Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per la consegna mirata a un singolo rene tramite un catetere posto nell'aorta addominale infrarenale nel topo.
Abstract
Sono necessarie iniezioni dirette per consentire una maggiore e specifica esposizione renale per una valutazione efficiente degli obiettivi farmacologici nel campo della ricerca renale. L'accumulo di farmaci in alcuni organi può dare luogo a effetti avversi e indesiderati, a seconda della natura dell'iniettato. Per ridurre al minimo lo sversamento e/o l'accumulo in altri tessuti, il metodo descritto nel presente documento indirizza la formulazione nel flusso sanguigno dell'arteria renale inserendo un catetere nell'aorta infra renale, appena sotto il punto in cui si ramia nell'arteria renale, risultando nel rene come organo raggiunto per la prima volta e distribuendo la formulazione in tutto il rene.
Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata del metodo, nonché delle sue sfide e difficoltà. Guida lo sperimentatore a diventare abile con questo tipo di microchirurgia che richiede precisione in condizioni sterili. La velocità è fondamentale per ridurre al minimo l'ischemia e praticare la procedura aumenterà la possibilità di iniezioni di successo senza effetti avversi. Modulando il tempo tra iniezione e riperfusione e il volume iniettato, il rischio di ricaduta ad altri organi viene mitigato.
Si noti che questa tecnica è adatta per strategie di dosamento singolo.
Introduction
Nel campo della ricerca preclinica nell'industria farmaceutica, lo sviluppo di modelli e metodi fa parte del lavoro quotidiano. C'è un crescente interesse per la capacità di indirizzare farmaci a organi specifici, o anche compartimenti separati di un organo, senza grandi ricadute / intrappolamenti, attraverso il flusso sanguigno, in altri tessuti. Ciò per consentire una maggiore e specifica esposizione per una valutazione efficiente degli obiettivi farmacologici nei modelli di diverse aree di malattia 1,2,3,4.
Un modo comune di fornire sostanze è per vie sistemiche (ad esempio, attraverso la vena di coda) poiché è meno invasivo del metodo descritto in questo manoscritto. Tuttavia, la somministrazione sistemica aumenta il rischio di aumento del metabolismo o accumulo del composto in altri tessuti rispetto all'organo bersaglio previsto, quando si passa attraverso organi filtranti come il polmone, il fegato e la milza 2,3,5. Oltre a non raggiungere il tessuto destinato, ciò potrebbe potenzialmente dar luogo a effetti avversi e /o indesiderati, a seconda della natura dell'iniettato. Solo molecole molto piccole passano i capillari degli organi filtranti e quindi il parto mirato è particolarmente importante se si lavora con molecole più grandi 6.
Per ridurre al minimo lo sversamento e/o l'accumulo di formulazione iniettata, in altri tessuti, il metodo descritto nel presente documento indirizza la formulazione nel flusso sanguigno dell'arteria renale attraverso un catetere inserito nell'aorta addominale appena sotto dove si ramia nell'arteria renale, risultando nel rene come organo raggiunto per la prima volta. Un altro vantaggio di questa somministrazione guidata è che è possibile utilizzare una dose/volume inferiore per raggiungere lo stesso livello di esposizione raggiunto tramite somministrazione sistemica 3.
Sono state esplorate altre vie di somministrazione, ad esempio le iniezioni attraverso un catetere direttamente nell'arteria renale. Nelle nostre mani, questo è stato trovato per presentare un rischio più elevato di incapacità di ripristinare la circolazione al rene. Il diametro molto piccolo dell'arteria renale (circa 0,35-0,55 mm di diametro) rende l'incisione relativamente grande e rappresenta un rischio di ostruzione e/o embolia quando si chiude il foro di ingresso. Secondo la nostra esperienza, il danno ischemico al rene si è spesso verificato quando si utilizza questo metodo, e quindi abbiamo sviluppato questo nuovo modo di colpire con successo il rene iniettando sostanze attraverso l'incisione dell'aorta più grande per colpire il rene.
Ci sono tecniche simili in fase di sviluppo nei ratti che manifestano anche le sfide e il rischio di stenosi / trombosi lavorando con iniezioni direttamente nell'arteria renale 5. Questo supporta i nostri risultati poiché i vasi nei topi sono ancora più piccoli.
Questo manoscritto e video descrivono, in dettaglio, come le iniezioni possono essere dirette nell'arteria renale nei topi attraverso un catetere inserito nell'aorta infrarenale, nonché indicazioni su come superare le difficoltà comuni nella procedura, per lavorare nel modo più sicuro possibile e quindi aumentare la riproducibilità.
Protocol
Le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato regionale di etica animale di Göteborg, Svezia.
1. Cure preoperatorie
- Utilizzare tecniche sterili per evitare infezioni.
- Sotto anestesia (ad esempio, isoflurane) e lavorando nel modo più asettico possibile, radere l'area chirurgica e rimuovere la pelliccia con una crema per la depilazione. Lasciare la crema per circa 1 minuto (massimo 2 minuti per evitare ustioni alla pelle). Lavare con cura con acqua. Questo primo passo può preferibilmente essere fatto 1-2 giorni prima dell'intervento chirurgico per evitare un ulteriore raffreddamento dell'animale proprio prima dell'intervento chirurgico.
- Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Per evitare infezioni, lavare l'area chirurgica con detergente antisettico per la pelle e pulire l'area con disinfettante (clorexidina) subito prima dell'intervento chirurgico.
- analgesia
- Predose l'animale con analgesici se non si tratta di una procedura terminale: Buprenorfina (ad esempio, temgesica) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
- anticoagulanti
- Utilizzare anticoagulanti per evitare coaguli di sangue: 10 UI di eparina attraverso la vena della coda proprio prima dell'intervento chirurgico (massimo 5 mL / kg).
2. Procedura chirurgica
- Autoclavare gli strumenti e utilizzare cateteri sterili. Fai lavare il sovratensione con sapone e ibicrub e indossa una maschera per il viso, una rete per capelli e un abito chirurgico sterile e guanti. Avere una seconda persona che gestisce gli animali e tutti i compiti "sporchi".
- Per l'anestesia, utilizzare isoflurane. Indurre l'anestesia posizionando il mouse in una scatola di anestesia con il 5% di isoflurane. Dopo l'induzione, controllare la profondità dell'anestesia controllando i riflessi e la respirazione.
- Durante l'intervento chirurgico, posizionare una maschera facciale sul mouse per dare una dose di mantenimento del 2% di isoflurane.
- Lavare l'animale con ibiscrub e clorexidina prima di metterlo sul tavolo chirurgico.
- Dopo l'anestesia, posizionare il mouse su un cuscinetto chirurgico riscaldato in posizione supina e fissare gli arti superiore e inferiore al tampone utilizzando nastro adesivo a bassa aderenza. Assicurarsi che gli arti superiori siano mantenuti in una posizione normale per prevenire la compressione polmonare. Se possibile, utilizzare una fonte di calore non elettrica.
NOTA: Usiamo l'anestesia per inalazione (ad esempio, isoflurane) per regolazioni più facili durante l'intervento chirurgico. - Drappeggiare il mouse con un involucro di plastica (ad esempio, Press'n Seal) ed eseguire il lavoro con un microscopio chirurgico.
- Proteggere i tessuti dall'essiccazione aggiungendo costantemente soluzione salina nell'area chirurgica. Questo aiuta anche a mantenere il tessuto elastico e riduce al minimo il rischio di danni durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. La salina dovrebbe essere di circa 37 °C per evitare il raffreddamento dell'animale.
- Dopo aver aperto la cavità addominale con un'incisione della linea mediana con forcep e forbici, utilizzare un impacco umido, piegato, per spingere tutti gli altri organi da parte per ottenere una buona vista sull'area dell'intervento chirurgico.
- Utilizzare i riavvolgitori per avere una buona panoramica dell'area chirurgica (gancio smussato da 5 mm).
- Localizzare l'aorta e il rene sinistro.
- Utilizzando due forcelle di microchirurgia, pulire delicatamente l'aorta, sia cranialmente (vedi 2.10.1) che caudally (vedi 2.10.2) dal rene, dai tessuti circostanti e posizionare una legatura sotto di essa (6-0 Seta). Fare attenzione a non pizzicare alcuna struttura. A modo tuo allungando delicatamente e tirando i tessuti, avvicinandoti il più possibile all'arteria renale. Intorno ai vasi ci sono diversi nervi non facilmente scoperti. Tienilo a mente poiché i nervi danneggiati possono causare paralisi o altri problemi post operatori.
- Cranially (sopra) il rene, utilizzare questa legatura per sollevare l'aorta per occluire momentaneamente il flusso sanguigno durante l'esecuzione dell'iniezione. In questa posizione, proprio sopra dove l'arteria renale, l'aorta si ramica nella direzione opposta (all'intestino, vedi figura 1). Per evitare di spingere l'iniezione in questo modo, metti la legatura sotto questo ramo. Lasciare la legatura senza alcuna tensione fino all'avvio della procedura di iniezione.
- Caudally (sotto) il rene, posizionare l'incisione vicino a dove l'aorta si ramica all'arteria renale / renale per evitare altri potenziali rami. Caudally dal rene l'aorta è molto vicino alla vena addominale. Fai molta attenzione a non danneggiare la vena.
- iniezione
- Quando tutte le legature sono in posizione; in primo luogo allungare la legatura inferiore e secondaria superiore per occluire il flusso sanguigno per dirigere il fluido iniettato verso il rene.
- Utilizzando un agopuntura (Ø 0,25 mm), forare e guidare la punta (arrotondata) del catetere (32GA) nell'aorta e fissarla con un singolo nodo sulla legatura in modo che non si muova o perda durante l'iniezione. (Figura 1). L'uso di un agopuntura al posto di una forbice consente la realizzazione di un foro di ingresso minimo nella nave.
- Iniettare 50 μL di fluidi. Il rene dovrebbe impallidire, indicando che l'iniezione ha perfuso il rene ed è finita nel luogo destinato.
- A questo punto ci sono due diversi scenari possibili.
- Dare un po 'di circolazione al rene allentando accuratamente la tensione nella legatura superiore prima di chiudere il foro di ingresso. In questo modo l'ischemia viene migliorata, ma essere consapevoli del fatto che il fluido iniettato può potenzialmente essere eliminato rapidamente attraverso la vena renale e quindi non consentire abbastanza tempo di dimora.
- Oppure procedere con l'intervento chirurgico senza dare il flusso sanguigno indietro.
- Dopo aver stretto nuovamente la legatura superiore, ritirare il catetere, suturare l'aorta e rescittere la piena circolazione.
- Rimuovere la legatura che tiene il catetere.
- Ritira il catetere.
- Suturare il foro di ingresso con un singolo punto (ethilon 11-0, ago arrotondato).
- Prima allentare la legatura inferiore e poi allentare molto lentamente quella superiore. Se c'è una perdita stringere di nuovo la legatura, attendere alcuni secondi e riprovare. Mantenere il tempo totale di ischemia fino a un massimo di 5-10 minuti per evitare danni ischemici.
- Testare la solidità spingendo l'area e cercare pulsazioni e fare in modo che il rene ritorni alla "colorazione normale" per riassicurare che il ricircolo sia stabilito.
- Tagliare i fili e rimuovere le legature sotto aorta.
- Rimuovere l'impacco e spingere l'intestino di nuovo in posizione. Donare alcuni fluidi, aggiungendo salina nella cavità addominale e suturare la peritonea (Vicryl 6-0) prima di chiudere la pelle con clip metalliche.
- Prima di svegliarsi gli animali ricevono 0,7-1 mL di Reidrex per via sottocutanea.
NOTA: L'intera procedura richiede circa 30-45 minuti per un sovratensione ben addestrato.
3. Assistenza postoperatoria
- Consentire agli animali di svegliarsi in un ambiente caldo posizionando un riscaldante (circa 38 °C) sotto una parte della gabbia per 2-3 giorni dopo l'operatore.
- Continuare a fornire analgesia (Buprenorfina, ad esempio, temgesico 0,05-0,1 mg/kg s.c.) 2-3 volte al giorno per 3 giorni dopo l'operatorio.
- Dare 10 mL/kg di Rehydrex s.c. occasionalmente se gli animali mostrano segni di disidratazione.
Representative Results
Il film è un mix di video di diversi interventi chirurgici per presentare quelli con la migliore qualità video. Alcune sequenze sono state prese da sessioni di allenamento in cui il mouse non dovrebbe svegliarsi. Pertanto, il mouse non è sempre adeguatamente drappeggiato. Quando un animale dovrebbe svegliarsi, lavoriamo sempre in modo asettico.
Le analisi istologiche hanno rivelato che l'esecuzione delle iniezioni direttamente nell'arteria renale ha dato luogo a lesioni renali, probabilmente dovute a un insufficiente ricircolo del flusso sanguigno con ischemia irreversibile (Figura 2). L'iniezione attraverso l'aorta addominale, d'altra parte, non ha causato alcuna lesione ischemica (Figura 3).
La tintura blu Evans è stata utilizzata per visualizzare che la perfusione attraverso l'aorta farà in modo che il rene sia il primo organo raggiunto (Figura 4). Nessun altro organo è diventato blu fino a dopo il passaggio attraverso la vena renale.
Abbiamo anche dimostrato che con questo metodo possiamo aumentare l'innesto delle formulazioni iniettate al rene perfuso utilizzando cellule staminali mesenchimali (Figura 5).
Figura 1: Posizionamento di suture e catetere. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Immagine dall'alto: Descrivere dove posizionare la prima legatura, cranialmente del rene sinistro. Immagine centrale: Panoramica sull'area chirurgica subito prima del posizionamento del catetere (2.11 nel protocollo). Immagine in basso: Panoramica sull'area chirurgica subito prima dell'iniezione (2.10 nel protocollo)
Figura 2: Iniezioni direttamente nell'arteria renale. Progettazione e risultati IHC di uno studio con iniezione di NaCl direttamente nell'arteria renale Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 3: Risultati dell'IHC al giorno 7 dopo la somministrazione di aorta. IHC risulta da uno studio con iniezione di NaCl nell'arteria renale tramite aorta addominale, 7 giorni dopo l'iniezione Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Iniezione di colorante blu Evans. Immagine dall'alto che mostra una vista seriale di un'iniezione tramite l'aorta della tintura blu Evans. Immagine in basso che mostra una sezione trasversale di un rene dopo l'iniezione tramite aorta di colorante blu Evans. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'infusione arteriosa addominale ha aumentato significativamente l'innesto delle cellule staminali mesenchimali nel rene sinistro rispetto al rene destro. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano sono state etichettate con CM-Dil (fluorescenza rossa) in sospensione. Un milione di MSC etichettati sono stati infusi attraverso l'arteria addominale in tre topi. Tre ore dopo l'infusione di DMS, i topi sono stati terminati. I reni sinistro e destro sono stati raccolti e incorporati negli OCT per la criosezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo metodo è riuscito a fornire formulazioni al rene senza causare danni renali. Può essere utilizzato per la consegna di qualsiasi tipo di formulazione (ad esempio, piccole molecole, cellule staminali / progenitrici o microvescicole). Il metodo può essere applicato in animali sani o in modelli di malattia renale.
Nella figura 2 e nella figura 3viene presentata l'istologia. La figura 2 mostra l'istologia 180 minuti dopo la perfusione, mentre la figura 3 mostra la storia 7 giorni dopo l'infusione. La ragione di ciò è che gli esperimenti con l'arteria renale durano solo 180 minuti. Per essere sicuri di non avere danni cronici con questo nuovo metodo, abbiamo volutamente aspettato 7 giorni per valutarli. L'n-numero è piccolo ma questo è solo un esempio.
Si noti che questo metodo di somministrazione di aorta di recente sviluppo per colpire il rene è un metodo invasivo con una produttività relativamente bassa ed è adatto solo per strategie di dosamento singolo. Il dosing ripetuto non è possibile con questo metodo.
Con piccole regolazioni dei posizionamenti della legatura questo metodo potrebbe essere utilizzato per infondere entrambi i reni simultaniamente5,7. Con l'aumento del rischio di fuoriuscita attraverso la ramificazione aortica abbiamo deciso di mantenere la legatura occluding il più vicino possibile al rene, portando l'iniezione solo al rene sinistro. Può anche essere usato in aggiunta ad altri modelli o tecniche come l'uninephrectomia o forse anche la lesione renale simultanea da ischemia reperfusionale (IRI). A nostro avviso, fare l'iniezione solo 24 ore dopo l'intervento chirurgico IRI 3 ètroppo duro e influenzerà sostanzialmente il recupero dell'animale.
Quando si utilizzano nuovi ceppi di topi, si dovrebbe sempre eseguire un esperimento pilota su alcuni animali da quel ceppo per garantire che il metodo non debba essere regolato in qualche modo. Ad esempio, in alcuni ceppi la ramificazione della nave dall'aorta può essere posizionata un po 'diversa. La posizione delle legature può cambiare in qualche modo per garantire che la formulazione finisca nella giusta posizione.
disidratazione
L'apertura della cavità addominale rappresenta un grande rischio di disidratazione. È quindi indispensabile aggiungere fluidi (circa 37 °C) sia durante che dopo l'intervento chirurgico per garantire una buona base per il recupero post operatorio. Di solito diamo 1 mL / topi .c. post-intervento chirurgico.
ischemia
Il tempo prolungato di intervento chirurgico o se non si riesce a raggiungere il ricircolo completo si tradurrà in ischemia. È importante registrare il tempo effettivo di ischemia e assicurarsi che la circolazione al rene (e alle zampe posteriori) sia ripristinata. L'allenamento costante e il rinfresco delle competenze sono, come sempre, importanti. Eseguire la procedura più velocemente riduce il tempo in cui il rene è esposto all'ischemia. Mantenere il tempo di ischemia (legatura dell'aorta) a circa 5 minuti (10 min max) ha dimostrato di non danneggiare il rene.
spillover
Considerando il rischio di ricaduta su altri organi quando la formulazione iniettata sta entrando di nuovo nella circolazione attraverso la vena renale, il volume iniettato deve essere mantenuto al minimo. Si consiglia un volume massimo di 50 μL. Il dosaggio è stato trovato anche, da altri, come fattore critico per l'efficienza3.
Effetti avversi (trombosi e paralisi)
Inizialmente quando abbiamo istituito il modello abbiamo riscontrato problemi non coerenti con la paralisi alle zampe posteriori. Dopo una dose rilevante di anticoagulante (10 UI di eparina nella vena della coda) preoperatoriamente, questo effetto avverso è stato significativamente diminuito. Dopo aver consultato esperti del settore, abbiamo anche iniziato a essere ancora più attenti nel lavorare con la chirurgia atraumatica, il che significa non pizzicare in alcun tessuto e toccare il meno possibile le aree. Queste azioni intraprese insieme hanno ridotto la frequenza della paralisi da circa il 50% a praticamente nessuna.
Inizialmente durante lo sviluppo del metodo, abbiamo applicato il tessuto anticoagulante sull'arteria renale per chiudere il foro di incisione. Questo non è stato possibile quando si esentrano iniezioni nell'aorta poiché la pressione è molto più alta nell'aorta. Anticoagulante aumenta anche il rischio di trombosi se entra nel lume del vaso.
Assicurarsi di non avere adventitia esposta nel lume dell'aorta durante la sutura poiché l'adventitia è molto trombogenica. Evitare anche di invertire i bordi della ferita o restringere l'aorta suturando alla coscia.
Ora abbiamo un metodo stabilito per fornire formulazioni direttamente al rene.
Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Acknowledgments
Grazie a René Remie di RRSSC per avermi aiutato a perfezionare la tecnica e ai laboratori Instech per la collaborazione nella produzione di uno speciale catetere progettato. Un grande ringraziamento anche a tutti i colleghi di AstraZeneca R&D per discussioni produttive con suggerimenti e trucchi e Xerox per aver completato il video con il suono.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
