Summary
Här beskriver vi optiskt förvärv och karakterisering av åtgärd potentialer från inducerad pluripotent stamcell härledda kardiomyocyter med hjälp av ett höghastighets modulärt fotometri system.
Abstract
Konventionella intracellulära mikroelektrod tekniker för att kvantifiera kardiomyocyt elektrofysiologi är extremt komplexa, arbetsintensiva och utförs vanligtvis i låg genomströmning. Snabb och pågående expansion av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) presenterar en ny standard inom kardiovaskulär forskning och alternativa metoder är nu nödvändiga för att öka genomströmningen av elektrofysiologiska data på en enda cellnivå. VF2.1Cl är ett nyligen härlett spänningskänsligt färgämne som ger ett snabbt enkanaligt svar med hög magnitud på fluktuationer i membranpotentialen. Den har kinetik som är överlägsen andra befintliga spänningsindikatorers och gör tillgängliga funktionella data som motsvarar traditionella mikroelektrodtekniker. Här visar vi förenklad, icke-invasiv verkan potential karakterisering i externt tempo mänskliga iPSC härledda kardiomyocyter med hjälp av ett modulärt och mycket överkomligt fotometrisystem.
Introduction
Elektrofysiologisk modellering av kardiomyocyter och konstruktion av effektiva plattformar för hjärtmedicinscreening är avgörande för utvecklingen av terapeutiska strategier för en mängd arytmiska störningar. Snabb expansion av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) har producerat lovande inbrytningar i human sjukdom modellering och farmakologisk undersökning med hjälp av isolerade patienten härledda kardiomyocyter (iPSC-CM). "Guldstandard" tekniker för elektrofysiologisk karakterisering av dessa celler genom patch-clamp (strömklämma) kan kvantifiera åtgärdspotential (AP) morfologi och varaktighet, men denna metod är otroligt komplex och långsam, och inte väl lämpad för hög genomströmning data förvärv1. iPSC-CMs rapporteras regelbundet ha en ökad diastolisk membranpotential och ökad läckageström jämfört med vuxna inhemska kardiomyocyter2. Det föreslås att mindre cellstorlek och minskad membranacitans som observerats i iPSC-CMs kan ge något systematiskt fel när du använder den nuvarande klämtekniken, kanske förklara dessa avvikelser3. För att maximera användbarheten av en iPSC-CM-plattform är en ytterligare metod värdefull för att öka dataflödet och säkerställa datanoggrannhet när transmembranspänningen ändras på en enda cellnivå i iPSC-CMs.
Spänningskänsliga färgämnen (VSD) har länge varit en föreslagen metod för att ge snabbare, icke-invasiv och motsvarande analys av hjärtAP-kinetik jämfört med de traditionellateknikerna 4. En ny studie har visat lämpligheten av ratiometric spänningskänslig sond fotometri att exakt kvantifiera hjärtat AP5. Dessutom ger förmågan att lätt skala upp optiska fotometrimetoder denna teknik till storskaliga kardiotoxicitetsskärmar som är kritiska i terapeutisk läkemedelsutveckling (t.ex. CiPA). Utveckling av standardiserade kardiotoxicitetsprotokoll i en blindad flerfunktionsstudie med mikroelektrodmatris och spänningsavkännande optiska tekniker har visat nyckelvärdet för dennametod 6.
Många potentiometriska färgämnen är kommersiellt tillgängliga, och pågående syntetisk utveckling av nya sonder visar spännande potential för att effektivisera sin effektivitet över en mängd olika hjärt- och neurala konstruktioner. Den idealiska VSD kommer att ha förstärkt kinetik och känslighet, samtidigt som den visar minskad kapacitiv belastning, fotoblekning och cytotoxicitet. Den nyligen syntetiserade VF2.1Cl (FluoVolt) uttrycker många av dessa fördelaktiga egenskaper till stor del på grund av sin nya trådbaserade molekylära struktur, som delas av andra medlemmar av den nya VoltageFluor (VF)familjen 7. I motsats till vanliga elektrokroma VSDs där enkla sonder molekylärt och elektriskt konjugerar till plasmamembranet, består detta färgämne av en passivt insatt, membranspäckad syntetisk tråd som parar ihop en elektronrik donator med en modifierad fluoresceinfluorofor (FITC). Mekanistiska detaljer finns i figur 1. Detta färgämne visar utmärkt känslighet för membranspänningsfluktuationer och visar en 27% förändring i utsläppsintensitet per 100 mV i motsats till ~ 10% sett i andra vanliga sonder vid jämförbarahastigheter 7. Dessutom interagerar trådbaserade PeT-system inte direkt med det cellulära elektriska fältet som ger minimal elektrisk störning och försumbara förändringar i cellulär kapacitiv belastning.
Figur 1: Kemiska, spektral- och mekanistiska parametrar för VF2.1Cl-färgämne. (A) Kemisk struktur av VF2.1Cl. Molekylära funktioner att notera inkluderar flera alkylgrupper inom fenylen vinylen molekylär tråd som underlättar införing i plasmamembranet. En negativt laddad sulfonsyragrupp konjugerad till FITC-sonden säkerställer fluorforstabilisering på den extracellulära ytan och hjälper till nära vinkelrät införing i förhållande till lipidbilayerns elektriska fält. B)Ett förenklat schema över vinkelrät VF2.1Cl inbäddning i plasmamembranet i en målcell. C)Absorptions- och emissionsspektra av VF2.1Cl-färgämne. Spektra är identiskt med standard FITC- och GFP-sonder. (D) Skildring av VF2.1Cl:s mekanistiska verkningssätt. Under viloförhållanden (hyperpolariserade) driver negativa intracellulära spänningar fria elektroner mot rostralfluorforen. Elektron överflöd säkerställer foto-inducerad elektron överföring (PeT) gynnas som en väg ut ur det upphetsade tillståndet efter den optiska excitationen, effektivt släcka fluorescens. Däremot påverkar en depolariserad membranpotential nedåtgående elektronrörelse som gynnar fluorescens vid optisk excitation. Det resulterande fluorescerande svaret är linjärt relaterat till membranspänning och kan användas exakt för att samla detaljerad tidsinformation om cellulär elektrofysiologisk kinetik. E)Representativa brightfield (övre) och fluorescens vid 470 nm (nedre) bilder av leporinkardiomyocyter laddade med VF2.1Cl.(F)Z stack av en enda laddad kardiomyocyt. Pilar anger områden med tydlig lokalisering av VF2.1Cl till cellmembranet. Bilder förvärvades med en snurrande disk confocal system bestående av en X-lightv3 snurrande disk confocal huvud med en 50 μm pinhole mönster; LDI-7-belysning; Prime95B kamera och ett PlanApo Lambda 100x mål. Skalbar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
FITC-sonden som konjugeras till VF2.1Cl säkerställer att den kan användas effektivt under standard- och GFP-filterkonfigurationer, och det kräver bara ett enkanaligt förvärvssystem, som båda är vanliga funktioner i fluorescerande bildplattformar. Analys av täta mänskliga iPSC-CM monoskikt med detta färgämne har nyligen rapporterats8,9,10,11. Vårt protokoll skiljer sig från dessa studier på grund av vår undersökning av enstaka, isolerade iPSC-CMs, ostörd av elektriska och paracrine influenser av täta syncytial monolayers, och vår användning av ett överkomligt och anpassningsbart fotometrisystem i motsats till komplexa confocal eller wide-field imaging arrangemang.
Här beskriver vi vårt protokoll för snabb förvärv och analys av robusta optiska APs från isolerade mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter och inhemska kardiomyocyter (se Kompletterande fil). Vi använder VF2.1Cl tillsammans med ett anpassningsbart toppmodernt tillstånd för encelliga fotometrimätningar. Dessa experimentella protokoll har godkänts av etikkommittén vid Universitetsmedicinska centret Göttingen (nr 10/9/15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellulära preparat
OBS: Mänskliga iPSCs som används i detta protokoll härleddes från friska givare och differentierades i monolayers med hjälp av fullt definierade små molekyl modulering av WNT signalering och laktat rening tekniker som tidigarebeskrivits 12,13,14. iPSC-CMs bibehölls var 2-3 dagar med ett kulturmedium som beskrivs nedan.
- Förbered ett odlingsmedium av basalt medium (RPMI 1640) och 2% tillägg (B27). Förvara vid 4 °C. Använd vid rumstemperatur (RT).
- Förbered ett pläteringsmedium av basalt medium (RPMI 1640), 2% tillägg (B27) och 1:2000 ROCK-hämmare. Förvara vid 4 °C. Använd på RT.
- Kappa steriliserad 10 mm rundglas #0 täcken med 150 μL 1:60 faktorfri källarmembranmatris och inkubera vid 4 °C i 4 timmar.
OBS: Optimering av täckplattans volym är nödvändig för att säkerställa att hela glaset är täckt samtidigt som tillräcklig ytspänning bibehålls för att förhindra spill. 150 μL rekommenderas för 10 mm runda täcken. Satsstorlek, täckplatta typ, täcklip volym och kulturplatta typ kan passa för experimenterarnas behov. - Börja iPSC-CM dissociation med ett EDTA-baserat cell dissociation reagens. Se till att monoskiktet är helt lossat genom att försiktigt spola med en 1 000 μL pipett.
- Överför den cellulära fjädringen till ett 15 ml-rör och tillsätt dubbelt volympläteringsmedium. Centrifugera i 10 min vid 100 x g.
- Återanvänd pelleten med önskad volym (återsuspensionsvolym) av pläteringsmedium. Räkna celler manuellt eller elektroniskt.
- Välj optimal densitet per täckglas (15 000) vilket möjliggör den isolerade cellanalysen senare.
- Beräkna volymen av "aktiv" cellulär fjädring (A) som behövs för att plätera alla täcken med önskad densitet. Applicera följande formel och dra ut i ett separat rör:
- Beräkna volymen extra pläteringsmedium (B) som behövs för att rymma varje täckglas med önskad volym. Applicera följande formel och lägg till den resulterande volymen på röret med aktiv fjädring:
- Ta bort matrisen från täckglasen och applicera "täckslipvolymen" för cellfjädring (A+B) på varje täckglas. Återanvänds regelbundet i röret för att säkerställa jämn cellfördelning.
- Inkubera vid 37 °C i 1 timme. Fyll försiktigt brunnen med pläteringsmedium.
- Efter 24 timmar, utbyta media med normalt odlingsmedium och behåll var 2-3 dagar.
2. Experimentell installation
- Utrusta ett inverterat epifluorescensmikroskop med en 40x förstoring, hög numerisk bländarlins (N.A: > 0,75) för att utföra experiment.
- Koppla en snabb omkoppling av varmvit LYSDIOD till mikroskopets överförda belysningsport. Sätt in ett enkelt rött 660 nm-filter i den överförda ljusbanan.
OBS: Denna lampa kan aktiveras under hela fotometriexperiment för att observera provet utan att förorena den gröna lysrörssignalen. - Montera ett snabbt omkopplingsledhuvud på 470 nm för fotografering. Sätt i ett 470/40 excitationsfilter vid mikroskopets epifluorescerande port för att rengöra ljuset som genereras av lysdioden.
OBS: För optimal signalk kvantifiering rekommenderas ett belysningssystem med hög hastighet återkopplingskontroll av optisk utgång. - Sätt in en mikroskopkub som innehåller en 495 nm lång passbalkdelare i spegelenheten karusellen i mikroskopet.
- Montera en detekteringsarm som innehåller ett justerbart fältmembran på mikroskopets C-mount-port för att möjliggöra val av intresseområde.
- Koppla separat en fotomultiplierdetektor (PMT) och en USB-kamera till mikroskopet. Detta kommer att ligga till grund för systemet för utsläppsdetektering.
- Sätt i en filterkub som innehåller en 565 nm lång passbalkdelning och ett 535/50-utsläppsfilter i PMT-porten. Detta delar utsläppsljus mellan de två detektorerna.
OBS: En kamera som är ansluten till den överförda porten i utsläppsdetekteringssystemet kan detektera överfört ljus under brightfield under alla experiment. - Koppla PMT till en strömförsörjning och en PMT-förstärkare. Anslut PMT-förstärkarens utgång till en analog ingångsstift i ett dataförvärvssystem.
- Filtrera analoga data från PMT vid 1 kHz eller högre.
- Digitalisera data med en frekvens som är minst dubbelt så hög som den högsta frekvensen som finns i analog signal (2 kHz eller högre) för att uppfylla Nyquists kriterier och förhindra alias.
3. Mobilladdning med VF2.1Cl
OBS: Alla steg som involverar detta färgämne måste utföras i svagt ljus.
- Förbered en tyrods badlösning på (i mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glukos, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 och varm till 37 °C.
- Förbered en alikvot av lastlösning i ett mikrocentrifugrör genom att blanda 5 μL 1 000x VF2,1Cl och 50 μL 20% löslig poloxamerlösning.
- Applicera 5 μL av lastlösningen på 5 ml uppvärmd tyrodlösning (total 0,1x färgkoncentration) i en 20 mm Petri-skål.
OBS: Slutlig färgkoncentration är 0,1x. Detta är 1/10th som föreslås av tillverkaren. Detta sparar resurser, säkerställer försumbar cytotoxicitet, och viktigt är fortfarande att behålla tydliga optiska signaler från laddade celler med höga signal-till-brusförhållanden. - Tillsätt en enda iPSC-CM-täckspäcka i skålen och inkubera vid 37 °C i 20 minuter.
- Montera en uppvärmd levande celltomografikammare. Montera på mikroskopstadiet och fyll med 500 μL färsk tyrods lösning.
- Tvätta täcket med färsk tyrodlösning vid 37 °C.
- Applicera försiktigt iPSC-CM-täcket på den förvärmda badkammaren med hjälp av finpunktstångar.
OBS: Se till att kammaren och dess innehåll alltid värms upp vid fysiologiska temperaturer. Om så önskas, börja med kontinuerlig perfusion av uppvärmd Tyrodes lösning.
4. Elektrisk fältstimulering
OBS: Extern utlösning av iPSC-CM är valfritt men användbart för standardisering av cellulär dynamik och experimentella parametrar. Det ökar analyst och möjliggör undersökning av frekvensberoende effekter.
- Fäst en stimuleringsinsats med två platinaelektroder 5 mm från varandra i inspelningskammaren.
- Anslut en extern stimulator till stimuleringsinsatsen. Ställ in på 5 ms bipolära fältpulser vid 0,5 Hz.
- Bestäm optimal stimuleringsspänning genom att öka stimulansen från 1 V och uppåt. Tröskelstimulans definieras som den lägsta spänningen vid vilken celler börjar kontraktera. Applicera spänningar ungefär 25% över denna tröskel. Normalt intervall är mellan 1 V och 30 V.
- Fixa stimuleringsfrekvensen med den externa stimulatorn eller utlösa den med förvärvsprogram.
5. Potentiellt förvärv av optiska åtgärder
OBS: Detta protokoll använder en kommersiell programvara för förvärv och analys.
- Visualisera myocyterna i brightfield-vy med hjälp av den överförda ljusvägen och USB-kameran.
- Markera en isolerad cell och beskär dess optiska bana med fältmembranet som säkerställer att endast ljus från den cell av intresse övervakas.
- Aktivera PMT-förstärkaren och ställ in PMT-tillförseln på 750 V.
- Kör stimuleringsprotokollet (se steg 4) tillsammans med förvärvsprogramvaran och aktivera samtidigt excitationslampan på 470 nm. Det senare kan göras via en fjärrpanel eller automatiseras med fast intensitet (TTL-signal).
- Justera förstärkning och förskjutning av PMT-förstärkaren för att se till att signalen inte mättas och är optimerad för inspelningssystemets detekteringsområde.
- Spela in 10 svep som säkerställer att stabila åtgärdspotentialer upptäcks.
- Fortsätt inspelningen och flytta omedelbart mikroskopstadiet för att kort förvärva bakgrundssignal från en region utan celler. Stäng av excitationslampan.
OBS: Detta bakgrundsvärde(F-förskjutning) kommer att användas för att ta hänsyn till eventuell bakgrundsfluorescens. - Om så önskas, lokalt granska referensläkemedel såsom 1 μM nifedipine för att identifiera cellulära svar på farmakologisk manipulation.
- Upprepa steg 5.2–5.7 varje gång du väljer en ny cell. Byt ut täckglas om så önskas för att säkerställa hög experimentell omsättning under ett enda sammanträde.
Protokoll för inläsning och bildförvärv beskrivs i figur 2.
6. Dataanalys
- Öppna en sparad inspelning med analysprogramvaran och i genomsnitt 10 svep som innehåller stimulerade åtgärdspotentialer från en enda cell.
- Ta ett medelvärde av baslinjesignalen som representerar Fförskjuta och subtrahera detta från den genomsnittliga spårningen.
- Beräkna ∆F/F0 med följande formel (där F mäts fluorescens och F0 är diastolisk fluorescens):
- Identifiera spårningsbaslinjen (diastoliskt) och intresseområde (AP) och mät önskade potentiella parametrar för hjärtåtgärder. Detta inkluderar men är inte begränsat till förfallstiden för 50% (APD50) och 90% (APD90)repolarisering.
- Exportera data från den här cellen till ett kalkylbladsprogram.
- Upprepa steg 6.1 – 6.5 för alla inspelningar. Utvärdera resultaten med lämpliga oparerade tester eller variansanalys.
Figur 2: Protokoll för inläsning och bildförvärv. (A) Flödesschema över komplett VF2.1Cl belastningsprotokoll för iPSC-CMs och inhemska kardiomyocyter. B)Ett förenklat schema över stråldelare (BS) och filterkonfigurationer som används i detta protokoll för excitation och detektion av VF2.1Cl-utsläpp som svar på förändringar i transmembranspänningen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Optiska actionpotentialprofiler (AP) för isolerade inhemska kardiomyocyter och humaninducerade pluripotenta stamceller härledda kardiomyocyter (iPSC-CM). (A) Representativ optisk AP för en enda murinkardiomyocyt (mitten) med medelvärdet ± SEM för APD50 och APD90 (n = 7, höger). (B) Representativ optisk AP för en enda mänsklig iPSC-härledd kardiomyocyt (mitten) med medelvärdet ± SEM för APD50 och APD90 (n = 48, höger). (C) Farmakologisk manipulering av iPSC-CM AP (mitten) med 1 μM nifedipine. Genomsnittlig ± SEM för APD90-ändring efter nifedipine applicering (n=5). **p < 0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
En hög signal till buller förhållandet observerades regelbundet i våra prover, trots det minskade synfältet när man fokuserar på en enda cell. Mer buller observerades i mindre iPSC-CMs, men det hindrade inte analysen efter ensemblens genomsnitt. AP morfologi är tydligt definierad, vilket ger en grundlig översikt över cellulära elektrofysiologiska funktion och repolarization mekanik över kardiomyocyt konstruktioner. Noteringsfunktioner ärden tidigare beskrivna 15 skarpa uppslagshastigheten och uttalade fas 1-egenskaper hos murinkardiomyocyter (APD50:58,34±17,98 ms, APD90: 160,9±30,15 ms, n=7; Figur 3A) som är morfologiskt åtskilda från optiska signaler från human iPSC-CM (APD50:170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n=48; Figur 3B). Vi observerade en högre frekvens av fotobleaching och cellulär toxicitet efter optisk undersökning i inhemska kardiomyocyter jämfört med odlade mänskliga iPSC-CMs. Protokoll för beredning och färgbelastning i inhemska kardiomyocyter ingår i det kompletterande materialet.
Human iPSC-CM är lyhörda för farmakologisk manipulering med nifedipine (1 μM). En känd L-typ Ca2 + kanal (CaV1.2) antagonist, nifedipine förväntas minska AP varaktigheten i celler med fysiologisk funktion. Under kontinuerlig läkemedelsapplikation observerades en 41,5% minskning av APD90 (n=5), vilket tyder på både det fysiologiska uttrycket för CaV1, 2 kanaler i dessa celler och funktionaliteten hos VF2.1Cl-baserad avbildning som en plattform för prospektiva hög genomströmning hjärt drog screening studier (Figur 3C).
Kompletterande material: Infödd kardiomyocytpreparat för spänningsavbildning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll för att enkelt förvärva detaljerade AP-profiler från isolerade iPSC-CMs lämpliga för elektrofysiologisk modellering och hjärtmedicin screening. Vi upptäcker regelbundna, robusta APs från våra glest sådda iPSC-CMs som föreslår både indikatorfunktionalitet och metodologisk återgivning.
På grund av det breda spektrumet av kommersiella metoder för iPSC-omprogrammering och brist på standardisering för hjärt differentieringsprotokoll, iPSC-baserade modeller kan visa enorm variation i deras funktion och morfologi16. Detta kan också hindra effektiviteten i kardiotoxicitetsstudier. Vi rapporterar generellt robusta svar på utökad experimentell undersökning med minimal indikator-inducerad cytotoxicitet vid låg excitation ljus intensiteter. Standardisering av grundläggande dissociation och coverlip sådd är avgörande för att säkerställa konsekvent kvalitet på iPSC-CM preparat. Lösa täcken, som enkelt kan sättas in och bytas ut inuti bildplattformen, är oerhört användbara för snabb datainsamling och karakterisering av enstaka kardiomyocyter. Det bör dock noteras att vi observerar en liten minskning av cellens livskraft efter längre perioder (dvs. mer än 4 veckor) av gles kultur på glasöverdrag.
Den modulära konstruktionen av ett höghastighetsfotometrisystem som beskrivs i steg 2 är av avgörande betydelse för detta protokoll. Många optikbaserade inställningar är kommersiellt tillgängliga och kan optimeras för ett brett spektrum av signalinspelningskrav. Dessa sträcker sig från kvantitativ avbildning med hög upplösning, stora områdeskameror till fotometrimätningar av total signal från ett definierat område. Med hjälp av det senare kvantifierar vi fluorescens i hög hastighet från ett enda maskerat område med hjälp av en fotomultiplier (PMT). I kombination med snabba omkopplingsbelysningskomponenter möjliggör detta noggrann dissekering av potentiella komponenter med snabb åtgärd med extremt hög temporal upplösning (analog signal upp till 1 kHz). Höga provtagningshastigheter krävs för att säkerställa tillförlitliga mätningar av verkan potentiella upstroke i kardiomyocyter och kan vara avgörande i andra excitable konstruktioner (dvs neuroner) med extremt snabb excitation kinetik. Dessutom är detta flexibla system fördelaktigt eftersom 1) det möjliggör noggrann undersökning av encellselektrofysiologi med val av fältmembran, 2) digitalisering av den analoga signalen är inte integrerad eller förprocessad och därför direkt under experimentörkontroll, 3) fotometriinstrumenteringens modulära karaktär möjliggör enkel omkonfigurering för att möjliggöra samtidig optisk mätning med andra indikatorer eller mikroelektroder. Tillägg av en andra fotomultiplierkanal, med lämpliga filteruppsättningar för att undvika spektral överlappning, möjliggör sann samtidig mätning av den fluorescerande intracellulära kalciumindikatorn CAL-590 tillsammans med VF2.1Cl. Det är också viktigt att notera att detta mångsidiga system kan användas alternativt för djup bedömning av intracellulär kalciumhantering som tidigarebeskrivits 17,18,19,20.
Även om den tidsmässiga upplösningen av vårt system medför många fördelar, bör det noteras att parametrar som kräver analys av den rumsliga fördelningen av fluorescenssignaler, såsom excitationsmönster eller ledningshastighet, inte är lämpliga för undersökning av de fotometritekniker som vi använder här och är inom området optisk kartläggning. Hårdvaran som beskrivs här kan enkelt konverteras till en optisk mappningskonfiguration genom utbyte av fotomultiplikatorn för en lämplig specialkamera med höga bildhastigheter och stor brunnskapacitet. Vår beskrivna konfiguration kan erbjuda extremt detaljerad temporal information tillen bråkdel (upp till 1/10) av det kommersiella priset på avancerade stora områdeskameror med motsvarande kapacitet. Konfokala linjeskanningstekniker är också mer rumsligt detaljerade än vår metod, men begränsningar i z begränsar fluorescensförvärv från flera tvärgående plan samtidigt. Detta är inte idealiskt för bildmembranbundna reportrar som innehas av iPSC-CMs med typiskt heterogena morfologier. Fotometrimätningar med ett standardefluorescensmikroskop undviker det här problemet genom att komma åt hela cellytan omedelbart, igen till en mycket lägre kostnad per datapunkt.
Vi rekommenderar starkt VF2.1Cl för att utföra spänningsanalyser med exciterbara celler. För närvarande finns många VSDs tillgängliga som fungerar under en mängd olika mekanismer, var och en med sina egna inneboende begränsningar. Vanliga elektrokroma styrylfärger som di-8-ANEPPS eller di-4-ANBDQBS som visar snabba svar på transmembranspänning hindras dock av låg känslighet och hög kapacitiv belastning21,22. Genetiskt kodade spänningsindikatorer (GEVI) använder fusionen av fluorescerande proteiner till molekylär spänningsavkänningsdomäner23 eller mikrobiellaopsiner 24 och ger mycket känsliga dissekeringar av cellulär spänningsdynamik, men hindras av minskad kinetik och icke-linjära svar. En lista över vanliga VSD och deras grundläggande dynamiska egenskaper ingår i tabell 1. PeT-sonder som VF2.1Cl erbjuder en bra kompromiss, visar snabb kinetik och anständig känslighet med minimal cellulär störning. Denna VSD är dock begränsad eftersom den, till skillnad från ratiometriska styrylfärger21, inte kan användas för att lösa absolut membranpotential. Denna inneboende nackdel belyser den olyckliga konsekvensen av att upprätthålla datanoggrannhet vid högre genomströmning vid analys av cellulär elektrofysiologi.
|
Känslighet (% ∆F/F per 100mV) |
Hastighet (ms) | |
| PeT-baserade färgämnen | ||
| VF2.1Cl7 | 27 | <1 |
| BeRST125 | 24 | <1 |
| RhoVR126 (på 1 000) | 47 | <1 |
| Hemicyaninfärger | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | <1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | <1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | <1 |
| RH23728 | 11 | <1 |
| PGH129 | 17.5 | <1 |
| GEVI | ||
| Ljusbågsljus 30 | 32 | 12324 |
| Båge D95N31 | 40 | 4124 |
| Sjöjungfru32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2.333 | 13.3 | 2523 |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| TVÄRBAND | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabell 1: En kort lista över vanliga VSD och deras viktigaste fluorescerande egenskaper.
Vi noterar att excitation-contraction uncouplers såsom blebbistatin eller 2,3-butan-dione monoxime (BDM) används ofta i optisk spänning mätningar för att minska rörelse artefakt genom att undertrycka hjärt sammandragning35. Tidigare rapporter har dock visat att båda föreningarna avsevärt förlänger AP-varaktigheten och platta AP-ersättning i hela perfused hjärtan36,37. Dessutom har blebbistatin fluorescerande egenskaper som överlappar VF2.1Cl och därför kanske inte är lämpligt för användning med dettafärgämne 38.
Vårt mångsidiga protokoll kräver minimala justeringar för optisk undersökning av en mängd tvådimensionella och tredimensionella exciterbara konstruktioner. Denna metod möjliggör snabb och exakt kvantifiering av repolariseringsmekanik, vilket kan ge värdefulla insikter om cellulära jonavvikelser. I våra händer levererar detta protokoll tydliga optiska signaler med bra signal-till-brusförhållanden även i mindre celler. Vår enkla och effektiva plattform kan tillämpas för icke-invasiv validering av hjärtläkemedelssäkerhet och screeningstudier med hög genomströmning med patientspecifika iPSC-CMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Cairn Research Ltd stödde denna publikation genom att täcka produktionskostnaderna för videofilen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Cairn Research Ltd för deras ekonomiska bidrag som täckte produktionskostnaderna för denna publikation. Dessutom tackar vi Ms. Ines Mueller och Ms. Stefanie Kestel för deras utmärkta tekniska support.
Författarnas forskning stöds av German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 och enligt Tysklands excellensstrategi - EXC 2067/1- 390729940) och Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
- Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
- Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
- Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
- Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
- Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).
- Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
- Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026 (2020).
- Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
- Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
- Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
- Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162 (2020).
- Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
- Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
- Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
- Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
- Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
- Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
- Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
- Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).
- Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).
- Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
- Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
