Summary
Her beskriver vi optisk erhvervelse og karakterisering af handlingspotentialer fra inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter ved hjælp af et højhastigheds modulært fotometrisystem.
Abstract
Konventionelle intracellulære mikroelektrode teknikker til at kvantificere kardiomyocyt elektrofysiologi er yderst komplekse, arbejdskrævende, og typisk udføres i lav gennemløb. Hurtig og løbende udvidelse af induceret pluripotente stamcelleteknologi (iPSC) præsenterer en ny standard inden for hjerte-kar-forskning, og alternative metoder er nu nødvendige for at øge gennemløbet af elektrofysiologiske data på et enkelt celleniveau. VF2.1Cl er en nyligt afledt spænding følsomme farvestof, som giver en hurtig enkelt kanal, høj størrelsesorden reaktion på udsving i membran potentiale. Den har kinetika, der er bedre end andre eksisterende spændingsindikatorer, og stiller funktionelle data svarende til de traditionelle mikroelektrodeteknikker til rådighed. Her demonstrerer vi forenklede, ikke-invasive handlingspotentiale karakterisering i eksternt tempo menneskelige iPSC afledte kardiomyocytter ved hjælp af en modulær og meget overkommelig fotometri system.
Introduction
Elektrofysiologisk modellering af kardiomyocytter og opbygning af effektive platforme til screening af hjertemedicin er afgørende for udviklingen af terapeutiske strategier for en række arytmisk lidelser. Hurtig udvidelse af induceret pluripotente stamcelle (iPSC) teknologi har produceret lovende indhug i menneskers sygdom modellering og farmakologisk undersøgelse ved hjælp af isolerede patient afledte kardiomyocytter (iPSC-CM). "Gold standard" teknikker til elektrofysiologisk karakterisering af disse celler gennem patch-clamp (nuværende-klemme) kan kvantificere handling potentiale (AP) morfologi og varighed, men denne metode er utrolig kompleks og langsom, og ikke velegnet til høj gennemløb dataindsamling1. iPSC-CMs er regelmæssigt rapporteret at have en øget diastolisk membran potentiale og øget lækagestrøm i forhold til voksne indfødte kardiomyocytter2. Det foreslås, at mindre cellestørrelse og reduceret membran kapacitans observeret i iPSC-CMs kan producere nogle systematiske fejl, når du bruger den nuværende klemme teknik, måske forklare disse afvigelser3. For at maksimere nytten af en iPSC-CM-platform er en ekstra metode værdifuld for at øge gennemløbet og sikre datanøjagtighed, når du karakteriserer transmembranspændingsændringer på et enkelt celleniveau i iPSC-CMs.
Spændingsfølsomme farvestoffer (VSD) har længe været en foreslået metode til at give hurtigere, ikke-invasiv og tilsvarende analyse af hjerte AP kinetik svarende til de traditionelle teknikker4. En nylig undersøgelse har vist egnetheden af forholdetmetrisk spænding følsomme sonde fotometri til præcist kvantificere hjerte AP5. Desuden, evnen til let at opskalere optiske fotometri tilgange giver denne teknik til stor skala cardiotoksicitet skærme kritisk i terapeutisk lægemiddeludvikling (f.eks CiPA). Udvikling af standardiserede cardiotoxicity protokoller i en blændet multi-site undersøgelse ved hjælp af mikroelektrode array og spænding-sensing optiske teknikker har vist den vigtigste værdi af denne tilgang6.
Mange potentiometriske farvestoffer er kommercielt tilgængelige, og løbende syntetisk udvikling af nye sonder viser spændende potentiale for at strømline deres effektivitet på tværs af en række hjerte-og neurale konstruktioner. Den ideelle VSD vil have augmented kinetik og følsomhed, mens der vises nedsat kapacitiv belastning, fotobleaching og cytotoksicitet. Den nyligt syntetiserede VF2.1Cl (FluoVolt) udtrykker mange af disse gavnlige egenskaber i høj grad på grund af sin nye wire-baserede molekylære struktur, deles af andre medlemmer af den nye VoltageFluor (VF) familie7. I modsætning til almindelige elektrokrome VSD'er, hvor simple sonder molekylært og elektrisk konjugerer til plasmamembranen, består dette farvestof af en passivt indsat, membran-spænder syntetisk ledning, der parrer en elektron-rig donor med en modificeret fluorescein fluorophor (FITC). Mekanistiske detaljer findes i figur 1. Dette farvestof viser fremragende følsomhed over for membranspændingsudsving, der viser en 27% ændring i emissionsintensiteten pr. 100 mV i modsætning til ~ 10% set i andre almindelige sonder ved sammenlignelige hastigheder7. Derudover interagerer trådbaserede PeT-systemer ikke direkte med det cellulære elektriske felt, der producerer minimal elektrisk interferens og ubetydelige ændringer i cellulær kapacitiv belastning.
Figur 1: Kemiske, spektrale og mekanistiske parametre for VF2.1Cl farvestof. (A) Den kemiske struktur af VF2.1Cl. Molekylære egenskaber, der skal bemærkes, omfatter flere alkylgrupper i phenylen vinylen molekylærtråden, som letter indsættelsen i plasmamembranen. En negativt ladet sulfonsyregruppe, der er bøjet til FITC-sonden, sikrer fluorophorestabilisering på den ekstracellulære overflade og hjælper nær vinkelret indsættelse i forhold til lipid-bilayerens elektriske felt. (B) Et forenklet skema over vinkelret VF2.1Cl, der integreres i plasmamembranen i en målcelle. (C) Absorption og emission spektre af VF2.1Cl farvestof. Spektre er identisk med standard FITC- og GFP-sonder. (D) Skildring af VF2.1Cl's mekanistiske virkningsmåde. Under hvileforhold (hyperpolariseret) driver negative intracellulære spændinger frie elektroner mod rostralfluoriphe. Elektron overflod sikrer foto-induceret elektron overførsel (PeT) er begunstiget som en vej ud af ophidset tilstand efter den optiske excitation, effektivt slukke fluorescens. I modsætning hertil påvirker et depolariseret membranpotentiale nedadgående elektronbevægelse, der favoriserer fluorescens ved optisk excitation. Den resulterende fluorescerende respons er lineært relateret til membranspænding og kan udnyttes præcist til at indsamle detaljerede tidsmæssige oplysninger om cellulær elektrofysiologisk kinetik. (E) Repræsentativt lysfelt (øvre) og fluorescens ved 470 nm (lavere) billeder af leporine kardiomyocytter fyldt med VF2.1Cl. (F) Z stak af en enkelt lastet kardiomyocyt. Pile angiver områder med klar lokalisering af VF2.1Cl til cellemembranen. Billeder blev erhvervet med en roterende disk confocal system bestående af en X-lightv3 spinning disk konfokal hoved med en 50 μm pinhole mønster; LDI-7 illuminator; Prime95B kamera og en PlanApo Lambda 100x mål. Skalalinje: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
FITC-sonden, der er bøjet til VF2.1Cl, sikrer, at den kan bruges effektivt under standard- og GFP-filterkonfigurationer, og det kræver kun et enkelt kanalopsamlingssystem, som begge er fælles træk ved fluorescerende billedplatforme. Analyse af tætte humane iPSC-CM-monolag med dette farvestof er for nylig blevet rapporteret8,9,10,11. Vores protokol adskiller sig fra disse undersøgelser på grund af vores undersøgelse af enkelt, isolerede iPSC-CMs, unperturbed af de elektriske og parakrine påvirkninger af tætte syncytial monolayers, og vores brug af en overkommelig og tilpasses fotometri system i modsætning til komplekse confocal eller wide-field imaging arrangementer.
Her beskriver vi vores protokol for hurtig erhvervelse og analyse af robuste optiske AP'er fra isolerede menneskelige iPSC-afledte kardiomyocytter og indfødte kardiomyocytter (se supplerende fil). Vi bruger VF2.1Cl kombineret med en tilpasselig state of the art platform til enkelt celle fotometri målinger. Disse eksperimentelle protokoller er godkendt af den etiske komité på University Medical Center Göttingen (nr. 10/9/15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellulære præparater
BEMÆRK: Humane iPSC'er, der anvendes i denne protokol, er afledt af raske donorer og differentieret i monolag ved hjælp af fuldt definerede små molekyler graduering af WNT signalering og laktatrensning teknikker som tidligere beskrevet12,13,14. iPSC-CMs blev opretholdt hver 2-3 dage med et kulturmedium skitseret nedenfor.
- Forbered et kulturmedium af basal medium (RPMI 1640) og 2% supplement (B27). Opbevares ved 4 °C. Bruges ved stuetemperatur (RT).
- Et belægningsmedium af basalt medium (RPMI 1640), 2% supplement (B27) og 1:2000 ROCK-hæmmer. Opbevares ved 4 °C. Brug på RT.
- Coat steriliseret 10 mm rundt glas # 0 coverslips med 150 μL af 1:60 faktorfri kældermembran matrix og inkubere ved 4 °C i 4 timer.
BEMÆRK: Optimering af dækslervolumen er nødvendig for at sikre, at hele glasset er dækket, samtidig med at der opretholdes tilstrækkelig overfladespænding for at forhindre spild. 150 μL anbefales til 10 mm runde dæksler. Batchstørrelse, coversliptype, coverslipvolumen og kulturpladetype kan tilpasses forsøgspersonernes behov. - Begynd iPSC-CM-dissociation med et EDTA-baseret celle dissociation reagens. Sørg for, at monolaget løsnes helt ved forsigtigt at skylle med en 1.000 μL pipette.
- Overfør celleaffjedringen til et 15 ML-rør, og tilsæt dobbeltvolumenbelægningsmedium. Centrifuge i 10 min ved 100 x g.
- Resuspend pellet med et ønsket volumen (resuspension volumen) af plating medium. Tæl celler manuelt eller elektronisk.
- Vælg optimal tæthed pr. dæksel (15.000), som vil give mulighed for den isolerede cellulære analyse senere.
- Beregn mængden af 'aktiv' cellulær suspension (A), der er nødvendig for at plade alle coverlips på denne ønskede tæthed. Påfør følgende formel, og træk den tilbage i et separat rør:
- Beregn den mængde ekstra belægningsmedium (B), der er nødvendigt for at imødekomme hver dæksler ved en ønsket lydstyrke. Anvend følgende formel, og føj den resulterende diskenhed til røret med aktiv affjedring:
- Fjern matrixen fra coverslips, og påfør celleaffjedringens »coverlip-volumen« på hver dæksel. Regelmæssigt genanvendes i røret for at sikre jævn cellulær distribution.
- Inkuberes ved 37 °C i 1 time. Fyld forsigtigt brønden med plating medium.
- Efter 24 timer skal du udveksle medier med normalt kulturmedium og vedligeholde hver 2-3 dag.
2. Eksperimentel opsætning
- Udstyre en omvendt epifluorescence mikroskop med en 40x forstørrelse, høj numerisk blænde linse (NC: > 0,75) til at udføre eksperimenter.
- Par en hurtig skifte varm hvid LED til den transmitterede belysning port af mikroskopet. Sæt et simpelt rødt 660 nm filter ind i den overførte lyssti.
BEMÆRK: Dette lys kan aktiveres i hele fotometriforsøg for at observere prøven uden at forurene det grønne fluorescerende signal. - Monter et hurtigt skifte 470 nm LED-hoved til fotometrioptagelse. Indsæt et 470/40 excitationsfilter i mikroskopets epifluorescent port for at rydde op i det lys, der genereres af LED'en.
BEMÆRK: For optimal signalkvantificering anbefales et belysningssystem med høj hastighedsfeedbackstyring af optisk udgang. - Sæt en mikroskopterning, der indeholder en 495 nm lang lysstrålekløver, i spejlenhedens karrusel i mikroskopet.
- Sæt en detektionsarm, der indeholder et justerbart feltmembran, til mikroskopets C-mount-port for at muliggøre valg af interesseområde.
- Separat parre en fotomultiplier detektor (PMT) og et USB-kamera til mikroskopet. Dette vil danne grundlag for emissionsdetekteringssystemet.
- Sæt en filterkube, der indeholder en 565 nm lang lysstrålekløver og et 535/50-emissionsfilter, i PMT-porten. Dette opdeler emissionslys mellem de to detektorer.
BEMÆRK: Et kamera, der er fastgjort til emissionsdetekteringssystemets transmitterede port, kan registrere transmitteret lys under lysfelt under alle eksperimenter. - Par PMT til en strømforsyning og en PMT forstærker. Tilslut YDELSE-forstærkerudgangen til en analog indgangsnål på et dataindsamlingssystem.
- Filtrer analoge data fra PMT ved 1 kHz eller højere.
- Digitaliser data med en frekvens, der er mindst dobbelt så høj som den højeste frekvens, der findes i analogt signal (2 kHz eller højere) for at opfylde Nyquist-kriterierne og forhindre aliasing.
3. Cellulær indlæsning med VF2.1Cl
BEMÆRK: Alle trin, der involverer dette farvestof, skal udføres under dårlige lysforhold.
- Forbered en Tyroders badopløsning af (i mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glukose, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2, pH = 7,35 og varm til 37 °C.
- Der fremstilles en aliquot af læsseopløsning i et mikrocentrifugerør ved at blande 5 μL 1.000x VF2.1Cl og 50 μL på 20% opløsende poloxameropløsning.
- 5 μL af læsseopløsningen påføres 5 mL opvarmet Tyroders opløsning (i alt 0,1x farvekoncentration) i en 20 mm petriskål.
BEMÆRK: Den endelige farvekoncentration er 0,1x. Dette er 1/10th, der foreslås af producenten. Dette sparer ressourcer, sikrer ubetydelig cytotoksicitet, og vigtigst af alt bevarer det stadig klare optiske signaler fra indlæste celler med høje signal- til støjforhold. - Der tilsættes en enkelt iPSC-CM-dækselsglidning til fadet, og inkuber ved 37 °C i 20 min.
- Saml et opvarmet levende cellebilledkammer. Monter på mikroskopstadiet og fyld med 500 μL frisk Tyroders opløsning.
- Dæksleren vaskes med frisk Tyroders opløsning ved 37 °C.
- Påfør forsigtigt iPSC-CM coverlip på det forvarmede badkammer ved hjælp af fine punkttakter.
BEMÆRK: Sørg for, at kammeret og dets indhold altid opvarmes ved fysiologiske temperaturer. Hvis det ønskes, påbegyndes med kontinuerlig perfusion af opvarmet Tyroders opløsning.
4. Elektrisk feltstimulering
BEMÆRK: Ekstern udløsning af iPSC-CM er valgfri, men nyttig til standardisering af cellulære dynamikker og eksperimentelle parametre. Det øger analysens lethed og giver mulighed for at undersøge frekvensafhængige virkninger.
- Fastgør en stimuleringsindsats med to platinelektroder, der er fordelt med 5 mm fra hinanden i optagekammeret.
- Tilslut en ekstern stimulator til stimuleringsindsatsen. Indstillet til 5 ms bipolar feltimpulser ved 0,5 Hz.
- Bestem optimal stimuleringsspænding ved at øge stimulus fra 1 V og opefter. Tærskel stimulus er defineret som den laveste spænding, hvor cellerne begynder at trække sig sammen. Påfør spændinger omkring 25% over denne tærskel. Normalområdet er mellem 1 V og 30 V.
- Fix stimulation frekvens med den eksterne stimulator eller udløse det med erhvervelse software.
5. Optisk aktion potentiel erhvervelse
BEMÆRK: Denne protokol bruger en kommerciel software til anskaffelse og analyse.
- Visualiser myocytterne i brightfield-visning ved hjælp af den overførte lyssti og USB-kameraet.
- Vælg en isoleret celle og beskær dens optiske kurve tæt med feltmembranen, der sikrer, at kun lys fra interessecellen overvåges.
- Aktiver PMT forstærkeren og indstil PMT-forsyningen til 750 V.
- Kør stimuleringsprotokollen (se trin 4) sammen med anskaffelsessoftwaren, og aktivér samtidig 470 nm excitationslampen. Sidstnævnte kan gøres via et fjernpanel eller automatiseres med en fast intensitet (TTL-signal).
- Juster gain og offset af PMT forstærker for at sikre, at signalet ikke mætter og er optimeret til registreringsområdet af optagelsessystemet.
- Record 10 sweeps sikre stabile handling potentialer opdages.
- Fortsæt optagelsen og straks flytte mikroskop fase til kort erhverve baggrundssignal fra et område blottet for celler. Sluk for excitationslyset.
BEMÆRK: Denne baggrundsværdi (Foffset) vil blive brugt til at tage højde for enhver baggrundslyscens. - Hvis det ønskes, lokalt gennemgå referencemedicin såsom 1 μM nifedipine at identificere cellulære reaktioner på farmakologisk manipulation.
- Gentag trin 5.2-5.7 på sekventiel vis, hver gang du vælger en ny celle. Swap out coverslips, hvis det ønskes for at sikre høj eksperimentel omsætning i et enkelt møde.
BEMÆRK: Protokoller for indlæsning og billedopsamling er beskrevet i figur 2.
6. Dataanalyse
- Åbn en gemt optagelse med analysesoftwaren og i gennemsnit 10 sweeps, der indeholder stimulerede handlingspotentialer fra en enkelt celle.
- Tag et gennemsnit af det oprindelige signal, der repræsentererF-forskydning, og træk dette fra det gennemsnitlige spor.
- Beregn ∆F/F0 med følgende formel (hvor F måles fluorescens og F0 er diastolisk fluorescens):
- Identificere spor baseline (diastolisk) og interesseområde (AP) og måle de ønskede hjertehandling potentielle parametre. Dette omfatter, men er ikke begrænset til henfaldstiden for 50% (APD50)og 90% (APD90)repolarisering.
- Eksporter dataene fra denne enkelt celle til en regnearkssoftware.
- Gentag trin 6.1 – 6.5 for alle optagelser. Vurder resultater med passende umalede test eller analyse af variansen.
Figur 2: Protokoller for indlæsning og billedopsamling. (A) Rutediagram over komplet VF2.1Cl-indlæsningsprotokol for iPSC-CMs og indbyggede kardiomyocytter. (B) Et forenklet skema over BS-konfigurationer (beam splitter) og filterkonfigurationer, der anvendes i denne protokol til excitation og påvisning af VF2.1Cl-emission som reaktion på ændringer i transmembranspændingen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Optisk handlingspotentiale (AP) profiler af isolerede indfødte kardiomyocytter og menneskeskabte pluripotente stamcelle afledte kardiomyocytter (iPSC-CM). (A) Repræsentativ optisk AP af en enkelt murin kardiomyocyt (i midten) med Middel ± SEM på APD50 og APD90 (n = 7, højre). (B) Repræsentativ optisk AP af en enkelt human iPSC afledt kardiomyocyt (i midten) med Middel ± SEM på APD50 og APD90 (n = 48, højre). (C) Farmakologisk manipulation af iPSC-CM AP (i midten) med 1 μM nifedipine. Gennemsnitlig ± SEM af APD90 ændring efter nifedipine ansøgning (n = 5). **p < 0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Et højt signal til støjforhold blev regelmæssigt observeret i vores prøver, på trods af det reducerede synsfelt, når der fokuseres på en enkelt celle. Mere støj blev observeret i mindre iPSC-CMs, men det forhindrede ikke analyse efter ensemble gennemsnit. AP morfologi er klart defineret, hvilket giver et grundigt overblik over cellulær elektrofysiologisk funktion og repolarisering mekanik på tværs af kardiomyocyt konstruktioner. Bemærk egenskaber er de tidligere beskrevne15 skarpe upstrokehastighed og udtalte fase 1-egenskaber ved murin cardiomyocytter (APD50: 58.34±17.98 ms, APD90: 160.9±30.15 ms, n=7; Figur 3A) som er morfologisk adskilt fra menneskelige iPSC-cm optiske signaler (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n=48 Figur 3B). Vi observerede en højere hastighed af fotobleaching og cellulær toksicitet efter optisk undersøgelse i indfødte kardiomyocytter sammenlignet med dyrkede menneskelige iPSC-CMs. Protokoller til forberedelse og farvebelastning i indfødte kardiomyocytter er inkluderet i det supplerende materiale.
Human iPSC-CM er lydhøre over for farmakologisk manipulation med nifedipin (1 μM). En kendt L-type Ca2 + kanal (CaV1.2) antagonist, nifedipine forventes at reducere AP varighed i celler med fysiologisk funktion. Under kontinuerlig lægemiddelpåføring blev der observeret et fald på 41,5 % i APD90 (n=5), hvilket tyder på både det fysiologiske udtryk for CaV1.2-kanaler i disse celler og funktionaliteten af VF2.1Cl-baseret billeddannelse som en platform for potentielle højtryksundersøgelse af hjertemedicin (Figur 3C).
Supplerende materiale: Native murine kardiomyocyt forberedelse til spænding billeddannelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en grundlæggende protokol til nemt at erhverve detaljerede AP profiler fra isolerede iPSC-CMs egnet til elektrofysiologisk modellering og hjertemedicin screening. Vi registrerer regelmæssige, robuste APs fra vores sparsomt seedede iPSC-CMs, som antyder både indikatorfunktionalitet og metodologisk troskab.
På grund af det brede spektrum af kommercielle metoder til iPSC omprogrammering og manglende standardisering for hjertedifferentiering protokoller, iPSC baserede modeller kan vise enorme variation i deres funktion og morfologi16. Dette kan også hindre effektiviteten af kardiotoksicitet undersøgelser. Vi rapporterer generelt robuste reaktioner på udvidet eksperimentel undersøgelse med minimal indikator-induceret cytotoksicitet ved lave excitation lysintensiteter. Standardisering af grundlæggende dissociation og coverslip såning er afgørende for at sikre ensartet kvalitet af iPSC-CM præparater. Løse coverlips, som let kan indsættes og udskiftes inde i billeddannelsesplatformen, er utroligt nyttige til hurtig dataindsamling og karakterisering af enkelte kardiomyocytter. Det skal dog bemærkes, at vi observerer et lille fald i celle levedygtighed efter længere perioder (dvs. mere end 4 uger) af sparsom kultur på glas coverslips.
Den modulære konstruktion af et højhastighedsfotometrisystem, der er skitseret i trin 2, er af afgørende betydning for denne protokol. Mange optikbaserede opsætninger er kommercielt tilgængelige og kan optimeres til en lang række krav til signaloptagelse. Disse spænder fra kvantitativ billeddannelse ved hjælp af høj opløsning, store område kameraer til fotometri målinger af det samlede signal fra et defineret område. Ved hjælp af sidstnævnte kvantificerer vi fluorescens ved høj hastighed fra et enkelt maskeret område ved hjælp af en fotomultiplier (PMT). Kombineret med hurtige koblingsbelysningskomponenter giver dette mulighed for grundig dissektion af hurtige handlingspotentialekomponenter med ekstremt høj tidsmæssig opløsning (analogt signal op til 1 kHz). Høje prøvetagningshastigheder er nødvendige for at sikre pålidelige målinger af handlingspotentialet i kardiomyocytter og kan være kritisk i andre spændende konstruktioner (dvs. neuroner) med ekstremt hurtig excitation kinetik. Endvidere er dette fleksible system gavnligt, fordi 1) det giver mulighed for grundig undersøgelse af enkeltcelleelektrofysiologi med feltmembranvalg, 2) digitalisering af det analoge signal ikke er integreret eller forarbejdet og er derfor direkte under eksperimentatorkontrol, 3) fotometriinstrumenteringens modulære karakter gør det muligt at foretage en enkel omstrukturering for at muliggøre samtidig optisk måling med andre indikatorer eller mikroelektroder. Tilføjelse af en anden fotomultiplierkanal med passende filtersæt for at undgå spektral overlapning vil muliggøre en ægte samtidig måling af den fluorescerende intracellulære calciumindikator CAL-590 sammen med VF2.1Cl. Det er også vigtigt at bemærke , at dette multifunktionssystem alternativt kan anvendes til dyb vurdering af intracellulær calciumhåndtering som tidligere beskrevet17,18,19,20.
Mens den tidsmæssige opløsning af vores system giver mange fordele, skal det bemærkes, at parametre, der kræver analyse af den rumlige fordeling af fluorescenssignaler, såsom excitationsmønstre eller ledningshastighed, ikke er egnede til undersøgelse af de fotometriteknikker, som vi bruger her og er inden for optisk kortlægning. Den hardware, der er beskrevet her, kan let konverteres til en optisk kortlægningskonfiguration ved udveksling af fotomultiplieren til et passende specialkamera med høje billedhastigheder og stor brøndkapacitet. Vores beskrevne konfiguration kan tilbyde ekstremt detaljerede tidsmæssige oplysninger til en brøkdel (op til 1/10th)af den kommercielle pris på avancerede store område kameraer med tilsvarende kapaciteter. Confocal line scan teknikker er også mere rumligt detaljerede end vores metode, men begrænsninger i z begrænse fluorescens erhvervelse fra flere tværgående planer på én gang. Dette er ikke ideelt til billeddannelse membran bundet reportere indehaves af iPSC-CMs med typisk heterogene morfologier. Fotometrimålinger ved hjælp af et standard epifluorescencemikroskop undgår dette problem ved at få adgang til hele den cellulære overflade øjeblikkeligt, igen til en meget lavere pris pr. datapunkt.
Vi anbefaler stærkt VF2.1Cl til udførelse af spændingsanalyser med spændende celler. I øjeblikket er mange VSD'er tilgængelige, der opererer under en lang række forskellige mekanismer, hver med deres egne iboende begrænsninger. Almindelige elektrokromiske styrylfarvestoffer som di-8-ANEPPS eller di-4-ANBDQBS , der viser hurtige reaktioner på transmembranspænding, hæmmes dog af lav følsomhed og høj kapacitiv belastning21,22. Genetisk kodede spændingsindikatorer (GEMI'er) anvender sammensmeltningen af fluorescerende proteiner til molekylær spændingsfølingsdomæner23 eller mikrobielle opsins24 og giver meget følsomme dissektioner af cellulær spændingsdynamik, men hindres af reducerede kinetika og ikke-lineære reaktioner. En liste over almindelige VSD'er og deres grundlæggende dynamiske egenskaber er inkluderet i tabel 1. PeT-sonder som VF2.1Cl tilbyder et godt kompromis, der viser hurtige kinetikere og anstændig følsomhed med minimal cellulær forstyrrelse. Denne VSD er dog begrænset, fordi den i modsætning til forholdetsmetrale styrylfarvestoffer21ikke kan bruges til at løse det absolutte membranpotentiale. Denne iboende ulempe fremhæver den uheldige konsekvens af at opretholde datapræcisighed ved højere gennemløb ved analyse af cellulær elektrofysiologi.
|
Følsomhed (% ∆F/F pr. 100mV) |
Hastighed (ms) | |
| PeT-baserede farvestoffer | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 | 47 | <1 |
| Hemicyanin farvestoffer | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEVIs | ||
| ArcLight30 | 32 | 12324 |
| Arch D95N31 | 40 | 4124 |
| Havfrue32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2,333 | 13.3 | 2523 |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| BÅND | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabel 1: En kort liste over almindelige VSD'er og deres vigtigste fluorescerende egenskaber.
Vi bemærker, at excitation-sammentrækning uncouplers såsom blebbistatin eller 2,3-butan-dion monoxime (BDM) bruges ofte i optiske spænding målinger for at reducere bevægelse artefakt ved at undertrykke hjerte sammentrækning35. Tidligere rapporter har imidlertid vist , at begge forbindelser forlænger AP's varighed betydeligt og udfladning af AP-restitution i hele perfunderede hjerter36,37. Desuden har blebbistatin fluorescerende egenskaber, der overlapper med spektret af VF2.1Cl og derfor ikke er egnet til brug med dette farvestof38.
Vores alsidige protokol kræver minimale justeringer for optisk undersøgelse af en række todimensionelle og tredimensionelle spændende konstruktioner. Denne metode giver mulighed for hurtig og præcis kvantificering af repolarisering mekanik, som kan give værdifuld indsigt i cellulære ioniske abnormiteter. I vores hænder leverer denne protokol klare optiske signaler med gode signal- til støjforhold selv i mindre celler. Vores enkle og effektive platform kan anvendes til ikke-invasiv validering af hjertemedicinsk sikkerhed og høj gennemløbsscreeningsundersøgelser ved hjælp af patientspecifikke iPSC-CMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cairn Research Ltd støttede denne publikation ved at dække produktionsomkostningerne for videofilen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Cairn Research Ltd. for deres art finansielle bidrag, der dækkede produktionsomkostningerne ved denne publikation. Derudover takker vi Ines Mueller og Fru Stefanie Kestel for deres fremragende tekniske support.
Forfatternes forskning støttes af Det Tyske Center for Hjerte-Kar-Forskning (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 og under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2067/1- 390729940) og Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
