Summary
Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.
Abstract
A alteração da função adipócito contribui para a patogênese de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. A modulação da expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos continua sendo altamente desafiadora. Este artigo descreve um protocolo para diferenciar os fibroblastos murinos em adipócitos maduros e modular a expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos maduros através de transfecção reversa usando RNA de pequena interferência (siRNA) e micro-RNA imitando (miR imitar) oligonucleotídeos. Este protocolo de transfecção reversa envolve a incubação do reagente transfeccionado e dos oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular à qual os adipócitos maduros são adicionados. Os adipócitos são então autorizados a recolocar à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Análises funcionais como o estudo da sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise podem ser realizadas nos adipócitos maduros 3T3-L1 transfetípidos para estudar o impacto da manipulação de proteínas ou micro-RNA na função adipócito.
Introduction
A obesidade é considerada um dos principais fatores de risco para inúmeras doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina (IR), Diabetes Tipo 2 (T2D) e doenças cardiovasculares1. As terapias atuais não conseguiram parar o constante aumento da prevalência dessas doenças, e o manejo do IR de pacientes obesos e diabéticos continua sendo uma questão clínica importante. O tecido adiposo desempenha um papel crucial no controle da homeostase energética, e sua expansão patológica durante a obesidade contribui para o desenvolvimento de IR e T2D2,3. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. Muitos estudos têm investigado o papel das RNAs de codificação de proteínas na fisiologia adipócito e sua associação com a obesidade.
Mais recentemente, a descoberta de RNAs não codificadas (NCRNAs), especialmente micro-RNAs (miRs), forjou novos conceitos relacionados ao mecanismo de regulação de programas de expressão genética. Estudos têm demonstrado que as NCRNAs são importantes reguladores da função adipócito, e que sua desregulação desempenha um papel importante nas doenças metabólicas4. Assim, a manipulação de proteínas e ncRNAs em adipócitos é crucial para decifrar seus papéis na função adipócito e seu impacto em patologias como o T2D. No entanto, manipular a expressão de proteínas e ncRNAs in vivo, bem como em adipócitos primários permanece altamente desafiador, favorecendo o uso de modelos in vitro adipócitos.
Os fibroblastos murine 3T3-L1 se diferenciam facilmente em adipócitos maduros, funcionais e responsivos à insulina, que são uma linha celular bem caracterizada usada para estudar a função adipócito (por exemplo, sinalização de insulina, captação de glicose, lipólise e secreção de adipokines)5,6,7,8,9,10. Essas propriedades tornam os adipócitos 3T3-L1 um modelo atraente para modular a expressão de codificação de proteínas e nc-RNAs para decifrar seu papel na função adipócite e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade. Infelizmente, enquanto os fibroblastos 3T3-L1 são fáceis de transfetar usando reagentes disponíveis comercialmente, adipócitos 3T3-L1 diferenciados são uma das linhas celulares mais difíceis de transfectar. É por isso que inúmeros estudos que manipulam a expressão genética em células 3T3-L1 têm focado na diferenciação de adipócitos em vez da função adipócito.
Por muito tempo, a única técnica eficiente para transfetálces foi a eletroporação5, que é tediosa, cara, e pode causar danos celulares. Este artigo relata uma técnica de transfecção reversa usando um reagente de transfecção comum, que reduz o tempo prático para transfecção, não tem efeito sobre a viabilidade celular, e é muito menos caro do que a eletroporação. Este protocolo é perfeitamente adequado para a transfecção de siRNA e outros oligonucleotídeos, como mímicas micro-RNA (miR mimics) e anti-miRs. O princípio do protocolo de transfecção reversa é incubar o reagente de transfecção e os oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular e, em seguida, semear os adipócitos maduros nos poços. Em seguida, os adipócitos se recolocarão à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Essa metodologia simples, eficiente e barata permite o estudo do papel das RNAs e miRs de codificação proteica na função adipócito e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade.
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Protocol
NOTA: Use técnicas estéreis para executar todas as etapas do protocolo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos.
1. Diferenciação de fibroblastos murine 3T3-L1 em adipócitos
- Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 mm em cultura média-DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1A). Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos (7% CO2 e 37 °C).
- Dois dias após a confluência, mude o meio de cultura, substituindo-o por DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro fetal de 10% (FCS) e 1% de penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 0,25 mM 3-Isobutil-1-metilxanthine (IBMX), 0,25 μM dexametasona, 5 μg/mL de insulina e 10 μM rosiglitazone.
NOTA: Leva 5 dias para atingir a confluência quando as células são semeadas a 300.000 células por prato de 100 mm. - Dois dias depois, substitua o meio de cultura por DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 5 μg/mL e rosiglitazone de 10 μM e incubar por 2 dias. Em seguida, alimente as células a cada 2 dias com DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1B).
- Transfeito os adipócitos 3T3-L1 7-8 dias após o início do protocolo de diferenciação.
NOTA: É importante atingir um alto nível de diferenciação (>80%) antes da transfecção para evitar a proliferação dos fibroblastos restantes após a transfecção, o que levaria a uma população mista de células que poderiam influenciar os resultados.
2. Preparação de placas pré-revestidas
- No dia anterior ou poucas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 μg/mL em 30% de etanol a partir de uma solução de estoque a 1 mg/mL. Adicione 250 μL de colágeno por poço de uma placa de 12 poços e 125 μL por poço de uma placa de 24 poços, e espalhe a solução sobre a superfície do poço.
- Deixe a placa sem a tampa sob o capô da cultura até que o colágeno seque. Lave duas vezes com o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco (D-PBS).
NOTA: As placas pré-revestidas estão disponíveis para compra.
3. Preparação da mistura de transfecção
NOTA: A concentração final de siRNA é entre 1 e 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por poço de uma placa de 12 poços). A concentração final da mímica miR é de 10 nM (10 pmol/bem). Determine a melhor concentração de cada siRNA, miR mimic ou outro oligonucleotídeo antes de iniciar o experimento para evitar efeitos fora do alvo. Realizar experimentos de transfesão em triplicado para facilitar a análise estatística dos resultados. Prepare todos os reagentes em excesso para explicar a perda normal durante a pipetação.
- Misture por pipetação (volume/volume) o siRNA (ou outros oligonucleotídeos) com um meio essencial mínimo melhorado(Tabela 1). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Adicione o reagente de transfecção e o meio mínimo essencial melhorado ao siRNA e a pipeta para misturar(Tabela 1). Incubar por 20 min em temperatura ambiente (durante este tempo, proceda à seção 4). Adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.
4. Preparação dos adipócitos 3T3-L1
- Lave as células na placa de Petri de 100 mm duas vezes com D-PBS. Adicione 5x trypsin às células (1 mL por prato de 100 mm), certificando-se de cobrir toda a superfície com o trypsin. Aguarde por 30 s e remova cuidadosamente o trippsin.
- Incubar a placa de Petri por 5-10 min a 37 °C na incubadora. Toque na antena de 100 mm para desprender as células.
- Adicione 10 ml de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% DE FCS e 1% penicilina e estreptomicina para neutralizar a trippsina. Tubo cuidadosamente o meio para cima e para baixo para desacopr as células e homogeneizar a suspensão celular.
- Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador celular automatizado, e ajuste a concentração das células para 6,25 x 105 células/mL de médio. Semente 800 μL da suspensão/poço da célula de uma placa de 12 poços (5 x 105 células) ou 400 μl da suspensão/poço da célula de uma placa de 24 poços (2,5 x 105 células) contendo a mistura de transfecção.
NOTA: Uma placa de Petri de 100 mm de adipócitos permitirá a preparação de uma placa de 12 poços ou uma placa de 24 poços. Um prato de 100 mm geralmente contém 6-7 x 106 adipócitos, que correspondem a 5 x 105 adipócitos por poço de uma placa de 12 poços. - Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular (7% CO2 e 37 °C), e não perturbe as células por 24 h. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o supernaente por DMEM fresco sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina.
NOTA: Também é possível semear as células em placas de 48 e 96 poços revestidas de colágeno, mas tomar mais precauções ao substituir a mídia para evitar o descolamento dos adipócitos.
5. Análise funcional de adipócitos 3T3-L1 transfeinados
- Meta de estudo knockdown 24-48 h e 48-96 h após siRNA ou miR imitam a entrega para mRNA e proteína, respectivamente.
- Realizar análises funcionais de adipócitos transfectados para estudar sinalização de insulina, captação de glicose, secreção de adipokine, lipólise e lipogênese.
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Representative Results
Utilizando-se o procedimento de transfecção reversa descrito aqui para modular a expressão de proteínas ou micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, os adipócitos têm mostrado preservar sua morfologia após a transfecção (Figura 1B,C). De fato, 2 dias após a transfecção, os adipócitos foram bem espalhados e ligados à placa e apresentaram gotículas lipídicas multiloculares que são uma característica de adipócitos 3T3-L1 maduros. O teor lipíduo não foi diferente entre os adipócitos transfectados e não transfectados(Figura 1D,E). Além disso, a expressão mRNA de marcadores de diferenciação como gamma receptor ativado por proliferador peroxisome 2 (Pparγ2), adiponectina (Adipoq),transportador de glicose 4 ou família portadora soluto 2 membro 4 (Slc2a4), substrato do receptor de insulina 1(Receita Federal),perilipin-1(Plin1) foi inalterado em células transfeinadas em comparação com a dos adipócitos não transfilidos(Figura 1F). Este protocolo de transfecção reversa é eficiente, pois >70% dos adipócitos foram transfecionados (Figura 1G,H).
Perilipin-1 é uma proteína específica de adipócito conhecida por promover a formação de gotículas lipídicas e inibir a lipólise. Aqui, adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com siRNA mexido (si-SCR) ou siRNA contra Plin1 (si-PLIN1). Três dias após a transfecção com si-PLIN1, o nível de mRNA de Plin1 diminuiu em 70% (Figura 2A) e o nível de proteína em 63% (Figura 2B,C). A expressão PLIN1 também foi analisada por microscopia de fluorescência 4 dias após a transfecção e constatou-se que diminuiu 92% em relação à sua expressão em adipócitos de controle(Figura 2D-F),demonstrando assim a eficácia tanto do protocolo de transfecção quanto do si-PLIN1.
Este protocolo também foi utilizado para realizar a transfecção reversa de adipócitos com oligonucleotídeos de micro-RNA (miR imitadores) para aumentar a expressão do miR-34a(Figura 3A). A superexpressão do miR-34a levou à diminuição da expressão proteica VAMP2 em 50% (Figura 3B,C), alvo confirmado de miR-34a11,12. Finalmente, este estudo mostra que a transfecção reversa de adipócitos 3T3-L1 preserva sua função e responsividade à estimulação da insulina. De fato, o knockdown de Plin1 em adipócitos 3T3-L1 levou a um aumento na lipólise basal(Figura 4A). Além disso, a superexpressão do miR-34a em adipócitos 3T3-L1 levou à inibição da proteína induzida pela insulina quinase B fosforilação(Figura 4B,C) e captação de glicose(Figura 4D).
Figura 1: Diferenciação dos fibroblastos 3T3-L1 em adipócitos maduros. (A) os fibroblastos 3T3-L1 foram semeados a uma densidade de 3 x 105 células por prato de 100 mm. Imagem representativa 10x brightfield de fibroblastos 3T3-L1 2 dias depois. (B) Dois dias após a confluência (dia 0), os fibroblastos 3T3-L1 foram diferenciados em adipócitos utilizando um mix de coquetéis de diferenciação por 4 dias (até o dia 4). Imagem representativa 10x brightfield de fibroblastos 3T3-L1 diferenciados em adipócitos (dia 7). Adipócitos com gotículas lipídicas multiloculares são facilmente perceptíveis. (C) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR no dia 7. Representativo 10x imagens de brightfield de adipócitos 3T3-L1 transfectados (dia 9). A morfologia dos adipócitos transfectados é comparável à dos adipócitos não transfectados, implicando que o método de transfecção é suave e não tóxico para os adipócitos. Barras de escala: 50 μm. (D-E) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR no dia 7 (painéis superiores); adipócitos não transfectados (painéis inferiores). Dois dias depois, as células foram incubadas com Óleo Vermelho O para manchar lipídios. (D) Imagens representativas das células manchadas na placa e imagens representativas de campo brilhante são mostradas. Barras de escala: 50 μm. (E) O O vermelho-óleo incorporado nas células foi elucido com 2-propanol e quantificado usando um espectrofotômetro. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com a absorção das células não transfeinadas normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada pelo teste t-do-aluno. (F) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR. Três dias após a transfecção, as células foram colhidas para isolar o RNA total. A expressão dos marcadores de diferenciação de adipócitos foi medida por qRT-PCR e normalizada utilizando níveis de RNA 36B4. Os dados representam a expressão mRNA em células transfeinadas em relação às de células não transfeinadas (normalizadas para 1, representadas pela linha pontilhada) e são expressas como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada pelo teste t-do-aluno. (G-H) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR ou corante fluorescente (FAM) rotulado si-RNA e banhados em tampas. Os adipócitos 3T3-L1 foram analisados 8 h depois por microscopia de fluorescência. (G) A imagem representativa de um plano único das células 3T3-L1 transfeinadas é mostrada. (H) Quantificação das células FAM positivos em relação ao número total de células. Os dados são expressos em percentagem de células contendo si-RNA fluorescente. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abreviaturas: si-SCR = siRNA mexido; SEM = erro padrão da média; qRT-PCR = reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa; FAM = fluoresceína amidita; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; si-FAM = Si-RNA rotulado para FAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Silenciamento de proteínas em adipócitos 3T3-L1. Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-RNA mexido (si-SCR) ou si-RNA contra Plin1 (si-PLIN1). (A) Três dias após a transfecção, a expressão mRNA de Plin1 foi medida por qRT-PCR. A expressão mRNA foi normalizada utilizando níveis de RNA 36B4 e expressa em unidades arbitrárias, com as células tratadas com si-SCR normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de quatro experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste tdo Student, **p < 0,01. (B-C) Três dias após a transfecção, os lysatos proteicos foram submetidos a manchas ocidentais com anticorpos direcionados contra PLIN1 e HSP90 (controle de carga). Imunoblots representativos são mostrados. (C) A quantidade de PLIN1 foi quantificada pela análise de densitometria e normalizada utilizando-se a quantidade de HSP90. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com as células tratadas com si-SCR normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de quatro experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o t-teste do Aluno, *p < 0,05. (D-F) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR ou si-PLIN1 e banhados em tampas. A expressão de PLIN1 foi analisada 96 h depois por microscopia de fluorescência. (D) São mostradas imagens representativas de um avião único de adipócitos 3T3-L1 manchados com anticorpo anti-perilipin e um anticorpo conjugado anti-coelho-Alexa647. Barras de escala = 10 μm. (E) Renderização de volume tridimensional (3D) de adipócitos 3T3-L1 segmentados em 3D usando software comercial. Barras de escala = 10 μm. (F) A quantificação da intensidade do sinal PLIN1 em relação ao número total de células. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com as células tratadas com si-SCR normalizadas para 100%. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney, ****p < 0,0001. Abreviaturas: si-SCR = siRNA mexido; si-PLIN1 = siRNA contra Plin1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = proteína de choque térmico 90; SEM = erro padrão da média; qRT-PCR = reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa; FAM = fluoresceína amidita; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenildole; IB = imunoblotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: superexpressão micro-RNA em adipócitos 3T3-L1. Os adipócitos 3T3-L1 foram transfeinados com o controle micro-RNA mimic (miR-control) ou micro-RNA 34a (miR-34a). Três dias após a transfecção, as células foram colhidas para (A) extração de RNA ou (B) preparação de lisess proteicas. (A) A expressão do miR-34a foi medida por qRT-PCR. A expressão miR foi normalizada utilizando pequenos níveis de RNA U6 e expressa em unidades arbitrárias, com as células tratadas com controle de miR normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o t-teste do Aluno, *p < 0,05. (B) Os lysates proteicos foram submetidos a manchas ocidentais com anticorpos direcionados contra VAMP2 e TUBULIN (controle de carga). Imunoblots representativos de três experimentos independentes são mostrados. (C) A quantidade de VAMP2 foi quantificada pela análise de densitometria e normalizada utilizando-se a quantidade de TUBULIN. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com as células de controle miR normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada pelo teste t doAluno, *p < 0,05. Abreviaturas: SEM = erro padrão da média; qRT-PCR = reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa; VAMP2 = proteína de membrana associada à vesícula 2; IB = imunoblotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos da modulação de proteína ou micro-RNA na função adipócito 3T3-L1. (A) Adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com si-SCR ou si-PLIN1. O meio foi alterado 24 horas após a transfecção e depois coletado 48h depois para medir a lipólise basal. Os resultados são expressos como glicerol lançado na mídia (μg/mL), e como a média + SEM de quatro experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste tdo Student, ***p < 0,001. (B) Os adipócitos 3T3-L1 foram transfectados com miR-control ou miR-34a. O meio foi alterado 24h após a transfecção e, em seguida, 48h depois, o meio foi alterado para o meio de esgotamento (DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 1% penicilina e estreptomicina e 0,5% BSA) para 6h. Em seguida, as células foram tratadas com insulina de 0,5 nM por 5 min. As células foram colhidas para preparar lises proteicas para manchas ocidentais com anticorpos direcionados contra fosfo-PKB e PKB (controle de carga). Imunoblots representativos de três experimentos independentes são mostrados. (C) A quantidade de fosfo-PKB foi quantificada pela análise de densitometria e normalizada utilizando a quantidade total de PKB. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com as células de controle de miR tratadas com insulina normalizada para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste ANOVA bidirecional, *p < 0,05 em comparação com as células de controle de miR tratadas com insulina. (D) 3T3-L1 adipócitos foram transfectados com miR-control ou miR-34a. A mídia foi alterada 24h após a transfecção, e então, 48 horas depois, o meio foi alterado para o meio de esgotamento por 6h. Em seguida, as células foram tratadas com insulina de 0,5 nM por 20 minutos. A absorção de(2-3H)desoxicoscose foi medida ao longo de 3 min. Os dados são expressos em unidades arbitrárias, com a absorção de glicose basal em células tratadas com controle de miR normalizadas para 1. Os resultados são expressos como a média + SEM de três experimentos independentes. A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste ANOVA bidirecional, *p < 0,05 em comparação com as células de controle de miR tratadas com insulina. Abreviaturas: si-SCR = siRNA mexido; si-PLIN1 = siRNA contra Plin1; SEM = erro padrão da média; PKB = proteína quinase B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR-controle; DMEM = Meio de Águia modificado de Dulbecco; BSA = albumina de soro bovino; ANOVA = análise de variância; IB = imunoblotting. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Por bem (placa de 12 poços) | Por bem (placa de 24 poços) | |
| Oligonucletídeos | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Meio Essencial Mínimo Melhorado | 20 μL | 10 μL |
| Reagente de transfecção | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Meio Essencial Mínimo Melhorado | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Volume total de mistura de transfecção | 200 μL | 100 μL |
Tabela 1: Reagentes de transfecção necessários para formatos de placas de 12 poços e 24 poços.
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Discussion
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a diferenciação e transfecção de adipócitos maduros. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos como, mas não se limitando a, siRNAs, imitações de micro-RNA e anti-micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, que é uma das linhas celulares mais difíceis de transfeito. Este método tem algumas limitações que precisam ser consideradas. Este protocolo não é eficiente para transfecção com DNA plasmídeo, o que limita a utilidade desta técnica para estudos de ganho de função. Embora as linhas celulares murinas, incluindo a linha celular 3T3-L1, tenham sido tipicamente usadas para estudar a função adipócito in vitro, padrões de expressão de micro-RNA e atividades no tecido murino são muitas vezes diferentes daqueles observados em humanos; este também é o caso com células primárias e linhas celulares. Além disso, o meio utilizado para a diferenciação do fibroblasto 3T3-L1 em adipócitos requer um coquetel hormonal não fisiológico (insulina, dexametasona, IBMX e rosiglitazone), e as células diferenciadas são morfologicamente distintas dos adipócitos in vivo maduros: apresentam gotículas lipídicas multiloculares em vez de uma gotícula lipídica unilocular. Isso poderia explicar algumas diferenças na expressão genética e respostas celulares entre estudos in vitro e in vivo.
Um benefício de usar este protocolo de transfecção reversa em comparação com a eletroporação é que este método é mais barato. De fato, os reagentes são menos caros, e a alta eficiência da transfecção reversa diminui as quantidades de oligonucleotídeos necessários, e não há necessidade de equipamentos caros, como um eletroporador. Além disso, o uso de uma menor concentração de siRNA é benéfico, pois evita efeitos fora do alvo. Além disso, essa transfecção reversa é um método fácil, rápido, gentil e simples de transfecção que requer menos células e garantirá excelente viabilidade celular e dados mais robustos em comparação com a eletroporação. Embora o procedimento detalhado acima tenha sido otimizado para a diferenciação e transfecção reversa das células 3T3-L1 do mouse, os preadipócitos humanos também podem ser diferenciados em adipócitos5 e facilmente submetidos à transfecção reversa usando este protocolo. Este relatório mostra que os adipócitos permanecem viáveis, saudáveis e responsivos à insulina após a transfecção reversa usando uma nova geração de um reagente de transfecção de anfefilos cationicos não liposomais. A transfecção reversa também pode ser realizada usando outros reagentes populares de transfecção. No entanto, as quantidades de oligonucleotídeos e reagente de transfecção precisariam ser otimizadas para garantir uma boa modulação da expressão e sem efeitos adversos sobre a viabilidade celular.
Este protocolo facilita o estudo do papel das proteínas e das micro-RNAs na função adipócito, mas também pode ser usado para modular outras RNAs não codificadas, como lnc-RNAs, Y-RNAs ou eRNAs. Existem etapas críticas no protocolo que podem impactar a eficiência do procedimento. A diferenciação dos fibroblastos 3T3-L1 em adipócitos deve ser cuidadosamente monitorada. É importante atingir um alto nível de diferenciação para evitar a proliferação de fibroblastos remanescentes após a transfecção, o que influenciaria os resultados do experimento. Outro ponto importante é realizar a transfecção em adipócitos maduros recém-diferenciados; o melhor tempo é de 7 a 8 dias após o início do protocolo de diferenciação, que corresponde a 3-4 dias após a remoção do coquetel de diferenciação. Isso garantirá uma eficácia robusta de transfecção e favorecerá um bom reapego dos adipócitos à placa. Finalmente, o tratamento de adipócitos com trippsina deve ser monitorado cuidadosamente para garantir o descolamento dos adipócitos sem danificar as células.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio do INSERM, da Université Côte d'Azur e da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) por meio do programa Investimentos para o futuro Laboratório de Excelência (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelência (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. é apoiado por subsídios da Société Francophone du Diabète (SFD), da Associação Francesaise d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), do Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e da Fondation Benjamin-Delessert. J.G. é suportado pelo ANR-18-CE14-0035-01. A J-F.T. é apoiada pela anr grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e uma subvenção da Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Agradecemos também a Instalação núcleo de imagem do C3M financiada pelo Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e pelo Région PACA, que também conta com o apoio da Plataforma de Microscopia e Imagem GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
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