Summary
מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.
Abstract
שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.
Introduction
השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם1. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלהם עם השמנת יתר.
לאחרונה, הגילוי של RNAs שאינם קידוד (ncRNAs), במיוחד מיקרו-RNAs (miRs), זייף מושגים חדשניים הקשורים למנגנון הרגולציה של תוכניות ביטוי גנים. מחקרים הראו כי ncRNAs הם רגולטורים חשובים של תפקוד אדיפוציטים, וכי dysregulation שלהם ממלא תפקיד חשוב במחלות מטבוליות4. לכן, מניפולציה של חלבונים ו NCRNAs ב adipocytes הוא חיוני כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת השפעתם על פתולוגיות כגון T2D. עם זאת, מניפולציה של ביטוי של חלבונים ו ncRNAs ב vivo, כמו גם adipocytes ראשוני נשאר מאתגר מאוד, העדפת השימוש במודלים אדיפוציטים במבחנה.
פיברובלסטים מורין 3T3-L1 בקלות להבדיל לתוך adipocytes בוגר, פונקציונלי, תנגודת לאינסולין, שהם קו תאים מאופיין היטב המשמש לחקר תפקוד אדיפוזיט (למשל, איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipolysis והפרשת אדיפוקינים)5,6,7,8,9,10. מאפיינים אלה הופכים את 3T3-L1 לאידיפוציטים מודל אטרקטיבי כדי לווסת את הביטוי של קידוד חלבונים ו- NC-RNAs כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת תפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר. למרבה הצער, בעוד 3T3-L1 פיברובלסטים קל להעביר באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית, מודיפוציטים 3T3-L1 מובחנים הם אחד מקווי התא הקשים ביותר כדי להעביר. זו הסיבה שמחקרים רבים המתמרנים ביטוי גנים בתאי 3T3-L1 התמקדו בבידול אדיפוציטים ולא בתפקוד אדיפוציטים.
במשך זמן רב, הטכניקה היעילה היחידה כדי טרנספקט adipocytes היה electroporation5, וזה מייגע, יקר, והוא יכול לגרום נזק לתא. מאמר זה מדווח על טכניקת טרנס-טרנס-זיהום באמצעות ריאגנט תעתיק נפוץ, אשר מפחית את הזמן מעשי עבור transfection, אין השפעה על הכדאיות התא, והוא הרבה פחות יקר מאשר electroporation. פרוטוקול זה מתאים באופן מושלם לתרגום של siRNA ואוליגונוקלאוטידים אחרים כגון מיקרו-RNA מחקה (מחקה miR) ואנטי-miRs. העיקרון של פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הפוך הוא לדגור על ריאגנט הטרנס-זיהום ואת האוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בצלחת תרבית התא ואז לזרוע את אדיפוציטים בוגרים לתוך הבארות. לאחר מכן, אדיפוציטים לחבר מחדש את פני הלוח דבק בנוכחות קומפלקס ריאגנט אוליגונוקלאוטידים / transfection. מתודולוגיה פשוטה, יעילה וזולה זו מאפשרת לחקור את תפקידם של RNAs ו- miRs קידוד חלבונים בתפקוד אדיפוציטים ותפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תא זרימה למינארית. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים אודות כל הריאגנטים והציוד.
1. הבחנה של פיברובלסטים מורין 3T3-L1 לאדיפוציטים
- לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מ"מ בתרבות בינונית DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל שזה עתה נולד, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין(איור 1A). מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות (7% CO2 ו 37 מעלות צלזיוס).
- יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף עם DMEM ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל עוברי (FCS), ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 mM 3-Isobutyl-1-מתילקסנתין (IBMX), 0.25 μM דקסמתזון, 5 מיקרוגרם / mL אינסולין, ו 10 μM רוזיגליצון.
הערה: זה לוקח 5 ימים כדי להגיע למפגש כאשר התאים נזרעים ב 300,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ. - יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 5 מיקרוגרם / mL אינסולין ו 10 מיקרומטר רוזיגליטזון ודגרה במשך יומיים. לאחר מכן, הזן את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 mM, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין (איור 1B).
- מעבירים את אדיפוציטים 3T3-L1 7-8 ימים לאחר תחילת פרוטוקול הבידול.
הערה: חשוב להגיע לרמה גבוהה של בידול (>80%) לפני transfection כדי למנוע את התפשטות של פיברובלסטים הנותרים לאחר transfection, אשר יוביל לאוכלוסייה מעורבת של תאים שעלולים להטות את התוצאות.
2. הכנת צלחות מראש
- ביום שלפני או כמה שעות לפני transfection, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 30% אתנול מפתרון מלאי ב 1 מ"ג / מ"ל. הוסיפו 250 מיקרו-אל של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות ו-125 מיקרול לבאר של צלחת של 24 בארות, ומפזרים את הפתרון על פני הבאר.
- השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. יש לשטוף פעמיים עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (D-PBS) של דולבק.
הערה: לוחות מראש זמינים לרכישה.
3. הכנת תערובת הטרנס-זיהום
הערה: הריכוז הסופי של siRNA הוא בין 1 ל 100 nM (1 עד 100 pmol של siRNA לכל באר של צלחת 12-באר). הריכוז הסופי של חיקוי miR הוא 10 ננומטר (10 pmol / well). קבע את הריכוז הטוב ביותר של כל siRNA, מחקה miR או אוליגונוקלאוטיד אחר לפני תחילת הניסוי כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה. בצע ניסויי טרנספטיציה במשולש כדי להקל על ניתוח סטטיסטי של התוצאות. הכן את כל הריאגנטים עודף כדי להסביר אובדן נורמלי במהלך pipetting.
- ערבבו לפי צנרת (נפח/נפח) את ה-siRNA (או אוליגונוקלאוטידים אחרים) עם מדיום מינימלי חיוני משופר(טבלה 1). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף את ריאגנט transfection ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א, וצינור לערבב (טבלה 1). דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (במהלך תקופה זו, המשך לסעיף 4). מוסיפים את תערובת התמהיל לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.
4. הכנת אדיפוציטים 3T3-L1
- לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף 5x טריפסין לתאים (1 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ), הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 s ולהסיר בזהירות את טריפסין.
- לדגור על צלחת פטרי במשך 5-10 דקות ב 37 °C (57 °F) באינקובטור. הקישו על צלחת 100 מ"מ כדי לנתק את התאים.
- יש להוסיף 10 מ"ל של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מ"מ, 10% FCS ו-1% פניצילין וסטרופומיצין כדי לנטרל את הטריפסין. בזהירות pipet המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא.
- לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי, ולהתאים את הריכוז של התאים ל 6.25 x 105 תאים / מ"ל של בינוני. זרע 800 μL של השעיית התא / באר של צלחת 12-well (5 x 105 תאים) או 400 μl של השעיית התא / באר של צלחת 24-well (2.5 x 105 תאים) המכיל את תערובת transfection.
הערה: צלחת פטרי אחת 100 מ"מ של אדיפוציטים תאפשר הכנת צלחת אחת 12-well או צלחת אחת 24-well. צלחת 100 מ"מ מכילה בדרך כלל 6-7 x 106 אדיפוציטים, אשר תואמים 5 x 105 אדיפוציטים לכל באר של צלחת 12-well. - לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים (7% CO2 ו 37 °C (37 °C), ולא להפריע לתאים במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין.
הערה: ניתן גם לזרוע את התאים לתוך קולגן מראש 48 ו 96-באר צלחות אבל לנקוט אמצעי זהירות נוספים בעת החלפת התקשורת כדי למנוע ניתוק של אדיפוציטים.
5. ניתוח פונקציונלי של אדיפוציטים 3T3-L1 שהודבקו
- מטרת המחקר 24-48 שעות ו-48-96 שעות לאחר siRNA או miR מחקים משלוח עבור mRNA וחלבון, בהתאמה.
- בצע ניתוחים פונקציונליים של אדיפוזיטים שהודבקו כדי לחקור איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, ליפוזיס וליפוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך של טרנס-טרנס-זיהום הפוך המתואר כאן כדי לווסת את הביטוי של חלבונים או מיקרו-RNAs ב 3T3-L1 adipocytes, adipocytes הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection (איור 1B,C). ואכן, 2 ימים לאחר transfection, adipocytes היו מפוזרים היטב מחוברים לצלחת והציג טיפות שומנים רב לשוניות כי הם אופייניים של adipocytes 3T3-L1 בוגר. תכולת השומנים לא הייתה שונה בין אדיפוזיטים שהודבקו ללא עבירות(איור 1D,E). יתר על כן, ביטוי mRNA של סמני בידול כגון peroxisome שגשוג קולטן גמא 2 (Pparγ2), אדיפונקטין (Adipoq),משגר גלוקוז 4 או משפחת נושאת solute 2 חבר 4 (Slc2a4),קולטן אינסולין מצע 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) היה ללא שינוי בתאים מודבקים לעומת זה ב adipocytes שאינם שהודבקו (איור 1F). פרוטוקול תעתיק לאחור זה יעיל מכיוון >70% מהאדיפוציטים הועברו(איור 1G,H).
Perilipin-1 הוא חלבון ספציפי לאדיפוזיטים הידוע כמקדם היווצרות טיפת שומנים בדם ומעכב ליפוליזה. כאן, 3T3-L1 adipocytes הועברו עם siRNA מקושקשת (si-SCR) או siRNA נגד פלין1 (si-PLIN1). שלושה ימים לאחר הטרנספקט עם si-PLIN1, רמת ה-mRNA של Plin1 ירדה ב-70%(איור 2A)ורמת החלבון ב-63%(איור 2B,C). ביטוי PLIN1 נותח גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית 4 ימים לאחר ההדבקה ונמצא כי ירד ב -92% בהשוואה לביטויו באדיפוציטים של פקדים (איור 2D-F), ובכך מדגים את היעילות של פרוטוקול הטרנס-זיהום ושל si-PLIN1.
פרוטוקול זה שימש גם לביצוע טרנס-טרנס-הדבקה הפוכה של אדיפוציטים עם מיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים כדי להעלות את הפיקוח על הביטוי של miR-34a (איור 3A). ביטוי יתר של miR-34a הוביל לירידה בביטוי חלבון VAMP2 ב -50% (איור 3B,C), יעד מאושר של miR-34a11,12. לבסוף, מחקר זה מראה כי טרנס-טרנס-זיהום הפוך של אדיפוציטים 3T3-L1 משמר את תפקודם ואת התגובה שלהם לגירוי אינסולין. ואכן, נוקאאוט של Plin1 ב 3T3-L1 אדיפוזיטים הוביל לעלייה ליפוליזה בזאלית (איור 4A). יתר על כן, ביטוי יתר של miR-34a ב 3T3-L1 אדיפוזיטים הוביל לעיכוב של חלבון המושרה באינסולין קינאז B זרחן (איור 4B,C) וספיגת גלוקוז (איור 4D).
איור 1: בידול של פיברובלסטים 3T3-L1 לאדיפוציטים בוגרים. (A)פיברובלסטים 3T3-L1 נזרעו בצפיפות של 3 x 105 תאים לכל צלחת 100 מ"מ. תמונה מייצגת 10x ברייטפילד של פיברובלסטים 3T3-L1 יומיים לאחר מכן. (B)יומיים לאחר המפגש (יום 0), הפיברובלסטים 3T3-L1 הובדלו לאדיפוציטים באמצעות תערובת קוקטייל בידול במשך 4 ימים (עד היום 4). תמונה מייצגת 10x ברייטפילד של פיברובלסטים 3T3-L1 המובחנים לאדיפוציטים (יום 7). Adipocytes עם טיפות שומנים רב לשוניים ניתנים להבחין בקלות. (C)אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR ביום 7. נציג 10x תמונות brightfield של adipocytes 3T3-L1 transfected (יום 9). המורפולוגיה של אדיפוציטים שהודבקו דומה לזו של אדיפוציטים שאינם מושפעים, מה שמרמז על כך ששיטת הטרנספקטיון עדינה ואינה רעילה לאדיפוציטים. מוטות קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D-E) אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR ביום 7 (לוחות עליונים); אדיפוציטים שאינם מושפעים (לוחות נמוכים יותר). יומיים לאחר מכן, התאים היו דגירה עם שמן אדום O להכתים שומנים. (D)מוצגות תמונות מייצגות של התאים המוכתמים בצלחת ותמונות 10x ברייטפילד מייצגות. מוטות קנה מידה: 50 מיקרומטר. (E)השמן האדום O המשולב בתאים היה eluted עם 2-propanol וכימת באמצעות ספקטרופוטומטר. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר ספיגת התאים שאינם מהודבקים מנורמלת ל- 1. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי מבחן tשל סטודנט. (ו)אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR. שלושה ימים לאחר ההדבקה, התאים נקצרו כדי לבודד את הרנ"א הכולל. הביטוי של סמני בידול אדיפוציט נמדד על ידי qRT-PCR ונורמל באמצעות רמות RNA 36B4. הנתונים מייצגים את ביטוי ה- mRNA בתאים שהודבקו ביחס לזה בתאים שאינם מודבקים (מנורמלים ל- 1, המיוצגים על ידי הקו המקווקו) ומתבטאים כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי מבחן tשל סטודנט. (G-H) אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR או צבע פלואורסצנטי (FAM) שכותרתו si-RNA מצופה על כיסויים. 3T3-L1 אדיפוציטים נותחו 8 שעות מאוחר יותר על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. (G)מוצגת תמונה מייצגת של מטוס יחיד של תאי 3T3-L1 שהודבקו. (H)כימות התאים החיוביים ל- FAM ביחס למספר התאים הכולל. הנתונים באים לידי ביטוי כאחוז התאים המכילים si-RNA פלואורסצנטי. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן מאן-ויטני, ****p < 0.0001. קיצורים: si-SCR = siRNA מקושקשת; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; qRT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז פולימראז הפוך-שעתוק כמותי; FAM = פלואורסצ'ין נידייט; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; si-FAM = סי-RNA עם תווית FAM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השתקת חלבונים באדיפוציטים של 3T3-L1. 3T3-L1 adipocytes הועברו עם si-RNA מקושקשת (si-SCR) או si-RNA נגד פלין1 (si-PLIN1). (A)שלושה ימים לאחר ההדבקה, ביטוי mRNA של Plin1 נמדד על ידי qRT-PCR. ביטוי ה- mRNA נרמל באמצעות רמות RNA של 36B4 והתבטא ביחידות שרירותיות, כאשר התאים שטופלו ב- si-SCR נרמלו ל- 1. התוצאות מתבטאות כממוצע + SEM של ארבעה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tשל סטודנט, **p < 0.01. (B-C) שלושה ימים לאחר ההדבקה, חלבון lysates היו נתונים סופג מערבי עם נוגדנים מכוונים נגד PLIN1 ו HSP90 (בקרת טעינה). אימונובלוטים מייצגים מוצגים. (C)כמות PLIN1 כותמה על ידי ניתוח סריקת צפיפות ונורמלה באמצעות כמות HSP90. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר התאים שטופלו ב- si-SCR מנורמלים ל- 1. התוצאות מתבטאות כממוצע + SEM של ארבעה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tשל סטודנט, *p < 0.05. (D-F) אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR או si-PLIN1 ומצופה על כיסויים. הביטוי של PLIN1 נותח 96 שעות מאוחר יותר על ידי מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. (D)תמונות מישור יחיד מייצגות של אדיפוציטים 3T3-L1 מוכתמים בנוגדן אנטי-פריליפין ונוגדן נגד ארנב-Alexa647-מצומדים מוצגים. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (E) עיבוד נפח תלת מימדי (3D) של אדיפוציטים 3T3-L1 המפולחים בתלת-ממד באמצעות תוכנה מסחרית. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (F) הכימות של עוצמת האות PLIN1 ביחס למספר הכולל של תאים. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר התאים שטופלו ב- SI-SCR מנורמלים ל - 100%. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן מאן-ויטני, ****p < 0.0001. קיצורים: si-SCR = siRNA מקושקשת; si-PLIN1 = siRNA נגד פלין1; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = חלבון הלם חום 90; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; qRT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז פולימראז הפוך-שעתוק כמותי; FAM = פלואורסצ'ין נידייט; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; IB = אימונובלוטינג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי יתר של מיקרו-RNA ב-3T3-L1 אדיפוציטים. 3T3-L1 adipocytes הועברו עם חיקוי מיקרו-RNA שליטה (בקרת miR) או מיקרו-RNA 34a לחקות (miR-34a). שלושה ימים לאחר ההדבקה, התאים נקצרו עבור (A)הפקת RNA או (B) הכנת ליסאטים חלבון. (A)הביטוי של miR-34a נמדד על ידי qRT-PCR. ביטוי ה- miR נרמל באמצעות רמות RNA קטנות U6 והתבטא ביחידות שרירותיות, כאשר התאים שטופלו בבקרת miR מנורמלים ל- 1. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tשל סטודנט, *p < 0.05. (B)ליזאטים חלבון היו נתונים סופג מערבי עם נוגדנים מכוונים נגד VAMP2 ו TUBULIN (בקרת טעינה). חיסונים מייצגים של שלושה ניסויים עצמאיים מוצגים. (C)כמות VAMP2 היה כימות על ידי ניתוח סריקת צפיפות ונורמל באמצעות כמות טובולין. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר תאי בקרת ה- miR מנורמלים ל- 1. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי מבחן tשל סטודנט, *p < 0.05. קיצורים: SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; qRT-PCR = תגובת שרשרת פולימראז פולימראז הפוך-שעתוק כמותי; VAMP2 = חלבון ממברנה הקשורים ארסית 2; IB = אימונובלוטינג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעות של אפנון חלבון או מיקרו-RNA בתפקוד אדיפוציט 3T3-L1. (A)אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם si-SCR או si-PLIN1. המדיום השתנה 24 שעות לאחר transfection ולאחר מכן נאסף 48 שעות מאוחר יותר כדי למדוד ליפוזיס בזאלי. התוצאות באות לידי ביטוי כמו גליצל ששוחרר במדיה (מיקרוגרם / מ"ל), וכממוצע + SEM של ארבעה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן tשל סטודנט, ***p < 0.001. (B)אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם בקרת MIR או miR-34a. המדיום השתנה 24 שעות לאחר transfection, ולאחר מכן, 48 שעות מאוחר יותר, המדיום השתנה למדיום דלדול (DMEM ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 1% פניצילין וסטרפטומיצין, ו 0.5% BSA) עבור 6 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו עם אינסולין 0.5 ננומטרי במשך 5 דקות. תאים נקצרו כדי להכין ליסאטים חלבון עבור סופג מערבי עם נוגדנים המכוונים נגד phospho-PKB ו- PKB (בקרת טעינה). חיסונים מייצגים של שלושה ניסויים עצמאיים מוצגים. (C)כמות הפוספו-PKB כותמה על ידי ניתוח סריקת צפיפות ונורמלה באמצעות הכמות הכוללת של PKB. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר תאי בקרת ה-miR מטופלים באינסולין מנורמלים ל-1. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת ANOVA הדו כיוונית, *p < 0.05 לעומת תאי בקרת miR שטופלו באינסולין. (D)אדיפוציטים 3T3-L1 הועברו עם בקרת MIR או miR-34a. המדיה שונתה 24 שעות לאחר ההדבקה, ולאחר מכן, 48 שעות מאוחר יותר, המדיום השתנה למדיום דלדול במשך 6 שעות. לאחר מכן, התאים טופלו באינסולין 0.5 ננומטרי למשך 20 דקות. ספיגה של (2-3H)deoxyglucose נמדדה מעל 3 דקות. הנתונים באים לידי ביטוי ביחידות שרירותיות, כאשר ספיגת הגלוקוז בזאלי בתאים שטופלו בבקרת miR מנורמלת ל-1. התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע + SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות בדיקת ANOVA הדו כיוונית, *p < 0.05 לעומת תאי בקרת miR שטופלו באינסולין. קיצורים: si-SCR = siRNA מקושקשת; si-PLIN1 = siRNA נגד פלין1; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; PKB = חלבון קינאז B; p-PKB = זרחן-PKB; miR-CTL = miR-control; DMEM = המדיום המותאם של הנשר של דולבק; BSA = אלבומין סרום בקר; ANOVA = ניתוח של שונות; IB = אימונובלוטינג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| לבאר (צלחת 12-באר) | לבאר (צלחת 24-באר) | |
| אוליגונוקלידס | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| מדיום מינימלי חיוני משופר | 20 μL | 10 μL |
| ריאגנט טרנספקטיון | 5.6 μL | 2.8 μL |
| מדיום מינימלי חיוני משופר | 154.4 μL | 77.2 μL |
| נפח כולל של תמהיל טרנספקטציה | 200 μL | 100 μL |
טבלה 1: ריאגנטים של טרנספקטו נדרשים לתבניות של 12-well ו-24-well.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבלות שיש לקחת בחשבון. פרוטוקול זה אינו יעיל עבור transfection עם DNA plasmid, אשר מגביל את התועלת של טכניקה זו עבור מחקרים רווח של פונקציה. למרות קווי תאים מורינים, כולל קו התא 3T3-L1, שימשו בדרך כלל כדי ללמוד תפקוד אדיפוציטים במבחנה, דפוסי ביטוי מיקרו-RNA ופעילויות ברקמת מורינה שונים לעתים קרובות מאלה שנצפו בבני אדם; זה גם המקרה עם תאים ראשיים וקווי תאים. יתר על כן, המדיום המשמש להבחנה של פיברובלסט 3T3-L1 לאדיפוזיטים דורש קוקטייל הורמונלי לא פיזיולוגי (אינסולין, דקסמתזון, IBMX ורוזיגליטזון), והתאים המובחנים נבדלים מורפולוגית מאדיפוציטים בוגרים של vivo: הם מציגים טיפות שומנים רב-מולקולריות במקום טיפת שומנים חד-עינית. זה יכול להסביר כמה הבדלים בביטוי גנים ותגובות תאיות בין מחקרים במבחנה ו in vivo.
אחד היתרונות של שימוש בפרוטוקול הפוך זה בהשוואה לאלקטרופורציה הוא ששיטה זו זולה יותר. ואכן, ריאגנטים הם פחות יקרים, ואת היעילות הגבוהה של transfection הפוך מקטין את הכמויות של אוליגונוקלאוטידים הדרושים, ואין צורך בציוד יקר כגון אלקטרופורטור. יתר על כן, באמצעות ריכוז נמוך יותר של siRNA מועיל כפי שהוא נמנע השפעות מחוץ למטרה. יתר על כן, טרנס-טרנספקט זה הוא שיטה קלה, מהירה, עדינה וישירה של טרנספקטציה הדורשת פחות תאים ותבטיח כדאיות תאים מעולה ונתונים חזקים יותר בהשוואה לאלקטרופורציה. למרות ההליך המפורט לעיל כבר אופטימיזציה עבור בידול ו transfection הפוך של תאי עכבר 3T3-L1, preadipocytes אנושי יכול להיות מובחן גם אדיפוציטים5 בקלות נתון transfection לאחור באמצעות פרוטוקול זה. דו"ח זה מראה כי אדיפוזיטים נשארים ברי קיימא, בריאים, ומגיבים לאינסולין לאחר טרנס-טרנספקטו לאחור באמצעות דור חדש של ריאגנט אמפיפיל קטיקטי לא ליפוזומלי. ניתן לבצע את ההדבקה ההפוכה גם באמצעות ריאגנטים פופולריים אחרים של טרנס-זיהום. עם זאת, כמויות של אוליגונוקלאוטידים ריאגנט transfection היה צריך להיות ממוטב כדי להבטיח אפנון טוב של ביטוי ולא השפעות שליליות על הכדאיות התא.
פרוטוקול זה מקל על המחקר של התפקיד של חלבונים ו micro-RNAs בפונקציה adipocyte, אבל זה יכול לשמש גם כדי לווסת RNAs אחרים שאינם קידוד כגון lnc-RNAs, Y-RNAs, או eRNAs. ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול שיכולים להשפיע על יעילות ההליך. ההבחנה של פיברובלסטים 3T3-L1 לתוך אדיפוציטים צריך להיות במעקב זהיר. חשוב להגיע לרמה גבוהה של בידול כדי למנוע את התפשטותם של פיברובלסטים שנותרו לאחר ההדבקה, אשר להטות את תוצאות הניסוי. נקודה חשובה נוספת היא לבצע את transfection על אדיפוציטים בוגרים מובחנים חדשים; התזמון הטוב ביותר הוא 7-8 ימים לאחר תחילת פרוטוקול הבידול, אשר מתאים 3-4 ימים לאחר הסרת קוקטייל הבידול. זה יבטיח יעילות transfection חזקה לטובת חיבור מחדש טוב של adipocytes לצלחת. לבסוף, הטיפול של אדיפוציטים עם טריפסין צריך להיות במעקב בקפידה כדי להבטיח ניתוק של אדיפוציטים מבלי לפגוע בתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת חוף ד'אזור, וסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות התוכנית השקעות למעבדת המצוינות העתידית (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ויוזמת המצוינות (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. נתמך על ידי מענקים מן Société Francophone du Diabète (SFD), האגודה Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), המכון Thématique Multi-Organismes טכנולוגיות לשפוך לה סנטה (ITMO), ואת פונדציה בנג'מין-Delessert. J.G. נתמך על ידי ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. נתמך על ידי מענק ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ומענק מן פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M הממומן על ידי קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-ימיים ו- Région PACA, הנתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופיה והדמיה GIS IBiSA חוף ד'אזור (MICA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
