Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61947
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2, 3
1Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Research Institute of Hearing Enhancement, Yonsei University Wonju College of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Hallym University College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.

Abstract

כדי לחקור את ההשפעות של תאי גזע mesenchymal (MSCs) על התחדשות התא וטיפול, שיטה זו עוקבת אחר נדידת MSC ושינויים מורפולוגיים לאחר תרבות משותפת עם אפיתל שבלול. האיבר של קורטי היה משותק על כיסוי פלסטיק על ידי לחיצה על חלק מהקרום של רייסנר שנוצר במהלך הניתוח. MSCs מוגבל על ידי גליל זכוכית היגר לכיוון אפיתל cochlear כאשר הצילינדר הוסר. לוקליזציה השלטת שלהם נצפתה modiolus של האיבר של קורטי, מיושר בכיוון דומה לזה של סיבי העצב. עם זאת, כמה MSCs היו לוקליזציה באזור הלימבוס והראה צורה מוארכת אופקית. בנוסף, ההגירה לאזור תאי השיער הוגדלה, והמורפולוגיה של ה- MSCs השתנתה לצורות שונות לאחר הטיפול בקנאמיצין. לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהשיתוף של MSCs עם אפיתל שבלול יהיה שימושי להתפתחות טיפולית באמצעות השתלת תאים ולחיקרי התחדשות תאים שיכולים לבחון תנאים וגורמים שונים.

Introduction

אובדן שמיעה יכול להתרחש מולדת או יכול להיגרם בהדרגה על ידי מספר גורמים, כולל הזדקנות, תרופות, ורעש. אובדן שמיעה הוא לעתים קרובות קשה לטפל כי זה מאוד מאתגר לשחזר תפקוד לקוי פעם תאי השיער האחראים על השמיעה פגומים1. על פי ארגון הבריאות העולמי, 461 מיליון בני אדם ברחבי העולם מעריכים כי יש אובדן שמיעה, המהווה 6.1% מאוכלוסיית העולם. מבין הסובלים מירידה בשמיעה, 93% הם מבוגרים ו-7% הם ילדים.

מספר גישות נוסו לטפל באובדן שמיעה; יש לציין כי גישת התחדשות באמצעות MSCs התפתחה כטיפול מבטיח. כאשר הרקמה פגומה, MSCs משתחררים באופן טבעי לתוך מערכת הדם ונדדים לאתר הפציעה שבו הם מפרישים מולקולות שונות כדי ליצור microenvironment המקדםהתחדשות 2. לפיכך, חשוב לפתח שיטה לטיפול ברקמות פגומות באמצעות הגירה של MSCs מושתל חיצונית כדי למקד איברים ואת הפרשתם הבאים של מולקולות הגורמות ויסות חיסוני חזק, אנגיוגנזה, ואנטי אפופטוזיס כדי לשפר את השיקום של תפקוד התא הפגוע3,4,5.

תהליך הביות שבו MSCs נודדים לרקמות פגומות עשוי להיות המכשול החשוב ביותר להתגבר עליו. MSCs יש מנגנון ביות מערכתי עם שלבים רציפים של קשירה / גלגול, הפעלה, מעצר, גלגול /diapedesis, והגירה6,7,8. נכון לעכשיו, נעשים מאמצים לזהות דרכים לשיפור צעדים אלה. אסטרטגיות שונות, כולל שינוי גנטי, הנדסת משטח התא, הפריה חוץ גופית, והדרכה מגנטית, נבדקו6,7. בנוסף, נעשו מספר ניסיונות לקדם את ההגנה וההתחדשות של תאי שיער שמיעתיים על ידי ביות MSCs לאתר של שבלול פגום. עם זאת, מעקב אחר MSCs ב vivo הוא זמן רב ועבודה אינטנסיבית ודורש מיומנויות מיוחדות מאוד9.

כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לבחינת הביות של MSCs בשבלול באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן לשגות המצלם את נדידת התאים במשך מספר שעות (איור 1). הוא פותח בתחילת המאה ה-20 והפך לאחרונה לכלי רב עוצמה לחקר הגירה של תאים ספציפיים.

Figure 1
איור 1: תקציר גרפי. (A) לאחר שהאיבר המנותח של קורטי דבק בכיסוי פלסטיק באמצעות מלקחיים, הכיסוי ממוקם על צלחת מיקרוסקופית עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, ו- (B) גליל הזכוכית ממוקם. (C) לאחר מילוי החלק הפנימי של גליל הזכוכית עם בינוני, (D) GFP שכותרתו MSCs עם בינוני מתווספים בזהירות מחוץ הצילינדר. (E)לאחר הדגירה בן לילה,(F)הצילינדר זכוכית מוסר, ותמונות נלקחות עם מיקרוסקופ confocal. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSCs = תאי גזע mesenchymal. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל פרוטוקולי המחקר מעורבים עכברי ICR אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת Yonsei במכללת וונג'ו לרפואה. הניסויים בוצעו על פי הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית. בפרוטוקול זה, עכברי ICR בהריון הוחזקו במחזור אור / כהה 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. ניתוח קוכליאה

  1. לעקר את מכסה המנוע של רקמת הזרימה למינארית על ידי הפעלת האור האולטרה סגול במשך ~ 30 דקות, ולרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול לפני השימוש. אפשר למשטחים להתייבש.
  2. מניחים מכשירי ניתוח ב 70% אתנול במשך 10 דקות, ויבש לפני השימוש.
  3. השתמש בלהב הפעלה כדי לערוף את ראשם של עכברים בני 3-4 ימים לאחר הלידה (איור 2A).
  4. מניחים את הגולגולת מתחת לסטריאומיקרוסקופ במכסה המנוע של זרימת הלמינארי, ומשרים את הרקמה ב-70% אתנול.
  5. להשרות במהירות את הרקמה בתמיסת ניתוח רקמות (1x פתרון מלח מאוזן של האנק, 1 מ"מ HEPES) כדי להסיר את האתנול.
  6. חותכים את קו האמצע של הגולגולת בלהב כירורגי(איור 2B,C).
  7. חשוף את הגולגולת על ידי משיכת העור לפני זמן מה וחיתוך תעלת השמיעה החיצונית של האוזן(איור 2D).
  8. חותכים מהקצה השני לחלק האחורי של הגולגולת לאורך קו העין(איור 2E).
  9. פתחו את הגולגולת והסירו את המוח הפתח, המוח הקטן וגזע המוח בעזרת מלקחיים קהים(איור 2F,G).
  10. בעזרת מלקחיים זעירים, הפרד את השבלול מעצם הזמן(איור 2H).
  11. מעבירים את השבלול לצלחת פטרי המכילה תמיסת ניתוח רקמות.
  12. נתק בזהירות את כל קפסולת שיבולת השועל, והשאיר רק את הרקמה הרכה הפנימית של השוליאר (איור 2I,J).
  13. החזיקו את המודיעין של השבלול עם מלקחיים ותעל השבלול עם זוג מלקחיים נוסף, והפרידו לאט לאט בין שתי הרקמות (איור 2K).
  14. הסירו את הווסקולאריס ואת הקרום הטקטורלי על ידי קילוף עדין שלהם(איור 2L,M).
  15. מניחים כיסוי פלסטיק מעוקר בתמיסת ניתוח רקמות חדשה, ולאחר מכן מניחים את האיבר של קורטי על כיסוי בקוטר 9 מ"מ, מוודאים שהממברנה הבזילארית פונה כלפי מטה (איור 2N-P).
  16. לשתק את הרקמה על ידי לחיצה על קרום רייסנר ואת רקמת modiolus הנותרים על מכסה עם מלקחיים (איור 2N-P).
  17. מעבירים את הכיסוי עם הרקמה המוטבעת למרכז צלחת קונפוקלית בקוטר 35 מ"מ.
  18. מניחים את גליל שיבוט הזכוכית על המנה, עם explant שבלול ממוקם במרכז המנה, ומוסיפים 100 μL של מדיום תרבות explant (DMEM / F12, 10% סרום שור עוברי (FBS), 1% תוספת N2, ampicillin (10 מיקרוגרם / מ"ל))10 בתוך הצילינדר (איור 2Q).
  19. צלחת 5 ×10 3 תאים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שמקורו בעצם העכבר, MSCs מתויגים ב-2 מ"ל של מדיום תרבות (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% תוספת N2, 10 מיקרוגרם/מ"ל של אמפיצילין) מחוץ לגליל הזכוכית (איור 2R).
    1. כאשר MSCs הם 80-90% confluent, להעביר אותם על ידי ניתוק אותם עם חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין.
  20. מעבירים בזהירות את המנה הקונפוקלית לאינקובטור לח ומדגרים לילה ב-37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2.
  21. שאפו את כל המדיום בתוך ומחוץ לצילינדר, ולאחר מכן הסירו את גליל הזכוכית מהצלחת הקונפוקלית.
  22. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום תרבות טרי לצלחת הקונפוקלית, ומדגירה את מנת תרבית הרקמה באינקובטור לח עד שהיא מוכנה לניתוח.

Figure 2
איור 2. ניתוח של לכישלת עכבר ושיתוף פעולה של האיבר של קורטי ו- MSCs. עריפתראשו של העכבר, (B) ו - (C) ניתוח קשתי של הראש, (D) ו - (E) ניתוח קורנל של המוח, (F) ו - (G) הסרת המוח ועצם הזמן, (H) השבלול, (אני) הסרת קיר השבלול הגרמי, ( J ) בידוד של השבלול, ( K ) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (J) בידוד של השבלול, (K) הפרדת צינור השבלול מן modiolus, (L) הפרדת סטריה vascularis (SV) ורצועה ספירלית (SL) מהאיבר של קורטי, (M) הסרת קרום tectorial, (N-P) קיבוע של שבלול על תלוש כיסוי פלסטיק, (Q) מיקום של coverlip ו גליל זכוכית בצלחת confocal, (R)חיסון של MSCs. בר בקנה מידה לבן (A-E) = 1 ס"מ; כתום (F, G, P) ו פס בקנה מידה צהוב (H,I) = 1 מ"מ; פס בקנה מידה ירוק (J-O) = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הדמיה לשגות בזמן

  1. לניסויים המוצגים כאן, השתמש במערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם מערכת אינקובטור הבמה העליונה.
  2. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקאלי, את האור הפלואורסצנטי ואת המחשב.
  3. הגדר את התנאים של החממה הבמה העליונה להציב על הבמה של מיקרוסקופ confocal ל 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 אטמוספרה.
  4. מניחים את צלחת המדגם על כלי התיקון של המנה, מכסים במכסה תיקון המנה וסוגר את התא עם מכסה התנור העליון.
  5. התאם את גודל התצוגה ואת המוקד כדי להתאים לשפות אחר האיבר של Corti ו- MSCs בשדה התצוגה.
  6. פתח את תוכנת עיבוד התמונה. תחת אפשרות האיתור, בחר באובייקט 20x Plan-Apochromat (צמצם מספרי 0.8) ובאזור חיתוך של 0.5x.
  7. תחת רכישה, לחץ על התקנה חכמה ובחר EGFP.
  8. פתח את כרטיסיית הערוץ תחת רכישה, והגדר את עוצמת הלייזר ל- 0.2%, את חור הפינה ל- 44 מיקרומטר, את הרווח הראשי ל- 750 Vואת הרווח הדיגיטלי ל- 1.0.
  9. לחץ על ESID תחת הגדרת הדמיה, והגדר את רווח ESID ל- 4 ואת הרווח הדיגיטלי ל- 7.5.
  10. לחץ על אריחים יתד לייצר 210 אריחים.
  11. פתח את אסטרטגיית מיקוד ובחר את מצב המוקד.
  12. תחת סידרת זמן, הגדר את משך הזמן ל- 24 שעות ואת מרווח הזמן ל- 10 דקות.
  13. תחת רכישה, להגדיר את גודל המסגרת ל 512 x 512 פיקסלים, מהירות הסריקה ל 8, הכיוון דו כיווני, הממוצע ל 4x, ואת הסיביות לפיקסל ל 16.
  14. לחץ על להתחיל ניסוי כדי להתחיל את הניסוי.

3. שינוי קובץ תמונה

  1. תחת עיבוד, לחץ על תפירה, ולהגדיר את הכיסוי המינימלי ל 5% ואת המעבר המקסימלי ל 10%.
  2. לחץ על ייצוא הסרט, להגדיר לא דחוס, ולהגדיר את המהירות ל 7.5.

4. חיסון

  1. שאפתן את המדיום בזהירות, ולשטוף את המדגם פעמיים עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) במשך 5 דקות.
  2. לתקן את המדגם עם 4% פורמלין ב PBS במשך 15 דקות, ולשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  3. לחלחל המדגם ב 0.1% טריטון X-100 ב PBS במשך 10 דקות, ולשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  4. הוסף 250 μL של phalloidin-iFluor 647 מגיב (1:1000 דילול PBS), ולהדגיר את המדגם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר.
  5. לשטוף את המדגם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות.
  6. מעבירים את הכיסוי לשקופית הזכוכית ומוסיפים 2 טיפות של פתרון הרכבה.
  7. הנח כיסוי בשקופית בעדינות.
  8. לאטום את הכיסוי עם לק ברור ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך עד התאים נצפו.
  9. צלם את השקופית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מסנן מתאים בהתרגשות/פליטה (Ex/Em)=650/665 ננומטר עבור פאלודין וב- Ex/Em=488/507 nm עבור EGFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אין ויטרו הגירה של MSCs במצב תלת מימדי הוערך על ידי מערכת Transwell או על ידי שיטת ריפוי הפצע המסורתית כדי לצפות הגירה במצב דו מימדי (2D)11. האיבר של קורטי הוא מבנה מורכב המורכב מתאים שונים כגון תאי בוצ'ר, תאי קלאודיוס, תאי דיטר, תאי עמוד, תאי הנסן, תאי שיער החיצוניים, תאי שיער פנימיים, סיבי עצב, קרום בזילארי ולמינה12. כאשר MSCs מושתלים לתוך רקמה המורכבת מתאים מורכבים כאלה, השימוש בטכנולוגיה כדי לברר היכן תאים מגויסים ומיוצבת הוא חיוני כדי להבין את המנגנון של טיפול בתאים והתחדשות באמצעות MSCs. בנוסף, כדי לקבוע כיצד MSCs מותאמים בנוכחות או בהיעדר נזק, שיטה דו-מימדית כגון שיטת ריפוי פצעים מתאימה יותר ממערכת Transwell שבה תאים נעים באופן אקראי כלפי מטה בכיוון אחד.

במחקר זה, הנתיב הדו מימדי של MSCs היה במעקב בשיטת ריפוי פצע פשוט באמצעות גליל זכוכית כמחסום בין MSCs לבין האיבר של Corti והסרת הצילינדר לאחר MSCs מחוברים. כאשר האיבר של קורטי היה תרבותי, פיברובלסטים גדלו מהר מאוד כלפי חוץ מתאי השיער החיצוניים הנמצאים בשכבה החיצונית ביותר(איור 3, וידאו 1). לכן, רוב MSCs שכותרתו GFP נראה נדחף החוצה על ידי fibroblasts הגדל במהירות (וידאו 1). עם זאת, כמה MSCs עם תווית GFP חדרו לשכבת הפיברובלסטים והיגרו בהצלחה לאיבר של קורטי(איור 3, וידאו 1).

Figure 3
איור 3. תמונה קונפוקלית של האיבר של רכיבי MSC בעלי תווית Corti ו- GFP. לאחר הסרת גליל הזכוכית ובוצעו 4 שעות נוספות של דגירה, קיבוע וכתמים. סרגל קנה מידה =100 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSCs: תאי גזע mesenchymal. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות בזמן של האיבר של Corti ו- GFP שכותרתו MSCs. לאחר הסרת גליל הזכוכית ובוצעו 4 שעות נוספות של דגירה, קיבוע וכתמים. סרגל קנה מידה =100 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; MSCs: תאי גזע mesenchymal. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

התוצאות של 72 שעות של דגירה הראו כי MSCs היגרו לאיבר של קורטי היו מקומיים בעיקר modiolus ואת האזור שבו סיבי עצב שבלול מופרדים modiolus נאספו; המורפולוגיה של ה-MSCs שונתה לצורה רדיאלית הדומה לזו של סיבי עצב(איור 4B). באופן מסקרן, התאים הפכו לצורה ליניארית לאורך קו הלימבוס ולא לאזור תא השיער(איור 4E, ראו חץ). למרות שהקצוות האפורים והבסאליים של האיבר של קורטי שולבו כדי למנוע מה- MSCs לעבור לצד המדיאלי של קרום הבזילארי, MSCs הצליחו לנדוד ולגדול באזור איסוף סיבי העצב על ידי חדירה לשכבות התאים השונות ולחסמים הפיזיים (איור 4E). כאשר הנזק לתאי השיער נגרם על ידי טיפול עם 1 mM kanamycin במשך 16 שעות, ותאים היו מתורבתים במשך 72 שעות נוספות לאחר הסרת kanamycin, MSCs היו מקומיים לא רק modiolus, אלא גם בתאי השיער החיצוניים (איור 4C,D).

Figure 4
איור 4. תמונות קונפוקל של האיבר של Corti ו- MSCs עם תווית GFP. (A)לאחר הסרת גליל הזכוכית ו-16 שעות נוספות של דגירה, צולמה תמונה לאחר קיבעון וכתמים. סרגל קנה המידה =200 מיקרומטר. (B) MSCs הופצו בעיקר באזור modiolus, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לאחר הסרת גליל הזכוכית מהצלחת, התאים היו עוד יותר דגירה עם 1.0 מ"מ kanamycin עבור 16 שעות, בתרבית עם מדיום נטול קנאמיצין עבור 72 שעות, ולאחר מכן קבוע ומוכתם. תמונות של (C) אזור תא השיער החיצוני, סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר; (D) אזור modiolus, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר; ו- (E) כל השבלול, סרגל קנה המידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות אלה מצביעות על כך שהמערכת הניסיונית שהודגמה במחקר זה תהיה כלי בדיקה שימושי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות של תאים באמצעות MSCs וניתן ליישם אותה במיוחד כדי לחקור אובדן שמיעה שנגרם על ידי גורמים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השתלת MSCs לאתרים פגומים כדי לקדם את ההתחדשות של תאים פגומים נחקרה בהרחבה, ואת ההשפעה הטיפולית ניכרת. ההשתלה והבידול הבאים של MSCs דווחו כדי לשחזר את השמיעה בחולדות עם אובדן שמיעה המושרה על ידי חומצה 3-nitropropionic13. למרות לי ואח 'להחיל MSCs על בני אדם טרנס-ורידים, הם לא השיגו שום שיפור משמעותי בשמיעה14. עד לאחרונה, כמעט 12 ניסויים נערכו כדי לשחזר את השמיעה במודל המכרסמים על ידי השתלת MSC. למרות התוצאה אינה ברורה במקצת בגלל הטרוגניות, יש אינדיקציה מסוימת כי MSCs יכול לקדם שמיעה.

גורמי גדילה שונים כימוקינים הקשורים chemoattraction מעורבים בהגירה של תאי גזע מושתלים לאזורים פגומים, ללא קשר הטרוגניות או הומוגניות15. כימוקינים הם הרגולטורים העיקריים של נדידת תאים עבור הומאוסטזיס של רקמות, תגובות חיסוניות וריפוי פצעים. chemoattraction הנגרמת על ידי Chemokine ב vivo לא יכול לעבוד באותו אופן כפי שהוא עושה במבחנה בשל ההבדלים בין vivo לבין תנאי ניסוי במבחנה. אמנם בתנאים ניסיוניים במבחנה יש מגבלות משלהם, קשה מאוד לנהל מחקרים vivo כדי לקדם הגירה יעילה, גיוס, והתחדשות של תאים16.

למרות המעקב אחר MSCs מושתלים לשחזור שמיעה חשוב במחקר רפואה רגנרטיבית, בניסויים vivo, במיוחד אלה הכרוכים בשמיעה, הם עבודה אינטנסיבית ברוב המקרים ולכן קשה מאוד לבצע עם גודל מדגם גדול. לפיכך, ההומוגניות של התוצאות נמוכה, וההטיה חמורה. לכן, זה יהיה יעיל ללמוד תחילה אירועים מבוססי הגירה כאלה בתנאים במבחנה. רוב המחקרים במבחנה על נדידת תאים בוצעו באמצעות Transwell או שיטות ריפוי פצעים.

שיטת coincubation של explanting שבלול עם MSCs הוקמה כדי לעקוב אחר תאי גזע נודדים, אשר מזהים אתרי פציעה לנוע לעברם. רוב המחקרים השתמשו בשיטה של הצמדת איבר של קורטי על כריכות זכוכית מצופה β-mercaptoethanol לאחר explantation. למרות אותה שיטה שימשה כאן, היה קשה לבחון את הרקמות כי הם לעתים קרובות מנותקים או מגולגל מן הכיסוי. לכן, ניסוי חדש בוצע כדי להקל על ניטור הרקמה. ראשית, איבר של קורטי הונח על כיסוי פלסטיק, ולאחר מכן הרקמה הייתה משותקת על הכיסוי על ידי לחיצה על החלק הנותר של קרום רייסנר שנוצר במהלך הניתוח באמצעות מלקחיים.

זה איפשר את ההחזקה היציבה של האיבר של קורטי לכיסוי כך שניתן יהיה לרכוש תמונה בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. למרות ששיטת תרבית הרקמות המוצגת כאן היא זולה וחסכונית בזמן, התפתחות המיומנות בניתוח לוקחת זמן מה. שיטות ידועות לתרבית רקמות כוללות את ההחזקה של הרקמה על ידי ציפוי הכיסוי עם פולי-ל-אורניתין ולמינין16; החלת תרבית תאים organotypic מוסיף שאינם דורשים חומרי דבק או ציפוי17 ובכך מבטל את הצורך בחומרים דבקים, אשר מפחית נזק explant; ושימוש בדבק רקמה המורכב מחלבונים המופקים ממולים ימיים10. פרוטוקול זה אינו דורש חומרי ציפוי ולא קרום organotypic ולא דבקים רקמה; כיסוי פלסטיק זול מספיק. תמונות טובות יותר ניתן לרכוש אם אזור של 8 מ"מ x 8 מ"מ נחשב יחד עם מחסנית Z של עובי הרקמה של האיבר של קורטי. בהתחשב בכמות העצומה של הנתונים שיש לאחסן ובזמן המתאים לשגות בזמן, נרכשו תמונות של תנועת תאים שלמה, תוך התמקדות ב- MSCs במקום באיבר של Corti.

נראה כי התוצאות המוצגות באיור 4 מצביעות על כך שניתן לדמיין הן את האיבר של Corti והן את ה- MSCs כתמונות וידאו ברורות כאשר התמונות שצולמו הן באורך של 2 מ"מ, ו- Z-stack משולב עם מעידת זמן. כאן, למרות שבוצע ניסוי תרבות משותפת עם MSCs ו explant, הגדרה זו יכולה להיות מיושמת על סוגי תאים שונים או תנאים למחקרים עתידיים. לדוגמה, זה יעזור ליישם פרוטוקול זה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות או exosomes להגן על הנזק של שבלול. תאי גזע עובריים (ESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSCs) יכולים להתחדש תפקודית ומורפולוגית לתאים דמויי תאי שיער מכניים18. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי ללמוד את הבידול של iPSCs או ESCs לתוך תאי שיער שמיעתיים או תאי תמיכה. שיטת ex vivo זו יכולה לסייע ברפואה רגנרטיבית כדי לשחזר את השמיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NRF-2018-R1D1A1B0705050175, HURF-2017-66) מקרן המחקר הלאומית (NRF) של קוריאה וקרן המחקר של אוניברסיטת האלים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS Buffer GenDEPOT P2100-104
4% Formalin T&I BPP-9004
Ampicillin sigma  A5354-10ml
BSA sigma  A4503-100G
confocal dish SPL 200350
confocal microscope  ZEISS LSM800
coverslip SPL 20009
DMEM/F12 Gibco 10565-018
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher scientific 16140071
Fluorsheild with DAPI sigma  F6057
Forcep Dumont 0508-L5-P0
HBSS Thermo Fisher scientific 14065056
HEPES Thermo Fisher scientific 15630080
N2 supplement Gibco 17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent abcam ab176759
Stage Top Incubator TOKAI HIT WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP cyagen MUBMX-01101
Triton X-100 sigma  T8787

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
  2. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  3. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
  4. Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
  5. Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
  6. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  7. Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
  8. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  9. Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
  10. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  11. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
  13. Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
  14. Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
  15. Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
  16. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
  17. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  18. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 166 איבר קורטי מיקרוסקופ קונפוקלי לשגות בזמן תא גזע mesenchymal הגירה תאי שיער תאים תומכים immunolabeling מערכת coculture
הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, J. E., Lee, S. H., Park, D.… More

Park, J. E., Lee, S. H., Park, D. J., Seo, Y. J., Kim, S. K. In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti. J. Vis. Exp. (166), e61947, doi:10.3791/61947 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter