Summary
Dit manuscript beschrijft een methode voor gerichte levering aan een enkele nier via een katheter die in de infrarenale abdominale aorta in de muis wordt geplaatst.
Abstract
Er is behoefte aan gerichte injecties om een verhoogde en specifieke nierblootstelling mogelijk te maken voor een efficiënte evaluatie van geneesmiddeldoelstellingen op het gebied van nieronderzoek. Accumulatie van geneesmiddelen in bepaalde organen kan leiden tot nadelige en ongewenste effecten, afhankelijk van de aard van het injectaat. Om spill-over en/of accumulatie in andere weefsels tot een minimum te beperken, leidt de hierin beschreven methode de formulering in de bloedbaan van de nierslagader door een katheter in de infra-renale aorta in te brengen, net onder waar deze zich in de nierslagader vertakt, wat resulteert in de nier als eerste bereikt orgaan en distributie van formulering door de nier.
Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van de methode, evenals de uitdagingen en moeilijkheden. Het begeleidt de experimenteerder om bekwaam te worden met dit type microchirurgie dat nauwkeurigheid vereist onder steriele omstandigheden. Snelheid is cruciaal voor het minimaliseren van de ischemie en het oefenen van de procedure zal de kans op succesvolle injecties zonder nadelige effecten vergroten. Door de tijd tussen injectie en reperfusie en het geïnjecteerde volume te moduleren, wordt het risico op overloop naar andere organen beperkt.
Merk op dat deze techniek geschikt is voor enkelvoudige doseringsstrategieën.
Introduction
In het preklinische onderzoeksveld binnen de farmaceutische industrie maakt model- en methodeontwikkeling deel uit van het dagelijks werk. Er is een toenemende belangstelling voor het vermogen om geneesmiddelen naar specifieke organen te leiden, of zelfs compartimenten van een orgaan te scheiden, zonder grote overloop / beknelling, via de bloedbaan, naar andere weefsels. Dit om een verhoogde en specifieke blootstelling mogelijk te maken voor een efficiënte evaluatie van geneesmiddeldoelstellingen in modellen van verschillende ziektegebieden 1,2,3,4.
Een veel voorkomende manier om stoffen af te leveren is via systemische routes (bijvoorbeeld via de staartader), omdat het minder invasief is dan de methode die in dit manuscript wordt beschreven. Systemische toediening verhoogt echter het risico op een verhoogd metabolisme of accumulatie van de verbinding in andere weefsels dan het beoogde doelorgaan, bij het passeren van filterorganen zoals de long, de lever en de milt 2,3,5. Afgezien van het niet bereiken van het voorbestemde weefsel, kan dit mogelijk leiden tot nadelige en/of ongewenste effecten, afhankelijk van de aard van het injectaat. Slechts zeer kleine moleculen passeren de haarvaten van filterorganen en daarom is gerichte levering vooral belangrijk bij het werken met grotere moleculen 6.
Om spillover en/of accumulatie van geïnjecteerde formulering, in andere weefsels, te minimaliseren, leidt de hierin beschreven methode de formulering in de bloedbaan van de nierslagader via een katheter die in de abdominale aorta wordt ingebracht net onder waar deze zich vertakt in de nierslagader, wat resulteert in de nier als eerste bereikte orgaan. Een ander voordeel van deze geleide toediening is dat een lagere dosis/volume kan worden gebruikt om hetzelfde blootstellingsniveau te bereiken als bereikt via systemische toediening 3.
Andere toedieningswegen zijn onderzocht, bijvoorbeeld injecties via een katheter rechtstreeks in de nierslagader. In onze handen bleek dit een hoger risico te vormen op het niet herstellen van de bloedsomloop naar de nier. De zeer kleine diameter van de nierslagader (ongeveer 0,35-0,55 mm in diameter) maakt de incisie relatief groot en vormt een risico op obstructie en/of embolie bij het sluiten van het ingangsgat. Volgens onze ervaring ischemische schade aan de nier vaak opgetreden bij het gebruik van deze methode, en daarom ontwikkelden we deze nieuwe manier om de nier met succes te richten door stoffen te injecteren door incisie van de grotere aorta om de nier te richten.
Er worden vergelijkbare technieken ontwikkeld bij ratten die ook de uitdagingen en het risico van stenose/trombose manifesteren door rechtstreeks met injecties in de nierslagader te werken 5. Dit ondersteunt onze bevindingen omdat de vaten in muizen nog kleiner zijn.
Dit manuscript en deze video beschrijven in detail hoe injecties in de nierslagader bij muizen kunnen worden geleid via een katheter die in de infrarenale aorta is ingebracht, evenals begeleiding bij het overwinnen van veelvoorkomende problemen in de procedure, om op de veiligste manier te werken en daardoor de reproduceerbaarheid te vergroten.
Protocol
Experimentele procedures werden goedgekeurd door het Regionaal Comité voor de ethiek van proefdieren in Göteborg, Zweden.
1. Preoperatieve zorg
- Gebruik steriele technieken om infecties te voorkomen.
- Onder narcose (bijv. isofluraan) en werkend op de meest aseptische manier mogelijk, scheert u het operatiegebied en verwijdert u de vacht met een ontharingscrème. Laat de crème ongeveer 1 minuut staan (maximaal 2 minuten om brandwonden te voorkomen). Was voorzichtig met water. Deze eerste stap kan bij voorkeur 1-2 dagen voor de operatie worden gedaan om extra koeling van het dier vlak voor de operatie te voorkomen.
- Breng oogsmeermiddel aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Om infecties te voorkomen, wast u het operatiegebied met een antiseptische huidreiniger en veegt u het gebied vlak voor de operatie af met ontsmettingsmiddel (chloorhexidine).
- Analgesie
- Doseer het dier vooraf met pijnstillers als het geen terminale procedure is: Buprenorfine (bijv. temgesic) 0,05-0,1 mg/kg s.c.)
- Anticoagulantia
- Gebruik anticoagulantia om bloedstolsels te voorkomen: 10 IE heparine door de staartader vlak voor de operatie (maximaal 5 ml/kg).
2. Chirurgische ingreep
- Autoclaaf de instrumenten en gebruik steriele katheters. Laat de surgent zich wassen met zeep en hibiscrub en draag een gezichtsmasker, een haarnetje en een steriele chirurgische jurk en handschoenen. Laat een tweede persoon de dieren en alle "vuile" taken afhandelen.
- Gebruik voor de anesthesie isofluraan. Induceer anesthesie door de muis in een anesthesiebox met 5% isofluraan te plaatsen. Controleer na de inductie de diepte van de anesthesie door reflexen en ademhaling te controleren.
- Plaats tijdens de operatie een gezichtsmasker op de muis om een onderhoudsdosis van 2% isofluraan te geven.
- Was het dier met hibiscrub en chloorhexidine voordat u het op de operatietafel legt.
- Na het verdoven plaatst u de muis op een verwarmde chirurgische pad in een liggende positie en bevestigt u de bovenste en onderste ledematen aan de pad met behulp van plakband met lage kleefkracht. Zorg ervoor dat de bovenste ledematen in een normale positie worden gehouden om longcompressie te voorkomen. Gebruik indien mogelijk een niet-elektrische warmtebron.
OPMERKING: We gebruiken inhalatie-anesthesie (bijv. isofluraan) voor gemakkelijkere aanpassingen tijdens de operatie. - Drapeer de muis met plasticfolie (bijv. Press'n Seal) en voer het werk uit met een chirurgische microscoop.
- Bescherm de weefsels tegen uitdroging door constant zoutoplossing toe te voegen aan het operatiegebied. Dit helpt ook om het weefsel elastisch te houden en minimaliseert het risico op schade tijdens het uitvoeren van de operatie. De zoutoplossing moet ongeveer 37 °C zijn om afkoeling van het dier te voorkomen.
- Na het openen van de buikholte met een middellijnincisie met tang en schaar, gebruikt u een vochtig, gevouwen kompres om alle andere organen opzij te duwen om een goed zicht over het operatiegebied te krijgen.
- Gebruik oprolmechanismen om een goed overzicht te hebben van het operatiegebied (5 mm stompe haak).
- Lokaliseer de aorta en de linkernier.
- Reinig met behulp van twee microchirurgie tangen de aorta voorzichtig, zowel schedelf (zie 2.10.1) als caudaal (zie 2.10.2) van de nier, van omliggende weefsels en plaats er een ligatuur onder (6-0 Zijde). Zorg ervoor dat u geen structuren knijpt. Werk je een weg naar binnen door de weefsels voorzichtig uit te rekken en te trekken, zo dicht mogelijk bij de nierslagader te komen. Rond de vaten zijn er verschillende zenuwen die niet gemakkelijk te ontdekken zijn. Houd hier rekening mee, omdat beschadigde zenuwen postoperatief verlamming of andere problemen kunnen veroorzaken.
- Cranially (boven) de nier, gebruik deze ligatuur om de aorta op te tillen om de bloedstroom tijdelijk af te houden tijdens het uitvoeren van de injectie. In deze positie, recht boven waar de nierslagader, de aorta vertakt in de tegenovergestelde richting (naar de darmen, zie figuur 1). Om te voorkomen dat u de injectie op deze manier duwt, plaatst u de ligatuur onder deze tak. Laat de ligatuur zonder spanning achter tot het begin van de injectieprocedure.
- Caudally (onder) de nier, plaats de incisie dicht bij waar de aorta vertakt naar de nier / nierslagader om andere potentiële takken te voorkomen. Caudally van de nier de aorta is zeer dicht bij de buikader. Pas op dat u de ader niet beschadigt.
- Injectie
- Wanneer alle ligaturen op hun plaats zijn; strek eerst de onderste en ten tweede de bovenste ligatuur om de bloedstroom af te afgesloten om de geïnjecteerde vloeistof naar de nier te leiden.
- Prik met een acupunctuurnaald (Ø 0,25 mm) door en leid de (afgeronde) punt van de katheter (32GA) in de aorta en bevestig deze met een enkele knoop op de ligatuur zodat deze tijdens de injectie niet beweegt of lekt. (Figuur 1). Het gebruik van een acupunctuurnaald in plaats van een schaar maakt het mogelijk om een minimaal ingangsgat in het vat te maken.
- Injecteer 50 μL vloeistoffen. De nier moet bleek worden, wat aangeeft dat de injectie de nier heeft doordrenkt en op de voorbestemde plaats is beland.
- Op dit moment zijn er twee verschillende scenario's mogelijk.
- Geef wat circulatie terug aan de nier door de spanning in de bovenste ligatuur voorzichtig los te maken voordat u het ingangsgat sluit. Op deze manier wordt ischemie verzacht, maar houd er rekening mee dat het geïnjecteerde vocht mogelijk snel via de nierader kan worden verwijderd en dus niet genoeg verblijfstijd mogelijk maakt.
- Of ga door met een operatie zonder de bloedstroom terug te geven.
- Nadat u de bovenste ligatuur opnieuw hebt aangespannen, trekt u de katheter terug, hecht u de aorta en geeft u de volledige bloedsomloop terug.
- Verwijder de ligatuur die de katheter vasthoudt.
- Trek de katheter terug.
- Hecht het ingangsgat met een enkele steek (ethilon 11-0, afgeronde naald).
- Maak eerst de onderste ligatuur los en maak dan heel langzaam de bovenste los. Als er lekkage is, draai de ligatuur dan weer aan, wacht een paar seconden en probeer het opnieuw. Houd de totale ischemietijd op maximaal 5-10 minuten om ischemische schade te voorkomen.
- Test de stevigheid door het gebied te duwen en te zoeken naar pulsaties en zorg ervoor dat de nier terugkeert naar "normale kleuring" om ervoor te zorgen dat de recirculatie wordt vastgesteld.
- Snijd de draden en verwijder de ligaturen onder de aorta.
- Verwijder het kompres en duw de darmen terug op hun plaats. Geef wat vocht terug, door zoutoplossing toe te voegen aan de buikholte en hecht de peritonea (Vicryl 6-0) voordat je de huid sluit met metalen clips.
- Voor het ontwaken krijgen de dieren subcutaan 0,7-1 ml Rehydrex.
OPMERKING: De hele procedure duurt ongeveer 30-45 minuten voor een goed getrainde surgent.
3. Postoperatieve zorg
- Laat dieren 2-3 dagen na de operatie wakker worden in een warme omgeving door een verwarmingskussen (ongeveer 38 °C) onder een deel van de kooi te plaatsen.
- Blijf analgesie (Buprenorfine, bijv. temgesic 0.05-0.1 mg/kg s.c.) 2-3 keer/dag gedurende 3 dagen postoperatief.
- Geef 10 ml/kg Rehydrex s.c. af en toe als dieren tekenen van uitdroging vertonen.
Representative Results
De film is een mix van video's van verschillende operaties om degenen met de beste videokwaliteit te presenteren. Sommige sequenties zijn genomen van oefensessies waarbij de muis niet hoort wakker te worden. Daarom is de muis niet altijd goed gedrapeerd. Wanneer een dier wakker moet worden, werken we altijd op een aseptische manier.
Histologische analyses toonden aan dat het uitvoeren van de injecties rechtstreeks in de nierslagader aanleiding gaf tot nierletsel, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende recirculatie van de bloedstroom met onomkeerbare ischemie als gevolg (Figuur 2). Injectie via de abdominale aorta daarentegen heeft geen ischemisch letsel veroorzaakt (figuur 3).
Evans blauwe kleurstof werd gebruikt om te visualiseren dat perfusie via de aorta ertoe zal leiden dat de nier het eerste bereikte orgaan is (Figuur 4). Geen andere organen werden blauw tot na de passage door de nierader.
We hebben ook laten zien dat we met behulp van deze methode de engraftment van geïnjecteerde formuleringen naar de doordrenkte nier kunnen verhogen met behulp van mesenchymale stamcellen (figuur 5).
Figuur 1: Plaatsing van hechtingen en katheter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Bovenste foto: Beschrijven waar de eerste ligatuur moet worden plaats, schedel van de linkernier. Middelste afbeelding: Overzicht over het operatiegebied vlak voor plaatsing van de katheter (2.11 in protocol). Onderste afbeelding: Overzicht over het operatiegebied vlak voor injectie (2.10 in protocol)
Figuur 2: Injecties rechtstreeks in de nierslagader. Ontwerp van en IHC-resultaten van een onderzoek met injectie van NaCl rechtstreeks in de nierslagader Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: IHC resultaten op dag 7 na toediening van aorta. IHC-resultaten van een onderzoek met injectie van NaCl in de nierslagader via abdominale aorta, 7 dagen na injectie Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Injectie van Evans blauwe kleurstof. Hoogste beeld dat een periodieke mening van een injectie via de aorta van evans blauwe kleurstof toont. Onderste foto met een dwarsdoorsnede van een nier na injectie via aorta van Evans blauwe kleurstof. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Abdominale arteriële infusie aanzienlijk verhoogde engraftment van mesenchymale stamcellen in de linker nier in vergelijking met de rechter nier. Menselijke beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen werden gelabeld met CM-Dil (rode fluorescentie) in suspensie. Een miljoen gelabelde MSC's werden doordrenkt via de buikslagader bij drie muizen. Drie uur na msd-infusie werden muizen beëindigd. Linker en rechter nieren werden geoogst en ingebed in OCT voor cryosectioning. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Deze methode is succesvol geweest in het leveren van formuleringen aan de nier zonder nierschade te veroorzaken. Het kan worden gebruikt voor de levering van elke vorm van formuleringen (bijv. kleine moleculen, stam / voorlopercellen of microvesicles). De methode kan worden toegepast bij gezonde dieren of bij nierziektemodellen.
In figuur 2 en figuur 3wordt de histologie gepresenteerd. Figuur 2 toont histologie 180 minuten na perfusie, terwijl figuur 3 de geschiedenis 7 dagen na infusie laat zien. De reden hiervoor is dat de experimenten met de nierslagader slechts 180 minuten lang waren. Om er zeker van te zijn dat we geen chronische schade hadden met deze nieuwe methode, wachtten we doelbewust 7 dagen om ze te evalueren. Het n-getal is klein, maar dit is slechts een voorbeeld.
Merk op dat deze nieuw ontwikkelde methode van aortatoediening om de nier te targeten een invasieve methode is met een relatief lage doorvoer en alleen geschikt is voor enkelvoudige doseringsstrategieën. Herhaalde toediening is met deze methode niet mogelijk.
Bij kleine aanpassingen van de ligatuurplaatsingen kan deze methode mogelijk worden gebruikt om beide nieren simultaniously5,7te infuseren . Met het verhoogde risico op overloop door aortavertakking hebben we besloten om de afsluitende ligatuur zo dicht mogelijk bij de nier te houden, waardoor de injectie alleen naar de linkernier leidt. Het kan ook worden gebruikt in aanvulling op andere modellen of technieken zoals uninephrectomy of misschien zelfs gelijktijdige renale ischemie reperfusie letsel (IRI). Naar onze mening is het doen van de injectie slechts 24 uur na de IRI3-operatie te hard en zal het herstel van het dier aanzienlijk beïnvloeden.
Bij het gebruik van nieuwe muizenstammen moet men altijd een proefexperiment uitvoeren op sommige dieren uit die stam om ervoor te zorgen dat de methode niet op de een of andere manier hoeft te worden aangepast. Bij sommige stammen kan de vaatvertakking van de aorta bijvoorbeeld een beetje anders worden gepositioneerd. De positie van de ligaturen kan enigszins veranderen om ervoor te zorgen dat de formulering op de juiste locatie terechtkomt.
Uitdroging
Het openen van de buikholte vormt een groot risico op uitdroging. Het is daarom noodzakelijk om vloeistoffen (ongeveer 37 °C) toe te voegen, zowel tijdens als na de operatie om een goede basis voor herstel na de operatie te garanderen. We geven meestal 1 ml/muizen s.c. na de operatie.
Ischemie
Langdurige operatietijd of als het niet bereiken van volledige recirculatie zal resulteren in ischemie. Het is belangrijk om de werkelijke ischemietijd vast te leggen en ervoor te zorgen dat de bloedsomloop naar de nier (en achterpoten) wordt hersteld. Constante training en vernieuwing van vaardigheden zijn, zoals altijd, belangrijk. Het sneller uitvoeren van de procedure vermindert de tijd dat de nier wordt blootgesteld aan ischemie. Het is aangetoond dat het houden van de ischemietijd (ligatie van aorta) tot ongeveer 5 minuten (maximaal 10 minuten) de nier niet schaadt.
Spillover
Gezien het risico van overloop naar andere organen wanneer de geïnjecteerde formulering opnieuw in de circulatie komt via de nierader, moet het geïnjecteerde volume tot een minimum worden beperkt. We raden een maximumvolume van 50 μL aan. De dosering is ook door anderen als een kritieke factor voor efficiëntie3.
Bijwerkingen (trombose en verlamming)
In eerste instantie ondervonden we bij het opzetten van het model niet-consistente problemen met verlamming in de achterbenen. Na de relevante dosis anticoagulantia (10 IE heparine in de staartader) preoperatief, was dit nadelige effect significant verminderd. Na het raadplegen van experts in het veld, begonnen we ook nog voorzichtiger te zijn in het werken met atraumatische chirurgie, wat betekent dat we geen weefsels knijpen en zo min mogelijk gebieden aanraken. Deze acties samen verminderden de frequentie van verlamming van ongeveer 50% tot vrijwel geen.
In eerste instantie hebben we tijdens de ontwikkeling van de methode antistollingsmiddelweefsel op de nierslagader aangebracht om het incisiegat te sluiten. Dit was niet mogelijk bij het doen van injecties in de aorta omdat de druk zoveel hoger is in de aorta. Anticoagulantia verhogen ook het risico op trombose als het in het vatlumen terechtkomt.
Zorg ervoor dat adventitia niet wordt blootgesteld in het lumen van de aorta bij het hechten, omdat adventitia zeer trombogeen is. Vermijd ook omkerende wondranden of vernauwing van de aorta door te hechten aan de dij.
We hebben nu een gevestigde methode om formuleringen rechtstreeks aan de nier te leveren.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Met dank aan René Remie van RRSSC voor het helpen finetunen van de techniek en Instech labs voor samenwerking bij het produceren van een speciaal ontworpen katheter. Een grote dank ook aan alle collega's van AstraZeneca R&D voor productieve discussies met tips en trucs en Xerox voor het voltooien van de video met geluid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt hook 5mm 8/pack | Cooper surgical | 3316-8G | |
| ETHILON Nylon Suture 11/0 | Ethicon | W2881 | For vessel |
| Microsurgery forceps curved | Karo Pharma | FRC-15 RM-8 | |
| Microsurgery forceps straight | Karo Pharma | FRS-15 RM-8 | |
| Mouse renal artery cannula, 3mm 32ga stainless steel, 10cm 2Fr PU, fits 25ga | Instech | C07SS-MRA1813 | |
| Vicryl, 6-0, BV-1 needle | Angthos | W9575 | For abdominal cavity |
References
- Porvasnik, S. L., Mah, C., Polyak, S. Targeting Murine Small Bowel and Colon Through Selective Superior Mesenteric Artery Injection. Microsurgery. 30 (6), 487-493 (2010).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Therapy. 21 (6), 618-628 (2014).
- Cai, J., et al. Maximum efficacy of mesenchymal stem cells in rat model of renal ischemia-reperfusion injury: renal artery administration with optimal numbers. PLoS One. 9 (3), 92347 (2014).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. (119), e54804 (2017).
- Monteiro Carvalho Mori da Cunha, M. G., et al. A Surgical Technique for Homogenous Renal Distribution of Substances in Rats. European Surgical Research. 51, 58-65 (2013).
- De Jong, W. H., et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials. 29 (12), 1912-1919 (2008).
- Ullah, M., et al. A Novel Approach to Deliver Therapeutic Extracellular Vesicles Directly into the Mouse Kidney via Its Arterial Blood Supply. Cells. 9 (4), 937 (2020).
