Summary
ここでは、小干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA模倣体(miRs)、抗マイクロRNA(抗miR)などのオリゴヌクレオチドを成熟したアディポサイトに送達し、タンパク質およびマイクロRNA発現を調節するプロトコルを紹介します。
Abstract
アディポサイト機能の変化は、2型糖尿病およびインスリン抵抗性を含む代謝性疾患の病因に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。アディポサイトにおけるタンパク質および マイクロRNAの 発現を調節することは、依然として非常に困難である。本論文では、マウス線維芽細胞を成熟したアディポ細胞に分化し、小干渉RNA(siRNA)およびマイクロRNA模倣(miR模倣)オリゴヌクレオチドを用いた逆トランスフェクションを通じて成熟したアディポ細胞におけるタンパク質およびマイクロRNAの発現を調節するプロトコルについて述べている。この逆トランスフェクションプロトコルは、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドのインキュベーションを含み、成熟したアディポサイトが添加される細胞培養プレートに複合体を形成する。次に、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で、接着板表面に再び付着させられます。インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪生成、脂肪分解の研究などの機能解析を、トランスフェクトした3T3-L1成熟脂肪細胞に対して行い、脂肪細胞機能に対するタンパク質またはマイクロRNA操作の影響を研究することができます。
Introduction
肥満は、インスリン抵抗性(IR)、2型糖尿病(T2D)、および心血管疾患1を含む多数の代謝性疾患の主要な危険因子と考えられている。現在の治療法は、これらの疾患の絶えず増加する有病率を止めることができず、肥満および糖尿病患者のIRの管理は依然として重要な臨床的問題である。脂肪組織は、エネルギー恒常性の制御に重要な役割を果たし、肥満時のその病理学的拡張は、IRおよびT2D2、3の発達に寄与する。これは、肥満関連疾患に対する新しい治療法を開発するために、アディポサイト機能不全に関与する分子メカニズムをよりよく理解する必要性を強調している。多くの研究は、アディポサイト生理学におけるタンパク質コードRNAの役割と肥満との関連を調査してきました。
最近では、非コードRNA(ncRNA)、特にマイクロRNA(miRs)の発見は、遺伝子発現プログラムの調節機構に関連する新しい概念を偽造している。研究は、ncRNAが、有数細胞細胞機能の重要な調節因子であり、その調節不調が代謝性疾患において重要な役割を果たしていることを示している。したがって、アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの操作は、アディポサイト機能におけるそれらの役割とT2Dなどの病理への影響を解読するために重要である。しかし、生体内および一次アディポサイトにおけるタンパク質およびncRNAの発現を操作することは依然として非常に困難であり、体外の椎骨細胞モデルの使用を支持する。
Mtune 3T3-L1線維芽細胞は、脂肪細胞機能(例えば、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、脂肪分解および脂肪分泌)5、6、7、8、9、10を研究するために使用される十分に特徴付けられる細胞株である成熟した、機能的、およびインスリン応答性脂肪細胞に容易に分化する。これらの特性は、3T3-L1アディポサイトを、タンパク質コードおよびnc-RNAの発現を調節し、有分細胞機能におけるその役割と肥満関連疾患における潜在的な役割を解読する魅力的なモデルにする。残念ながら、3T3-L1線維芽細胞は市販の試薬を使用してトランスフェクトしやすいのに対し、分化された3T3-L1アディポサイトはトランスフェクトするのが最も困難な細胞株の1つである。このため、3T3-L1細胞における遺伝子発現を操作する数多くの研究が、アディポサイト機能ではなく、アディポサイト分化に焦点を当てています。
長い間、アディポ細胞をトランスフェクトする唯一の効率的な技術はエレクトロポレーション5であり、これは退屈で高価であり、細胞損傷を引き起こす可能性があります。本論文では、トランスフェクションの実用時間を短縮する一般的なトランスフェクション試薬を用いた逆トランスフェクション技術を報告し、細胞の生存率に影響を及ぼさないため、エレクトロポレーションよりもはるかに安価である。このプロトコルは、マイクロRNA模倣(miR模倣)および抗miRsのようなsiRNAおよび他のオリゴヌクレオチドのトランスフェクションに完全に適している。逆トランスフェクションプロトコルの原理は、トランスフェクション試薬とオリゴヌクレオチドをインキュベートして細胞培養プレートに複合体を形成し、成熟したアディポサイトをウェルに播種する。次いで、このアディポサイトは、オリゴヌクレオチド/トランスフェクション試薬複合体の存在下で接着板表面に再び付着する。このシンプルで効率的で安価な方法論は、有数体細胞機能におけるタンパク質コードRNAおよびmiRの役割と肥満関連疾患におけるその潜在的な役割の研究を可能にする。
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Protocol
注: 滅菌技術を使用して、層流細胞培養フード内のプロトコルのすべてのステップを実行します。すべての試薬および装置の詳細については、 資料表 を参照してください。
1. 腺3T3-L1線維芽細胞のアディポ細胞への分化
- 3T3-L1線維芽細胞を、ピルビン酸を含まない培地DMEM、25mMグルコース、10%新生児の子牛血清、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む培地中のDMEMで3T3-L1の繊維芽細胞を成長させる(図1A)。培養インキュベーター(7%CO2および37°C)に皿を入れる。
- 合流から2日後、 培地を変更し、ピルビン酸なしDMEM、25mMグルコース、10%の胎児血清(FCS)、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシンに0.25 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、0.25 μMデキサメタゾン、5 μg/mL、インスリンスキタゾン、インスリンスライト10を補充した。
注:細胞が100 mm皿あたり30万個の細胞で播種されると、合流するまでに5日かかります。 - 2日後、培養液をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン1%に5μg/mLインスリンと10μMロシグリタゾンとインキュベートを2日間補充してDMEMに置き換えます。次いで、2日毎にピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(図1B)で細胞を供給する。
- 分化プロトコルの開始から7-8日後に3T3-L1のアディポサイトをトランスフェクトする。
注:トランスフェクション後に残りの線維芽細胞の増殖を避けるために、トランスフェクションの前に高いレベルの分化(>80%)に到達することが重要であり、結果に偏る可能性のある細胞の混合集団につながる可能性があります。
2. プレコートプレートの準備
- トランスフェクションの前日または数時間前に、1mg/mLのストック溶液から30%エタノールで100μg/mLのコラーゲンタイプIの溶液を調製します。12ウェルプレートのウェルあたり250μL、24ウェルプレートのウェルあたり125 μLを加え、ウェルの表面に溶液を広げます。
- コラーゲンが乾くまで、培養フードの下に蓋をせずにプレートを放置します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分(D-PBS)で2回洗浄します。
注:プレコーティングされたプレートは購入可能です。
3. トランスフェクションミックスの調製
注: siRNA の最終的な濃度は 1 ~ 100 nM (12 ウェル プレートのウェルあたり 1 ~ 100 pmol siRNA) です。miRの模倣の最終的な集中は10 nM(10 pmol/well)である。実験を開始する前に、各siRNA、miR模倣、または他のオリゴヌクレオチドの最適な濃度を決定し、オフターゲット効果を回避します。結果の統計分析を容易にするために三重でトランスフェクション実験を行います。ピペット処理中の通常の損失を考慮して、過剰に全ての試薬を準備してください。
- 改善された最小必須培地(表1)とsiRNA(または他のオリゴヌクレオチド)をピペッティング(体積/体積)で混合する。室温で5分間インキュベートします。
- トランスフェクション試薬と改良された最小必須培地をsiRNAに加え、ミキシングするピペットを加える(表1)。室温で20分間インキュベートします(この間、セクション4に進みます)。コラーゲンコーティングされたプレートの各ウェルにトランスフェクションミックスを追加します。
4. 3T3-L1のアディポサイトの調製
- 100mmペトリ皿の細胞をD-PBSで2回洗います。5倍のトリプシンを細胞に加え(100mm皿あたり1mL)、すべての表面をトリプシンで覆うことを確認します。30 s を待ち、慎重にトリプシンを取り外します。
- ペトリ皿をインキュベーターで37°Cで5〜10分間インキュベートします。100mm皿をタップしてセルを取り外します。
- ピルビン酸なしのDMEM10ml、25mMグルコース、10%FCS、ペニシリンとストレプトマイシン1%を加えてトリプシンを中和します。慎重に上下に培地をパイプし、細胞を取り外し、細胞懸濁液を均質化します。
- マラッセス計房または自動セルカウンターを使用して細胞を数え、培地の6.25 x 105 細胞/mLに細胞の濃度を調整します。12ウェルプレート(5 x105 細胞)またはトランスフェクションミックスを含む24ウェルプレート(2.5 x105 細胞)の細胞懸濁液/ウェルの800μLの種子。
注:アディポサイトの100ミリメートルペトリ皿は、12ウェルプレートまたは1つの24ウェルプレートの調製を可能にします。100 mm皿は通常6-7 x 106 のアディポサイトを含み、12ウェルプレートのウェルあたり5 x 105 のアディポサイトに相当する。 - プレートを細胞培養インキュベーター(7%CO2および37°C)にインキュベートし、24時間細胞を乱さない。翌日は、上清をピルビン酸、25 mMグルコース、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを使用せずに、新鮮なDMEMに慎重に交換してください。
注:また、コラーゲンプレコーティング48-および96ウェルプレートに細胞を播種することも可能ですが、アディサイトの剥離を避けるためにメディアを交換する際に、より多くの予防措置を取ります。
5. トランスフェクト3T3-L1の異胞細胞の機能解析
- mRNAおよびタンパク質に対するsiRNAまたはmiR模倣送達後の24-48時間および48-96時間の標的ノックダウンをそれぞれ研究した。
- トランスフェクトされた脂肪細胞の機能解析を行い、インスリンシグナル伝達、グルコース取り込み、アディポカイン分泌、脂肪分解、およびリポジェネシスを研究する。
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Representative Results
3T3-L1アディポサイトにおけるタンパク質またはマイクロRNAの発現を調節するためにここで説明する逆トランスフェクションの手順を用いて、このアディポサイトはトランスフェクション後にそれらの形態を維持することが示されている(図1B、C)。実際、トランスフェクションの2日後、脂肪細胞は、プレートに良好に広がり、結合し、成熟した3T3-L1脂肪細胞の特徴である多発性脂質滴を提示した。脂質含有量は、トランスフェクトと非トランスフェクト脂肪細胞の間で異ならなかった(図1D、E)。また、 ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ2(Pparγ2)、アディポネクチン(Adipoq)、グルコーストランスポーター4または溶質キャリアファミリー2メンバー4(Slc2a4)、インスリン受容体基質1(Irs1)、ペリリピン-1(Plin1)などの分化マーカーのmRNA発現は、非感染したトランスジテス(トランスジテス)と比較して変転球細胞では変わらなかった。この逆トランスフェクションプロトコルは、>70%のアディポサイトがトランスフェクションされたとして効率的である(図1G,H)。
ペリリピン-1は、脂質滴形成を促進し、脂肪分解を阻害することが知られている脂肪細胞特異的タンパク質である。ここで、3T3-L1アディポサイトは、Plin1(si-PLIN1)に対してスクランブルsiRNA(si-SCR)またはsiRNAでトランスフェクトした。si-PLIN1によるトランスフェクションの3日後、Plin1のmRNAレベルは70%減少し(図2A)、タンパク質レベルは63%減少した(図2B、C)。PLIN1発現は、トランスフェクションの4日後に蛍光顕微鏡法によっても分析され、対照アディポ球(図2D-F)における発現と比較して92%減少し、トランスフェクションプロトコルとsi-PLIN1の両方の有効性を実証した。
このプロトコルは、マイクロRNA模倣(miR模倣)オリゴヌクレオチドを用いたアディポサイトの逆トランスフェクションを行い、miR-34aの発現をアップレレートするためにも使用された(図3A)。miR-34aの過剰発現は、VAMP2タンパク質発現の50%減少(図3B,C)につながり、miR-34a11,12の確認された標的である。最後に、この研究は、3T3-L1アディポサイトの逆トランスフェクションがインスリン刺激に対する機能と応答性を維持することを示している。実際、3T3-L1脂肪細胞におけるPlin1のノックダウンは、基礎脂肪分解の増加につながった(図4A)。また、3T3-L1アディポサイトにおけるmiR-34aの過剰発現は、インスリン誘発タンパク質キナーゼBリン酸化の阻害(図4B、C)およびグルコース取り込み(図4D)を引き起こした。
図1:成熟したアディポサイトへの3T3-L1線維芽細胞の分化。(A)3T3-L1線維芽細胞を100mm皿あたり3×105細胞の密度で播種した。代表10x明視野画像の3T3-L1線維芽細胞の2日後。(B) 合流の2日後(0日目)、3T3-L1線維芽細胞を4日間(4日目まで)分化カクテルミックスを用いてアディポサイトに分化した。3T3-L1線維芽細胞の代表10倍の明視野画像を、アディポサイトに分化した(7日目)。多細胞の脂質滴を有する脂肪細胞は容易に識別可能である。(C) 3T3-L1のアディポサイトは7日目にsi-SCRでトランスフェクトされた。トランスフェクトされた3T3-L1アディポサイトの代表的な10倍の明視野画像(9日目)。トランスフェクトされたアディポサイトの形態は、非トランスフェクトされたアディポサイトの形態に匹敵し、トランスフェクション法が穏やかで、アディポサイトに有毒ではないことを示唆している。スケールバー: 50 μm(D–E) 3T3-L1のアディポサイトは7日目にsi-SCRにトランスフェクトされた(上部パネル)。非トランスフェクトされたアディポサイト(下部パネル)。2日後、細胞をオイルレッドOでインキュベートし、脂質を染色した。(D) プレート内の染色された細胞の代表的な画像と代表10倍の明視野画像が示されている。スケールバー:50μm(E)細胞に取り込まれたオイルレッドOを2-プロパノールで溶出し、分光光度計を用いて定量した。データは任意の単位で表現され、非トランスフェクト細胞の吸光度は1に正規化される。結果は、3つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計分析は、学生のt-testによって行われました。(F) 3T3-L1のアディポサイトをsi-SCRでトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、細胞を採取し、全RNAを単離した。アディポサイト分化マーカーの発現をqRT-PCRにより測定し、36B4 RNAレベルを用いて正規化した。データは、非トランスフェクト細胞(1に正規化され、点線で表される)の対照的にトランスフェクトされた細胞におけるmRNA発現を表し、3つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計分析は、学生のt-testによって行われました。(G – H)3T3-L1アディポサイトは、si-SCRまたは蛍光色素(FAM)標識si-RNAでトランスフェクトされ、カバースリップにメッキされました。3T3-L1アディポサイトは、8時間後に蛍光顕微鏡で分析した。(G)トランスフェクトされた3T3-L1細胞の代表的な単一面画像が示されている。(H) 細胞の総数に対する FAM 陽性細胞の定量化。データは、蛍光si-RNAを含む細胞の割合として表されます。統計分析は、マンホイットニー検定、****p<0.0001を用いて実施した。 略語: si-SCR = スクランブル siRNA;SEM = 平均の標準誤差。qRT-PCR = 定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;FAM = フルオレセインアミド;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;si-FAM = FAM標識された si-RNA.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3T3-L1のアディポサイトにおけるタンパク質サイレンシング。3T3-L1アディポサイトは、プリイン1(si-PLIN1)に対してスクランブルsi-RNA(si-SCR)またはsi-RNAでトランスフェクトされた。(A) トランスフェクションの3日後に、プリン1のmRNA発現をqRT-PCRで測定した。mRNA発現を36B4 RNAレベルを用いて正規化し、任意の単位で発現し、si-SCR処理細胞を1に正規化した。結果は、4つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計分析は、スチューデントのt-test、**p<0.01を使用して行われました。 (B –C)トランスフェクションの3日後、タンパク質ライセートは、PLIN1およびHSP90に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った(ローディングコントロール)。代表的な免疫ブロットが示されている。(C)PLIN1の量を、濃度測定スキャン分析で定量し、HSP90の量を用いて正規化した。データは任意の単位で表され、si-SCR 処理されたセルは 1 に正規化されます。結果は、4つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計分析は、スチューデントのt-test,*p < 0.05 を用いて行った。(D – F)3T3-L1のアディポサイトは、si-SCRまたはsi-PLIN1でトランスフェクトされ、カバースリップにメッキされた。PLIN1の発現を蛍光顕微鏡法により96時間後に分析した。(D)抗ペリリピン抗体および抗ウサギ-Alexa647共役抗体で染色された3T3-L1脂肪細胞の代表的な単一面画像が示されている。スケールバー = 10 μm(E) 商用ソフトウェアを使用して3Dでセグメント化された3T3-L1の3次元(3D)ボリュームレンダリング。スケールバー= 10 μm(F) 細胞の総数に対するPLIN1シグナル強度の定量。データは任意の単位で表され、si-SCR処理されたセルは100%に正規化されます。統計分析は、マンホイットニー検定、****p<0.0001を用いて実施した。 略語: si-SCR = スクランブル siRNA;si-PLIN1 = plin1に対する siRNA;Plin1 = ペリリピン-1;HSP90 = ヒートショックタンパク質 90;SEM = 平均の標準誤差。qRT-PCR = 定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;FAM = フルオレセインアミド;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール;IB = 免疫ブロッティング。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3T3-L1アディポサイトにおけるマイクロRNA過剰発現。 3T3-L1アディポサイトは、コントロールマイクロRNA模倣(miR対照)またはマイクロRNA34a模倣(miR-34a)を導入した。トランスフェクションの3日後、細胞を、(A)RNA抽出または(B)タンパク質溶菌の調製のために採取した。(A)miR-34aの発現をqRT-PCRで測定した。miR発現はU6小RNAレベルを用いて正規化し、任意の単位で発現し、miR対照処理細胞は1に正規化された。結果は、3つの独立した実験の平均 +SEM として表される。統計分析は、スチューデントの t-test,*p < 0.05 を用いて行った。(B)タンパク質ライセートは、VAMP2およびTUBULINに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った(ローディングコントロール)。3つの独立した実験の代表的な免疫ブロットが示される。(C)VAMP2の量を濃度測定スキャン解析で定量し、TUBULINの量を用いて正規化した。データは任意の単位で表され、miR コントロール セルは 1 に正規化されます。結果は、3つの独立した実験の平均 +SEM として表される。統計分析は、学生の t-検定、*p <0.05によって行われました。略語: SEM = 平均の標準誤差。qRT-PCR = 定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応;VAMP2 = ベシクル関連膜タンパク質 2;IB = 免疫ブロッティング。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3T3-L1のアディポサイト機能におけるタンパク質またはマイクロRNA変調の効果(A)3T3-L1のアディポサイトは、si-SCRまたはsi-PLIN1でトランスフェクションされた。トランスフェクション後24時間に培地を交換し、次いで48時間後に採取して基底脂肪分解を測定した。結果は、培地中で放出されるグリセロール(μg/mL)、及び4つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計分析は、スチューデントのt-test、***p<0.001を使用して実行されました。 (B)3T3-L1のアディポサイトは、miRコントロールまたはmiR-34aでトランスフェクトされた。トランスフェクション後24時間に培地を交換し、その後48時間後、培地を6時間の枯渇培地(ピルビン酸なしDMEM、25mMグルコース、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、および0.5%BSA)に変更した。次いで、細胞を5分間0.5nMインスリンで処理した。細胞を採取し、ホスホ-PKBおよびPKB(ローディングコントロール)に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング用のタンパク質ライセートを調製した。3つの独立した実験の代表的な免疫ブロットが示される。(C)リン酸PKBの量を、濃度測定スキャン解析で定量化し、PKBの総量を用いて正規化した。データは任意の単位で表され、miRコントロール細胞はインスリンで処理され、1に正規化される。結果は、3つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計解析は、インスリンで処理されたmiR対照細胞と比較して、2方向ANOVA試験を用いて実施し、*p<0.05であった。(D)3T3-L1のアディポサイトは、miRコントロールまたはmiR-34aでトランスフェクトされた。この媒体は、トランスフェクション後24時間変更し、その後、48時間後、培地を6時間の枯渇培地に変更した。次いで、細胞を20分間0.5nMインスリンで処理した。(2-3H)デオキシグルコースの取り込みは3分以上測定した。データは任意の単位で表され、miR対照処理細胞における基礎グルコース取り込みは1に正規化される。結果は、3つの独立した実験の平均+SEMとして表される。統計解析は、インスリンで処理されたmiR対照細胞と比較して、2方向ANOVA試験を用いて実施し、*p<0.05であった。略語: si-SCR = スクランブル siRNA;si-PLIN1 = plin1に対する siRNA;SEM = 平均の標準誤差。PKB = プロテインキナーゼ B;p-PKB = 蛍光体-PKB;miR-CTL = miR 制御;DMEM = ダルベッコの修正イーグルの媒体;BSA = ウシ血清アルブミン;分散分析 = 分散分析IB = 免疫ブロッティング。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ウェルあたり(12ウェルプレート) | ウェルあたり(24ウェルプレート) | |
| オリゴヌクレチド | 20 μL | 10 μL |
| (シRNA、miR.) | ||
| 改善された最小必須培地 | 20 μL | 10 μL |
| トランスフェクション試薬 | 5.6 μL | 2.8 μL |
| 改善された最小必須培地 | 154.4 μL | 77.2 μL |
| トランスフェクションミックスの総量 | 200 μL | 100 μL |
表1:12ウェルおよび24ウェルプレートフォーマットに必要なトランスフェクション試薬。
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Discussion
本論文では、成熟したアディポサイトの分化とトランスフェクションに関する詳細なプロトコルを紹介する。この逆トランスフェクション法は、トランスフェクトが最も困難な細胞株の1つである3T3-L1アディポサイトにsiRNA、マイクロRNA模倣、および抗マイクロRNAのようなオリゴヌクレオチドをトランスフェクトする簡便で経済的で効率の高い方法である。この方法には、考慮する必要があるいくつかの制限があります。このプロトコルは、機能獲得研究のためにこの技術の有用性を制限するプラスミドDNAによるトランスフェクションには有効ではありません。3T3-L1細胞株を含むマウス細胞株は、通常、インビトロでの有分細胞機能を研究するために使用されてきたが、マウス組織におけるマイクロRNA発現パターンおよび活動はしばしばヒトで観察されるものとは異なる。これは、プライマリ セルとセル ラインにも当てはまりやすいです。さらに、3T3-L1線維芽細胞を脂肪細胞に分化するために使用される培地には、生理学的なホルモンカクテル(インスリン、デキサメタゾン、IBMX、およびロシグリタゾン)が必要であり、分化した細胞は生体内の成熟した脂肪細胞と形態的に区別され、単ロ黄色の脂質滴の代わりに多ロクチ眼脂質滴を提示する。これは、インビトロとインビボ研究の間の遺伝子発現および細胞応答のいくつかの違いを説明することができる。
エレクトロポレーションと比較してこの逆トランスフェクションプロトコルを使用することの1つの利点は、この方法が安価であるということです。実際、試薬は安価で、逆トランスフェクションの高効率化により必要なオリゴヌクレオチドの量が減少し、エレクトロポレーターなどの高価な機器は必要ありません。さらに、siRNAの低濃度を使用することは、オフターゲット効果を回避するので有益である。さらに、この逆トランスフェクションは、より少ない細胞を必要とし、エレクトロポレーションと比較して優れた細胞生存率とより堅牢なデータを保証するトランスフェクションの簡単で、迅速で、穏やかな、簡単な方法です。上記の手順はマウス3T3-L1細胞の分化および逆トランスフェクションに最適化されているが、ヒトの前読細胞もまた、このプロトコルを用いてアディポサイト5 に分化され、逆トランスフェクションを受けやすくすることができる。この報告は、脂肪細胞が非リポソームカチオン性両親媒性トランスフェクション試薬の新世代を用いて逆トランスフェクション後も生き生き、健康で、インスリンに反応し続けることを示している。逆トランスフェクションは、他の一般的なトランスフェクション試薬を用いて行うこともできます。しかし、オリゴヌクレオチドとトランスフェクション試薬の量は、良好な発現調節を保証し、細胞の生存率に悪影響を及ぼさないように最適化する必要があります。
このプロトコルは、アディポサイト機能におけるタンパク質およびマイクロRNAの役割の研究を容易にするが、lnc-RNA、Y-RNA、またはeRNAのような他の非コードRNAを調節するためにも使用することができる。プロトコルには、手順の効率に影響を与える重要なステップがあります。3T3-L1線維芽細胞のアディポサイトへの分化は注意深く監視されるべきである。トランスフェクション後に残存する線維芽細胞の増殖を避けるために高レベルの分化に達することが重要であり、これは実験の結果に偏るであろう。もう一つの重要なポイントは、新たに分化した成熟したアディポサイトにトランスフェクションを行うことである。最良のタイミングは、分化カクテルを除去した後、3〜4日に対応する分化プロトコルの開始後7〜8日です。これは、堅牢なトランスフェクションの有効性を保証し、プレートにアディポサイトの良好な再付着を好みます.最後に、トリプシンによるアディポ細胞の治療は、細胞を損傷することなく、アディポサイトの剥離を確実にするために注意深く監視されるべきである。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、将来の優秀研究所(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)とイニシアティブ・オブ・エクセレンス(アイデックス・UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)を通じて、INSERM、コート・ダジュール大学、フランス国立研究機関(ANR)によって支援されました。J.J.は、ソシエテ・フランコフォン・デュ・ディアベテ(SFD)、フランソワーズ・デチュード・エ・ド・レシェルシュ・シュル・ロベシテ(AFERO)、テマティク・マルチ・オーガミーズ・テクノロジーズ・インスティトゥート・ド・サンテ(ITMO)、フォンダシオン・ベンジャミン・デレッサーの助成金を受けています。J.G.はANR-18-CE14-0035-01でサポートされています。J-F.T.はANRグラントADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01とフォンダシオンからの助成金は、ラ・レシェルシュ・メディカル(エクイペFRM、DEQ20180839587)によってサポートされています。また、コンセイル・デ・アルプ・マリティームが出資するC3Mのイメージング・コア・ファシリティと、GIS IBiSA顕微鏡・イメージング・プラットフォームコート・ダジュール(MICA)が支援するレジオンPACAに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
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- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
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