Summary
यहां प्रस्तुत प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए परिपक्व एडिपोसाइट्स में छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिराना), माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर), या एंटी-माइक्रो-आरएनए (एंटी-एमआईआर) जैसे ओलिगोन्यूक्लियोट्स देने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
एडिपोसाइट फ़ंक्शन का परिवर्तन टाइप 2 मधुमेह और इंसुलिन प्रतिरोध सहित मेटाबोलिक रोगों के रोगजनन में योगदान देता है। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मॉडुलन करना बेहद चुनौतीपूर्ण रहता है। यह पत्र मुरीन फाइब्रोब्लास्ट को परिपक्व एडिपोसाइट्स में अंतर करने और छोटे हस्तक्षेप वाले आरएनए (सिरएनए) और माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफेक्शन के माध्यम से परिपक्व एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की इनक्यूबेशन शामिल है ताकि सेल कल्चर प्लेट में एक जटिल बनाया जा सके, जिससे परिपक्व एडिपोसाइट्स जोड़े जाते हैं। इसके बाद एडिपोसाइट्स को ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स/ट्रांसफैक्शन रिएजेंट कॉम्प्लेक्स की मौजूदगी में अनुयायी प्लेट की सतह पर फिर से संलग्न करने की अनुमति है । इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोजेनेसिस और लिपोलिसिस के अध्ययन जैसे कार्यात्मक विश्लेषण ों को संक्रमित 3T3-L1 परिपक्व एडिपोसाइट्स पर किया जा सकता है ताकि आदिपोसाइट फ़ंक्शन पर प्रोटीन या माइक्रो-आरएनए हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन किया जा सके।
Introduction
मोटापा इंसुलिन प्रतिरोध (आईआर), टाइप 2 मधुमेह (T2D), और हृदय रोगों 1 सहित कई चयापचय रोगों के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक मानाजाताहै । वर्तमान चिकित्सा इन रोगों की लगातार बढ़ती व्यापकता को रोकने में विफल रहे हैं, और मोटापे से ग्रस्त और मधुमेह रोगियों के आईआर के प्रबंधन एक महत्वपूर्ण नैदानिक मुद्दा बना हुआ है । एडिपोस ऊतक ऊर्जा होमोस्टेसिस के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और मोटापे के दौरान इसका रोग विस्तार आईआर और टी 2डी2,3के विकास में योगदानदेताहै। यह मोटापे से संबंधित रोगों के खिलाफ नए उपचार विकसित करने के लिए adipocyte शिथिलता में शामिल आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है । कई शोध अध्ययनों में एडिपोसाइट फिजियोलॉजी में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए की भूमिका और मोटापे के साथ उनके जुड़ाव की जांच की गई है ।
हाल ही में, गैर-कोडिंग आरएनए (एनसीआरएन), विशेष रूप से माइक्रो-आरएनए (एमआईआरएस) की खोज ने जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के नियमन के तंत्र से संबंधित उपन्यास अवधारणाओं को जाली कर दिया है। अध्ययनों से पता चला है कि एनसीआरएन एडिपोसाइट फ़ंक्शन के महत्वपूर्ण नियामक हैं, और उनका डिस्रेगुलेशन मेटाबोलिक रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है4। इस प्रकार, आदिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन का हेरफेर आदिपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिकाओं और टी2डी जैसी विकृतियों पर उनके प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, वीवो के साथ-साथ प्राथमिक एडिपोसाइट्स में प्रोटीन और एनसीआरएन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करना अत्यधिक चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, जो इन विट्रो एडिपोसाइट मॉडल के उपयोग के पक्ष में है।
मुरीन 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट आसानी से परिपक्व, कार्यात्मक, और इंसुलिन-उत्तरदायी एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जो एक अच्छी तरह से विशेषता वाली सेल लाइन है जिसका उपयोग एडिपोसिट फ़ंक्शन (जैसे, इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, लिपोलिसिस और एडिपोकिन्स स्राव) का अध्ययन करने के लिए किया जाता है)5,6,7,8,9,10। ये गुण 3T3-L1 adipocytes को प्रोटीन-कोडिंग और एनसी-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाते हैं ताकि एडीपोसाइट फ़ंक्शन में उनकी भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका को समझा जा सके। दुर्भाग्य से, जबकि 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट्स का उपयोग करके ट्रांसफेक्ट करना आसान है, विभेदित 3T3-L1 adipocytes ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन सेल लाइनों में से एक हैं। यही कारण है कि 3T3-L1 कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने वाले कई अध्ययनों ने एडिपोसाइट फ़ंक्शन के बजाय एडीपोसाइट भेदभाव पर ध्यान केंद्रित किया है।
लंबे समय तक, एडिपोसाइट्स को स्थानांतरित करने के लिए एकमात्र कुशल तकनीक इलेक्ट्रोपॉयशन5थी, जो थकाऊ, महंगा है, और सेल क्षति का कारण बन सकती है। यह पेपर एक आम ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफैक्शन तकनीक की रिपोर्ट करता है, जो ट्रांसफैक्शन के लिए हाथों को समय पर कम करता है, सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है, और इलेक्ट्रोपॉनेशन की तुलना में बहुत कम महंगा है। यह प्रोटोकॉल पूरी तरह से सिरना और अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जैसे माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) और एंटी-एमआईआर के ट्रांसफेक्शन के लिए अनुकूल है। रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल का सिद्धांत कोशिका संस्कृति प्लेट में एक जटिल बनाने के लिए ट्रांसफैक्शन रिएजेंट और ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को इनक्यूबेट करना और फिर परिपक्व एडीपोसाइट्स को कुओं में बीज करना है। फिर, एडिपोसाइट्स ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स/ट्रांसफैक्शन रीएजेंट कॉम्प्लेक्स की उपस्थिति में अनुयायी प्लेट सतह पर फिर से संलग्न होते हैं। यह सरल, कुशल और सस्ती पद्धति एडिपोसाइट फ़ंक्शन में प्रोटीन-कोडिंग आरएनए और एमआईआर की भूमिका और मोटापे से संबंधित बीमारियों में उनकी संभावित भूमिका के अध्ययन की अनुमति देती है।
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Protocol
नोट: एक लैमिनार प्रवाह सेल संस्कृति हुड में प्रोटोकॉल के सभी चरणों को करने के लिए बाँझ तकनीकों का उपयोग करें। सभी अभिकर्दकों और उपकरणों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. एडिपोसाइट्स में मुरीन 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट का भेदभाव
- 100 मिमी व्यंजनों में 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट्स को बिना पायरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% नवजात बछड़े सीरम, और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन(चित्रा 1A)के बिना संस्कृति मध्यम-डीएमईएम में उगाएं। व्यंजनों को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (7% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस) में रखें।
- संगम के दो दिन बाद, संस्कृति माध्यम बदलें, बिना पायरुवेट के डीएमईएम के साथ बदलें, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन 0.25 एमएम 3-आइसोब्यूटिल-1-मिथाइलक्सेंथाइन (आईबीएमएक्सएक्स), 0.25 माइक्रोन डेक्सामेथासोन, 5 g/mL इंसुलिन, और 10 mμ
नोट: जब कोशिकाओं को प्रति 100 मिमी पकवान 300,000 कोशिकाओं पर वरीयता दी जाती है तो इसे पूरी तरह से प्राप्त करने में 5 दिन लगते हैं। - दो दिन बाद, संस्कृति माध्यम को बिना पायरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक के साथ 5 μg/mL इंसुलिन और 10 μM rosiglitazone और 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट के साथ बदलें । फिर, कोशिकाओं को हर 2 दिन में बिना पायरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन(चित्रा 1B)के साथ खिलाएं ।
- भेदभाव प्रोटोकॉल की शुरुआत के 7-8 दिनों के बाद 3T3-L1 adipocytes ट्रांसफेक्ट करें।
नोट: ट्रांसफैक्शन के बाद शेष फाइब्रोब्लास्ट के प्रसार से बचने के लिए ट्रांसफैक्शन से पहले उच्च स्तर के भेदभाव (>80%) तक पहुंचना महत्वपूर्ण है, जिससे कोशिकाओं की मिश्रित आबादी पैदा होगी जो परिणामों को पूर्वाग्रह कर सकती है।
2. प्रीकोटेड प्लेटों की तैयारी
- ट्रांसफेक्शन से पहले या कुछ घंटे पहले के दिन, 1 मिलीग्राम/एमएल पर स्टॉक समाधान से 30% इथेनॉल में 100 μg/l पर कोलेजन टाइप I का समाधान तैयार करें। एक 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से कोलेजन के 250 μL जोड़ें और एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 125 μL, और अच्छी तरह से सतह पर समाधान फैल गया।
- कोलेजन सूखने तक संस्कृति हुड के नीचे ढक्कन के बिना प्लेट छोड़ दें। दुलबेको के फॉस्फेट-बफर लवण (डी-पीबीएस) के साथ दो बार धोएं।
नोट: प्रीकोट प्लेटें खरीद के लिए उपलब्ध हैं।
3. ट्रांसफैक्शन मिश्रण की तैयारी
नोट: सिरना की अंतिम एकाग्रता 1 और 100 एनएम (12-अच्छी प्लेट के प्रति अच्छी तरह से सिरना के 1 से 100 पीएमओएल) के बीच है। एमआईआर नकल की अंतिम एकाग्रता 10 एनएम (10 pmol/well) है । ऑफ-टारगेट प्रभावों से बचने के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले प्रत्येक सिरना, एमआईआर नकल, या अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करें। परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण को सुविधाजनक बनाने के लिए ट्रिपलीकेट में ट्रांसफेक्शन प्रयोग करें। पिपटिंग के दौरान सामान्य नुकसान के लिए अतिरिक्त रूप से सभी अभिकर् ती तैयार करें।
- बेहतर न्यूनतम आवश्यक माध्यम(तालिका 1)के साथ सिरना (या अन्य ओलिगोन्यूक्लियोटाइड) को पिपटिंग (वॉल्यूम/वॉल्यूम) द्वारा मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- रिसेक्शन रीएजेंट और बेहतर मिनिमल एसेंशियल मीडियम को सिरना में जोड़ें, और पिपेट टू मिक्स(टेबल 1)। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट (इस समय के दौरान, धारा 4 पर आगे बढ़ें)। कोलेजन-लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें।
4. 3T3-L1 adipocytes की तैयारी
- 100 एमएम पेट्री डिश में कोशिकाओं को डी-पीबीएस के साथ दो बार धोएं। कोशिकाओं (1 एमएल प्रति 100 मिमी डिश) में 5x ट्राइपसिन जोड़ें, जिससे ट्राइप्सिन के साथ सभी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें। 30 एस के लिए प्रतीक्षा करें और ध्यान से ट्रिप्सिन को हटा दें।
- इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए पेट्री डिश को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को अलग करने के लिए 100 मिमी डिश को टैप करें।
- ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए बिना पायरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% एफसीएस और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 मिलीलीटर डीएमईएम जोड़ें। कोशिकाओं को अलग करने और कोशिका निलंबन को समरूप बनाने के लिए माध्यम को ध्यान से ऊपर और नीचे पिप्ट करें।
- एक Malassez गिनती कक्ष या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती, और 6.25 x 105 कोशिकाओं/ कोशिका निलंबन के बीज ८०० μL/एक 12 अच्छी तरह से थाली के अच्छी तरह से (5 x 105 कोशिकाओं) या सेल निलंबन के ४०० μl/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली (२.५ x 105 कोशिकाओं) ट्रांसफेक्शन मिश्रण युक्त ।
नोट: एडिपोसाइट्स की एक 100 मिमी पेट्री डिश एक 12-अच्छी प्लेट या 1 24-अच्छी प्लेट की तैयारी की अनुमति देगी। एक 100 मिमी पकवान में आमतौर पर 6-7 x 106 एडिपोसाइट्स होते हैं, जो 12-अच्छी प्लेट के प्रति कुएं 5 x10 5 एडीपोसाइट्स के अनुरूप होते हैं। - प्लेटों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर (7% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस) में इनक्यूबेट करें, और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को परेशान न करें। अगले दिन, ध्यान से बिना पाइरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 10% एफसीएस, और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के ताजा डीएमईएम के साथ सुपरनैटेंट को बदलें।
नोट: कोशिकाओं को कोलेजन-प्रीकोटेड 48- और 96-अच्छी प्लेटों में बीज करना भी संभव है, लेकिन एडिपोसाइट्स की टुकड़ी से बचने के लिए मीडिया की जगह लेते समय अधिक सावधानी बरतें।
5. संक्रमित 3T3-L1 adipocytes के कार्यात्मक विश्लेषण
- अध्ययन लक्ष्य नॉकडाउन 24-48 एच और 48-96 घंटे के बाद सिरना या एमआईआर एमआरएनए और प्रोटीन के लिए वितरण की नकल, क्रमशः ।
- इंसुलिन सिग्नलिंग, ग्लूकोज तेज, एडिपोकिन स्राव, लिपोलिसिस और लिपोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए संक्रमित एडिपोसाइट्स के कार्यात्मक विश्लेषण करें।
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Representative Results
3T3-L1 adipocytes में प्रोटीन या माइक्रो-आरएनए की अभिव्यक्ति को मिलाना करने के लिए यहां वर्णित रिवर्स-ट्रांसफेक्शन की प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, एडिपोसाइट्स को ट्रांसफैक्शन(चित्रा 1B,सी) के बाद अपनी आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए दिखाया गयाहै। दरअसल, ट्रांसफेक्शन के 2 दिन बाद, एडिपोसाइट्स अच्छी तरह से फैल गए और प्लेट से जुड़े हुए थे और बहुभाषी लिपिड बूंदों को प्रस्तुत किया गया था जो परिपक्व 3T3-L1 एडिपोसाइट्स की विशेषता है। लिपिड सामग्री संक्रमित और गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स(चित्रा 1D,ई)के बीच अलग नहीं थी। इसके अलावा, पेरोक्सीसोम प्रोलिफरेटर-सक्रिय रिसेप्टर गामा 2(Pparγ2),एडिपोनेक्टिन (आदिपोक),ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 या सोल्यूट कैरियर परिवार 2 सदस्य जैसे भेदभाव मार्कर की एमआरएनए अभिव्यक्ति 4(Slc2a4),इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट 1(आईआरएस1),पेरिलिपिन-1(Plin1)गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स(चित्रा 1F)की तुलना में संक्रमित कोशिकाओं में अपरिवर्तित था। यह रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल कुशल है क्योंकि > 70% एडिपोसाइट्स संक्रमित थे(चित्रा 1G,H)।
पेरिलिपिन-1 एक एडीपोसाइट-विशिष्ट प्रोटीन है जो लिपिड ड्रॉपलेट गठन को बढ़ावा देने और लिपोलिसिस को बाधित करने के लिए जाना जाता है। यहां, 3T3-L1 adipocytes तले हुए सिरना (एसआई-एससीआर) या Plin1 (si-PLIN1) के खिलाफ सिरना से संक्रमित थे । एसआई-प्ली 1 के साथ ट्रांसफैक्शन के तीन दिन बाद, प्लिन1 के एमआरएनए स्तर में 70%(चित्रा 2 ए)और प्रोटीन स्तर में 63%(चित्रा 2B,सी)की कमी आई थी। PLIN1 अभिव्यक्ति भी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया था 4 दिन ट्रांसफैक्शन के बाद और नियंत्रण adipocytes(चित्रा 2D-F)में अपनी अभिव्यक्ति की तुलना में ९२% की कमी आई है पाया गया था, इस प्रकार दोनों ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल और एसआई-PLIN1 की प्रभावकारिता का प्रदर्शन ।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग एमआईआर-34ए(चित्रा3 ए) की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए माइक्रो-आरएनए नकल (एमआईआर नकल) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ एडिपोसाइट्स के रिवर्स-ट्रांसफेक्शन करने के लिए भी किया गया था। एमआईआर-34ए के अतिउपप्रयोग के कारण VAMP2 प्रोटीन अभिव्यक्ति में 50% की कमी आई(चित्रा 3B,सी),एमआईआर-34ए11, 12का एक पुष्ट लक्ष्य। अंत में, इस अध्ययन से पता चलता है कि 3T3-L1 adipocytes के रिवर्स-ट्रांसफैक्शन इंसुलिन उत्तेजना के लिए उनके कार्य और जवाबदेही को बरकरार रखता है । दरअसल, 3T3-L1 adipocytes में Plin1 के नॉकआउट बेसल लिपोलिसिस(चित्रा 4A)में वृद्धि हुई । इसके अलावा, 3T3-L1 adipocytes में एमआईआर-34a के अतिउत्पादन के कारण इंसुलिन-प्रेरित प्रोटीन किनेज़ बी फॉस्फोरिलेशन(चित्रा 4 बी,सी)और ग्लूकोज तेज(चित्रा 4D)का अवरोध हुआ।
चित्रा 1: परिपक्व एडिपोसाइट्स में 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट का भेदभाव। (A)3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट को प्रति 100 मिमी डिश 3 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर वरीयता दी गई थी। प्रतिनिधि 10x ब्राइटफील्ड छवि 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट की 2 दिन बाद। (ख)दो दिन की नरमी (दिन 0) के बाद, 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट को 4 दिनों (4 दिन तक) के लिए भेदभाव कॉकटेल मिश्रण का उपयोग करके एडिपोसाइट्स में विभेदित किया गया था। 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट की प्रतिनिधि 10x ब्राइटफील्ड छवि आदिपोसाइट्स (7 दिन) में विभेदित है। बहुभाषी लिपिड बूंदों के साथ Adipocytes आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं। (ग)3T3-L1 adipocytes 7 दिन एसआई-एससीआर से संक्रमित थे । प्रतिनिधि 10x चमकीले छवियां संक्रमित 3T3-L1 adipocytes (दिन 9) । संक्रमित एडिपोसाइट्स की आकृति विज्ञान गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स के बराबर है, जिसका अर्थ है कि ट्रांसफैक्शन विधि कोमल है और एडिपोसाइट्स के लिए विषाक्त नहीं है। स्केल बार: 50 माइक्रोन(डी-ई)3T3-L1 adipocytes 7 दिन (ऊपरी पैनलों) पर एसआई-एससीआर से संक्रमित थे; गैर-संक्रमित एडिपोसाइट्स (निचले पैनल)। दो दिन बाद, कोशिकाओं को तेल लाल ओ के साथ दाग लिपिड के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । (घ)प्लेट में दाग कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां और प्रतिनिधि 10x ब्राइटफील्ड छवियां दिखाई जाती हैं। स्केल बार: 50 माइक्रोन(ई)कोशिकाओं में शामिल तेल लाल ओ को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 2-प्रोपनॉल और मात्राकृत के साथ तैयार किया गया था। डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं, गैर-संक्रमित कोशिकाओं के अवशोषण के साथ 1 को सामान्य किया जाता है। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्टद्वारा किया गया था । (F)3T3-L1 adipocytes एसआई-एससीआर से संक्रमित थे । ट्रांसफैक्शन के तीन दिन बाद, कोशिकाओं को कुल आरएनए को अलग करने के लिए काटा गया था । एडिपोसाइट विभेदन मार्कर की अभिव्यक्ति को क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था और 36B4 आरएनए स्तरों का उपयोग करके सामान्य किया गया था। डेटा संक्रमित कोशिकाओं में एमआरएनए अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं जो गैर-संक्रमित कोशिकाओं (सामान्यीकृत से 1, बिंदीदार रेखा द्वारा दर्शाए जाते हैं) और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + एसईएम के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्टद्वारा किया गया था । (जी-एच) 3T3-L1 adipocytes एसआई-एससीआर या फ्लोरोसेंट डाई (FAM) से संक्रमित थे-लेबल एसआई-आरएनए और कवरस्लिप पर चढ़ाया । 3T3-L1 adipocytes 8 घंटे बाद फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया । (जी)संक्रमित 3T3-L1 कोशिकाओं के प्रतिनिधि एकल विमान छवि दिखाया गया है । (H)कोशिकाओं की कुल संख्या के सापेक्ष एफएएम-पॉजिटिव कोशिकाओं का मात्राकरण। डेटा फ्लोरोसेंट सी-आरएनए युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण मान-व्हिटनी परीक्षण, ****पी < 0.0001 का उपयोग करके किया गया था। संक्षिप्त: एसआई-एससीआर = तले हुए सिरना; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; FAM = फ्लोरोसिन अमीसाइट; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; si-FAM = FAM-लेबल एसआई-आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: 3T3-L1 adipocytes में प्रोटीन-मुंह बंद । 3T3-L1 adipocytes तले हुए एसआई-आरएनए (एसआई-एससीआर) या Plin1 (si-PLIN1) के खिलाफ एसआई-आरएनए से संक्रमित थे । (क)ट्रांसफेक्शन के तीन दिन बाद प्लीन1 की एमआरएनए एक्सप्रेशन को क्यूआरटी-पीसीआर ने मापा था । एमआरएनए अभिव्यक्ति को 36B4 आरएनए स्तरों का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था और मनमाने इकाइयों में व्यक्त किया गया था, जिसमें एसआई-एससीआर-उपचारित कोशिकाओं को सामान्यीकृत किया गया था। परिणाम चार स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट,**पी < 0.01 का उपयोग करके किया गया था। (बी-सी) ट्रांसफैक्शन के तीन दिन बाद, प्रोटीन lysates PLIN1 और HSP90 (लोडिंग नियंत्रण) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग के अधीन थे । प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट्स दिखाए जाते हैं। (ग)PLIN1 की मात्रा घनत्व स्कैनिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी और HSP90 की मात्रा का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था । डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें एसआई-एससीआर-उपचारित कोशिकाओं को 1 से सामान्य किया जाता है। परिणाम चार स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट,*पी < ०.०५ का उपयोग करके किया गया था । (D-F) 3T3-L1 adipocytes एसआई-एससीआर या एसआई-PLIN1 से संक्रमित थे और कवरस्लिप पर चढ़ाया गया था। PLIN1 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण बाद में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा 96 घंटे किया गया था। (घ)एंटी-पेरिलिपिन एंटीबॉडी और एंटी-रैबिट-एलेक्सा647-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग 3T3-L1 adipocytes के प्रतिनिधि एकल विमान छवियों को दिखाया गया है । स्केल बार = 10 माइक्रोन.(ई)तीन आयामी (3 डी) मात्रा-3T3-L1 adipocytes वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 3 डी में खंडित प्रतिपादन । स्केल बार = 10 माइक्रोन(एफ)कोशिकाओं की कुल संख्या के सापेक्ष PLIN1 सिग्नल तीव्रता का मात्राकरण। डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें एसआई-एससीआर-उपचारित कोशिकाओं को 100% तक सामान्य किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण मान-व्हिटनी परीक्षण, ****पी < 0.0001 का उपयोग करके किया गया था। संक्षिप्त: एसआई-एससीआर = तले हुए सिरना; si-PLIN1 = Plin1 के खिलाफ सिराना; प्लिन 1 = पेरिलिपिन-1; HSP90 = हीट शॉक प्रोटीन 90; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; FAM = फ्लोरोसिन अमीसाइट; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; आईबी = इम्यूनोब्लोटिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: 3T3-L1 adipocytes में माइक्रो-आरएनए ओवरएक्सप्रेसेशन। 3T3-L1 adipocytes नियंत्रण माइक्रो आरएनए नकल (miR नियंत्रण) या माइक्रो आरएनए 34a नकल (miR-34a) से संक्रमित थे । ट्रांसफेक्शन के तीन दिन बाद कोशिकाओं को(ए)आरएनए एक्सट्रेक्शन या(बी)प्रोटीन लाइट्स तैयार करने के लिए काटा गया । }एमआईआर-34ए की अभिव्यक्ति को क्यूआरटी-पीसीआर ने मापा था। एमआईआर अभिव्यक्ति को U6 छोटे आरएनए स्तरों का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था और मनमाने इकाइयों में व्यक्त किया गया था, जिसमें एमआईआर-नियंत्रण-उपचारित कोशिकाओं को सामान्यीकृत किया गया था। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट,*पी < ०.०५ का उपयोग करके किया गया था । (ख)वीएएमपी2 और तुबुलिन (लोडिंग कंट्रोल) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन लजीजियों को पश्चिमी दाग के अधीन किया गया था । तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट दिखाए जाते हैं। (ग)वीएएमपी 2 की मात्रा घनत्व स्कैनिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी और तुबुलिन की मात्रा का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था । डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं, जिसमें एमआईआर-नियंत्रण कोशिकाएं 1 तक सामान्य हो जाती हैं। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट,*पी < ०.०५ द्वारा किया गया था । संक्षिप्त रूप: एसईएम = मतलब की मानक त्रुटि; क्यूआरटी-पीसीआर = मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; VAMP2 = वेसिकल से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 2; आईबी = इम्यूनोब्लोटिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: 3T3-L1 adipocyte समारोह में प्रोटीन या माइक्रो आरएनए मॉड्यूलेशन के प्रभाव। (A)3T3-L1 adipocytes एसआई-एससीआर या एसआई-PLIN1 से संक्रमित थे । ट्रांसफैक्शन के बाद माध्यम को 24 घंटे बदल दिया गया था और फिर बेसल लिपोलिसिस को मापने के लिए बाद में 48 घंटे एकत्र किए गए थे। परिणाम मीडिया (μg/mL) में जारी ग्लिसरोल के रूप में व्यक्त किए जाते हैं, और चार स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में । सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टी-टेस्ट,***पी < 0.001 का उपयोग करके किया गया था। (B)3T3-L1 adipocytes एमआईआर-नियंत्रण या miR-34a से संक्रमित थे । ट्रांसफेक्शन के बाद मीडियम को 24 घंटे बदल दिया गया और फिर 48 घंटे बाद मीडियम को 6 घंटे के लिए कमिेशन मीडियम (बिना पायरुवेट, 25 एमएम ग्लूकोज, 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन और ०.५% बीएसए) में बदल दिया गया । फिर, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 0.5 एनएम इंसुलिन के साथ इलाज किया गया। फॉस्फो-पीकेबी और पीकेबी (लोडिंग कंट्रोल) के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए प्रोटीन लैस तैयार करने के लिए कोशिकाओं की कटाई की गई थी । तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट दिखाए जाते हैं। (ग)फॉस्फो-पीकेबी की मात्रा घनत्व स्कैनिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी और पीकेबी की कुल राशि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था । डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त कर रहे हैं, miR नियंत्रण कोशिकाओं के साथ इंसुलिन के साथ इलाज 1 को सामान्यीकृत । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण दो तरह के ANOVA परीक्षण का उपयोग कर किया गया था, *पी < ०.०५ miR नियंत्रण इंसुलिन के साथ इलाज कोशिकाओं की तुलना में । (घ)3T3-L1 adipocytes एमआईआर नियंत्रण या miR-34a से संक्रमित थे । ट्रांसफेक्शन के बाद मीडिया को 24 घंटे बदल दिया गया और फिर 48 घंटे बाद माध्यम को 6 घंटे के लिए कम होने वाले मीडियम में बदल दिया गया। फिर, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए 0.5 एनएम इंसुलिन के साथ इलाज किया गया। (2-3एच) डिऑक्सीग्लुकोस का तेज 3 मिनट से अधिक मापा गया था । डेटा मनमाने ढंग से इकाइयों में व्यक्त कर रहे हैं, एमआईआर में बेसल ग्लूकोज तेज के साथ-इलाज कोशिकाओं को 1 से सामान्यीकृत । परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब + SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण दो तरह के ANOVA परीक्षण का उपयोग कर किया गया था, *पी < ०.०५ miR नियंत्रण इंसुलिन के साथ इलाज कोशिकाओं की तुलना में । संक्षिप्त: एसआई-एससीआर = तले हुए सिरना; si-PLIN1 = Plin1 के खिलाफ सिराना; SEM = मतलब के मानक त्रुटि; पीकेबी = प्रोटीन किनेस बी; पी-पीकेबी = फॉस्फोर-पीकेबी; एमआईआर-सीटीएल = एमआईआर-नियंत्रण; DMEM = Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम; बीएसए = गोजातीय सीरम एल्बुमिन; ANOVA = विचरण का विश्लेषण; आईबी = इम्यूनोब्लोटिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| प्रति अच्छी तरह से (12-अच्छी थाली) | प्रति अच्छी तरह से (24-अच्छी थाली) | |
| ओलिगोन्यूक्लिटाइड्स | 20 माइक्रोन | 10 माइक्रोल |
| (एसआई-आरएनए, एमआईआर...) | ||
| बेहतर न्यूनतम आवश्यक माध्यम | 20 माइक्रोन | 10 माइक्रोल |
| ट्रांसफैक्शन रीएजेंट | 5.6 माइक्रोल | 2.8 माइक्रोन |
| बेहतर न्यूनतम आवश्यक माध्यम | 154.4 माइक्रोन | 77.2 माइक्रोल |
| ट्रांसफैक्शन मिश्रण की कुल मात्रा | 200 माइक्रोल | 100 माइक्रोल |
तालिका 1: 12-वेल और 24-वेल प्लेट प्रारूपों के लिए आवश्यक ट्रांसफैक्शन अभिकर्मक।
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Discussion
यह पत्र परिपक्व एडिपोसाइट्स के भेदभाव और स्थानांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह रिवर्स-ट्रांसफेक्शन विधि ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को स्थानांतरित करने के लिए एक सरल, किफायती और अत्यधिक कुशल विधि है, जैसे कि सीआरएएनए, माइक्रो-आरएनए नकल, और एंटी-माइक्रो-आरएनए 3T3-L1 एडिपोसाइट्स में, जो ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे कठिन सेल लाइनों में से एक है। इस विधि में कुछ सीमाएं हैं जिन पर विचार करने की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल प्लाज्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफैक्शन के लिए कुशल नहीं है, जो लाभ-कार्य अध्ययनों के लिए इस तकनीक की उपयोगिता को सीमित करता है। यद्यपि 3T3-L1 सेल लाइन सहित मुरीन सेल लाइनों का उपयोग आमतौर पर विट्रो में एडिपोसाइट फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, माइक्रो-आरएनए अभिव्यक्ति पैटर्न और मुरीन ऊतक में गतिविधियां अक्सर मनुष्यों में देखे गए लोगों से अलग होती हैं; यह प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों के साथ भी मामला है। इसके अलावा, एडिपोसाइट्स में 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट के भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम को एक अनफिजियोलॉजिकल हार्मोन कॉकटेल (इंसुलिन, डेक्सामेथासोन, आईबीएमएक्स और रोसिग्लिटाज़ोन) की आवश्यकता होती है, और विभेदित कोशिकाएं वीवो परिपक्व एडिपोसाइट्स में से रूपात्मक रूप से अलग होती हैं: वे एक अनलोकुलर लिपिड ड्रॉपलेट के बजाय बहुभाषी लिपिड ड्रॉपलेट पेश करती हैं। यह इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के बीच जीन अभिव्यक्ति और सेलुलर प्रतिक्रियाओं में कुछ अंतर समझा सकता है।
इलेक्ट्रोपाउशन की तुलना में इस रिवर्स-ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि यह विधि सस्ती है। दरअसल, अभिकर् ता कम खर्चीला होते हैं, और रिवर्स ट्रांसफैक्शन की उच्च दक्षता आवश्यक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड की मात्रा को कम करती है, और इलेक्ट्रोपोरेटर जैसे महंगे उपकरणों की कोई आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, सिरना की कम एकाग्रता का उपयोग करना फायदेमंद है क्योंकि यह ऑफ-टारगेट प्रभावों से बचा जाता है। इसके अलावा, यह रिवर्स-ट्रांसफैक्शन ट्रांसफैक्शन की एक आसान, तेज, कोमल और सीधी विधि है जिसके लिए कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है और इलेक्ट्रोपॉरेशन की तुलना में उत्कृष्ट कोशिका व्यवहार्यता और अधिक मजबूत डेटा सुनिश्चित करेगा। यद्यपि ऊपर विस्तृत प्रक्रिया को माउस 3T3-एल 1 कोशिकाओं के भेदभाव और रिवर्स-ट्रांसफेक्शन के लिए अनुकूलित किया गया है, मानव प्रीडिपोसाइट्स को एडिपोसाइट्स5 में भी अंतर किया जा सकता है और आसानी से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफेक्शन के अधीन किया जा सकता है। इस रिपोर्ट से पता चलता है कि एक गैर-लिपोसमल cationic एम्फीेक्शन रिएजेंट की एक नई पीढ़ी का उपयोग करके रिवर्स-ट्रांसफैक्शन के बाद एडिपोसाइट्स व्यवहार्य, स्वस्थ और इंसुलिन के प्रति उत्तरदायी रहते हैं। रिवर्स-ट्रांसफैक्शन अन्य लोकप्रिय ट्रांसफैक्शन रिएजेंट्स का उपयोग करके भी किया जा सकता है। हालांकि, अभिव्यक्ति के अच्छे मॉड्यूलेशन और सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रतिकूल प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और ट्रांसफेक्शन रिएजेंट की मात्रा को अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी।
यह प्रोटोकॉल एडिपोसिट फ़ंक्शन में प्रोटीन और माइक्रो-आरएनए की भूमिका के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, लेकिन इसका उपयोग एलएनसी-आरएनए, वाई-आरएनए या ईआरएएनए जैसे अन्य गैर-कोडिंग आरएनए को मिलाने के लिए भी किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं जो प्रक्रिया की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं। एडिपोसाइट्स में 3T3-L1 फाइब्रोब्लास्ट के भेदभाव की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। ट्रांसफैक्शन के बाद शेष फाइब्रोब्लास्ट के प्रसार से बचने के लिए उच्च स्तर के भेदभाव तक पहुंचना महत्वपूर्ण है, जो प्रयोग के परिणामों को पूर्वाग्रह देगा। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु नए विभेदित परिपक्व आदिपोसाइट्स पर ट्रांसफैक्शन करना है; सबसे अच्छा समय भेदभाव प्रोटोकॉल की शुरुआत के 7-8 दिन बाद है, जो भेदभाव कॉकटेल को हटाने के बाद 3-4 दिनों से मेल खाता है। यह मजबूत ट्रांसफेक्शन प्रभावकारिता सुनिश्चित करेगा और प्लेट में आदिपोसाइट्स के अच्छे पुनर्attachमेंट का पक्ष लेगा। अंत में, ट्राइप्सिन के साथ एडिपोसाइट्स के उपचार की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए ताकि कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना एडिपोसाइट्स की टुकड़ी सुनिश्चित की जा सके।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को INSERM, Université कोटे डी अज़ूर, और फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) द्वारा भविष्य की प्रयोगशाला उत्कृष्टता के लिए कार्यक्रम निवेश के माध्यम से समर्थित किया गया था (लैबेक्स सिग्नलिफे-एएनआर-11-लैबएक्स-0028-01) और उत्कृष्टता की पहल (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001)। जेजे को सोसिएट फ्रैंकोफोन डु डायबेट (एसएफडी), एसोसिएशन फ्रैंकोइस डी एट्यूड एट डी रेचेचे सुर एल ओबेसिटे (एएफईआरओ), इंस्टिट्यूट थेमेटिक मल्टी-ऑर्गेन्स टेक्नोलॉजीज डालना ला सैंटे (आईटीएमओ), और प्रियतम बेंजामिन-डीलेसर्ट के अनुदानों द्वारा समर्थित है। जेजी ANR-18-CE14-0035-01 द्वारा समर्थित है । जे-एफटी को एएनआर ग्रांट ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 द्वारा समर्थित किया जाता है और प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (इक्विप एफआरएम, DEQ20180839587) से अनुदान । हम Conseil Départemental des Alpes-Maritimes और रेगियन PACA द्वारा वित्त पोषित C3M की इमेजिंग कोर सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं, जिसे जीआईएस आईबिसा माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म कोटे डी अज़ूर (MICA) द्वारा भी समर्थित किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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