Summary
Her beskriver vi optisk anskaffelse og karakterisering av virkningspotensialer fra indusert pluripotent stamcelle avledet kardiomyocytter ved hjelp av et høyhastighets modulært fotometrisystem.
Abstract
Konvensjonelle intracellulære mikroelektrode teknikker for å kvantifisere kardiomyocytt elektrofysiologi er ekstremt komplekse, arbeidskrevende, og utføres vanligvis i lav gjennomstrømning. Rask og pågående utvidelse av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) presenterer en ny standard innen kardiovaskulær forskning, og alternative metoder er nå nødvendige for å øke gjennomstrømningen av elektrofysiologiske data på et enkelt cellenivå. VF2.1Cl er et nylig avledet spenningssensitivt fargestoff som gir en rask enkeltkanals, høy størrelsesrespons på svingninger i membranpotensialet. Den har kinetikk som er bedre enn andre eksisterende spenningsindikatorer og gjør tilgjengelige funksjonelle data tilsvarende tradisjonelle mikroelektrodeteknikker. Her demonstrerer vi forenklede, ikke-invasive handlingspotensialkarakterisering i eksternt tempo menneskelige iPSC-avledede kardiomyocytter ved hjelp av et modulært og svært rimelig fotometrisystem.
Introduction
Elektrofysiologisk modellering av kardiomyocytter og bygging av effektive plattformer for screening av hjertemedisin er avgjørende for utvikling av terapeutiske strategier for en rekke arytmiske lidelser. Rask utvidelse av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har gitt lovende inngrep i modellering av menneskers sykdom og farmakologisk undersøkelse ved hjelp av isolerte pasientavledede kardiomyocytter (iPSC-CM). "Gullstandard" teknikker for elektrofysiologisk karakterisering av disse cellene gjennom patch-clamp (strømklemme) kan kvantifisere virkningspotensial (AP) morfologi og varighet, men denne metoden er utrolig kompleks og langsom, og ikke godt egnet for høy gjennomstrømningsdatainnhenting1. iPSC-CMs rapporteres regelmessig å ha et økt diastolisk membranpotensial og økt lekkasjestrøm sammenlignet med voksne innfødte kardiomyocytter2. Det foreslås at mindre cellestørrelse og redusert membran kapasitans observert i iPSC-CMs kan gi noen systematiske feil når du bruker dagens klemmeteknikk, kanskje forklare disse avvikene3. For å maksimere nytten av en iPSC-CM-plattform, er en ekstra metode verdifull for å øke gjennomstrømningen og sikre datanøyaktighet når du karakteriserer transmembranspenningsendringer på et enkelt cellenivå i iPSC-CMs.
Spenningssensitive fargestoffer (VSD) har lenge vært en foreslått metode for å gi raskere, ikke-invasiv og tilsvarende analyse av hjerte-AP-kinetikk sammenlignet med de av tradisjonelle teknikker4. En nylig studie har vist egnetheten til ratiometrisk spenningssensitiv sondefotometri for å nøyaktig kvantifisere hjertet AP5. Videre gir evnen til å enkelt skalere opp optiske fotometritilnærminger denne teknikken til store kardiotoksisitetsskjermer som er kritiske i terapeutisk legemiddelutvikling (f.eks. CiPA). Utvikling av standardiserte kardiotoksisitetsprotokoller i en blindet flerstedsstudie ved hjelp av mikroelektrode array og spenningssensor optiske teknikker har vist nøkkelverdien av denne tilnærmingen6.
Mange potensiometriske fargestoffer er kommersielt tilgjengelige, og pågående syntetisk utvikling av nye sonder viser spennende potensial for å effektivisere effektiviteten på tvers av en rekke hjerte- og nevrale konstruksjoner. Den ideelle VSD vil ha utvidet kinetikk og følsomhet, samtidig som den viser redusert kapasitiv belastning, fotobleaching og cytotoksisitet. Den nylig syntetiserte VF2.1Cl (FluoVolt) uttrykker mange av disse fordelaktige egenskapene, hovedsakelig på grunn av sin nye trådbaserte molekylære struktur, delt av andre medlemmer av den nye VoltageFluor (VF) -familien7. I motsetning til vanlige elektrokrome VSDer der enkle sonder molekylært og elektrisk konjugerer til plasmamembranen, består dette fargestoffet av en passivt innsatt, membran-spanning syntetisk ledning som parrer en elektronrik donor med en modifisert fluorescein fluorofor (FITC). Mekanistiske detaljer finnes i figur 1. Dette fargestoffet viser utmerket følsomhet for svingninger i membranspenningen, og viser en 27% endring i utslippsintensitet per 100 mV i motsetning til ~ 10% sett i andre vanlige sonder ved sammenlignbare hastigheter7. I tillegg samhandler ikke trådbaserte PeT-systemer direkte med det cellulære elektriske feltet som gir minimal elektrisk interferens og ubetydelige endringer i cellulær kapasitiv belastning.
Figur 1: Kjemiske, spektrale og mekanistiske parametere for VF2.1Cl fargestoff. (A) Kjemisk struktur av VF2.1Cl. Molekylære egenskaper å merke seg inkluderer flere alkylgrupper i fenylen vinylen molekylær ledning som letter innsetting i plasmamembranen. En negativt ladet sulfonsyregruppe som er konjugert til FITC-sonden sikrer fluoroforstabilisering på den ekstracellulære overflaten og hjelper nær vinkelrett innsetting i forhold til det elektriske feltet til lipidbilayeren. (B) Et forenklet skjematisk for vinkelrett VF2.1Cl-innebygging i plasmamembranen til en målcelle. (C) Absorpsjon og utslipp spektra av VF2.1Cl fargestoff. Spectra er identisk med standard FITC- og GFP-sonder. (D) Skildring av den mekanistiske virkningsmodusen til VF2.1Cl. Under hvileforhold (hyperpolarisert) driver negative intracellulære spenninger frie elektroner mot rostral fluorofor. Elektron overflod sikrer fotoindusert elektronoverføring (PeT) favoriseres som en vei ut av spent tilstand etter optisk eksitasjon, effektivt slukke fluorescens. Derimot påvirker et depolarisert membranpotensial nedadgående elektronbevegelse som favoriserer fluorescens ved optisk eksitasjon. Den resulterende fluorescerende responsen er lineært relatert til membranspenning og kan nøyaktig brukes til å samle detaljert tidsinformasjon om cellulær elektrofysiologisk kinetikk. (E) Representative brightfield (øvre) og fluorescens ved 470 nm (nedre) bilder av leporine kardiomyocytter lastet med VF2.1Cl. (F) Z-stabel med en enkelt lastet kardiomyocytt. Piler indikerer områder med klar lokalisering av VF2.1Cl til cellulær membran. Bilder ble anskaffet med et spinnende diskkonfokalt system som består av en X-lightv3 spinnende disk konfokalt hode med et 50 μm pinhole mønster; LDI-7 belysning; Prime95B kamera og en PlanApo Lambda 100x mål. Skalalinje: 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
FITC-proben som er konjugert til VF2.1Cl, sikrer at den kan brukes effektivt under standard- og GFP-filterkonfigurasjoner, og den krever bare et enkeltkanals oppkjøpssystem, som begge er vanlige egenskaper ved fluorescerende bildeplattformer. Analyse av tette menneskelige iPSC-CM monolayers med dette fargestoffet har nylig blitt rapportert8,9,10,11. Vår protokoll skiller seg fra disse studiene på grunn av vår undersøkelse av enkle, isolerte iPSC-CMer, uforstyrret av de elektriske og parakrine påvirkningene av tette synytiale monolayers, og vår bruk av et rimelig og tilpassbart fotometrisystem i motsetning til komplekse konfølende eller bredfelts bildebehandlingsordninger.
Her beskriver vi vår protokoll for rask anskaffelse og analyse av robuste optiske APer fra isolerte humane iPSC-avledede kardiomyocytter og innfødte kardiomyocytter (se Tilleggsfil). Vi bruker VF2.1Cl kombinert med en tilpassbar toppmoderne plattform for enkeltcellet fotometrimålinger. Disse eksperimentelle protokollene er godkjent av etikkkomiteen ved Universitetssykehuset Göttingen (nr. 10.9.15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellulære preparater
MERK: Humane iPSCer som brukes i denne protokollen ble avledet fra friske donorer og differensiert i monolayers ved hjelp av fullt definert liten molekylmodulering av WNT-signalering og laktatrensingsteknikker som tidligere beskrevet12,13,14. iPSC-CMs ble opprettholdt hver 2-3 dager med et kulturmedium skissert nedenfor.
- Forbered et kulturmedium av basal medium (RPMI 1640) og 2% supplement (B27). Oppbevars ved 4 °C. Brukes ved romtemperatur (RT).
- Forbered et plating medium av basal medium (RPMI 1640), 2% supplement (B27) og 1:2000 ROCK hemmer. Oppbevars ved 4 °C. Bruk ved RT.
- Frakk sterilisert 10 mm rundt glass #0 deksler med 150 μL av 1:60 faktorfri kjellermembranmatrise og inkuber ved 4 °C i 4 timer.
MERK: Optimalisering av deksler er nødvendig for å sikre at hele glasset er dekket samtidig som det opprettholdes tilstrekkelig overflatespenning for å forhindre søl. 150 μL anbefales for 10 mm runde deksler. Batchstørrelse, coverliptype, coverlipvolum og kulturplatetype kan tilpasses eksperimentenes behov. - Start iPSC-CM-dissosiasjon med en EDTA-basert celledissosiasjonsreagens. Påse at monolayeren er helt løsrevet ved å skylle forsiktig med en 1000 μL pipette.
- Overfør den cellulære suspensjonen til et 15 ml rør og tilsett dobbeltvolumbeleggmedium. Sentrifuge i 10 min ved 100 x g.
- Resuspend pellet med ønsket volum (resuspension volum) av plating medium. Telle celler manuelt eller elektronisk.
- Velg optimal tetthet per dekslerlip (15,000) som vil tillate den isolerte cellulære analysen senere.
- Beregn volumet av 'aktiv' cellulær suspensjon (A) som trengs for å plate alle deksler på denne ønskede tettheten. Påfør følgende formel og trekk deg tilbake i et eget rør:
- Beregn volumet av ekstra plating medium (B) som trengs for å imøtekomme hver dekslelip på ønsket volum. Påfør følgende formel og legg til det resulterende volumet på røret med aktiv suspensjon:
- Fjern matrisen fra dekslerlips og påfør 'coverlip volum' av celle suspensjon (A + B) på hver coverlip. Resuspend regelmessig i røret for å sikre jevn cellulær distribusjon.
- Inkuber ved 37 °C i 1 time. Fyll brønnen forsiktig med plating medium.
- Etter 24 timer, utveksle medier med normalt kulturmedium og opprettholde hver 2-3 dager.
2. Eksperimentelt oppsett
- Utstyr et invertert epifluorescensmikroskop med en 40x forstørrelse, høy numerisk blenderåpningslinse (N.A: > 0,75) for å utføre eksperimenter.
- Koble en raskt bytte varm hvit LED til den overførte belysningsporten på mikroskopet. Sett inn et enkelt rødt filter på 660 nm i den overførte lysbanen.
MERK: Dette lyset kan aktiveres gjennom fotometriforsøk for å observere prøven uten å forurense det grønne fluorescerende signalet. - Monter et raskt vekslingshode på 470 nm for fotometriopptak. Sett inn et eksitasjonsfilter på 470/40 ved epifluorescent-porten på mikroskopet for å rense opp lyset som genereres av LED-lampen.
MERK: For optimal signalkrantifisering anbefales et belysningssystem med høyhastighetstilbakemeldingskontroll av optisk utgang. - Sett inn en mikroskopkube som inneholder en 495 nm lang passstrålesplitter i speilenhetens karusell i mikroskopet.
- Monter en deteksjonsarm som inneholder en justerbar feltmembran, til mikroskopets C-monterport for å tillate valg av interesseområde.
- Koble separat en fotomultiplierdetektor (PMT) og et USB-kamera til mikroskopet. Dette vil danne grunnlaget for utslippsdeteksjonssystemet.
- Sett inn en filterkube som inneholder en 565 nm lang passstrålesplitter og et 535/50 utslippsfilter i PMT-porten. Dette deler utslippslyset mellom de to detektorene.
MERK: Et kamera som er koblet til den overførte porten til utslippsdeteksjonssystemet, kan oppdage overført lys under brightfield gjennom alle eksperimenter. - Koble PMT til en strømforsyning og en PMT-forsterker. Koble PMT-forsterkerutgangen til en analog inngangspinne for et datainnsamlingssystem.
- Filtrer analoge data fra PMT ved 1 kHz eller høyere.
- Digitaliser data med en frekvens som er minst dobbelt så stor som den høyeste frekvensen som finnes i analogt signal (2 kHz eller høyere) for å oppfylle Nyquist-kriteriene og forhindre alias.
3. Mobil lasting med VF2.1Cl
MERK: Alle trinn som involverer dette fargestoffet må utføres under dårlige lysforhold.
- Forbered en Tyrodes badeløsning av (i mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glukose, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 og varm til 37 °C.
- Forbered en aliquot av lastløsning i et mikrosenterrør ved å blande 5 μL 1000x VF2.1Cl og 50 μL 20% solubilizing poloxamer løsning.
- Påfør 5 μL av lasteløsningen på 5 ml oppvarmet Tyrodes oppløsning (totalt 0,1x fargekonsentrasjon) i en 20 mm Petri-tallerken.
MERK: Endelig fargekonsentrasjon er 0,1x. Dette er 1/10th som er foreslått av produsenten. Dette sparer ressurser, sikrer ubetydelig cytotoksisitet, og viktigst, beholder fortsatt klare optiske signaler fra ladede celler med høyt signal- til støyforhold. - Tilsett en enkelt iPSC-CM dekselslipp på parabolen og inkuber ved 37 °C i 20 minutter.
- Sett sammen et oppvarmet levende celleavbildningskammer. Monter på mikroskopstadiet og fyll med 500 μL fersk Tyrodes oppløsning.
- Vask dekslene med fersk Tyrodes oppløsning ved 37 °C.
- Påfør iPSC-CM-dekslene forsiktig på det forvarmede badekammeret ved hjelp av fine punkt tang.
MERK: Sørg for at kammeret og innholdet alltid varmes opp ved fysiologiske temperaturer. Begynn om ønskelig med kontinuerlig perfusjon av oppvarmet Tyrodes løsning.
4. Elektrisk feltstimulering
MERK: Ekstern utløsning av iPSC-CM er valgfritt, men nyttig for standardisering av cellulær dynamikk og eksperimentelle parametere. Det øker den enkle analysen og muliggjør undersøkelse av frekvensavhengige effekter.
- Fest en stimuleringsinnsats med to platinaelektroder fordelt 5 mm fra hverandre i opptakskammeret.
- Koble en ekstern stimulator til stimuleringsinnsatsen. Sett til 5 ms bipolare feltpulser på 0,5 Hz.
- Bestem optimal stimuleringsspenning ved å øke stimulansen fra 1 V og oppover. Terskel stimulans er definert som den laveste spenningen der celler begynner å trekke seg sammen. Påfør spenninger omtrent 25% over denne terskelen. Normal rekkevidde er mellom 1 V og 30 V.
- Fest stimuleringsfrekvensen med den eksterne stimulatoren eller utløs den med oppkjøpsprogramvare.
5. Optisk handling potensiell oppkjøp
MERK: Denne protokollen bruker en kommersiell programvare for anskaffelse og analyse.
- Visualiser myocyttene i brightfield-visning ved hjelp av den overførte lysbanen og USB-kameraet.
- Velg en isolert celle og beskjær den optiske banen tett med feltmembranen, slik at bare lys fra cellen av interesse overvåkes.
- Aktiver PMT-forsterkeren og sett PMT-forsyningen til 750 V.
- Kjør stimuleringsprotokollen (se trinn 4) sammen med anskaffelsesprogramvaren og aktiver samtidig eksitasjonslyset på 470 nm. Sistnevnte kan gjøres via et eksternt panel eller automatiseres med en fast intensitet (TTL-signal).
- Juster forsterkning og forskyvning av PMT-forsterkeren for å sikre at signalet ikke metter og er optimalisert for registreringsområdet til opptakssystemet.
- Registrer 10 feiringer som sikrer stabile handlingspotensialer.
- Fortsett innspillingen og flytt umiddelbart mikroskopstadiet for å kort skaffe bakgrunnssignal fra et område uten celler. Slå av eksitasjonslyset.
MERK: Denne bakgrunnsverdien(F-forskyvning ) vil bli brukt til å ta høyde for all bakgrunnsfluorescens. - Om ønskelig, lokalt parfymere referansemedisiner som 1 μM nifedipine for å identifisere cellulære responser på farmakologisk manipulasjon.
- Gjenta trinn 5.2-5.7 hver gang du merker en ny celle, på en sekvensiell måte. Bytt ut deksler hvis ønskelig for å sikre høy eksperimentell omsetning i en enkelt sittende.
MERK: Innlastings- og bildeanskaffelsesprotokoller er beskrevet i figur 2.
6. Dataanalyse
- Åpne et lagret opptak med analyseprogramvaren og gjennomsnittlig 10 sveip som inneholder stimulerte handlingspotensialer fra en enkelt celle.
- Ta en del av basislinjesignalet som representererF-forskyvning, og trekk dette fra den gjennomsnittlige sporingen.
- Beregn ∆F/F0 med følgende formel (der F måles fluorescens og F0 er diastolisk fluorescens):
- Identifiser sporgrunnlinjen (diastolisk) og interesseområdet (AP) og mål de ønskede potensielle hjertevirkningsparametrene. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, forfallstiden for 50% (APD50) og 90% (APD90) repolering.
- Eksporter dataene fra denne enkeltcellen til en regnearkprogramvare.
- Gjenta trinn 6.1 – 6.5 for alle innspillinger. Vurder resultater med passende ubetalte tester eller variansanalyse.
Figur 2: Innlastings- og bildeanskaffelsesprotokoller. (A) Flytskjema for fullstendig VF2.1Cl-innlastingsprotokoll for iPSC-CMer og opprinnelige kardiomyocytter. (B) En forenklet skjematisk av strålesplitter (BS) og filterkonfigurasjoner som brukes i denne protokollen for eksitasjon og deteksjon av VF2.1Cl-utslipp som svar på endringer i transmembranspenning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Optisk virkningspotensial (AP) profiler av isolerte innfødte kardiomyocytter og menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (iPSC-CM). (A) Representativ optisk AP av en enkelt murine kardiomyocytt (midten) med Mean ± SEM av APD50 og APD90 (n = 7, høyre). (B) Representativ optisk AP av en enkelt menneskelig iPSC avledet kardiomyocytt (i midten) med Mean ± SEM av APD50 og APD90 (n = 48, høyre). (C) Farmakologisk manipulering av iPSC-CM AP (i midten) med 1 μM nifedipine. Gjennomsnittlig ± SEM av APD90-endring etter nifedipinpåføring (n =5). **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Et høyt signal-til-støy-forhold ble regelmessig observert i våre prøver, til tross for redusert synsfelt når vi fokuserte på en enkelt celle. Mer støy ble observert i mindre iPSC-CMer, men det hindret ikke analyse etter ensemblegjennomsnitt. AP morfologi er klart definert, noe som gir en grundig oversikt over cellulær elektrofysiologisk funksjon og repoleringsmekanikk på tvers av kardiomyocyttkonstruksjoner. Merknadsegenskaper er de tidligere beskrevne15 skarpe oppslagshastigheten og uttalt fase 1-egenskapene til murin kardiomyocytter (APD50: 58,34±17,98 ms, APD90: 160,9±30,15 ms, n = 7; Figur 3A) som er morfologisk forskjellig fra humane iPSC-CM optiske signaler (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n = 48; Figur 3B). Vi observerte en høyere grad av fotobleaching og cellulær toksisitet etter optisk undersøkelse hos innfødte kardiomyocytter sammenlignet med dyrkede menneskelige iPSC-CMer. Protokoller for tilberedning og fargestoffbelastning i innfødte kardiomyocytter er inkludert i tilleggsmaterialet.
Human iPSC-CM reagerer på farmakologisk manipulasjon med nifedipin (1 μM). En kjent L-type Ca2+ kanal (CaV1.2) antagonist, nifedipine forventes å redusere AP-varigheten i celler med fysiologisk funksjon. Under kontinuerlig legemiddelbruk ble det observert en 41,5 % reduksjon i APD90 (n=5), noe som tyder på både det fysiologiske uttrykket for CaV1.2-kanaler i disse cellene og funksjonaliteten til VF2.1Cl-basert avbildning som en plattform for prospektive screeningstudier med høyt gjennomstrømningsmedisin (figur 3C).
Tilleggsmateriale: Innfødt murin kardiomyocyttpreparat for spenningsavbildning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en grunnleggende protokoll for enkelt å skaffe detaljerte AP-profiler fra isolerte iPSC-CMer egnet for elektrofysiologisk modellering og hjertemedisinscreening. Vi oppdager regelmessige, robuste APer fra våre tynt frøede iPSC-CMer som antyder både indikatorfunksjonalitet og metodisk gjengivelse.
På grunn av det brede spekteret av kommersielle metoder for iPSC-omprogrammering og mangel på standardisering for hjertedifferensieringsprotokoller, kan iPSC-baserte modeller vise enorm variasjon i deres funksjon og morfologi16. Dette kan også hindre effektiviteten av kardiotoksisitetsstudier. Vi rapporterer generelt robuste svar på utvidet eksperimentell undersøkelse med minimal indikatorindusert cytotoksisitet ved lave eksitasjonslysintensiteter. Standardisering av grunnleggende dissosiasjon og coverlip såing er avgjørende for å sikre konsistent kvalitet på iPSC-CM preparater. Løse deksler, som enkelt kan settes inn og erstattes inne i bildeplattformen, er utrolig nyttige for rask datainnsamling og karakterisering av enkle kardiomyocytter. Det skal imidlertid bemerkes at vi observerer en liten nedgang i celle levedyktighet etter lengre perioder (dvs. mer enn 4 uker) av sparsom kultur på glassdeksler.
Den modulære konstruksjonen av et høyhastighets fotometrisystem skissert i trinn 2 er av avgjørende betydning for denne protokollen. Mange optikkbaserte oppsett er kommersielt tilgjengelige og kan optimaliseres for et bredt spekter av krav til signalopptak. Disse spenner fra kvantitative bilder ved hjelp av høyoppløselige kameraer i stort område til fotometrimålinger av totalt signal fra et definert område. Ved hjelp av sistnevnte kvantifiserer vi fluorescens ved høy hastighet fra et enkelt maskert område ved hjelp av en fotomultiplier (PMT). Kombinert med raske koblingsbelysningskomponenter, gir dette mulighet for grundig disseksjon av hurtigvirkende potensielle komponenter med ekstremt høy temporal oppløsning (analogt signal opptil 1 kHz). Høye samplingsfrekvenser er nødvendig for å sikre pålitelige målinger av virkningspotensiale oppsving i kardiomyocytter og kan være kritisk i andre spennende konstruksjoner (dvs. nevroner) med ekstremt rask eksitasjonskinetikk. Videre er dette fleksible systemet gunstig fordi 1) det muliggjør grundig undersøkelse av encellet elektrofysiologi med valg av feltmembran, 2) digitalisering av det analoge signalet er ikke integrert eller forhåndsbehandlet og er derfor direkte under eksperimenteringskontroll, 3) den modulære karakteren av fotometriinstrumentering tillater enkel rekonfigurering for å muliggjøre samtidig optisk måling med andre indikatorer eller mikroelektroder. Tilsetning av en annen fotomultiplierkanal, med passende filtersett for å unngå spektral overlapping, vil muliggjøre sann samtidig måling av fluorescerende intracellulær kalsiumindikator CAL-590 sammen med VF2.1Cl. Det er også viktig å merke seg at dette flerbrukssystemet kan brukes alternativt til dyp vurdering av intracellulær kalsiumhåndtering som tidligere beskrevet17,18,19,20.
Selv om den tidsmessige oppløsningen til systemet vårt gir mange fordeler, bør det bemerkes at parametere som krever analyse av den romlige fordelingen av fluorescenssignaler, for eksempel eksitasjonsmønstre eller ledningshastighet, ikke er egnet for undersøkelse av fotometriteknikkene vi bruker her og er i riket av optisk kartlegging. Maskinvaren som er beskrevet her, kan enkelt konverteres til en optisk kartleggingskonfigurasjon ved utveksling av fotomultiplier for et passende spesialkamera med høye bildefrekvenser og stor brønnkapasitet. Vår beskrevne konfigurasjon kan tilby ekstremt detaljert temporal informasjon på en brøkdel (opptil 1/10th) av den kommersielle prisen på avanserte store kameraer med tilsvarende evner. Confocal line scan teknikker er også mer romlig detaljert enn vår metode, men begrensninger i z begrense fluorescens oppkjøp fra flere tverrgående plan samtidig. Dette er ikke ideelt for avbildning av membranbundne reportere holdt av iPSC-CMs med typisk heterogene morfologier. Fotometrimålinger ved hjelp av et standard epifluorescensmikroskop unngår dette problemet ved å få tilgang til hele cellulær overflate øyeblikkelig, igjen til en mye lavere kostnad per datapunkt.
Vi anbefaler på det sterkeste VF2.1Cl for å utføre spenningsanalyser med spennende celler. For tiden er mange VSDer tilgjengelige som opererer under en rekke forskjellige mekanismer, hver med sine egne iboende begrensninger. Vanlige elektrokrome styrylfarger som di-8-ANEPPS eller di-4-ANBDQBS som viser raske responser på transmembranspenning, hindres imidlertid av lav følsomhet og høy kapasitiv belastning21,22. Genetisk kodede spenningsindikatorer (GEVIer) benytter fusjonen av fluorescerende proteiner til molekylær spenningssensorer23 eller mikrobielle opsiner24 og gir svært sensitive disseksjoner av cellulær spenningsdynamikk, men hindres av redusert kinetikk og ikke-lineære responser. En liste over vanlige VSDer og deres grunnleggende dynamiske egenskaper er inkludert i tabell 1. PeT-sonder som VF2.1Cl tilbyr et godt kompromiss, og viser rask kinetikk og anstendig følsomhet med minimal cellulær forstyrrelse. Imidlertid er denne VSD begrenset fordi, i motsetning til ratiometriske styrylfarger21, kan den ikke brukes til å løse absolutt membranpotensial. Denne iboende ulempen fremhever den uheldige konsekvensen av å opprettholde datanøyaktighet ved høyere gjennomstrømning ved analyse av cellulær elektrofysiologi.
|
Følsomhet (% ∆F / F per 100mV) |
Hastighet (ms) | |
| PeT-baserte fargestoffer | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 | 47 | <1 |
| Hemicyanin fargestoffer | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEVIer | ||
| Lysbue30 | 32 | 12324 |
| Bue D95N31 | 40 | 4124 |
| Havfrue32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2.333 | 13.3 | 2523 |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| BÅND | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabell 1: En kort liste over vanlige VSDer og deres viktigste fluorescerende egenskaper.
Vi merker at excitation-sammentrekning uncouplers som blebbistatin eller 2,3-butan-dione monoxime (BDM) brukes ofte i optiske spenningsmålinger for å redusere bevegelsesartefakt ved å undertrykke hjertekontraksjon35. Tidligere rapporter har imidlertid vist at begge forbindelsene forlenger AP-varigheten betydelig og flater ut AP-erstatning i hele perfused hjerter36,37. I tillegg har blebbistatin fluorescerende egenskaper som overlapper med spektra av VF2.1Cl og derfor kan ikke være hensiktsmessig for bruk med dette fargestoffet38.
Vår allsidige protokoll krever minimale justeringer for optisk undersøkelse av en rekke todimensjonale og tredimensjonale spennende konstruksjoner. Denne metoden muliggjør rask og presis kvantifisering av repoleringsmekanikk, noe som kan gi verdifull innsikt i cellulære ioniske abnormiteter. I våre hender leverer denne protokollen klare optiske signaler med gode signal-til-støy-forhold selv i mindre celler. Vår enkle og effektive plattform kan brukes til ikke-invasiv validering av hjertemedisinsk sikkerhet og screeningstudier med høy gjennomstrømning ved hjelp av pasientspesifikke iPSC-CMer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cairn Research Ltd støttet denne publikasjonen ved å dekke produksjonskostnadene for videofilen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne Cairn Research Ltd. for deres vennlige økonomiske bidrag som dekket produksjonskostnadene for denne publikasjonen. I tillegg takker vi Ms. Ines Mueller og Ms. Stefanie Kestel for deres utmerkede tekniske støtte.
Forfatternes forskning støttes av det tyske senter for kardiovaskulær forskning (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 og under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2067/1- 390729940) og Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
