Summary
Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.
Abstract
Le tecniche convenzionali di microelettrodi intracellulari per quantificare l'elettrofisiologia dei cardiomiociti sono estremamente complesse, ad alta intensità di lavoro e tipicamente eseguite a bassa produttività. La rapida e continua espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) presenta un nuovo standard nella ricerca cardiovascolare e sono ora necessari metodi alternativi per aumentare la produttività dei dati elettrofisiologici a livello di singola cellula. VF2.1Cl è un colorante sensibile alla tensione di recente derivazione che fornisce una rapida risposta a canale singolo e di alta grandezza alle fluttuazioni del potenziale di membrana. Possiede una cinetica superiore a quella di altri indicatori di tensione esistenti e rende disponibili dati funzionali equivalenti a quelli delle tecniche tradizionali di microelettrodo. Qui, dimostriamo la caratterizzazione semplificata e non invasiva del potenziale d'azione nei cardiomiociti umani derivati da iPSC a ritmo esterno utilizzando un sistema di fotometria modulare e altamente conveniente.
Introduction
La modellazione elettrofisiologica dei cardiomiociti e la costruzione di piattaforme efficienti per lo screening dei farmaci cardiaci è essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per una varietà di disturbi aritmici. La rapida espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha prodotto promettenti incursioni nella modellizzazione delle malattie umane e nell'indagine farmacologica utilizzando cardiomiociti derivati da pazienti isolati (iPSC-CM). Le tecniche "Gold standard" per la caratterizzazione elettrofisiologica di queste cellule attraverso patch-clamp (current-clamp) possono quantificare la morfologia e la durata del potenziale d'azione (AP), tuttavia, questo metodo è incredibilmente complesso e lento e non adatto per l'acquisizione di dati ad alto rendimento1. IPSC-CM sono regolarmente segnalati per avere un aumento del potenziale di membrana diastolica e una maggiore corrente di dispersione rispetto ai cardiomiociti nativi adulti2. Si suggerisce che le dimensioni più piccole delle cellule e la ridotta capacità della membrana osservata nelle iPSC-CM possano produrre qualche errore sistematico quando si utilizza la tecnica del morsetto di corrente, forse spiegando queste deviazioni3. Al fine di massimizzare l'utilità di una piattaforma iPSC-CM, un metodo aggiuntivo è prezioso per aumentare la produttività e garantire l'accuratezza dei dati quando si caratterizzano le variazioni di tensione transmembrana a livello di singola cella in iPSC-CM.
I coloranti sensibili alla tensione (VSD) sono stati a lungo un metodo proposto per fornire un'analisi più rapida, non invasiva ed equivalente della cinetica AP cardiaca rispetto a quelle delle tecniche tradizionali4. Un recente studio ha dimostrato l'idoneità della fotometria della sonda sensibile alla tensione di tensione per quantificare con precisione l'AP5 cardiaco. Inoltre, la capacità di scalare prontamente gli approcci di fotometria ottica conferisce questa tecnica a schermi cardiotossicità su larga scala critici nello sviluppo di farmaci terapeutici (ad esempio, CiPA). Lo sviluppo di protocolli di cardiotossicità standardizzati in uno studio multi-sito in cieco utilizzando array di microelettrodi e tecniche ottiche di rilevamento della tensione ha dimostrato il valore chiave di questo approccio6.
Molti coloranti potenziometrici sono disponibili in commercio e lo sviluppo sintetico in corso di nuove sonde mostra un potenziale entusiasmante per semplificare la loro efficacia in una varietà di costrutti cardiaci e neurali. Il VSD ideale avrà una cinetica e una sensibilità aumentate, mentre mostra una diminuzione del carico capacitivo, del fotoscissicità e della citotossicità. Il VF2.1Cl (FluoVolt) recentemente sintetizzato esprime molte di queste proprietà benefiche in gran parte grazie alla sua nuova struttura molecolare a filo, condivisa da altri membri della nuova famiglia VoltageFluor (VF)7. In contrasto con i comuni VSD elettrocromici in cui semplici sonde si coniugano molecolarmente ed elettricamente alla membrana plasmatica, questo colorante è costituito da un filo sintetico inserito passivamente, che abbraccia la membrana che accoppia un donatore ricco di elettroni con un fluoroforo di fluoresceina modificato (FITC). I dettagli meccanicistici sono forniti nella Figura 1. Questo colorante dimostra un'eccellente sensibilità alle fluttuazioni di tensione della membrana, mostrando una variazione del 27% dell'intensità di emissione per 100 mV rispetto a ~ 10% osservata in altre sonde comuni a velocità comparabili7. Inoltre, i sistemi PeT a filo non interagiscono direttamente con il campo elettrico cellulare che produce interferenze elettriche minime e cambiamenti trascurabili nel carico capacitivo cellulare.
Figura 1: Parametri chimici, spettrali e meccanicistici del colorante VF2.1Cl. (A) Struttura chimica di VF2.1Cl. Le caratteristiche molecolari da notare includono più gruppi alchilici all'interno del filo molecolare fenilene vinilene che facilitano l'inserimento nella membrana plasmatica. Un gruppo di acido solfonico caricato negativamente coniugato alla sonda FITC assicura la stabilizzazione del fluoroforo sulla superficie extracellulare e aiuta vicino all'inserzione perpendicolare rispetto al campo elettrico del doppio strato lipidico. (B) Schema semplificato dell'incorporazione perpendicolare di VF2.1Cl nella membrana plasmatica di una cellula bersaglio. (C) Spettri di assorbimento ed emissione del colorante VF2.1Cl. Gli spettri sono identici a quello delle sonde FITC e GFP standard. (D) Rappresentazione del meccanismo d'azione di VF2.1Cl. In condizioni di riposo (iperpolarizzato), tensioni intracellulari negative guidano gli elettroni liberi verso il fluoroforo rostrale. L'abbondanza di elettroni assicura che il trasferimento di elettroni fotoindotto (PeT) sia favorito come via d'uscita dallo stato eccitato dopo l'eccitazione ottica, spegnendo efficacemente la fluorescenza. Al contrario, un potenziale di membrana depolarizzato influenza il movimento verso il basso degli elettroni favorendo la fluorescenza all'eccitazione ottica. La risposta fluorescente risultante è linearmente correlata alla tensione di membrana e può essere utilizzata con precisione per raccogliere informazioni temporali dettagliate sulla cinetica elettrofisiologica cellulare. (E) Immagini rappresentative a campo luminoso (superiore) e fluorescenza a 470 nm (inferiore) di cardiomiociti leporina caricati con pila VF2.1Cl. (F) Z di un singolo cardiomiocita caricato. Le frecce indicano aree di chiara localizzazione di VF2.1Cl alla membrana cellulare. Le immagini sono state acquisite con un sistema confocale a disco rotante costituito da una testa confocale a disco rotante X-lightv3 con un modello stenopeico da 50 μm; Illuminatore LDI-7; Fotocamera Prime95B e obiettivo PlanApo Lambda 100x. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La sonda FITC coniugata a VF2.1Cl assicura che possa essere utilizzata efficacemente nelle configurazioni standard e dei filtri GFP e richiede solo un sistema di acquisizione a canale singolo, entrambe caratteristiche comuni delle piattaforme di imaging fluorescenti. Analisi di monostrati iPSC-CM umani densi con questo colorante è stata recentemente riportata8,9,10,11. Il nostro protocollo differisce da questi studi a causa della nostra indagine su singoli iPSC-CM isolati, imperturbabili dalle influenze elettriche e paracrine di densi monostrati sinciziali e dal nostro uso di un sistema di fotometria economico e personalizzabile rispetto a complesse disposizioni di imaging confocale o ad ampio campo.
Qui, descriviamo il nostro protocollo per l'acquisizione rapida e l'analisi di robusti AP ottici da cardiomiociti umani isolati derivati da iPSC e cardiomiociti nativi (vedi File supplementare). Utilizziamo VF2.1Cl abbinato a una piattaforma all'avanguardia personalizzabile per misure fotometriche a cella singola. Questi protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico del Centro medico universitario di Gottinga (n. 10/9/15).
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Protocol
1. Preparati cellulari
NOTA: Le iPSC umane utilizzate in questo protocollo sono state derivate da donatori sani e differenziate in monostrati utilizzando la modulazione di piccole molecole completamente definita delle tecniche di segnalazione WNT e di purificazione del lattato come precedentemente descritto12,13,14. I CM iPSC sono stati mantenuti ogni 2-3 giorni con un terreno di coltura descritto di seguito.
- Preparare un terreno di coltura di mezzo basale (RPMI 1640) e un supplemento al 2% (B27). Conservare a 4 °C. Utilizzare a temperatura ambiente (RT).
- Preparare un mezzo di placcatura di mezzo basale (RPMI 1640), supplemento al 2% (B27) e inibitore ROCK 1:2000. Conservare a 4 °C. Utilizzare in RT.
- Coperchi in vetro rotondo #0 da 10 mm sterilizzati con 150 μL di matrice di membrana basale libera da 1:60 fattori e incubare a 4 °C per 4 ore.
NOTA: l'ottimizzazione del volume del coverslip è necessaria per garantire che l'intero vetro sia coperto mantenendo un'adeguata tensione superficiale per evitare fuoriuscite. 150 μL è consigliato per coperture rotonde da 10 mm. Le dimensioni del lotto, il tipo di coverslip, il volume del coverslip e il tipo di piastra di coltura possono essere adatti alle esigenze degli sperimentatori. - Iniziare la dissociazione iPSC-CM con un reagente di dissociazione cellulare basato su EDTA. Assicurarsi che il monostrato sia completamente staccato lavando delicatamente con una pipetta da 1.000 μL.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere un mezzo di placcatura a doppio volume. Centrifuga per 10 min a 100 x g.
- Risuspenare il pellet con un volume desiderato (volume di risuspensione) del mezzo di placcatura. Contare le celle manualmente o elettronicamente.
- Selezionare la densità ottimale per coverslip (15.000) che consentirà l'analisi cellulare isolata in un secondo momento.
- Calcola il volume di sospensione cellulare "attiva" (A) necessaria per placcare tutti i coverslip a questa densità desiderata. Applicare la seguente formula e prelevare in un tubo separato:
- Calcolare il volume di mezzo di placcatura supplementare (B) necessario per accogliere ogni coverslip al volume desiderato. Applicare la seguente formula e aggiungere il volume risultante al tubo di sospensione attiva:
- Rimuovere la matrice dai coverslip e applicare il "volume coverslip" della sospensione cellulare (A + B) su ciascun coverslip. Riaspensare regolarmente nel tubo per garantire una distribuzione cellulare uniforme.
- Incubare a 37 °C per 1 ora. Riempire delicatamente il pozzo con il mezzo di placcatura.
- Dopo 24 ore, scambiare i supporti con il normale terreno di coltura e mantenere ogni 2-3 giorni.
2. Configurazione sperimentale
- Equipaggiare un microscopio a epifluorescenza invertita con un ingrandimento 40x, una lente ad alta apertura numerica (N.A: > 0,75) per condurre esperimenti.
- Accoppiare un LED bianco caldo a commutazione rapida alla porta di illuminazione trasmessa del microscopio. Inserire un semplice filtro rosso a 660 nm nel percorso della luce trasmessa.
NOTA: Questa luce può essere attivata durante gli esperimenti di fotometria per osservare il campione senza contaminare il segnale fluorescente verde. - Montare una testina LED a commutazione rapida da 470 nm per la registrazione fotometrica. Inserire un filtro di eccitazione 470/40 sulla porta epifluorescente del microscopio per ripulire la luce generata dal LED.
NOTA: per una quantificazione ottimale del segnale si consiglia un sistema di illuminazione con controllo del feedback ad alta velocità dell'uscita ottica. - Inserire un cubo di microscopio contenente uno splitter a fascio passante lungo 495 nm nel carosello dell'unità a specchio all'interno del microscopio.
- Montare un braccio di rilevamento contenente un diaframma a campo regolabile sulla porta C-mount del microscopio per consentire la selezione della regione di interesse.
- Accoppiare separatamente un rilevatore di fotomoltiplicatori (PMT) e una fotocamera USB al microscopio. Questo sarà la base del sistema di rilevamento delle emissioni.
- Inserire un cubo filtrante contenente uno splitter a fascio passante lungo 565 nm e un filtro di emissione 535/50 nella porta PMT. Questo divide la luce di emissione tra i due rivelatori.
NOTA: una telecamera collegata alla porta trasmessa del sistema di rilevamento delle emissioni è in grado di rilevare la luce trasmessa sotto il campo luminoso durante tutti gli esperimenti. - Accoppiare il PMT a un alimentatore e a un amplificatore PMT. Collegare l'uscita dell'amplificatore PMT a un pin di ingresso analogico di un sistema di acquisizione dati.
- Filtrare i dati analogici dal PMT a 1 kHz o superiore.
- Digitalizzare i dati a una frequenza almeno doppia rispetto alla frequenza più alta presente nel segnale analogico (2 kHz o superiore) per soddisfare i criteri di Nyquist e prevenire l'aliasing.
3. Caricamento cellulare con VF2.1Cl
NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono questo colorante devono essere eseguite in condizioni di scarsa illuminazione.
- Preparare una soluzione da bagno di Tyrode di (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucosio, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 e caldo a 37 °C.
- Preparare un'aliquota della soluzione di carico in un tubo di microcentrifuga mescolando 5 μL di 1.000x VF2.1Cl e 50 μL di soluzione di poloxamer solubilizzante al 20%.
- Applicare 5 μL della soluzione di carico a 5 mL di soluzione di Tyrode riscaldata (concentrazione totale di colorante 0,1x) in una capsula di Petri da 20 mm.
NOTA: la concentrazione finale del colorante è 0,1x. Questo è 1/10di quello suggerito dal produttore. Ciò preserva le risorse, garantisce una citotossicità trascurabile e, soprattutto, conserva ancora chiari segnali ottici da cellule caricate con elevati rapporti segnale/rumore. - Aggiungere un singolo coperchio iPSC-CM al piatto e incubare a 37 °C per 20 minuti.
- Assemblare una camera di imaging a cellule vive riscaldata. Montare sullo stadio del microscopio e riempire con 500 μL di soluzione di Tyrode fresca.
- Lavare il coperchio con la soluzione fresca di Tyrode a 37 °C.
- Applicare con attenzione il coverslip iPSC-CM sulla camera da bagno preriscaldata utilizzando una pinna a punto fine.
NOTA: Assicurarsi che la camera e il suo contenuto siano sempre riscaldati a temperature fisiologiche. Se lo si desidera, iniziare con una perfusione continua della soluzione di Tyrode riscaldata.
4. Stimolazione elettrica del campo
NOTA: L'attivazione esterna di iPSC-CM è facoltativa ma utile per la standardizzazione della dinamica cellulare e dei parametri sperimentali. Aumenta la facilità di analisi e consente l'indagine degli effetti dipendenti dalla frequenza.
- Collegare un inserto di stimolazione con due elettrodi di platino distanziati di 5 mm nella camera di registrazione.
- Collegare uno stimolatore esterno all'inserto di stimolazione. Impostare su impulsi di campo bipolare da 5 ms a 0,5 Hz.
- Determinare la tensione di stimolazione ottimale aumentando lo stimolo da 1 V in su. Lo stimolo di soglia è definito come la tensione più bassa alla quale le cellule iniziano a contrarsi. Applicare tensioni di circa il 25% al di sopra di questa soglia. L'intervallo normale è compreso tra 1 V e 30 V.
- Fissa la frequenza di stimolazione con lo stimolatore esterno o attivala con un software di acquisizione.
5. Acquisizione del potenziale d'azione ottico
NOTA: questo protocollo utilizza un software commerciale per l'acquisizione e l'analisi.
- Visualizza i miociti in vista a campo luminoso utilizzando il percorso della luce trasmessa e la telecamera USB.
- Selezionare una cella isolata e ritagliare strettamente il suo percorso ottico con il diaframma di campo assicurando che venga monitorata solo la luce proveniente dalla cella di interesse.
- Attivare l'amplificatore PMT e impostare l'alimentazione PMT su 750 V.
- Eseguire il protocollo di stimolazione (vedere il passaggio 4) insieme al software di acquisizione e contemporaneamente attivare la luce di eccitazione a 470 nm. Quest'ultimo può essere fatto tramite un pannello remoto o automatizzato ad un'intensità fissa (segnale TTL).
- Regolare il guadagno e l'offset dell'amplificatore PMT per assicurarsi che il segnale non si saturi e sia ottimizzato per il raggio di rilevamento del sistema di registrazione.
- Registra 10 sweep assicurando che vengano rilevati potenziali d'azione stabili.
- Continuare a registrare e spostare immediatamente lo stadio del microscopio per acquisire brevemente il segnale di fondo da una regione priva di cellule. Spegnere la spia di eccitazione.
NOTA: questo valore di sfondo(offset F) verrà utilizzato per tenere conto di qualsiasi fluorescenza di fondo. - Se lo si desidera, perfondere localmente farmaci di riferimento come la nifedipina da 1 μM per identificare le risposte cellulari alla manipolazione farmacologica.
- In modo sequenziale, ripetere i passaggi da 5.2 a 5.7, ogni volta selezionando una nuova cella. Sostituire le coverslip se lo si desidera per garantire un elevato turnover sperimentale in una singola seduta.
NOTA: i protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini sono descritti nella Figura 2.
6. Analisi dei dati
- Apri una registrazione salvata con il software di analisi e in media 10 sweep contenenti potenziali d'azione stimolati da una singola cella.
- Prendi una media del segnale di base che rappresental'offset F e sottrai questo dalla traccia mediata.
- Calcola ∆F/F0 con la seguente formula (dove F è misurata la fluorescenza e F0 è la fluorescenza diastolica):
- Identificare la traccia basale (diastolica) e l'area di interesse (AP) e misurare i parametri del potenziale d'azione cardiaco desiderati. Ciò include, ma non è limitato al tempo di decadimento per la ripolarizzazione del 50% (APD50)e del 90% (APD90).
- Esporta i dati da questa singola cella a un software per fogli di calcolo.
- Ripetere i passaggi 6.1 – 6.5 per tutte le registrazioni. Valutare i risultati con appropriati test non accoppiati o analisi della varianza.
Figura 2: Protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini. (A) Diagramma di flusso del protocollo di carico VF2.1Cl completo per iPSC-CM e cardiomiociti nativi. (B) Schema semplificato di beam splitter (BS) e configurazioni di filtri utilizzati in questo protocollo per l'eccitazione e il rilevamento dell'emissione di VF2.1Cl in risposta alle variazioni della tensione transmembrana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Figura 3: Profili del potenziale d'azione ottico (AP) di cardiomiociti nativi isolati e cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CM). (A) AP ottico rappresentativo di un singolo cardiomiocita murino (al centro) con SEM ± media di APD50 e APD90 (n = 7, destra). (B) AP ottico rappresentativo di un singolo cardiomiocita umano derivato da iPSC (centro) con SEM ± media di APD50 e APD90 (n = 48, a destra). (C) Manipolazione farmacologica di iPSC-CM AP (centro) con 1 μM di nifedipina. La ± SEM dell'alterazione di APD90 dopo applicazione di nifedipina (n=5). **p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Un elevato rapporto segnale/rumore è stato regolarmente osservato nei nostri campioni, nonostante il campo visivo ridotto quando ci si concentra su una singola cella. Più rumore è stato osservato in iPSC-CM più piccoli, ma ciò non ha ostacolato l'analisi successiva alla media dell'insieme. La morfologia dell'AP è chiaramente definita, fornendo una panoramica approfondita della funzione elettrofisiologica cellulare e della meccanica di ripolarizzazione attraverso i costrutti cardiomiocitari. Caratteristiche di nota sono la velocità di15 sharp upstroke precedentemente descritta e le caratteristiche pronunciate di fase 1 dei cardiomiociti murini (APD50: 58.34±17.98 ms, APD90: 160.9±30.15 ms, n = 7; Figura 3A) che sono morfologicamente distinti dai segnali ottici iPSC-CM umani (APD50: 170.1±11.18 ms, APD90: 317.5±15.56 ms, n=48; Figura 3B). Abbiamo osservato un più alto tasso di fotosbiancamento e tossicità cellulare dopo l'indagine ottica nei cardiomiociti nativi rispetto alle iPSC-CM umane in coltura. I protocolli per la preparazione e il carico del colorante nei cardiomiociti nativi sono inclusi nel materiale supplementare.
Gli iPSC-CM umani rispondono alla manipolazione farmacologica con nifedipina (1 μM). Un noto antagonista del canale Ca2+ di tipo L (CaV1.2), la nifedipina dovrebbe ridurre la durata dell'AP nelle cellule con funzione fisiologica. Durante l'applicazione continua del farmaco, è stata osservata una diminuzione del 41,5% dell'APD90 (n = 5), suggerendo sia l'espressione fisiologica dei canali CaV1,2 in queste cellule sia la funzionalità dell'imaging basato su VF2.1Cl come piattaforma per studi prospettici di screening dei farmaci cardiaci ad alto rendimento (Figura 3C).
Materiale supplementare: preparazione nativa dei cardiomiociti murini per l'imaging in tensione. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Qui descriviamo un protocollo di base per acquisire facilmente profili AP dettagliati da iPSC-CM isolati adatti per la modellazione elettrofisiologica e lo screening di farmaci cardiaci. Rileviamo AP regolari e robusti dai nostri iPSC-CM scarsamente seminati, il che suggerisce sia la funzionalità dell'indicatore che la fedeltà metodologica.
A causa dell'ampio spettro di metodologie commerciali per la riprogrammazione iPSC e della mancanza di standardizzazione per i protocolli di differenziazione cardiaca, i modelli basati su iPSC possono mostrare un'immensa variabilità nella loro funzione e morfologia16. Ciò può anche ostacolare l'efficacia degli studi di cardiotossicità. Riportiamo risposte generalmente robuste a indagini sperimentali estese con citotossicità minima indotta da indicatori a basse intensità luminose di eccitazione. La standardizzazione della dissociazione di base e della semina a copertura è fondamentale per garantire una qualità costante dei preparati iPSC-CM. I coverslip sciolti, che possono essere facilmente inseriti e sostituiti all'interno della piattaforma di imaging, sono incredibilmente utili per una rapida acquisizione e caratterizzazione dei dati di singoli cardiomiociti. Va notato, tuttavia, che osserviamo un leggero calo della vitalità cellulare dopo lunghi periodi (cioè più di 4 settimane) di coltura sparsa su coperture di vetro.
La costruzione modulare di un sistema di fotometria ad alta velocità delineato nella fase 2 è di fondamentale importanza per questo protocollo. Molte configurazioni basate su ottica sono disponibili in commercio e possono essere ottimizzate per un'ampia gamma di requisiti di registrazione del segnale. Questi vanno dall'imaging quantitativo utilizzando telecamere ad alta risoluzione e di grandi aree fino alle misurazioni fotometriche del segnale totale da un'area definita. Usando quest'ultimo, quantifichiamo la fluorescenza ad alta velocità da una singola area mascherata utilizzando un fotomoltiplicatore (PMT). In combinazione con componenti di illuminazione a commutazione rapida, ciò consente una dissezione completa di componenti con potenziale d'azione rapida con una risoluzione temporale estremamente elevata (segnale analogico fino a 1 kHz). Sono necessarie alte frequenze di campionamento per garantire misurazioni affidabili del potenziale d'azione upstroke nei cardiomiociti e possono essere fondamentali in altri costrutti eccitabili (cioè neuroni) con cinetica di eccitazione estremamente veloce. Inoltre, questo sistema flessibile è vantaggioso perché 1) consente un'indagine approfondita dell'elettrofisiologia a cella singola con selezione del diaframma di campo, 2) la digitalizzazione del segnale analogico non è integrata o pre-elaborata ed è quindi direttamente sotto il controllo dello sperimentatore, 3) la natura modulare della strumentazione fotometrica consente una semplice riconfigurazione per consentire la misurazione ottica simultanea con altri indicatori o microelettrodi. L'aggiunta di un secondo canale fotomoltiplicatore, con set di filtri appropriati per evitare sovrapposizioni spettrali, consentirà una vera misurazione simultanea dell'indicatore fluorescente intracellulare di calcio CAL-590 insieme a VF2.1Cl. È anche importante notare che questo sistema multiuso può essere utilizzato alternativamente per la valutazione approfondita della manipolazione intracellulare del calcio come precedentemente descritto17,18,19,20.
Mentre la risoluzione temporale del nostro sistema porta molti vantaggi, va notato che i parametri che richiedono l'analisi della distribuzione spaziale dei segnali di fluorescenza, come i modelli di eccitazione o la velocità di conduzione, non sono adatti per l'indagine con le tecniche di fotometria che usiamo qui e sono nel regno della mappatura ottica. L'hardware qui descritto può essere facilmente convertito in una configurazione di mappatura ottica mediante lo scambio del fotomoltiplicatore con una fotocamera specializzata adatta con frame rate elevati e grande capacità del pozzo. La nostra configurazione descritta può offrire informazioni temporali estremamente dettagliate a una frazione (fino a 1/10th)del prezzo commerciale di telecamere avanzate per grandi aree con capacità equivalenti. Le tecniche di scansione della linea confocale sono anche più dettagliate spazialmente rispetto al nostro metodo, tuttavia le limitazioni in z limitano l'acquisizione di fluorescenza da più piani trasversali contemporaneamente. Questo non è l'ideale per l'imaging di reporter legati a membrana detenuti da iPSC-CM con morfologie tipicamente eterogenee. Le misurazioni fotometriche che utilizzano un microscopio a epifluorescenza standard evitano questo problema accedendo istantaneamente all'intera superficie cellulare, sempre a un costo molto inferiore per punto dati.
Raccomandiamo vivamente VF2.1Cl per condurre saggi di tensione con cellule eccitabili. Attualmente, sono disponibili molti VSD che operano sotto una moltitudine di meccanismi diversi, ognuno con i propri limiti intrinseci. I comuni coloranti stirici elettrocromici come di-8-ANEPPS o di-4-ANBDQBS che mostrano risposte rapide alla tensione transmembrana sono tuttavia ostacolati dalla bassa sensibilità e dall'elevato carico capacitivo21,22. Gli indicatori di tensione geneticamente codificati (GEVI) utilizzano la fusione di proteine fluorescenti in domini di rilevamento della tensione molecolare23 o ossine microbiche24 e forniscono dissezioni altamente sensibili della dinamica della tensione cellulare, ma sono ostacolati da cinetiche ridotte e risposte non lineari. Un elenco di VSD comuni e le loro proprietà dinamiche di base sono inclusi nella Tabella 1. Le sonde PeT come VF2.1Cl offrono un buon compromesso, mostrando una cinetica veloce e una sensibilità decente con interruzioni cellulari minime. Tuttavia, questo VSD è limitato perché, a differenza dei coloranti stirilo21, non può essere utilizzato per risolvere il potenziale di membrana assoluto. Questo svantaggio intrinseco evidenzia la sfortunata conseguenza di mantenere l'accuratezza dei dati a un throughput più elevato quando si misura l'elettrofisiologia cellulare.
|
Sensibilità (% ∆F/F per 100mV) |
Velocità (ms) | |
| Coloranti a base di PeT | ||
| VF2,1Cl7 | 27 | < 1 |
| BeRST125 · | 24 | < 1 |
| RhoVR126 · | 47 | < 1 |
| Coloranti emicyanine | ||
| Di-8-ANEPPS21 | 10 | < 1 |
| Di-4-ANEPPS27 | 8 | < 1 |
| Di-4-ANBDQBS22 | 10–20 | < 1 |
| RH23728 | 11 | < 1 |
| PGH129 · | 17.5 | < 1 |
| GEVIS | ||
| ArcLight30 | 32 | 12324 |
| Arco D95N31 | 40 | 4124 |
| Sirena32 | 40 | 17.4 |
| VSFP 2,333 | 13.3 | 2523 |
| QuasAr224 | 90 | 11 |
| TASTO | ||
| Dio/DPA34 | 56 | 2 |
Tabella 1: Un breve elenco dei VSD comuni e delle loro principali proprietà fluorescenti.
Notiamo che gli unaccoppiatori eccitazione-contrazione come blebbistatina o 2,3-butano-dione monoxime (BDM) sono spesso utilizzati nelle misurazioni della tensione ottica per ridurre l'artefatto del movimento sopprimendo la contrazione cardiaca35. Tuttavia, rapporti precedenti hanno dimostrato che entrambi i composti prolungano significativamente la durata dell'AP e appiattiscono la restituzione dell'AP in cuori interi perfusi36,37. Inoltre, blebbistatin ha proprietà fluorescenti che si sovrappongono agli spettri di VF2.1Cl e quindi potrebbero non essere appropriate per l'uso con questo colorante38.
Il nostro protocollo versatile richiede regolazioni minime per l'indagine ottica in una varietà di costrutti eccitabili bidimensionali e tridimensionali. Questo metodo consente una quantificazione rapida e precisa della meccanica di ripolarizzazione, che può fornire preziose informazioni sulle anomalie ioniche cellulari. Nelle nostre mani, questo protocollo fornisce segnali ottici chiari con buoni rapporti segnale/rumore anche in celle più piccole. La nostra piattaforma semplice ed efficace può essere applicata per la convalida non invasiva della sicurezza dei farmaci cardiaci e studi di screening ad alto rendimento utilizzando iPSC-CM specifici per il paziente.
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Disclosures
Cairn Research Ltd ha supportato questa pubblicazione coprendo i costi di produzione del file video.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Cairn Research Ltd. per il loro gentile contributo finanziario che ha coperto i costi di produzione di questa pubblicazione. Inoltre, ringraziamo la signora Ines Mueller e la signora Stefanie Kestel per il loro eccellente supporto tecnico.
La ricerca degli autori è sostenuta dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania - EXC 2067/1- 390729940) e dalla Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 0.25 Trypsin EDTA | Gibco | 25200056 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucose anhydrous BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FluoVolt Membrane Potential Kit | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inhibitor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 61870010 | |
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | ||
| Circle Coverslips, Thickness 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Dual OptoLED Power Supply | Cairn Research | ||
| ET470/40x Excitation Filter | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Etched Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Cairn Research | ||
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | ||
| MonoLED | Cairn Research | ||
| Multiport Adaptors | Cairn Research | ||
| Myopacer Cell Stimulator | IonOptix | ||
| Optomask Shutter | Cairn Research | ||
| Optoscan System Controller | Cairn Research | ||
| PH-1 Temperature Controlled Platform | Warner Instruments | ||
| Photomultiplier Detector | Cairn Research | ||
| PMT Amplifier Insert | Cairn Research | ||
| PMT Supply Insert | Cairn Research | ||
| RC-26G Open Bath Chamber | Warner Instruments | ||
| SA-OLY/2AL Stage Adaptor | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| TC-20 Dual Channel Temperature Controller | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Objective | Olympus | ||
| USB 3.0 Colour Camera | Imaging Source | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| IC Capture 2.4 | Imaging Source | ||
| Prism 8 | Graphpad |
References
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