Summary
I denne studien presenterer vi en sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av konfokal mikroskopi for å observere celler som beveger seg mot skadet vev ved eksvivosinkubasjon med cochlea-epitelet som inneholder Cortis organ.
Abstract
For å studere effekten av mesenchymale stamceller (MSC) på celleregenerering og behandling, sporer denne metoden MSC-migrasjon og morfologiske endringer etter samkultur med cochlea epitel. Cortis organ ble immobilisert på en plastdekslerlip ved å trykke på en del av Reissners membran generert under disseksjonen. MSCer begrenset av en glasssylinder migrerte mot cochlea epitel da sylinderen ble fjernet. Deres dominerende lokalisering ble observert i modiolus av Corti-organet, justert i en retning som ligner på nervefibrene. Noen MSCer ble imidlertid lokalisert i limbussområdet og viste en horisontalt langstrakt form. I tillegg ble migrasjon til hårcelleområdet økt, og morfologien til MSCene endret seg til ulike former etter kanamycinbehandling. Til slutt indikerer resultatene av denne studien at kokulturen av MSC med cochlea epitel vil være nyttig for utvikling av terapeutiske behandlinger via celletransplantasjon og for studier av celleregenerering som kan undersøke ulike forhold og faktorer.
Introduction
Hørselstap kan forekomme medfødt eller kan forårsakes gradvis av flere faktorer, inkludert aldring, narkotika og støy. Hørselstap er ofte vanskelig å behandle fordi det er svært utfordrende å gjenopprette nedsatt funksjon når hårcellene som er ansvarlige for hørselen er skadet1. Ifølge Verdens helseorganisasjon anslås 461 millioner mennesker over hele verden å ha hørselstap, noe som utgjør 6,1% av verdens befolkning. Av dem med hørselstap er 93 % voksne, og 7 % er barn.
En rekke tilnærminger har blitt forsøkt behandlet med hørselstap; spesielt har en regenereringstilnærming ved hjelp av MSC dukket opp som en lovende behandling. Når vev er skadet, slippes MSC naturlig ut i sirkulasjonssystemet og migrerer til skadestedet der de skiller ut ulike molekyler for å danne et mikromiljø som fremmer regenerering2. Derfor er det viktig å utvikle en metode for å behandle skadede vev gjennom migrering av eksternt implanterte MSCer for å målrette organer og deres etterfølgende sekresjon av molekyler som forårsaker potent immunregulering, angiogenese og anti-apoptose for å forbedre restaureringen av skadet cellefunksjon3,4,5.
Homing prosessen der MSCs migrerer til skadet vev kan være det viktigste hinderet å overvinne. MSCer har en systemisk homing-mekanisme med sekvensielle trinn for tethering/valsing, aktivering, arrestasjon, transmigrasjon/diapedese og migrering6,7,8. For tiden arbeides det med å identifisere måter å forbedre disse trinnene på. Ulike strategier, inkludert genetisk modifikasjon, celleoverflateteknikk, in vitro-grunning og magnetisk veiledning, er testet6,7. I tillegg er det gjort flere forsøk på å fremme beskyttelse og regenerering av auditive hårceller ved å homing MSCs til stedet for skadet cochlea. Sporing av MSCer in vivo er imidlertid tidkrevende og arbeidskrevende og krever svært spesialiserte ferdigheter9.
For å løse dette problemet ble det utviklet en metode for å observere homing av MSCer i cochlea gjennom tidsforløp konfokal mikroskopi som fotograferer migrering av celler over flere timer (Figur 1). Den ble utviklet tidlig på 1900-tallet og har nylig blitt et kraftig verktøy for å studere migrasjon av spesifikke celler.
Figur 1: Grafisk abstrakt. (A) Etter at det dissekerte organet til Corti er festet på en plastdekslelip ved hjelp av tang, plasseres dekslene på en 35 mm glassbunnet konfokal mikroskopisk tallerken, og (B) glasssylinderen er plassert. (C) Etter at du har fylt innsiden av glasssylinderen med middels, legges GFP-merkede MSCer med medium forsiktig utenfor sylinderen (D) GFP-merkede MSCer med medium. (E) Etter inkubasjon over natten, (F) fjernes glasssylinderen, og bilder tas med et konfokalt mikroskop. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSC = mesenchymale stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forskningsprotokoller som involverer ICR-mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Yonsei University ved Wonju College of Medicine. Eksperimenter ble utført i henhold til Verdens medisinske forenings etiske retningslinjer. I denne protokollen ble gravide ICR-mus holdt i en 12/12 t lys / mørk syklus med fri tilgang til mat og vann.
1. Cochlea disseksjon
- Steriliser laminærstrømningsvevskulturhetten ved å slå på ultrafiolett lys i ~ 30 min, og spray alle overflater med 70% etanol før bruk. La overflatene tørke.
- Plasser disseksjonsinstrumentene i 70% etanol i 10 min, og tørk før bruk.
- Bruk et operasjonsblad til å halshugge postnatale 3-4 daggamle mus (figur 2A).
- Plasser skallen under et stereomikroskop i laminær strømningshette, og suge vevet i 70% etanol.
- Bløtlegg raskt vevet i vevs disseksjonsløsning (1x Hanks balanserte saltløsning, 1 mM HEPES) for å fjerne etanol.
- Klipp midtlinjen på skallen med et kirurgisk blad (Figur 2B,C).
- Utsett skallen ved å trekke ned huden fremre og kutte den ytre hørbare kanalen på øret (Figur 2D).
- Klipp fra fremre til bakre del av kraniet over øyelinjen (Figur 2E).
- Åpne skallen og fjern forebrain, cerebellum og hjernestamme med stumpe tang (Figur 2F,G).
- Bruk mikro tang, separer cochlea fra temporalbenet (Figur 2H).
- Overfør cochlea til en Petri-tallerken som inneholder vevs disseksjonsløsning.
- Disseker forsiktig alle cochlea otic kapsel, slik at bare det indre cochlea bløtvevet (Figur 2I,J).
- Hold modiolusen til cochleaen med tang og cochleakanalen med et annet par tang, og skill sakte de to vevene (Figur 2K).
- Fjern stria vascularis og tectorial membran ved å forsiktig skrelle dem bort (Figur 2L,M).
- Legg en sterilisert plastdekslerlip i ny vevs disseksjonsløsning, og plasser deretter Cortis organ på en deksleslip på 9 mm diameter, og pass på at basilarmembranen vender nedover (Figur 2N-P).
- Immobiliser vevet ved å trykke reissnermembranen og det gjenværende modiolusvevet på dekslene med tang (Figur 2N-P).
- Overfør dekslene med det innebygde vevet til midten av en konfokal tallerken med en diameter på 35 mm.
- Legg glasskloningssylinderen på parabolen, med cochlea eksplanten plassert i midten av parabolen, og tilsett 100 μL explantkulturmedium (DMEM/F12, 10% foster bovint serum (FBS), 1% N2 supplement, ampicillin (10 μg/ml))10 inne i sylinderen (Figur 2Q).
- Plate 5 × 103 celler med musebenmarg-avledet grønt fluorescerende protein (GFP)-merket MSC i 2 ml kulturmedium (45% DMEM + 45% DMEM / F12, 10% FBS, 1% N2 supplement, 10 μg / ml ampicillin) utenfor glasssylinderen (Figur 2R).
- Når MSC-ene er 80-90% konfluente, passerer du dem ved å løsne dem med trypsin-etylendiamintetraacetisk syre.
- Overfør forsiktig den konfokale retten til en fuktet inkubator og inkuber over natten ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære.
- Aspirer alt medium inne og utenfor sylinderen, og fjern deretter glasssylinderen fra den konfokale parabolen.
- Tilsett 2 ml ferskt kulturmedium til den konfokale parabolen, og inkuber vevskulturretten i en fuktet inkubator til den er klar til analyse.
Figur 2. Disseksjon av en mus cochlea og kokultur av organet i Corti og MSCs. (A) Halshugging av mus, (B) og (C) midtlinje sagittal disseksjon av hodet, (D) og (E) coronal disseksjon av hjernen, (F) og (G) fjerning av hjernen og temporal bein, (H) cochlea, (I) fjerning av benet cochleaveggen, (J) isolasjon av cochlea, (K) separasjon av cochleakanalen fra modiolus, (L) separasjon av stria vaskulær (SV) og spiral ligament (SL) fra organet i Corti, (M) fjerning av tectorialmembranen, (N-P) fiksering av cochlea på en plastdeksel slip, (Q) plassering av dekslerlip og glass sylinder i konfokal parabolen, (R) inokulering av MSCs. Hvit skala bar (A-E) = 1 cm; oransje (F, G, P) og gul skalalinje (H,I) = 1 mm; grønn skala bar (J-O) = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Bilde av tidsforløp
- For forsøkene som presenteres her, bruk et konfokalt mikroskopisystem med et trinn topp inkubatorsystem.
- Slå på det konfiskeringsmikroskopet, lysstoffrør og datamaskin.
- Sett betingelsene for scene-topp inkubatoren plassert på scenen av det konfektmikroskopet til 37 °C og 5 % CO2-atmosfære.
- Plasser prøvefatet på festebeholderen, dekk med festelokket til parabolen, og lukk kammeret med det øverste varmelokket.
- Juster zoom og fokus for å lokalisere organet til Corti og MSCer innen synsfeltet.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren. Under lokaliseringsalternativet velger du et målsetting for 20x Plan-Apochromat (numerisk blenderåpning 0,8) og et beskjæringsområde på 0,5x.
- Under Anskaffelseklikker du smart oppsett og velger EGFP.
- Åpne kanalfanen under Anskaffelse, og sett lasereffekten til 0,2 %, hullhullet til 44 μm, hovedgevinsten til 750 Vog den digitale gevinsten til 1,0.
- Klikk på ESID under bildeoppsett, og sett ESID-forsterkningen til 4 og den digitale gevinsten til 7,5.
- Klikk på Fliser og stake for å produsere 210 fliser.
- Åpne Fokusstrategi , og velg fokusmodus.
- Under tidsseriersetter du varigheten til 24 timer og intervallet til 10 min.
- Under Anskaffelsesetter du rammestørrelsen til 512 x 512 piksler, skannehastigheten til 8, retningen til toveis, gjennomsnittet til 4xog bitene per piksel til 16.
- Klikk på starteksperimentet for å starte eksperimentet.
3. Endring av bildefil
- Under behandlingklikker du på søm, og setter det minimale overlegget til 5 % og det maksimale skiftet til 10 %.
- Klikk filmeksport, sett ukomprimert, og sett hastigheten til 7.5.
4. Immunstaining
- Aspirer mediet forsiktig, og vask prøven to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) i 5 min.
- Fest prøven med 4% formalin i PBS i 15 min, og vask prøven 3 ganger med PBS i 5 minutter.
- Permeabiliser prøven i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 min, og vask 3 ganger med PBS i 5 minutter.
- Tilsett 250 μL falloidin-iFluor 647 reagens (1:1000 fortynning i PBS), og inkuber prøven i 1 time ved romtemperatur på shakeren.
- Vask prøven 3 ganger med PBS i 5 min.
- Overfør dekslene på glasssklie, og tilsett 2 dråper monteringsløsning.
- Plasser en deksleslip på lysbildet forsiktig.
- Forsegle dekslene med klar neglelakk og oppbevar ved 4 °C i mørket til cellene blir observert.
- Bilde lysbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop med et passende filter ved eksitasjon/utslipp (Ex/Em)=650/665 nm for falloidin og ved Ex/Em=488/507 nm for EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-migrering av MSCer i tredimensjonal modus er vurdert av et Transwell-system eller ved den tradisjonelle sårhelingsmetoden for å observere migrasjon i todimensjonal modus (2D)11. Organet i Corti er en kompleks struktur som består av ulike celler som Boettcher-celler, Claudius-celler, Deiters-celler, søyleceller, Hensens celler, ytre hårceller, indre hårceller, nervefibre, basilarmembran og retikululær lamina12. Når MSC-er transplanteres i vev som består av slike komplekse celler, er bruk av teknologi for å fastslå hvor celler rekrutteres og stabiliseres avgjørende for å forstå mekanismen for celleterapi og regenerering ved hjelp av MSCer. I tillegg, for å bestemme hvordan MSCer er lokalisert i nærvær eller fravær av skade, er en 2D-metode som en sårhelingsmetode mer egnet enn et Transwell-system der celler beveger seg tilfeldig nedover i en retning.
I denne studien ble den todimensjonale banen til MSCer sporet i en sårhelingsmetode ved ganske enkelt å bruke en glasssylinder som en barriere mellom MSC-ene og organet i Corti og fjerne sylinderen etter at MSCene er festet. Da Corti-organet ble dyrket, vokste fibroblaster veldig raskt utover fra de ytre hårcellene som er tilstede i det ytterste laget (Figur 3, Video 1). Derfor så de fleste GFP-merkede MSCer ut til å bli presset ut av raskt voksende fibroblaster (Video 1). Likevel trengte noen GFP-merkede MSCer inn i laget av fibroblaster og migrerte vellykket til cortiorganet (figur 3, video 1).
Figur 3. Konfiskert bilde av organet til Corti og GFP-merkede MSCer. Etter fjerning av glasssylinderen og ytterligere 4 timers inkubasjon ble det utført fiksering og farging. Skalalinje =100 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSCer: mesenchymale stamceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Tidsforløp konfektmikroskopi av orgelet til Corti og GFP-merkede MSCer. Etter fjerning av glasssylinderen og ytterligere 4 timers inkubasjon ble det utført fiksering og farging. Skalalinje =100 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; MSCer: mesenchymale stamceller. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Resultatene fra 72 h inkubasjon viste at MSCer migrerte til Corti-organet og hovedsakelig ble lokalisert i modiolus og området der cochlear nervefibrene skilt fra modiolus ble samlet; MORfologien til MSC-ene ble endret til en radial form som ligner på nervefibre (figur 4B). Interessant nok ble celler forvandlet til en lineær form langs limbuslinjen i stedet for hårcelleområdet (Figur 4E, se pil). Selv om de apikale og basale endene av Corti-organet ble kombinert for å forhindre at MSCene beveget seg til medialsiden av basilarmembranen, var MSCer i stand til å migrere og vokse i nervefiberoppsamlingsområdet ved å trenge inn i de forskjellige cellelagene og fysiske barrierer (Figur 4E). Når skade på hårceller ble indusert ved behandling med 1 mM kanamycin i 16 timer, og cellene ble dyrket i ytterligere 72 timer etter fjerning av kanamycin, ble MSCer lokalisert ikke bare i modiolus, men også i de ytre hårcellene (Figur 4C,D).
Figur 4. Confocal bilder av orgelet til Corti og GFP-merkede MSCer. (A) Etter fjerning av glasssylinderen og ytterligere 16 timers inkubasjon ble det tatt et bilde etter fiksering og farging. Skalalinjen =200 μm. (B) MSCer ble hovedsakelig fordelt i modiolusområdet, skalalinjen =20 μm. Etter fjerning av glasssylinderen fra parabolen ble cellene ytterligere inkubert med 1,0 mM kanamycin i 16 timer, dyrket med kanamycinfritt medium i 72 timer, og deretter festet og farget. Bilder av (C) ytre hårcelleområde, skala bar = 20 μm; (D) modiolus område, skala bar = 50 μm; og (E) hel cochlea, skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disse resultatene indikerer at det eksperimentelle systemet som er demonstrert i denne studien, vil være et nyttig testverktøy for å utvikle celleterapeutiske strategier ved hjelp av MSC og kan brukes spesielt for å studere hørselstap forårsaket av ulike faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantasjon av MSC til skadede steder for å fremme regenerering av skadede celler har blitt grundig studert, og den terapeutiske effekten er tydelig. Transplantasjonen og påfølgende differensiering av MSC er rapportert å gjenopprette hørsel hos rotter med hørselstap indusert av 3-nitropropioninsyre13. Selv om Lee et al. anvendte MSCer på mennesker trans-venøst, oppnådde de ingen signifikant forbedring ihørselen 14. Inntil nylig ble nesten 12 eksperimenter utført for å gjenopprette hørselen i gnagermodellen ved MSC-transplantasjon. Selv om resultatet er noe uklart på grunn av heterogenitet, er det en viss indikasjon på at MSCer kan fremme hørsel.
Ulike vekstfaktorer og kjemokiner relatert til kjemoattraksjon er involvert i migrering av transplanterte stamceller til skadede områder, uavhengig av heterogenitet eller homogenitet15. Kjemokiner er viktige regulatorer for cellemigrasjon for vev homeostase, immunresponser og sårheling. Kjemokinindusert kjemoattraction in vivo fungerer kanskje ikke på samme måte som det gjør in vitro på grunn av forskjellene mellom in vivo og in vitro eksperimentelle forhold. Selv om in vitro eksperimentelle forhold har sine egne begrensninger, er det svært vanskelig å gjennomføre in vivo-studier for å fremme effektiv migrasjon, rekruttering og regenerering av celle16.
Selv om sporing av MSC transplantert for hørselsrestaurering er viktig i regenerativ medisinforskning, er in vivo-eksperimenter, spesielt de som involverer hørsel, arbeidskrevende i de fleste tilfeller og er derfor ekstremt vanskelige å utføre med store utvalgsstørrelser. Derfor er homogeniteten til resultatene lav, og skjevheten er alvorlig. Derfor vil det være effektivt å først studere slike migrasjonsbaserte hendelser under in vitro-forhold. De fleste in vitro-studier på cellemigrasjon har blitt utført ved hjelp av Transwell eller sårhelingsmetoder.
En myntkubasjonsmetode for å forklare cochlea med MSCer ble etablert for å spore de migrerende stamcellene, som gjenkjenner skadesteder og beveger seg mot dem. De fleste studier har brukt en metode for å feste et organ av Corti på glassdeksler belagt med β-mercaptoetanol etter utvisning. Selv om den samme metoden ble brukt her, var det vanskelig å undersøke vevet fordi de ofte løsnet eller rullet opp fra dekslet. Derfor ble det utført en ny studie for å gjøre det lettere å overvåke vevet. Først ble et organ av Corti plassert på en plastdekslerlip, og deretter ble vevet immobilisert på dekslene ved å trykke på den gjenværende delen av Reissners membran generert under disseksjonen ved hjelp av tang.
Dette gjorde det mulig for den stabile tilknytningen av Corti-organet til dekslene slik at et bilde kunne oppnås vellykket ved konfektmikroskopi. Selv om vevskulturmetoden som presenteres her er en billig og tidsbesparende, tar utviklingen av ferdighet i disseksjon litt tid. Kjente vevskulturmetoder inkluderer vedlegg av vevet ved å belegge dekslene med poly-L-ornitin og laminin16; påføring av organotypiske cellekulturinnlegg som ikke krever lim ellerbeleggmaterialer 17, og dermed eliminerer behovet for limstoffer, noe som reduserer utvisende skade; og bruke et vevslim sammensatt av proteiner ekstrahert fra marine blåskjell10. Denne protokollen krever verken beleggmaterialer eller organotypiske membraner eller vevslim; en billig plastdekslerlip er tilstrekkelig. Bedre bilder kan skaffes hvis et område på 8 mm x 8 mm vurderes sammen med en Z-stabel av vevstykkelsen til Corti-organet. Tatt i betraktning den enorme mengden data som skal lagres og riktig tid for tidsforløp, ble bilder av hele cellebevegelser anskaffet, med fokus på MSC-ene i stedet for Cortis organ.
Resultatene vist i figur 4 ser ut til å antyde at både organet til Corti og MSC kan visualiseres som klare videobilder når bildene som tas er 2 mm lange, og Z-stakken kombineres med et tidsforløp. Her, selv om et samkultureksperiment ble utført med MSCer og en utvisning, kan denne innstillingen brukes på forskjellige celletyper eller betingelser for fremtidige studier. For eksempel vil det bidra til å bruke denne protokollen for å undersøke effekten av narkotika eller eksosomer som beskytter skaden av cochlea. Embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller (iPSCer) kan funksjonelt og morfologisk regenerere til mekanosensitive hårcellelignende celler18. Derfor kan denne protokollen brukes til å studere differensiering av iPSCer eller ESCer i auditive hårceller eller støtteceller. Denne ex vivo-metoden kan hjelpe til med regenerativ medisin for å gjenopprette hørselen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) fra National Research Foundation (NRF) i Korea og Hallym University Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L.
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
