במחקר זה, אנו מציגים שיטת הדמיה בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להתבונן בתאים הנעים לכיוון רקמה פגומה על ידי דגירה ex vivo עם אפיתל שבלול המכיל את האיבר של קורטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
כדי לחקור את ההשפעות של תאי גזע mesenchymal (MSCs) על התחדשות התא וטיפול, שיטה זו עוקבת אחר נדידת MSC ושינויים מורפולוגיים לאחר תרבות משותפת עם אפיתל שבלול. האיבר של קורטי היה משותק על כיסוי פלסטיק על ידי לחיצה על חלק מהקרום של רייסנר שנוצר במהלך הניתוח. MSCs מוגבל על ידי גליל זכוכית היגר לכיוון אפיתל cochlear כאשר הצילינדר הוסר. לוקליזציה השלטת שלהם נצפתה modiolus של האיבר של קורטי, מיושר בכיוון דומה לזה של סיבי העצב. עם זאת, כמה MSCs היו לוקליזציה באזור הלימבוס והראה צורה מוארכת אופקית. בנוסף, ההגירה לאזור תאי השיער הוגדלה, והמורפולוגיה של ה- MSCs השתנתה לצורות שונות לאחר הטיפול בקנאמיצין. לסיכום, תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהשיתוף של MSCs עם אפיתל שבלול יהיה שימושי להתפתחות טיפולית באמצעות השתלת תאים ולחיקרי התחדשות תאים שיכולים לבחון תנאים וגורמים שונים.
מבוא
אובדן שמיעה יכול להתרחש מולדת או יכול להיגרם בהדרגה על ידי מספר גורמים, כולל הזדקנות, תרופות, ורעש. אובדן שמיעה הוא לעתים קרובות קשה לטפל כי זה מאוד מאתגר לשחזר תפקוד לקוי פעם תאי השיער האחראים על השמיעה פגומים1. על פי ארגון הבריאות העולמי, 461 מיליון בני אדם ברחבי העולם מעריכים כי יש אובדן שמיעה, המהווה 6.1% מאוכלוסיית העולם. מבין הסובלים מירידה בשמיעה, 93% הם מבוגרים ו-7% הם ילדים.
מספר גישות נוסו לטפל באובדן שמיעה; יש לציין כי גישת התחדשות באמצעות MSCs התפתחה כטיפול מבטיח. כאשר הרקמה פגומה, MSCs משתחררים באופן טבעי לתוך מערכת הדם ונדדים לאתר הפציעה שבו הם מפרישים מולקולות שונות כדי ליצור microenvironment המקדם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולי המחקר מעורבים עכברי ICR אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת Yonsei במכללת וונג'ו לרפואה. הניסויים בוצעו על פי הקוד האתי של ההסתדרות הרפואית העולמית. בפרוטוקול זה, עכברי ICR בהריון הוחזקו במחזור אור / כהה 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.
1. ניתוח קוכליאה
- לעקר את מכסה המנוע של רקמת הזרימה למינארית על ידי הפעלת האור האולטרה סגול במשך ~ 30 דקות, ולרסס את כל המשטחים עם 70% אתנול לפני השימוש. אפשר למשטחים להתייבש.
- מניחים מכשירי ניתוח ב 70% אתנול במשך 10 דקות, ויבש לפני השימוש.
- השתמש בלהב הפעלה כדי לערוף את ראשם של עכברים בני 3-4 ימים לאחר הלידה (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אין ויטרו הגירה של MSCs במצב תלת מימדי הוערך על ידי מערכת Transwell או על ידי שיטת ריפוי הפצע המסורתית כדי לצפות הגירה במצב דו מימדי (2D)11. האיבר של קורטי הוא מבנה מורכב המורכב מתאים שונים כגון תאי בוצ'ר, תאי קלאודיוס, תאי דיטר, תאי עמוד, תאי הנסן, תאי שיער החיצוניים, תאי שיער פנימיים, סיבי עצב, קרום בזילארי ולמינה12. כאשר MSCs מושתלים לתוך רקמה המורכבת מתאים מורכבים כאלה, השימוש בטכנולוגיה כדי לברר היכן תאים מגויסים ומיוצבת הוא חיוני כדי ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השתלת MSCs לאתרים פגומים כדי לקדם את ההתחדשות של תאים פגומים נחקרה בהרחבה, ואת ההשפעה הטיפולית ניכרת. ההשתלה והבידול הבאים של MSCs דווחו כדי לשחזר את השמיעה בחולדות עם אובדן שמיעה המושרה על ידי חומצה 3-nitropropionic13. למרות לי ואח 'להחיל MSCs על בני אדם טרנס-ורידים, הם לא השיגו שום שיפור משמעותי בשמיעה14. עד לאחרונה, כמעט 12 ניסויים נערכו כדי לשחזר את השמיעה במודל המכרסמים על ידי השתלת MSC. למרות התוצאה אינה ברורה במקצת בגלל הטרוגניות, יש אינדיקציה מסוימת כי MSCs יכול לקד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר (NRF-2018-R1D1A1B0705050175, HURF-2017-66) מקרן המחקר הלאומית (NRF) של קוריאה וקרן המחקר של אוניברסיטת האלים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% פורמלין | T& | אני BPP-9004 | |
| אמפיצילין | סיגמא | A5354-10 מ"ל | |
| סיגמא BSA | A4503-100G | ||
| SPL | 200350 | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| סרום בקר עוברי | תרמו פישר | 16140071 | |
| Fluorsheild עם DAPI | sigma | F6057 | |
| מלקחיים | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | תרמו פישר מדעי | 14065056 | |
| HEPES | תרמו פישר | 15630080 | |
| מדעי תוסף N2 | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| חממה עליונה | שלב TOKAI HIT | WELSX | |
| זן C57BL/6 תאי גזע מסנכימליים של עכבר עם GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
מקורות
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise revie....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
