. (A) Réplique de plateaux de micropuits d’agarose moulés de (B) mélanges iPSC-CM, iPSC-EC et iPSC-CF capturés à l’intérieur des micropuits pour l’auto-assemblage. Barre d’échelle 500 = μm. (C) Micrographie montrant le compactage des microtissus cardiaques au jour 3. Barre d’échelle = 500 μm. (D) Les tailles de microtissus cardiaques formées montrent une relation linéaire avec les densités d’ensemencement initiales, avec des densités cellulaires plus élevées entraînant des microtissus plus importants. (E) Une figure représentative montrant les microtissus cardiaques auto-assemblés dans le réseau de micropuits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Immunocoloration et viabilité après digestion enzymatique
La coloration par immunofluorescence du jour 12 post-fabrication à l’aide d’anticorps contre cTnT2 pour les iPSC-CM, CD31 pour les iPSC-CE et DDR2 pour les iPSC-FC a révélé une distribution cellulaire unique dans les microtissus cardiaques. Les iPSC-CM, les plus lourds des trois types de cellules, occupaient le centre, tandis que les iPSC-CE étaient intercalés dans les microtissus et que les iPSC-FC occupaient principalement la périphérie (Figure 4A). Une digestion courte et rapide des microtissus obtenue à l’aide de Dispase I et de Liberase TL a entraîné une proportion cellulaire globale très viable (Figure 4B, panneau supérieur) avec moins de 5% de cellules apoptotiques après 2 semaines en culture. Elle a été suivie d’une brève exposition de 1 h de microtissus cardiaques à une concentration élevée (5 μM) de doxorubicine, un médicament chimiothérapeutique connu pour induire une cardiotoxicité dose-dépendante (Figure 4B, panneau inférieur).

Figure 4
Figure 4 : Immunocoloration des microtissus cardiaques et évaluation de la viabilité cellulaire. (A) Images confocales de la pile z de microtissus cardiaque humain colorés pour les iPSC-CM (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CFs (DDR2) et noyaux colorés avec (DAPI). Barre d’échelle = 200 μm. (B) Diagrammes de cytométrie en flux de microtissus cardiaques digérés enzymatiquement en suspension unicellulaire et colorés avec l’annexine V (marqueur apoptotique) et le colorant d’exclusion des cellules mortes (To-Pro3). La suspension unicellulaire digérée a montré une viabilité cellulaire élevée (91 %) avec une population de cellules apoptotiques de <5 % (panneau supérieur), comparativement à la suspension unicellulaire traitée avec un médicament chimiothérapeutique induisant l’apoptose, la doxorubicine, pendant 1 h à une concentration de 5 μM (panneau inférieur). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse computationnelle de la contractilité
Les analyses de contractilité de microtissus cardiaques individuels peuvent être effectuées à l’aide d’un outil d’analyse d’images basé sur MATLAB. Des enregistrements vidéo de microtissus cardiaques battant spontanément ont été obtenus à 30 ips pour analyse. Comme décrit précédemment11, la méthode de correspondance de blocs utilise un algorithme de suivi de mouvement pour capturer le mouvement d’un bloc de pixels pour le nombre total d’images acquises en tant que série chronologique de vecteurs de mouvement. La contractilité des microtissus et le mouvement des vecteurs génèrent une pseudo heatmap qui illustre le profil de contraction moyen ou moyen à travers le microtissu (Figure 5A). Le mouvement contractile des microtissus cardiaques génère des pics positifs qui sont mesurés comme la vitesse de contraction (cercle bleu), la vitesse de relaxation (triangle rouge) et la vitesse de battement, dont le dernier est calculé comme le temps entre deux cycles de contraction (Figure 5B). De plus, la contractilité des microtissus cardiaques ne change pas de manière significative sur 4 semaines en culture (Figure 5C).

Figure 5
Figure 5: Analyse de contraction des microtissus cardiaques. (A) Image de contraste de phase et carte de contraction des microtissus cardiaques 1 semaine après la fabrication. Barre d’échelle = 200 μm. (B) Les microtissus cardiaques montrent des profils de contraction et de relaxation réguliers et des taux de battement. Le tableau montre des valeurs représentatives de la vitesse de battement, de la contraction maximale et des vitesses de relaxation. (C) La culture à long terme de microtissus cardiaques jusqu’à 4 semaines n’influence pas de manière significative les paramètres de contractilité (n = 20/groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Pour générer des microtissus cardiaques à partir d’iPSC-CM, d’iPSC-EC et d’iPSC-CF prédifférenciés, il est essentiel d’obtenir une culture très pure pour un meilleur contrôle du nombre de cellules après un compactage cellulaire inhibé par contact dans les microtissus cardiaques. Récemment, Giacomelli et. al.18 ont démontré la fabrication de microtissus cardiaques à l’aide d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC. Les microtissus cardiaques générés à l’aide de la méthode décrite se composent d’environ 5 000 cellules (70 % d’iPSC-CM, 15 % d’iPSC-CE et 15 % d’iPSC-FC). Dans cette méthode, les cardiomyocytes et les cellules endothéliales ont été co-différenciés, suivis d’une séparation des progéniteurs endothéliaux à l’aide du marqueur CD34+. Le protocole actuel décrit ici se compose de 12 000 cellules (70 % d’iPSC-CM, 20 % d’iPSC-CE et 10 % d’iPSC-FC) par microtissu, ce qui donne un nombre de cellules plus élevé par construction pour les analyses de cellules uniques en aval. De plus, étant donné que les trois types de cellules sont différenciés séparément, il existe une hétérogénéité limitée dans les populations cellulaires, ce qui est unique à la compréhension des réponses spécifiques des cellules aux traitements.

Pour la différenciation des cardiomyocytes, nous et d’autres avons déjà démontré la dérivation de cardiomyocytes purs en utilisant des conditions de culture chimiquement définies12,19,20. En bref, la différenciation commence par l’induction du mésendoderme, suivie de la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine qui favorise la spécification de la lignée cardiaque. Une purification plus poussée des cardiomyocytes dans un milieu privé de glucose permet l’élimination des non-cardiomyocytes. Ici, il est important de noter qu’une culture prolongée dans un milieu de purification peut nuire à la qualité des cardiomyocytes. Un protocole récemment publié montre que la capacité proliférative des cardiomyocytes à un stade précoce peut être exploitée pour obtenir un grand nombre de cellules. L’expansion des iPSC-CM humains est induite par la réintroduction du CHIR, un mitogène puissant au début de la phase proliférative21. Bien que le mécanisme moléculaire précis soit encore inconnu, cette technique peut améliorer considérablement le rendement en iPSC-CM de dix ou cent fois. De plus, pour améliorer la fidélité des iPSC-CM pour la modélisation des maladies, ils peuvent être cultivés dans un milieu de maturation pour améliorer la maturation électrophysiologique, mécanique et structurelle22. Un aperçu complet des techniques de maturation iPSC-CM est examiné ailleurs23.

Des cellules endothéliales vasculaires ont été générées à partir de cellules souches pluripotentes avec différentes efficacités variables de purification13,24,25. Le protocole actuel offre une efficacité de différenciation élevée et la sélection d’iPSC-EC phénotypiquement stables avec MACS26. La méthodologie de différenciation pour générer des fibroblastes cardiaques fonctionnels suit la modulation de la voie Wnt et la signalisation du facteur de croissance des fibroblastes (FGF) pour générer iPSC-CFs17. In vivo Les FC proviennent de l’épicarde, de l’endocarde et des progéniteurs de la crête neurale16,27,28,29. Ici, la lignée FK est générée à partir de progéniteurs cardiaques mésodermiques engagés sans générer de cellules épicardiques comme intermédiaire. Dans l’ensemble, les protocoles décrits ici pour générer des iPSC-CM, iPSC-CE et iPSC-FC prennent en compte la facilité de reproductibilité et la grande pureté basée sur les caractéristiques phénotypiques. Pour obtenir des microtissus de haute qualité, il est important d’obtenir une pureté de >90% pour chaque type de cellule. Une plus grande pureté dans le phénotype cellulaire assurera également la détection des changements de trajectoire cellulaire dus à différents traitements.

Après une dérivation réussie des trois types de cellules, les cellules sont soigneusement distribuées dans la chambre d’ensemencement de l’agarose pour permettre la sédimentation des cellules dans les renfoncements circulaires. Les paramètres critiques comprennent la réalisation d’une suspension homogène d’une seule cellule et la prévention des agrégats ou des amas cellulaires qui peuvent entraîner une variabilité de la distribution granulométrique des microtissus cardiaques. Du point de vue de la structure globale, les constructions 3D sont souvent limitées par la diffusion des nutriments, et à mesure que la densité cellulaire augmente, la taille et l’épaisseur des constructions augmentent également de manière linéaire. Les constructions issues de l’ingénierie tissulaire sous forme de structures sphériques ont un taux de consommation de nutriments uniforme en raison de la diffusivité isotrope et de la distance fixe entre le noyau et la surface30,31. La taille finale du microtissu dicte le gradient de concentration des nutriments et la diffusion de l’oxygène vers le centre. Dans un système de culture statique, des constructions supérieures à 350-400 μm peuvent conduire à un noyau cellulaire nécrotique lorsqu’elles sont cultivées sur de plus longues périodes de temps. Par conséquent, une attention particulière devrait être accordée à la densité d’ensemencement. Une limitation du modèle de microtissu cardiaque est qu’il ne permet pas l’alignement cardiomyocytaire offert par les méthodologies qui impliquent le confinement géométrique de cellules individuelles. Par conséquent, la quantification de paramètres tels que l’alignement ou la longueur du sarcomère reste limitée en raison de l’assemblage cellulaire multidimensionnel aléatoire. Malgré la limitation, la technique permet une évaluation dose-dépendante rapide des toxicités médicamenteuses ou de petites molécules sur les cellules cardiovasculaires32. Dans une étude récente, nous avons utilisé des microtissus 3D composés d’iPSC-CM pour modéliser la cardiomyopathie induite par une surcharge en fer secondaire, et nous avons observé une réduction significative de la taille du microtissu en raison d’une forte concentration de traitement au fer33.

En ce qui concerne l’immunocoloration, contrairement aux cultures 2D, une perméabilisation et une durée d’incubation des anticorps primaires plus longues sont nécessaires pour permettre la diffusion des anticorps dans les microtissus. Le temps d’incubation pour une pénétration adéquate des anticorps peut nécessiter une optimisation supplémentaire pour les microtissus de plus de ~ 400 μm de diamètre. Un autre aspect important est l’étape de blocage plus longue avec les protéines sériques pour réduire la fluorescence de fond résultant de la liaison non spécifique. En règle générale, un sérum bloquant contenant des niveaux élevés d’IgG est préféré, comme le sérum de chèvre ou d’âne. Afin de maintenir l’intégrité structurelle des microtissus cardiaques, nous n’avons pas sondé les protéines impliquées dans des interactions cellule-cellule spécifiques et leur maintien au cours de la période de culture. Pour le phénotypage cellulaire, les microtissus doivent être digérés sur une courte période de temps pour assurer une viabilité cellulaire élevée et la préservation des antigènes extracellulaires cibles. Une combinaison de digestion enzymatique et de perturbation mécanique avec une pointe de pipette à large alésage permet un traitement efficace et doux des microtissus pendant le processus de digestion. Des cellules uniques viables de haute qualité obtenues grâce à ce protocole de digestion rapide peuvent être utilisées pour élucider les interactions biologiques complexes cellule-cellule à l’aide de scRNA-seq34,35,36.

En plus de la caractérisation morphologique et structurale, il est important d’évaluer les propriétés fonctionnelles des microtissus cardiaques pour évaluer l’efficacité, la toxicité et l’état pathologique de l’assemblage tissulaire in vitro. L’analyse quantitative de la contraction tissulaire est un paramètre pertinent pour évaluer la fonction cardiaque. Plusieurs techniques de microscopie vidéo non invasives combinées à des algorithmes de suivi de mouvement ont permis une surveillance en temps réel avec une mesure robuste de la contraction du tissu cardiaque liée aux caractéristiques phénotypiques. Pour quantifier les changements de phénotype, les microtissus cardiaques peuvent être maintenus in vitro jusqu’à 4 semaines sans changements significatifs des paramètres contractiles. La plupart des algorithmes logiciels fonctionnent sur les principes du flux optique et de la cartographie vectorielle, qui se superposent à des séries capturées d’images vidéo11,37,38. L’analyse du flux optique peut mener à la détection d’artefacts; par conséquent, l’utilisateur doit éviter ou minimiser les perturbations environnantes accidentelles qui pourraient entraîner un mouvement de l’échantillon ou des vibrations transmises à la scène du microscope. Il convient de noter que les analyses de contractilité peuvent ne pas détecter d’effets de tension ou de charge passifs dus à la forme suspendue des microtissus, contrairement aux microtissus formés entre des poteaux flexibles de rigidité prédéfinie. Cependant, dans les deux cas, il est important de noter que les profils de contraction des tissus musculaires cardiaques modifiés n’atteignent pas les forces de contraction générées au niveau des organes. Les principaux avantages des tests basés sur l’image sont qu’ils sont non destructifs et permettent de mesurer l’exposition aiguë et chronique aux médicaments sans étalonnage approfondi. Ces outils peuvent être appliqués sur une variété de plates-formes 2D et 3D pour mesurer les changements de contractilité cardiaque dus à des traitements ou à des maladies génétiques sous-jacentes, et pour évaluer les stratégies de maturation tissulaire. Les recherches futures sur ce modèle de microtissu pourraient impliquer la combinaison de mesures électrophysiologiques qui permettront l’enregistrement simultané de colorants sensibles au calcium ou à la tension pour obtenir plusieurs enregistrements indépendants de chaque microtissu dans un réseau à haut débit.

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Disclosures

J.C.W. est cofondateur de Khloris Biosciences mais n’a pas d’intérêts concurrents, car le travail présenté ici est complètement indépendant. Les autres auteurs ne signalent aucun conflit.

Acknowledgments

Nous remercions la Dre Amanda Chase pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement a été fourni par le Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) de l’Université de Californie, T29FT0380 (D.T.) et 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) et 17MERIT33610009 (J.C.W.); et National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 et NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioingénierie Numéro 169 iPSC cardiomyocytes cellules endothéliales fibroblastes microtissus auto-assemblage
Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain
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Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu,… More

Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

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