Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.
Abstract
Verandering van de adipocytenfunctie draagt bij aan de pathogenese van metabole ziekten, waaronder diabetes type 2 en insulineresistentie. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Het moduleren van de expressie van eiwitten en micro-RNA's in adipocyten blijft zeer uitdagend. Dit artikel beschrijft een protocol om murine fibroblasten te differentiëren in volwassen adipocyten en om de expressie van eiwitten en micro-RNA's in volwassen adipocyten te moduleren door middel van omgekeerde transfectie met behulp van klein-interfererend RNA (siRNA) en micro-RNA nabootsen (miR mimic) oligonucleotiden. Dit omgekeerde transfectieprotocol omvat de incubatie van het transfectiereagens en de oligonucleotiden om een complex te vormen in de celkweekplaat waaraan de volwassen adipocyten worden toegevoegd. De adipocyten mogen zich vervolgens opnieuw hechten aan het aanhangen van plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden /transfectiereagenscomplex. Functionele analyses zoals de studie van insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse kunnen worden uitgevoerd op de getransfecteerde 3T3-L1 volwassen adipocyten om de impact van eiwit- of micro-RNA-manipulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen.
Introduction
Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor tal van stofwisselingsziekten, waaronder insulineresistentie (IR), diabetes type 2 (T2D) en hart- en vaatziekten1. De huidige therapieën zijn er niet in geslaagd om de voortdurend stijgende prevalentie van deze ziekten te stoppen, en het beheer van de IR van obese en diabetische patiënten blijft een belangrijk klinisch probleem. Vetweefsel speelt een cruciale rol bij de controle van energiehomeostase en de pathologische expansie tijdens obesitas draagt bij aan de ontwikkeling van IR en T2D2,3. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Veel onderzoeken hebben de rol van eiwitcoderende RNA's in de adipocytenfysiologie en hun associatie met obesitas onderzocht.
Meer recent heeft de ontdekking van niet-coderende RNA's (ncRNA's), met name micro-RNA's (miRs), nieuwe concepten gesmeed met betrekking tot het mechanisme van de regulatie van genexpressieprogramma's. Studies hebben aangetoond dat ncRNA's belangrijke regulatoren zijn van de adipocytenfunctie en dat hun ontregeling een belangrijke rol speelt bij stofwisselingsziekten4. De manipulatie van eiwitten en ncRNA's in adipocyten is dus cruciaal om hun rol in de adipocytenfunctie en hun impact op pathologieën zoals T2D te ontcijferen. Het manipuleren van de expressie van eiwitten en ncRNA's in vivo en in primaire adipocyten blijft echter zeer uitdagend, wat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert.
Murine 3T3-L1 fibroblasten differentiëren gemakkelijk in volwassen, functionele en insuline-responsieve adipocyten, die een goed gekarakteriseerde cellijn zijn die wordt gebruikt om de adipocytenfunctie te bestuderen (bijv. Insulinesignalering, glucoseopname, lipolyse en adipokines-secretie)5,6,7,8,9,10. Deze eigenschappen maken 3T3-L1-adipocyten een aantrekkelijk model om de expressie van eiwitcoderende en nc-RNA's te moduleren om hun rol in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te ontcijferen. Helaas, terwijl 3T3-L1 fibroblasten gemakkelijk te transfecteren zijn met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia, zijn gedifferentieerde 3T3-L1-adipocyten een van de moeilijkste cellijnen om te transfecteren. Dit is de reden waarom talrijke studies die genexpressie in 3T3-L1-cellen manipuleren, zich hebben gericht op adipocytendifferentiatie in plaats van op de adipocytenfunctie.
Lange tijd was de enige efficiënte techniek om adipocyten te transfecteren elektroporatie5, wat vervelend en duur is en celschade kan veroorzaken. Dit artikel rapporteert een omgekeerde transfectietechniek met behulp van een gemeenschappelijk transfectiereagens, dat de hands-on tijd voor transfectie vermindert, geen effect heeft op de levensvatbaarheid van cellen en veel goedkoper is dan elektroporatie. Dit protocol is perfect geschikt voor de transfectie van siRNA en andere oligonucleotiden zoals micro-RNA-mimics (miR-mimics) en anti-miRs. Het principe van het reverse-transfectieprotocol is om het transfectiereagens en de oligonucleotiden te incuberen om een complex in de celkweekplaat te vormen en vervolgens de volwassen adipocyten in de putten te zaaien. Vervolgens hechten de adipocyten zich opnieuw aan het aanhangen van het plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden / transfectiereagenscomplex. Deze eenvoudige, efficiënte en goedkope methodologie maakt het mogelijk om de rol van eiwitcoderende RNA's en miRs in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Gebruik steriele technieken om alle stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flowcelkweekkap. Zie tabel met materialen voor meer informatie over alle reagentia en apparatuur.
1. Differentiatie van murine 3T3-L1 fibroblasten in adipocyten
- Kweek de 3T3-L1 fibroblasten in 100 mm schotels in kweek medium-DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% pasgeboren kalfsserum en 1% penicilline en streptomycine(Figuur 1A). Plaats de schalen in een weefselkweekincubator (7% CO2 en 37 °C).
- Verander twee dagen na confluentie het kweekmedium en vervang door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 0,25 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0,25 μM dexamethason, 5 μg / ml insuline en 10 μM rosiglitazon.
OPMERKING: Het duurt 5 dagen om samenvloeiing te bereiken wanneer de cellen worden gezaaid bij 300.000 cellen per 100 mm schaal. - Vervang twee dagen later het kweekmedium door DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine aangevuld met 5 μg/ml insuline en 10 μM rosiglitazon en incubateer gedurende 2 dagen. Voed de cellen vervolgens om de 2 dagen met DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine(figuur 1B).
- Transfecteer de 3T3-L1 adipocyten 7-8 dagen na het begin van het differentiatieprotocol.
OPMERKING: Het is belangrijk om een hoog niveau van differentiatie (>80%) te bereiken vóór de transfectie om de proliferatie van de resterende fibroblasten na de transfectie te voorkomen, wat zou leiden tot een gemengde populatie van cellen die de resultaten zou kunnen vertekenen.
2. Bereiding van voorgecoate platen
- Bereid op de dag voor of enkele uren voor de transfectie een oplossing van collageen type I bij 100 μg/ml in 30% ethanol uit een stamoplossing van 1 mg/ml. Voeg 250 μL collageen toe per putje van een 12-putplaat en 125 μL per putje van een 24-putplaat en verdeel de oplossing over het oppervlak van de put.
- Laat de plaat zonder deksel onder de kweekkap totdat het collageen droogt. Tweemaal wassen met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
OPMERKING: Voorgecoate platen zijn te koop.
3. Bereiding van het transfectiemengsel
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie siRNA ligt tussen 1 en 100 nM (1 tot 100 pmol siRNA per put van een 12-well plaat). De uiteindelijke concentratie van de miR-nabootsing is 10 nM (10 pmol/put). Bepaal de beste concentratie van elk siRNA, miR-mimiek of ander oligonucleotide voordat het experiment wordt gestart om off-target effecten te voorkomen. Voer transfectie-experimenten uit in drievoud om statistische analyse van de resultaten te vergemakkelijken. Bereid alle reagentia in overmaat voor om rekening te houden met normaal verlies tijdens het pipetteren.
- Meng door pipetteren (volume/volume) het siRNA (of andere oligonucleotiden) met verbeterde Minimal Essential Medium(tabel 1). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het transfectiereagens en het verbeterde Minimal Essential Medium toe aan het siRNA en pipetteer om te mengen(tabel 1). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (ga gedurende deze tijd verder naar sectie 4). Voeg de transfectiemix toe aan elk putje van de met collageen beklede plaat.
4. Bereiding van de 3T3-L1 adipocyten
- Was de cellen in de petrischaal van 100 mm tweemaal met D-PBS. Voeg 5x trypsine toe aan de cellen (1 ml per 100 mm schaal) en zorg ervoor dat je het hele oppervlak bedekt met de trypsine. Wacht op 30 s en verwijder voorzichtig de trypsine.
- Incubeer de petrischaal gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in de couveuse. Tik op de 100 mm schaal om de cellen los te maken.
- Voeg 10 ml DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine toe om de trypsine te neutraliseren. Pipetteer het medium voorzichtig op en neer om de cellen los te maken en de celsuspensie te homogeniseren.
- Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer of een geautomatiseerde celteller en pas de concentratie van de cellen aan op 6,25 x10 5 cellen / ml medium. Zaad 800 μL van de celsuspensie/put van een 12-putplaat (5 x 105 cellen) of 400 μl van de celsuspensie/put van een 24-putplaat (2,5 x 105 cellen) die het transfectiemengsel bevat.
OPMERKING: Een petrischaaltje van 100 mm met adipocyten maakt de bereiding van één 12-well-plaat of één 24-well-plaat mogelijk. Een schaal van 100 mm bevat meestal 6-7 x 106 adipocyten, wat overeenkomt met 5 x 105 adipocyten per put van een 12-well plaat. - Incubeer de platen in een celkweekincubator(7% CO 2 en 37 °C) en verstoor de cellen gedurende 24 uur niet. Vervang de volgende dag voorzichtig het supernatant door verse DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 10% FCS en 1% penicilline en streptomycine.
OPMERKING: Het is ook mogelijk om de cellen in collageen-voorgecoate 48- en 96-well platen te zaaien, maar neem meer voorzorgsmaatregelen bij het vervangen van de media om loslating van de adipocyten te voorkomen.
5. Functionele analyse van getransfecteerde 3T3-L1 adipocyten
- Studie richt zich op knockdown 24-48 h en 48-96 h na siRNA of miR nabootsing voor respectievelijk mRNA en eiwit.
- Voer functionele analyses uit van getransfecteerde adipocyten om insulinesignalering, glucoseopname, adipokine-secretie, lipolyse en lipogenese te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hier beschreven procedure van omgekeerde transfectie om de expressie van eiwitten of micro-RNA's in 3T3-L1-adipocyten te moduleren, is aangetoond dat de adipocyten hun morfologie behouden na de transfectie (Figuur 1B,C). Inderdaad, 2 dagen na de transfectie waren de adipocyten goed verspreid en bevestigd aan de plaat en presenteerden multiloculaire lipidedruppels die kenmerkend zijn voor volwassen 3T3-L1-adipocyten. Het lipidengehalte verschilde niet tussen de getransfecteerde en niet-getransfecteerde adipocyten (figuur 1D, E). Bovendien was de mRNA-expressie van differentiatiemarkers zoals peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (Pparγ2), adiponectine (Adipoq), glucosetransporter 4 of solute carrier family 2 member 4 (Slc2a4), insulinereceptorgubstraat 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) onveranderd in getransfecteerde cellen in vergelijking met die in niet-getransfecteerde adipocyten (Figuur 1F). Dit reverse-transfectieprotocol is efficiënt omdat >70% van de adipocyten getransfecteerd waren(Figuur 1G,H).
Perilipin-1 is een adipocyt-specifiek eiwit waarvan bekend is dat het de vorming van lipidedruppeljes bevordert en lipolyse remt. Hier werden 3T3-L1-adipocyten getransfecteerd met gescrambled siRNA (si-SCR) of siRNA tegen Plin1 (si-PLIN1). Drie dagen na de transfectie met si-PLIN1 was het mRNA-gehalte van Plin1 met 70% gedaald (figuur 2A) en het eiwitgehalte met 63% (figuur 2B, C). PLIN1-expressie werd ook geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie 4 dagen na de transfectie en bleek met 92% te zijn afgenomen in vergelijking met de expressie ervan in controleadipocyten (Figuur 2D-F), waardoor de werkzaamheid van zowel het transfectieprotocol als de si-PLIN1 werd aangetoond.
Dit protocol werd ook gebruikt om reverse-transfectie van adipocyten uit te voeren met micro-RNA-nabootsing (miR-mimics) oligonucleotiden om de expressie van miR-34a te upreguleren (figuur 3A). De overexpressie van miR-34a leidde tot de afname van VAMP2-eiwitexpressie met 50% (Figuur 3B,C), een bevestigd doelwit van miR-34a11,12. Ten slotte toont deze studie aan dat omgekeerde transfectie van 3T3-L1-adipocyten hun functie en reactievermogen op insulinestimulatie behoudt. Inderdaad, knockdown van Plin1 in 3T3-L1 adipocyten leidde tot een toename van basale lipolyse (Figuur 4A). Bovendien leidde de overexpressie van miR-34a in 3T3-L1-adipocyten tot de remming van insuline-geïnduceerde eiwitkinase B-fosforylering (figuur 4B, C) en glucoseopname ( figuur4D).
Figuur 1: Differentiatie van 3T3-L1 fibroblasten in volwassen adipocyten. (A) 3T3-L1 fibroblasten werden gezaaid met een dichtheid van 3 x 105 cellen per 100 mm schaal. Representatief 10x brightfield beeld van 3T3-L1 fibroblasten 2 dagen later. (B)Twee dagen na confluentie (dag 0) werden de 3T3-L1 fibroblasten gedifferentieerd in adipocyten met behulp van een differentiatiecocktailmix gedurende 4 dagen (tot dag 4). Representatief 10x brightfield beeld van 3T3-L1 fibroblasten gedifferentieerd in adipocyten (dag 7). Adipocyten met multiloculaire lipidedruppeltjes zijn gemakkelijk waarneembaar. CDe3T3-L1 adipocyten werden op dag 7 getransfecteerd met si-SCR. Representatieve 10x brightfield beelden van getransfecteerde 3T3-L1 adipocyten (dag 9). De morfologie van de getransfecteerde adipocyten is vergelijkbaar met die van de niet-getransfecteerde adipocyten, wat impliceert dat de transfectiemethode zacht is en niet toxisch voor de adipocyten. Schaalstaven: 50 μm. (D-E) De 3T3-L1 adipocyten werden op dag 7 getransfecteerd met si-SCR (bovenste panelen); niet-getransfecteerde adipocyten (onderste panelen). Twee dagen later werden de cellen geïncubeerd met Oil Red O om lipiden te kleuren. (D) Representatieve beelden van de gekleurde cellen in de plaat en representatieve 10x brightfield beelden worden getoond. Schaalstaven: 50 μm. (E) De Oil Red O die in de cellen is opgenomen, werd geëlekeerd met 2-propanol en gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer. Gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de absorptie van de niet-getransfecteerde cellen is genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd door student's t-test. (F) De 3T3-L1 adipocyten werden getransfecteerd met si-SCR. Drie dagen na de transfectie werden de cellen geoogst om het totale RNA te isoleren. De expressie van adipocyt differentiatiemarkers werd gemeten met qRT-PCR en genormaliseerd met behulp van 36B4 RNA-niveaus. De gegevens vertegenwoordigen de mRNA-expressie in getransfecteerde cellen ten opzichte van die in niet-getransfecteerde cellen (genormaliseerd tot 1, weergegeven door de stippellijn) en worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd door student's t-test. (G-H) De 3T3-L1-adipocyten werden getransfecteerd met si-SCR of fluorescerende kleurstof (FAM)-gelabeld si-RNA en verguld op coverslips. 3T3-L1-adipocyten werden 8 uur later geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. (G) Representatief enkelvlaksbeeld van getransfecteerde 3T3-L1-cellen wordt getoond. (H) Kwantificering van de FAM-positieve cellen ten opzichte van het totale aantal cellen. Gegevens worden uitgedrukt als percentage cellen die fluorescerend si-RNA bevatten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Mann-Whitney-test, ****p < 0,0001. Afkortingen: si-SCR = scrambled siRNA; SEM = standaardfout van het gemiddelde; qRT-PCR = kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie; FAM = fluoresceïne-amidiet; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; si-FAM = FAM-gelabeld si-RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Eiwit-uitschakeling in 3T3-L1 adipocyten. 3T3-L1-adipocyten werden getransfecteerd met gecrambled si-RNA (si-SCR) of si-RNA tegen Plin1 (si-PLIN1). Driedagen na de transfectie werd de mRNA-expressie van Plin1 gemeten met qRT-PCR. De mRNA-expressie werd genormaliseerd met behulp van 36B4 RNA-niveaus en uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de met si-SCR behandelde cellen werden genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van vier onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Student's t-test,**p < 0,01. (B-C) Drie dagen na de transfectie werden eiwitlysaten onderworpen aan western blotting met antilichamen gericht tegen PLIN1 en HSP90 (loading control). Representatieve immunoblots worden getoond. (C) De hoeveelheid PLIN1 werd gekwantificeerd door densitometriescananalyse en genormaliseerd met behulp van de hoeveelheid HSP90. Gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de met si-SCR behandelde cellen zijn genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van vier onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van student's t-test,*p < 0,05. (D-F) De 3T3-L1-adipocyten werden getransfecteerd met si-SCR of si-PLIN1 en op coverslips verguld. De expressie van PLIN1 werd 96 uur later geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. (D) Representatieve enkelvlaksbeelden van 3T3-L1-adipocyten gekleurd met anti-perilipin-antilichaam en een anti-konijn-Alexa647-geconjugeerd antilichaam worden getoond. Schaalbalken = 10 μm. (E) Driedimensionale (3D) volumeweergave van 3T3-L1-adipocyten gesegmenteerd in 3D met behulp van commerciële software. Schaalstaven = 10 μm. (F) De kwantificering van de PLIN1-signaalintensiteit ten opzichte van het totale aantal cellen. Gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de met si-SCR behandelde cellen zijn genormaliseerd tot 100%. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Mann-Whitney-test, ****p < 0,0001. Afkortingen: si-SCR = scrambled siRNA; si-PLIN1 = siRNA tegen Plin1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = heat shock eiwit 90; SEM = standaardfout van het gemiddelde; qRT-PCR = kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie; FAM = fluoresceïne-amidiet; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindool; IB = immunoblotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: micro-RNA-overexpressie in 3T3-L1-adipocyten. 3T3-L1-adipocyten werden getransfecteerd met controle micro-RNA mimic (miR-control) of micro-RNA 34a mimic (miR-34a). Drie dagen na de transfectie werden de cellen geoogst voor (A) RNA-extractie of (B) bereiding van eiwitlysaten. (A) De expressie van miR-34a werd gemeten met qRT-PCR. De miR-expressie werd genormaliseerd met behulp van kleine U6-RNA-niveaus en uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de met miR-controle behandelde cellen werden genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van student's t-test,*p < 0,05. (B) Eiwitlysaten werden onderworpen aan western blotting met antilichamen gericht tegen VAMP2 en TUBULIN (belastingscontrole). Representatieve immunoblots van drie onafhankelijke experimenten worden getoond. (C) De hoeveelheid VAMP2 werd gekwantificeerd door densitometriescananalyse en genormaliseerd met behulp van de hoeveelheid TUBULIN. Gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de miR-controlecellen zijn genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd door student t-test,*p < 0,05. Afkortingen: SEM = standaardfout van het gemiddelde; qRT-PCR = kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie; VAMP2 = blaasjes-geassocieerd membraaneiwit 2; IB = immunoblotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van eiwit- of micro-RNA-modulatie in de 3T3-L1 adipocytenfunctie. (A) 3T3-L1 adipocyten werden getransfecteerd met si-SCR of si-PLIN1. Het medium werd 24 uur na de transfectie veranderd en vervolgens 48 uur later verzameld om basale lipolyse te meten. De resultaten worden uitgedrukt als glycerol dat vrijkomt in de media (μg/ml) en als het gemiddelde + SEM van vier onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Student's t-test, ***p < 0,001. (B) 3T3-L1 adipocyten werden getransfecteerd met miR-controle of miR-34a. Het medium werd 24 uur na de transfectie veranderd en vervolgens, 48 uur later, werd het medium gedurende 6 uur veranderd in het depletiemedium (DMEM zonder pyruvaat, 25 mM glucose, 1% penicilline en streptomycine en 0,5% BSA). Vervolgens werden de cellen gedurende 5 minuten behandeld met 0,5 nM insuline. Cellen werden geoogst om eiwitlysaten voor western blotting te bereiden met antilichamen gericht tegen fosfo-PKB en PKB (loading control). Representatieve immunoblots van drie onafhankelijke experimenten worden getoond. (C) De hoeveelheid fosfo-PKB werd gekwantificeerd door middel van densitometriescananalyse en genormaliseerd met behulp van de totale hoeveelheid PKB. De gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de miR-controlecellen die met insuline worden behandeld, zijn genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de tweeweg ANOVA-test, *p < 0,05 in vergelijking met miR-controlecellen behandeld met insuline. (D) 3T3-L1 adipocyten werden getransfecteerd met miR-controle of miR-34a. De media werden 24 uur na de transfectie veranderd en vervolgens, 48 uur later, werd het medium gedurende 6 uur veranderd in het depletiemedium. Vervolgens werden de cellen behandeld met 0,5 nM insuline gedurende 20 minuten. De opname van (2-3H)deoxyglucose werd gemeten gedurende 3 min. De gegevens worden uitgedrukt in willekeurige eenheden, waarbij de basale glucoseopname in met miR-controle behandelde cellen is genormaliseerd tot 1. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde + SEM van drie onafhankelijke experimenten. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de tweeweg ANOVA-test, *p < 0,05 in vergelijking met miR-controlecellen behandeld met insuline. Afkortingen: si-SCR = scrambled siRNA; si-PLIN1 = siRNA tegen Plin1; SEM = standaardfout van het gemiddelde; PKB = proteïnekinase B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR-controle; DMEM = Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium; BSA = runderserumalbumine; ANOVA = variantieanalyse; IB = immunoblotting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Per put (12-well plaat) | Per put (24-well plaat) | |
| Oligonucletiden | 20 μL | 10 μl |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Verbeterde Minimal Essential Medium | 20 μL | 10 μl |
| Transfectie reagens | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Verbeterde Minimal Essential Medium | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Totaal volume transfectiemix | 200 μL | 100 μL |
Tabel 1: Transfectiereagentia vereist voor 12-well en 24-well plaatformaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de differentiatie en transfectie van volwassen adipocyten. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden zoals, maar niet beperkt tot, siRNA's, micro-RNA-nabootsingen en anti-micro-RNA's te transfecteren in 3T3-L1-adipocyten, wat een van de moeilijkste cellijnen is om te transfecteren. Deze methode heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Dit protocol is niet efficiënt voor transfectie met plasmide-DNA, wat het nut van deze techniek voor gain-of-function-studies beperkt. Hoewel muriene cellijnen, waaronder de 3T3-L1-cellijn, meestal zijn gebruikt om de adipocytenfunctie in vitro te bestuderen, verschillen micro-RNA-expressiepatronen en -activiteiten in muizenweefsel vaak van die waargenomen bij mensen; dit is ook het geval bij primaire cellen en cellijnen. Bovendien vereist het medium dat wordt gebruikt voor de differentiatie van 3T3-L1 fibroblast in adipocyten een onfysiologische hormooncocktail (insuline, dexamethason, IBMX en rosiglitazon), en de gedifferentieerde cellen zijn morfologisch verschillend van in vivo volwassen adipocyten: ze presenteren multiloculaire lipidedruppels in plaats van een oniloculaire lipidedruppel. Dit zou enkele verschillen in genexpressie en cellulaire responsen tussen in vitro en in vivo studies kunnen verklaren.
Een voordeel van het gebruik van dit omgekeerde transfectieprotocol in vergelijking met elektroporatie is dat deze methode goedkoper is. Inderdaad, de reagentia zijn minder duur en de hoge efficiëntie van de omgekeerde transfectie vermindert de benodigde hoeveelheden oligonucleotiden en er is geen dure apparatuur zoals een elektroporator nodig. Bovendien is het gebruik van een lagere concentratie siRNA gunstig omdat het off-target effecten vermijdt. Bovendien is deze omgekeerde transfectie een eenvoudige, snelle, zachte en eenvoudige methode van transfectie die minder cellen vereist en zorgt voor een uitstekende levensvatbaarheid van de cel en robuustere gegevens in vergelijking met elektroporatie. Hoewel de hierboven beschreven procedure is geoptimaliseerd voor de differentiatie en omgekeerde transfectie van muis 3T3-L1-cellen, kunnen menselijke preadipocyten ook worden gedifferentieerd in adipocyten5 en gemakkelijk worden onderworpen aan omgekeerde transfectie met behulp van dit protocol. Dit rapport toont aan dat adipocyten levensvatbaar, gezond en responsief op insuline blijven na de omgekeerde transfectie met behulp van een nieuwe generatie van een niet-liposomaal kationisch amfifiel transfectiereagens. De omgekeerde transfectie kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere populaire transfectiereagentia. De hoeveelheden oligonucleotiden en transfectiereagens zouden echter moeten worden geoptimaliseerd om een goede modulatie van expressie en geen nadelige effecten op de levensvatbaarheid van cellen te garanderen.
Dit protocol vergemakkelijkt de studie van de rol van eiwitten en micro-RNA's in de adipocytenfunctie, maar het kan ook worden gebruikt om andere niet-coderende RNA's zoals lnc-RNA's, Y-RNA's of eRNA's te moduleren. Er zijn kritieke stappen in het protocol die van invloed kunnen zijn op de efficiëntie van de procedure. De differentiatie van 3T3-L1 fibroblasten in adipocyten moet zorgvuldig worden gecontroleerd. Het is belangrijk om een hoog niveau van differentiatie te bereiken om de proliferatie van resterende fibroblasten na de transfectie te voorkomen, wat de resultaten van het experiment zou vertekenen. Een ander belangrijk punt is om de transfectie uit te voeren op nieuw gedifferentieerde volwassen adipocyten; de beste timing is 7-8 dagen na het begin van het differentiatieprotocol, wat overeenkomt met 3-4 dagen na het verwijderen van de differentiatiecocktail. Dit zorgt voor een robuuste transfectie-werkzaamheid en bevordert een goede herbevestiging van de adipocyten aan de plaat. Ten slotte moet de behandeling van adipocyten met trypsine zorgvuldig worden gecontroleerd om loslating van de adipocyten te garanderen zonder de cellen te beschadigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door INSERM, de Université Côte d'Azur en het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via het programma Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) en Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. wordt ondersteund door subsidies van de Société Francophone du Diabète (SFD), de Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), het Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) en de Fondation Benjamin-Delessert. J.G. wordt ondersteund door ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. wordt ondersteund door ANR-subsidie ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 en een subsidie van de Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M, gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, die ook wordt ondersteund door het GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
