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Bioengineering

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61890
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, 3Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, 4Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

Summary

यहां हम एक उच्च गति मॉड्यूलर फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से कार्रवाई क्षमता के ऑप्टिकल अधिग्रहण और लक्षण वर्णन करते हैं।

Abstract

कार्डियोमायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की मात्रा निर्धारित करने के लिए पारंपरिक इंट्रासेलुलर माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीक बेहद जटिल, श्रम गहन हैं, और आम तौर पर कम थ्रूपुट में किए जाते हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से और चल रहे विस्तार हृदय अनुसंधान में एक नया मानक प्रस्तुत करता है और वैकल्पिक तरीकों अब एक ही सेल के स्तर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं । VF2.1Cl हाल ही में व्युत्पन्न वोल्टेज संवेदनशील डाई है जो एक तेजी से एकल चैनल, झिल्ली क्षमता में उतार-चढ़ाव के लिए उच्च परिमाण प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इसमें अन्य मौजूदा वोल्टेज संकेतकों से बेहतर गतिज होती है और पारंपरिक माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीकों के बराबर कार्यात्मक डेटा उपलब्ध होता है। यहां, हम मॉड्यूलर और अत्यधिक किफायती फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके बाहरी रूप से पुस्तक वाले मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में सरलीकृत, गैर-आक्रामक कार्रवाई संभावित लक्षण वर्णन प्रदर्शित करते हैं।

Introduction

कार्डियोमायोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए कुशल प्लेटफार्मों का निर्माण विभिन्न प्रकार के अतालता विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से विस्तार अलग रोगी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) का उपयोग कर मानव रोग मॉडलिंग और औषधीय जांच में आशाजनक पैठ का उत्पादन किया है । पैच-क्लैंप (वर्तमान-क्लैंप) के माध्यम से इन कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" तकनीक कार्रवाई क्षमता (एपी) आकृति विज्ञान और अवधि की मात्रा निर्धारित कर सकती है, हालांकि, यह विधि अविश्वसनीय रूप से जटिल और धीमी है, और उच्च थ्रूपुट डेटा अधिग्रहण 1 के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल नहीं है। आईपीएससी-सीएम को नियमित रूप से वयस्क देशी कार्डियोमायोसाइट्स2की तुलना में डायस्टोलिक झिल्ली की क्षमता और रिसाव में वृद्धि की संभावना बताई जाती है। यह सुझाव दिया जाता है कि आईपीएससी-सीएम में देखी गई छोटी कोशिका आकार और कम झिल्ली क्षमता वर्तमान क्लैंप तकनीक का उपयोग करते समय कुछ व्यवस्थित त्रुटि पैदा कर सकती है, शायद इन विचलन3को समझा सकती है। एक आईपीएससी-सीएम प्लेटफॉर्म की उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए, आईपीएससी-सीएम में एक सेल स्तर पर ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज परिवर्तन की विशेषता होने पर थ्रूपुट बढ़ाने और डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त विधि मूल्यवान है।

वोल्टेज संवेदनशील रंगों (वीएसडी) लंबे समय से पारंपरिक तकनीकों के मुकाबले हृदय एपी काइनेटिक्स के तेज, गैर-आक्रामक और समकक्ष विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक प्रस्तावित विधि रही है4। हाल ही में हुए एक अध्ययन में कार्डियक एपी5को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए रेशेट्रिक वोल्टेज सेंसिटिव प्रोब फोटोमेट्री की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, ऑप्टिकल फोटोमेट्री दृष्टिकोण को आसानी से स्केल करने की क्षमता इस तकनीक को चिकित्सीय दवा विकास (जैसे, सिपा) में महत्वपूर्ण बड़े पैमाने पर कार्डियोटॉक्सीसिटी स्क्रीन पर उधार देती है। माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और वोल्टेज-सेंसिंग ऑप्टिकल तकनीकों का उपयोग करके एक अंधे बहु-साइट अध्ययन में मानकीकृत कार्डियोटॉक्सिसिटी प्रोटोकॉल के विकास ने इस दृष्टिकोण6के प्रमुख मूल्य का प्रदर्शन किया है।

कई शक्तिशाली उपकरणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और नए जांच के चल रहे सिंथेटिक विकास हृदय और तंत्रिका निर्माण की एक किस्म भर में अपनी प्रभावशीलता को व्यवस्थित करने के लिए रोमांचक क्षमता दिखाते हैं । आदर्श वीएसडी में कम कैपेसिटिव लोड, फोटोब्लेचिंग और साइटोटॉक्सिकिटी प्रदर्शित करते हुए काइनेटिक्स और संवेदनशीलता में वृद्धि होगी। हाल ही में संश्लेषित VF2.1Cl (FluoVolt) इन लाभकारी गुणों में से कई काफी हद तक अपने उपन्यास तार आधारित आणविक संरचना के कारण व्यक्त करता है, जो नए वोल्टेजफ्लूर (वीएफ) परिवार7के अन्य सदस्यों द्वारा साझा किया गया है । आम इलेक्ट्रोक्रोमिक वीएसडी के विपरीत जिसमें प्लाज्मा झिल्ली के लिए आणविक और विद्युत रूप से संविलियन सरल जांच की जाती है, इस डाई में निष्क्रिय रूप से डाला गया, झिल्ली-फैले सिंथेटिक तार होते हैं जो एक इलेक्ट्रॉन-समृद्ध दाता को संशोधित फ्लोरोसिन फ्लोरोफोर (फिटसी) के साथ जोड़ते हैं। मशीनी विवरण चित्र 1में प्रदान किए गए हैं । यह डाई झिल्ली वोल्टेज में उतार-चढ़ाव के प्रति उत्कृष्ट संवेदनशीलता को दर्शाता है, जो तुलनात्मक गति 7 पर अन्य सामान्य जांच में देखे गए ~ 10% के विपरीत प्रति 100 एमवी उत्सर्जन तीव्रता में27%परिवर्तन प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, वायर-आधारित पीईटी सिस्टम सीधे सेलुलर इलेक्ट्रिक फील्ड के साथ बातचीत नहीं करते हैं जो सेलुलर कैपेसिटिव लोड में न्यूनतम विद्युत हस्तक्षेप और नगण्य परिवर्तन पैदा करता है।

Figure 1
चित्रा 1: VF2.1Cl डाई के रासायनिक, स्पेक्ट्रल और मशीनी पैरामीटर। (A)VF2.1Cl. आणविक सुविधाओं की रासायनिक संरचना नोट करने के लिए फेनिलीन विनाइलीन आणविक तार के भीतर कई एल्किल समूहों को शामिल किया गया है जो प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन की सुविधा प्रदान करते हैं । एक नकारात्मक आवेशित सल्फोनिक एसिड समूह फिटसी जांच के लिए संयुग्मित लिपिड बाइलेयर के विद्युत क्षेत्र के सापेक्ष लंबवत प्रविष्टि के पास बाहृशल सतह और एड्स पर फ्लोरोफोर स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है। (ख)एक लक्ष्य कोशिका के प्लाज्मा झिल्ली में एम्बेडिंग लंबवत VF2.1Cl की एक सरलीकृत योजनाबद्ध । (ग)वीएफ 2.1सीएल डाई का अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। स्पेक्ट्रा मानक फिटसी और जीएफपी जांच के समान है। (घ)VF2.1Cl की कार्यनीतता के यंत्रवादी तरीके का चित्रण। आराम की स्थिति (हाइपरपोलराइज्ड) में, नकारात्मक इंट्रासेलुलर वोल्टेज रोस्ट्रल फ्लोरोफोर की ओर मुफ्त इलेक्ट्रॉनों को ड्राइव करते हैं। इलेक्ट्रॉन बहुतायत सुनिश्चित करता है फोटो प्रेरित इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण (पीईटी) ऑप्टिकल उत्तेजन के बाद उत्तेजित राज्य से बाहर एक मार्ग के रूप में इष्ट है, प्रभावी ढंग से फ्लोरेसेंस शमन । इसके विपरीत, एक डीपोलराइज्ड झिल्ली क्षमता ऑप्टिकल एक्सिलिएशन पर फ्लोरेसेंस के पक्ष में नीचे इलेक्ट्रॉन आंदोलन को प्रभावित करती है। परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया झिल्ली वोल्टेज से संबंधित है और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल काइनेटिक्स पर विस्तृत लौकिक जानकारी इकट्ठा करने के लिए ठीक से उपयोग किया जा सकता है। (ई)प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड (ऊपरी) और फ्लोरेसेंस पर 470 एनएम (लोअर) वीएफ 2.1सीएल से भरे लेपोरीन कार्डियोमायोसाइट्स की छवियां।(एफ)जेड स्टैक एक लोडेड कार्डियोमायोसाइट के। तीर सेलुलर झिल्ली के लिए VF2.1Cl के स्पष्ट स्थानीयकरण के क्षेत्रों का संकेत देते हैं। छवियों को एक कताई डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम के साथ अधिग्रहीत किया गया था जिसमें एक्स-लाइटवी 3 कताई डिस्क कॉन्फोकल हेड शामिल था, जिसमें 50 माइक्रोन पिनहोल पैटर्न था; एलडीआई-7 प्रकाशक; प्राइम95बी कैमरा और एक प्लानपो लैम्ब्डा 100x उद्देश्य। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीएफ 2.1सीएल को संजीद जाने वाली फिटसी जांच यह सुनिश्चित करती है कि इसका उपयोग मानक और जीएफपी फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन के तहत प्रभावी ढंग से किया जा सकता है, और इसके लिए केवल एक चैनल अधिग्रहण प्रणाली की आवश्यकता होती है, जिनमें से दोनों फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्लेटफार्मों की आम विशेषताएं हैं। इस डाई के साथ घने मानव आईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का विश्लेषण हाल ही में8,9, 10,11बतायागया है । हमारा प्रोटोकॉल एकल, अलग आईपीएससी-सीएम की हमारी जांच के कारण इन अध्ययनों से अलग है, जो घने सिंकायल मोनोलेयर के विद्युत और पैराक्राइन प्रभावों से बेफिक्र है, और जटिल कॉन्फोकल या वाइड-फील्ड इमेजिंग व्यवस्थाओं के विपरीत एक किफायती और अनुकूलन फोटोमेट्री सिस्टम का हमारा उपयोग है।

यहां, हम अलग मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और देशी कार्डियोमायोसाइट्स (पूरक फ़ाइलदेखें) से मजबूत ऑप्टिकल एपीएस के तेजी से अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एकल सेल फोटोमेट्री मापन के लिए कला मंच के अनुकूलन राज्य के साथ मिलकर VF2.1Cl का उपयोग करें। इन प्रायोगिक प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र गोटिंगेन (नंबर 10/9/15) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

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Protocol

1. सेलुलर तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मानव आईपीएससी स्वस्थ दानदाताओं से प्राप्त किए गए थे और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग और लैक्टेट शुद्धिकरण तकनीकों के पूरी तरह से परिभाषित छोटे अणु मॉड्यूलेशन का उपयोग करके मोनोलेयर्स में अंतर किया गया था जैसा कि पहले12,13,14वर्णित है। आईपीएससी-सीएम को हर 2-3 दिन में एक संस्कृति माध्यम के साथ बनाए रखा गया था।

  1. बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640) और 2% सप्लीमेंट (बी27) का कल्चर मीडियम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कमरे के तापमान (आरटी) पर उपयोग करें।
  2. बेसल मीडियम (आरपीएमआई 1640), 2% सप्लीमेंट (B27) और 1:2000 रॉक अवरोधक का एक चढ़ाना माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आरटी में उपयोग करें।
  3. कोट 10 मिमी गोल ग्लास #0 कवरस्लिप 1:60 कारक मुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 150 माइक्रोन के साथ और 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: रिसाव को रोकने के लिए पर्याप्त सतह तनाव बनाए रखते हुए पूरे ग्लास को कवर किया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कवरलिप वॉल्यूम का अनुकूलन आवश्यक है। 10 मिमी गोल कवर्लिप्स के लिए 150 माइक्रोन की सिफारिश की जाती है। बैच आकार, कवरलिप प्रकार, कवरलिप वॉल्यूम और संस्कृति प्लेट प्रकार प्रयोगकर्ताओं की जरूरतों के अनुकूल हो सकते हैं।
  4. एक EDTA आधारित सेल वियोजन अभिकरोटा के साथ iPSC-सीएम वियोजन शुरू करें। सुनिश्चित करें कि मोनोलेयर धीरे-धीरे 1,000 माइक्रोट के साथ फ्लश करके पूरी तरह से अलग है।
  5. सेलुलर सस्पेंशन को 15 एमएल ट्यूब में ट्रांसफर करें और डबल वॉल्यूम प्लेटिंग मीडियम डालें । 100 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  6. प्लेटिंग माध्यम के वांछित मात्रा (पुनर्पिण मात्रा) के साथ गोली को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को मैन्युअल या इलेक्ट्रॉनिक रूप से गिनें।
  7. प्रति कवरस्लिप (15,000) इष्टतम घनत्व का चयन करें जो बाद में अलग सेलुलर विश्लेषण के लिए अनुमति देगा।
  8. इस वांछित घनत्व पर सभी कवर्लिप्स को प्लेट करने के लिए आवश्यक 'सक्रिय' सेलुलर निलंबन (ए) की मात्रा की गणना करें। निम्नलिखित सूत्र लागू करें और एक अलग ट्यूब में वापस ले:
    Equation 1
  9. प्रत्येक कवरस्लिप को वांछित मात्रा में समायोजित करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त चढ़ाना माध्यम (बी) की मात्रा की गणना करें। निम्नलिखित सूत्र लागू करें और परिणामस्वरूप मात्रा को सक्रिय निलंबन की ट्यूब में जोड़ें:
    Equation 2
  10. कवरस्लिप से मैट्रिक्स निकालें और प्रत्येक कवरस्लिप के लिए सेल निलंबन (ए + बी) के 'कवरस्लिप वॉल्यूम' लागू करें। नियमित रूप से ट्यूब में पुनर्सुलन भी सेलुलर वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
  11. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। धीरे-धीरे चढ़ाना माध्यम से अच्छी तरह से भरें।
  12. 24 घंटे के बाद, सामान्य संस्कृति माध्यम के साथ मीडिया का आदान-प्रदान करें और हर 2-3 दिनों में बनाए रखें।

2. प्रायोगिक सेटअप

  1. प्रयोगों का संचालन करने के लिए एक उल्टे एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप को 40x आवर्धन, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेंस (एनए: > 0.75) से लैस करें।
  2. माइक्रोस्कोप के संचारित रोशनी बंदरगाह के लिए एक तेजी से स्विचन गर्म सफेद एलईडी युगल। प्रेषित प्रकाश पथ में एक साधारण लाल 660 एनएम फिल्टर डालें।
    नोट: इस प्रकाश को ग्रीन फ्लोरोसेंट सिग्नल को दूषित किए बिना नमूने का निरीक्षण करने के लिए फोटोमेट्री प्रयोगों में सक्रिय किया जा सकता है।
  3. फोटोमेट्री रिकॉर्डिंग के लिए एक तेजी से स्विचिंग 470 एनएम एलईडी हेड माउंट करें। एलईडी द्वारा उत्पन्न प्रकाश को साफ करने के लिए माइक्रोस्कोप के एपिफ्लोरेटेंट बंदरगाह पर 470/40 उत्तेजन फिल्टर डालें।
    नोट: इष्टतम सिग्नल क्वांटिफिकेशन के लिए ऑप्टिकल आउटपुट के उच्च गति प्रतिक्रिया नियंत्रण के साथ एक रोशनी प्रणाली की सिफारिश की जाती है।
  4. माइक्रोस्कोप के भीतर मिरर यूनिट हिंडोला में 495 एनएम लंबे पास बीम स्प्लिटर युक्त माइक्रोस्कोप क्यूब डालें।
  5. ब्याज चयन के क्षेत्र की अनुमति देने के लिए माइक्रोस्कोप सी-माउंट पोर्ट के लिए एक समायोज्य क्षेत्र डायाफ्राम युक्त एक डिटेक्शन आर्म फिट करें।
  6. माइक्रोस्कोप के लिए एक फोटोमल्टीपीयर डिटेक्टर (पीएमटी) और एक यूएसबी कैमरा अलग से जोड़ा। यह उत्सर्जन डिटेक्शन सिस्टम का आधार बनेगी।
  7. पीएमटी पोर्ट में 565 एनएम लंबे पास बीम स्प्लिटर और 535/50 उत्सर्जन फिल्टर युक्त फिल्टर क्यूब डालें। यह दो डिटेक्टरों के बीच उत्सर्जन प्रकाश विभाजन ।
    नोट: उत्सर्जन का पता लगाने प्रणाली के संचारित बंदरगाह से जुड़ा एक कैमरा सभी प्रयोगों में ब्राइटफील्ड के तहत संचारित प्रकाश का पता लगा सकता है ।
  8. एक बिजली की आपूर्ति और एक पीएमटी एम्पलीफायर के लिए पीएमटी कपल । पीएमटी एम्पलीफायर आउटपुट को डेटा एक्विजिशन सिस्टम के एनालॉग इनपुट पिन से कनेक्ट करें।
  9. पीएमटी से 1 किलोहर्ट्ज या उससे अधिक पर एनालॉग डेटा फ़िल्टर करें।
  10. एक आवृत्ति पर डेटा को डिजिटाइज करें जो कम से कम एनालॉग सिग्नल (2 kHz या उससे अधिक) में मौजूद उच्चतम आवृत्ति से दोगुना है, न्यक्विस्ट मानदंडों को पूरा करने और उपनाम को रोकने के लिए।

3. VF2.1Cl के साथ सेलुलर लोडिंग

नोट: इस डाई से जुड़े सभी कदम कम रोशनी की स्थिति में किए जाने चाहिए।

  1. (एमएमएम में) के एक टायरोड के स्नान समाधान तैयार करें: 140 एनएसीएल, 10 एचईपीई, 10 ग्लूकोज, 4 केसीएल, 1 एमजीसीएल2, 2सीएसीएल2,पीएच = 7.35 और गर्म से 37 डिग्री सेल्सियस तक।
  2. 1,000x VF2.1Cl के 5 माइक्रोल और 20% घुलनशील पोलोक्सामर समाधान के 50 माइक्रोल मिलाकर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लोडिंग समाधान का एक एलिकोट तैयार करें।
  3. 20 मिमी पेट्री डिश में गर्म टायरोड के समाधान (कुल 0.1x डाई एकाग्रता) के 5 एमएल के लिए लोडिंग समाधान के 5 माइक्रोन लागू करें।
    नोट: अंतिम डाई एकाग्रता 0.1x है। यह 1/10वें कि निर्माता द्वारा सुझाव दिया है । यह संसाधनों का संरक्षण करता है, नगण्य साइटोटॉक्सिकिटी सुनिश्चित करता है, और महत्वपूर्ण बात, अभी भी उच्च संकेत से शोर अनुपात के साथ भरी हुई कोशिकाओं से स्पष्ट ऑप्टिकल संकेतों को बरकरार रखता है।
  4. डिश में एक आईपीएससी-सीएम कवर स्लिप जोड़ें और 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
  5. एक गर्म लाइव सेल इमेजिंग कक्ष इकट्ठा करें। माइक्रोस्कोप चरण पर माउंट और ताजा टायरोड के समाधान के 500 माइक्रोन के साथ भरें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा टायरोड के समाधान के साथ कवरस्लिप धोएं।
  7. ध्यान से ठीक बिंदु संदंश का उपयोग कर पूर्व गर्म स्नान कक्ष के लिए आईपीएससी-सीएम कवरलिप लागू होते हैं ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कक्ष और इसकी सामग्री हमेशा शारीरिक तापमान पर गर्म होती है। यदि वांछित है, तो गर्म टायरोड के समाधान के निरंतर पर्फ्यूजन के साथ शुरू करें।

4. विद्युत क्षेत्र उत्तेजना

नोट: आईपीएससी-सीएम का बाहरी ट्रिगर वैकल्पिक है लेकिन सेलुलर गतिशीलता और प्रयोगात्मक मापदंडों के मानकीकरण के लिए उपयोगी है। यह विश्लेषण की आसानी को बढ़ाता है और आवृत्ति-निर्भर प्रभावों की जांच के लिए अनुमति देता है।

  1. रिकॉर्डिंग कक्ष में 5 मिमी दूरी पर दो प्लेटिनम इलेक्ट्रोड के साथ एक उत्तेजना डालें संलग्न करें।
  2. उत्तेजना डालने के लिए एक बाहरी उत्तेजक कनेक्ट करें। 0.5 हर्ट्ज पर 5 एमएस द्विध्रुवी क्षेत्र दालों के लिए सेट करें।
  3. 1 वी ऊपर की ओर से उत्तेजना को बढ़ाकर इष्टतम उत्तेजना वोल्टेज निर्धारित करें। थ्रेसहोल्ड उत्तेजना को सबसे कम वोल्टेज के रूप में परिभाषित किया गया है जिस पर कोशिकाएं अनुबंध करना शुरू करती हैं। इस सीमा से लगभग 25% ऊपर वोल्टेज लागू करें। सामान्य रेंज 1 वी और 30 वी के बीच है।
  4. बाहरी उत्तेजक के साथ उत्तेजना आवृत्ति को ठीक करें या अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ इसे ट्रिगर करें।

5. ऑप्टिकल कार्रवाई संभावित अधिग्रहण

नोट: यह प्रोटोकॉल अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है।

  1. संचारित प्रकाश पथ और यूएसबी कैमरे का उपयोग करके ब्राइटफील्ड व्यू में मायोसाइट्स की कल्पना करें।
  2. एक अलग सेल का चयन करें और क्षेत्र डायाफ्राम के साथ अपने ऑप्टिकल पथ को कसकर फसल करें जिससे ब्याज की कोशिका से केवल प्रकाश सुनिश्चित किया जा सके।
  3. पीएमटी एम्पलीफायर को एक्टिवेट करें और पीएमटी की सप्लाई 750 वी पर सेट करें।
  4. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ उत्तेजना प्रोटोकॉल (चरण 4 देखें) चलाएं और साथ ही 470 एनएम उत्तेजना प्रकाश को सक्रिय करें। उत्तरार्द्ध एक रिमोट पैनल के माध्यम से किया जा सकता है या एक निश्चित तीव्रता (टीटीएल सिग्नल) पर स्वचालित किया जा सकता है।
  5. पीएमटी एम्पलीफायर के लाभ और ऑफसेट को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सिग्नल संतृप्त न हो और रिकॉर्डिंग सिस्टम की डिटेक्शन रेंज के लिए अनुकूलित हो।
  6. स्थिर कार्रवाई क्षमता सुनिश्चित करने वाले रिकॉर्ड 10 स्वीप्स का पता लगाया जाता है ।
  7. रिकॉर्डिंग जारी रखें और कोशिकाओं से रहित क्षेत्र से पृष्ठभूमि संकेत प्राप्त करने के लिए तुरंत माइक्रोस्कोप चरण को स्थानांतरित करें। उत्तेजन प्रकाश बंद कर दें।
    नोट: इस पृष्ठभूमि मूल्य (एफऑफसेट) किसी भी पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के लिए खाते में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  8. यदि वांछित है, तो स्थानीय रूप से औषधीय हेरफेर के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए 1 μM निफेडिपिन जैसी संदर्भ दवाओं को फीका करें।
  9. अनुक्रमिक फैशन में, हर बार एक नई सेल का चयन करते हुए कदम 5.2-5.7 दोहराएं। एक ही बैठक में उच्च प्रयोगात्मक कारोबार सुनिश्चित करने के लिए वांछित होने पर कवर्लिप्स को स्वैप करें।
    नोट: लोड िंग और छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल चित्रा 2में वर्णित हैं ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर और औसत 10 स्वीप्स के साथ एक सहेजी गई रिकॉर्डिंग खोलें जिसमें एक ही सेल से उत्तेजित कार्रवाई क्षमता होती है।
  2. एफऑफसेट का प्रतिनिधित्व करने वाले बेसलाइन सिग्नल का एक मतलब लें और औसत ट्रेस से इसे घटाएं।
  3. निम्नलिखित सूत्र के साथ ∆F/F0 की गणना करें (जहां एफ को फ्लोरेसेंस मापा जाता है और एफ 0 डायस्टोलिक फ्लोरेसेंस है):
    Equation 3
  4. ट्रेस बेसलाइन (डायस्टोलिक) और ब्याज के क्षेत्र (एपी) की पहचान करें और वांछित हृदय कार्रवाई संभावित मापदंडों को मापें। इसमें 50% (एपीडी 50) और 90% (एपीडी90)पुनर्ध्रुवीकरण के लिएक्षयसमय तक सीमित नहीं है।
  5. इस सिंगल सेल से डाटा को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में एक्सपोर्ट करें।
  6. सभी रिकॉर्डिंग के लिए 6.1 - 6.5 चरण दोहराएं। उचित अकरोपित परीक्षणों या विचरण के विश्लेषण के साथ परिणामों का आकलन करें।

Figure 2
चित्रा 2: लोडिंग और छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल। }आईपीएससी-सीएम और नेटिव कार्डियोमायोसाइट्स के लिए कंप्लीट वीएफ2.1सीएल लोडिंग प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट। (ख)ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज में परिवर्तन के प्रत्युत्तर में वीएफ 2.1सीएल उत्सर्जन के उत्सर्जन को उत्तेजित करने और पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बीम स्प्लिटर (बीएस) और फिल्टर विन्यास का एक सरलीकृत योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

Figure 3
चित्रा 3: ऑप्टिकल एक्शन पोटेंशियल (एपी) अलग देशी कार्डियोमायोसाइट्स और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) के प्रोफाइल । (A)एपीडी50 और एपीडी90 (एन = 7, राइट) के मीन ± एसईएम के साथ सिंगल मुरारीन कार्डियोमायोसाइट (केंद्र) का प्रतिनिधि ऑप्टिकल एपी। (ख)एक मानव आईपीएससी के प्रतिनिधि ऑप्टिकल एपी ने एपीडी50 और एपीडी90 (एन = 48, दाएं) के मतलब ± एसईएम के साथ कार्डियोमायोसाइट (केंद्र) प्राप्त किया। (ग)1 माइक्रोनएम निफेडिफिन के साथ आईपीएससी-सीएम एपी (केंद्र) की फार्माकोलॉजिकल हेरफेर । मतलब ± निफेडिपाइन आवेदन (एन = 5) के बाद एपीडी90 परिवर्तन के एसईएम। **पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक एकल कोशिका पर ध्यान केंद्रित करते समय देखने के कम क्षेत्र के बावजूद, हमारे नमूनों में शोर अनुपात के लिए एक उच्च संकेत नियमित रूप से देखा गया था। छोटे आईपीएससी-सीएम में अधिक शोर देखा गया, लेकिन इससे कलाकारों की टुकड़ी औसत के बाद विश्लेषण में बाधा नहीं आई । एपी आकृति विज्ञान को स्पष्ट रूप से परिभाषित किया गया है, जो कार्डियोमायोसाइट निर्माणों में सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल फ़ंक्शन और पुनर्ध्रुपन यांत्रिकी का पूरी तरह से अवलोकन देता है। नोट की विशेषताएं पहले वर्णित15 तेज अपस्ट्रोक वेग और स्पष्ट चरण 1 विशेषताएं हैं जो मुरीन कार्डियोमायोसाइट्स (एपीडी50: 58.34±17.98एमएस, एपीडी90:160.9±30.15 एमएस, एन = 7; चित्रा 3ए) जो मानव आईपीएससी-सीएम ऑप्टिकल सिग्नल (एपीडी50: 170.1±11.18एमएस, एपीडी90:317.5±15.56 एमएस, एन = 48; से अलग हैं; चित्रा 3B)। हमने सुसंस्कृत मानव आईपीएससी-सीएम की तुलना में देशी कार्डियोमायोसाइट्स में ऑप्टिकल जांच के बाद फोटोब्लैचिंग और सेलुलर विषाक्तता की उच्च दर देखी। देशी कार्डियोमायोसाइट्स में तैयारी और डाई लोडिंग के लिए प्रोटोकॉल पूरक सामग्रीमें शामिल हैं।

मानव आईपीएससी-सीएम निफेडिपाइन (1 माइक्रोन) के साथ औषधीय हेरफेर के लिए उत्तरदायी हैं। एक ज्ञात एल-प्रकार Ca2 + चैनल (सीएवी1.2) विरोधी, निफेडिपिन शारीरिक समारोह के साथ कोशिकाओं में एपी अवधि को कम करने की उम्मीद है। निरंतर दवा आवेदन के दौरान, एपीडी90 में 41.5% की कमी देखी गई (एन = 5), इन कोशिकाओं में सीएवी1.2 चैनलों की शारीरिक अभिव्यक्ति और संभावित उच्च थ्रूपुट कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन(चित्रा 3 सी)के लिए एक मंच के रूप में VF2.1Cl-आधारित इमेजिंग की कार्यक्षमता दोनों का सुझाव दिया गया था।

अनुपूरक सामग्री: वोल्टेज इमेजिंग के लिए देशी मुरीन कार्डियोमायोसाइट तैयारी। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त अलग-थलग आईपीएससी-सीएम से विस्तृत एपी प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम अपने विरल वरीयता प्राप्त आईपीएससी-सीएम से नियमित, मजबूत एपीएस का पता लगाते हैं जो संकेतक कार्यक्षमता और पद्धतिगत निष्ठा दोनों का सुझाव देता है।

आईपीएससी पुनर्प्रोग्रामिंग के लिए वाणिज्यिक पद्धतियों के व्यापक स्पेक्ट्रम और हृदय भेदभाव प्रोटोकॉल के लिए मानकीकरण की कमी के कारण, आईपीएससी आधारित मॉडल अपने कार्य और आकृति विज्ञान16में अपार परिवर्तनशीलता दिखा सकते हैं। इससे कार्डियोटॉक्सिसिटी अध्ययन की तासीर में भी रुकावट आ सकती है। हम कम उमंग प्रकाश तीव्रता पर न्यूनतम संकेतक-प्रेरित साइटोटॉक्सिकिटी के साथ विस्तारित प्रयोगात्मक जांच के लिए आम तौर पर मजबूत प्रतिक्रियाओं की रिपोर्ट करते हैं। आईपीएससी-सीएम की तैयारी की लगातार गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए बुनियादी वियोजन और कवरलिप सीडिंग का मानकीकरण महत्वपूर्ण है। ढीले कवरस्लिप, जिन्हें आसानी से इमेजिंग प्लेटफॉर्म के अंदर डाला और प्रतिस्थापित किया जा सकता है, तेजी से डेटा अधिग्रहण और एकल कार्डियोमायोसाइट्स के लक्षण वर्णन के लिए अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम ग्लास कवर्लिप्स पर विरल संस्कृति की विस्तारित अवधि (यानी, 4 सप्ताह से अधिक) के बाद कोशिका व्यवहार्यता में थोड़ी गिरावट का पालन करते हैं।

स्टेप 2 में उल्लिखित हाई-स्पीड फोटोमेट्री सिस्टम का मॉड्यूलर निर्माण इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है। कई प्रकाशिकी-आधारित सेटअप व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और सिग्नल रिकॉर्डिंग आवश्यकताओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ये उच्च रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करके मात्रात्मक इमेजिंग से लेकर, एक परिभाषित क्षेत्र से कुल संकेत के फोटोमेट्री माप के माध्यम से बड़े क्षेत्र के कैमरों तक। उत्तरार्द्ध का उपयोग करके, हम फोटोमल्टीप्लायर (पीएमटी) का उपयोग करके एक नकाबपोश क्षेत्र से उच्च गति पर फ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करते हैं। तेजी से स्विचिंग रोशनी घटकों के साथ संयुक्त, यह बेहद उच्च लौकिक संकल्प (1 किलोहर्ट्ज तक एनालॉग सिग्नल) के साथ तेजी से कार्रवाई संभावित घटकों के पूरी तरह से विच्छेदन के लिए अनुमति देता है। कार्डियोमायोसाइट्स में कार्रवाई संभावित अपस्ट्रोक के विश्वसनीय माप सुनिश्चित करने के लिए उच्च नमूना दरों की आवश्यकता होती है और बेहद तेजी से उत्तेजन गतिज गतिज के साथ अन्य उत्तेजनीय निर्माण (यानी न्यूरॉन्स) में महत्वपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, यह लचीला प्रणाली फायदेमंद है क्योंकि 1) यह फील्ड डायाफ्राम चयन के साथ एकल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की पूरी जांच की अनुमति देता है, 2) एनालॉग सिग्नल का डिजिटलीकरण एकीकृत या पूर्व-संसाधित नहीं है और इसलिए सीधे प्रयोगकर्ता नियंत्रण के तहत है, 3) फोटोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन की मॉड्यूलर प्रकृति सरल पुनर्विन्यास को अन्य संकेतकों या माइक्रोइलेक्टोड्स के साथ एक साथ ऑप्टिकल माप को सक्षम करने की अनुमति देती है। स्पेक्ट्रल ओवरलैप से बचने के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट के साथ एक दूसरे फोटोमल्टीप्लायर चैनल के अलावा, वीएफ 2.1सीएल के साथ फ्लोरोसेंट इंट्रासेलुलर कैल्शियम संकेतक सीएएल-590 का सही एक साथ माप सक्षम करेगा। यह भी ध्यान रखना जरूरी है कि इस बहुउद्देशीय प्रणाली का उपयोग वैकल्पिक रूप से इंट्रासेलुलर कैल्शियम हैंडलिंग के गहरे आकलन के लिए किया जा सकता है जैसा कि पहले17 , 18,19,20वर्णित है ।

जबकि हमारी प्रणाली का लौकिक संकल्प कई फायदे लाता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फ्लोरेसेंस संकेतों के स्थानिक वितरण के विश्लेषण की आवश्यकता वाले पैरामीटर, जैसे उत्तेजना पैटर्न या चालन वेग, फोटोमेट्री तकनीकों द्वारा जांच के लिए उपयुक्त नहीं हैं जो हम यहां उपयोग करते हैं और ऑप्टिकल मानचित्रण के स्थानों में हैं। यहां वर्णित हार्डवेयर को उच्च फ्रेम दरों और बड़ी अच्छी क्षमता के साथ एक उपयुक्त विशेषज्ञ कैमरे के लिए फोटोमल्टीप्लायर के आदान-प्रदान द्वारा ऑप्टिकल मैपिंग विन्यास में आसानी से परिवर्तित किया जा सकता है। हमारे वर्णित विन्यास समकक्ष क्षमताओं के साथ उन्नत बड़े क्षेत्र कैमरों के वाणिज्यिक मूल्य के एक अंश (1/10वेंतक) पर अत्यंत विस्तृत लौकिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । कॉन्फोकल लाइन स्कैन तकनीक भी हमारी विधि की तुलना में अधिक स्थानिक रूप से विस्तृत हैं, हालांकि जेड में सीमाएं एक बार में कई ट्रांसवर्स विमानों से फ्लोरेसेंस अधिग्रहण को प्रतिबंधित करती हैं। यह आम तौर पर विषम मॉर्फोलोजी के साथ आईपीएससी-सीएम द्वारा आयोजित इमेजिंग झिल्ली बाध्य संवाददाताओं के लिए आदर्श नहीं है। एक मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फोटोमेट्री माप पूरे सेलुलर सतह को तुरंत तक पहुंचने से इस समस्या से बचते हैं, फिर से प्रति डेटा बिंदु बहुत कम लागत पर।

हम उत्तेजनीय कोशिकाओं के साथ वोल्टेज परख आयोजित करने के लिए VF2.1Cl अत्यधिक सलाह देते हैं। वर्तमान में, कई वीएसडी उपलब्ध हैं जो विभिन्न तंत्रों की एक भीड़ के तहत काम करते हैं, प्रत्येक अपनी अंतर्निहित सीमाओं के साथ। सामान्य इलेक्ट्रोक्रोमिक स्टाइलिल डाई जैसे डी-8-एएनईपीपीएस या डी-4-एएनबीडीक्यूबीएस जो ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज के लिए तेज प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित करतेहैं,हालांकि कम संवेदनशीलता और उच्च क्षमता वाले लोड21,22से बाधित होते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड वोल्टेज संकेतक (जीईवीआई) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संलयन का उपयोग आणविक वोल्टेज संवेदन डोमेन23 या माइक्रोबियल ऑप्सिन24 तक करते हैं और सेलुलर वोल्टेज गतिशीलता के अत्यधिक संवेदनशील विच्छेदन प्रदान करते हैं, लेकिन कम काइनेटिक्स और नॉनलाइनर प्रतिक्रियाओं से बाधित होते हैं। तालिका 1में आम वीएसडी और उनके बुनियादी गतिशील गुणों की एक सूची शामिल है। वीएफ 2.1सीएल जैसी पीईटी जांच एक अच्छा समझौता प्रदान करती है, जो न्यूनतम सेलुलर व्यवधान के साथ तेजी से काइनेटिक्स और सभ्य संवेदनशीलता प्रदर्शित करती है। हालांकि, यह वीएसडी सीमित है क्योंकि, अनुपातमेट्रिक स्टाइलिल रंजक रंगों21के विपरीत, इसका उपयोग पूर्ण झिल्ली क्षमता को हल करने के लिए नहीं किया जा सकता है। यह अंतर्निहित नुकसान सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को बताते समय उच्च थ्रूपुट पर डेटा सटीकता बनाए रखने के दुर्भाग्यपूर्ण परिणाम पर प्रकाश डालता है।

संवेदनशीलता
(% ∆F/F प्रति 100mV)		 स्पीड (एमएस)
पीईटी आधारित रंग
VF2.1Cl7 27 <1
बर्स्टी125 24 <1
RhoVR126 47 <1
हेमिकाइन रंग
दी-8-ANEPPS21 10 <1
दी-4-ANEPPS27 8 <1
Di-4-ANBDQBS22 10–20 <1
आरएच23728 11 <1
पीजीएच129 17.5 <1
गेविस
आर्कलाइट30 32 12324
आर्क D95N31 40 4124
मत्स्यांगना32 40 17.4
वीएसएफपी 2.333 13.3 2523
क्वासर224 90 11
चिंता करना
डियो/डीपीए34 56 2

तालिका 1: आम वीएसडी और उनके प्रमुख फ्लोरोसेंट गुणों की एक संक्षिप्त सूची।

हम ध्यान दें कि एक्सटिटेशन-संकुचन अनकूपर्स जैसे ब्लेबिस्टटिन या 2,3-ब्यूटेन-डायोन मोनोक्सीम (बीडीएम) का उपयोग अक्सर ऑप्टिकल वोल्टेज माप में हृदय संकुचन35को दबाकर गति कलाकृतियों को कम करने के लिए किया जाता है। हालांकि, पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि दोनों यौगिक एपी की अवधि को काफी हद तक बढ़ाते हैं और पूरे परफोसेड हार्ट्स36,37में एपी क्षतिपूर्ति को समतल करते हैं। इसके अलावा, ब्लेबिस्टाटिन में फ्लोरोसेंट गुण होते हैं जो वीएफ 2.1सीएल के स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप होते हैं और इसलिए इस डाई38के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं।

हमारे बहुमुखी प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न प्रकार के दो-आयामी और त्रि-आयामी उत्तेजनीय निर्माणों में ऑप्टिकल जांच के लिए न्यूनतम समायोजन की आवश्यकता होती है। यह विधि पुनर्ध्रुवीकरण यांत्रिकी के तेजी से और सटीक मात्राकरण के लिए अनुमति देती है, जो सेलुलर आयनिक असामान्यताओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। हमारे हाथों में, यह प्रोटोकॉल छोटी कोशिकाओं में भी शोर अनुपात के लिए अच्छे संकेत के साथ स्पष्ट ऑप्टिकल संकेत प्रदान करता है। हमारे सरल और प्रभावी मंच हृदय दवा सुरक्षा और रोगी विशिष्ट आईपीएससी-सीएम का उपयोग कर उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग अध्ययन के गैर-इनवेसिव सत्यापन के लिए लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

केयर्न रिसर्च लिमिटेड ने वीडियो फ़ाइल की उत्पादन लागत को कवर करके इस प्रकाशन का समर्थन किया।

Acknowledgments

लेखकों को अपनी तरह के वित्तीय योगदान है जो इस प्रकाशन के उत्पादन लागत को कवर के लिए केयर्न रिसर्च लिमिटेड स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम सुश्री आईएनएस म्यूलर और सुश्री स्टेफनी केस्टेल को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।

लेखकों के अनुसंधान को जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेएचके), ड्यूश फॉरचुंग्सजेमेन्सचैफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन, वीओ 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत-EXC 2067/1-390729940) और Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
0.25 Trypsin EDTA  Gibco  25200056
B27 Supplement  Gibco  17504044
CaCl2 Carl Roth  HN04.2
D(+)-Glucose anhydrous BioChemica ITW Reagents A1422
Fetal Bovine Serum  Gibco  10270-106
FluoVolt Membrane Potential Kit  Invitrogen  F10488
HEPES Carl Roth  HN77.4
KCl Sigma-Aldrich 6781.1
Lamanin Sigma-Aldrich 114956-81-9
Matrigel  BD 354230
NaCl  Sigma-Aldrich 9265.2
Nifedipine  Sigma-Aldrich 21829-25-4
Penicillin/Streptomycin Invitrogen  15140
ROCK Inhibitor Y27632 Stemolecule 04-0012-10
RPMI 1640 Medium  Gibco  61870010
Versene EDTA  Gibco  15040033
Equipment
495LP Dichroic Beamsplitter  Chroma Technology
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices
Circle Coverslips, Thickness 0 Thermo Scientific CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B Molecular Devices
Dual OptoLED Power Supply  Cairn Research 
ET470/40x Excitation Filter  Chroma Technology
ET535/50m Chroma Technology
Etched Neubauer Hemacytometer Hausser Scientific
Filter Cubes  Cairn Research 
IX73 Inverted Microscope  Olympus 
MonoLED Cairn Research 
Multiport Adaptors  Cairn Research 
Myopacer Cell Stimulator  IonOptix
Optomask Shutter  Cairn Research 
Optoscan System Controller Cairn Research 
PH-1 Temperature Controlled Platform   Warner Instruments 
Photomultiplier Detector  Cairn Research 
PMT Amplifier Insert Cairn Research 
PMT Supply Insert Cairn Research 
RC-26G Open Bath Chamber  Warner Instruments 
SA-OLY/2AL Stage Adaptor  Olympus 
T565lpxr Dichroic Beamsplitter  Chroma Technology
T660lpxr Dichroic Beamsplitter Chroma Technology
TC-20 Dual Channel Temperature Controller  npi Electronic
UPLFLN 40X Objective Olympus 
USB 3.0 Colour Camera  Imaging Source
Software
Clampex 11.1 Molecular Devices 
Clampfit 11.1 Molecular Devices 
IC Capture 2.4  Imaging Source 
Prism 8 Graphpad

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 166 वोल्टेज संवेदनशील डाई फ्लोरेसेंस एक्शन क्षमता प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल कार्डियोमायोसाइट ऑप्टिकल
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप
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Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (166), e61890, doi:10.3791/61890 (2020).

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