コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

Summary

本研究では、共焦点顕微鏡を用いて、コルチの器官を含む人工内皮上皮を用いてex vivoインキュベーションによって損傷組織に向かって移動する細胞を観察するリアルタイムイメージング法を提示する。

Abstract

間葉系幹細胞(MCs)が細胞再生および治療に及ぼす影響を調べ、人工内皮との共培養後のMSC移行および形態学的変化を追跡する。コルティの器官は、解剖中に発生したライスナーの膜の一部を押すことによってプラスチックカバースリップに固定化された。ガラスシリンダーで閉じ込められたMSCは、シリンダーが取り外されたときに人工内皮上皮に移行した。彼らの主な局在は、コルチの器官の透析で観察され、神経線維と同様の方向に整列した。しかし、いくつかのMSCは、手足の領域に局在し、水平に細長い形状を示した。また、毛細胞領域への移動が増加し、カナマイシン処理後にMSCの形態が様々な形態に変化した。結論として、この研究の結果は、人工内皮とのMSCの共培養が細胞移植による治療薬の開発および様々な条件および要因を調べることができる細胞再生の研究に有用であることを示している。

Introduction

難聴は先天的に起こり得るか、加齢、薬物、騒音を含むいくつかの要因によって徐々に引き起こされる可能性がある。難聴は、聴力を担う毛細胞が損傷した後に機能障害を回復することは非常に困難であるため、しばしば治療が困難^である。世界保健機関(WHO)によると、世界の4億6,100万人が難聴と推定されており、これは世界人口の6.1%を占めています。難聴者のうち93%が成人で、7%が子供です。

多くのアプローチは、難聴を治療するために試みられてきた;特に、MSCを用いた再生アプローチが有望な治療法として登場している。組織が損傷すると、MSCは循環系に自然に放出され、損傷部位に移動し、そこで様々な分子を分泌して再生を促進する微小環境を形成する^2。したがって、外部移植されたMSCを標的とする臓器への移行と、強力な免疫調節、血管新生、および抗アポトーシスを引き起こす分子のその後の分泌を通じて損傷した組織を治療する方法を開発することが重要であり、損傷した^{細胞機能3、4、5}の回復を強化する。

MSCが損傷した組織に移行するホーミングプロセスは、克服すべき最も重要な障害である可能性があります。MSCには、テザリング/ローリング、活性化、逮捕、トランスマイグレーション/ダイアペデス、および移行^6、7、8の順次ステップを備えた全身ホーミングメカニズムがあります。現在、これらのステップを改善する方法を特定するための取り組みが進行中です。遺伝子組み換え、細胞表面工学、インビトロプライミング、磁気誘導など、さまざまな戦略が^6,7で試験されています。さらに、損傷した人工内毛部位にMSCをホーミングすることにより、聴覚毛細胞の保護と再生を促進するためにいくつかの試みがなされている。しかし、インビボでのMSCの追跡は時間と労力を要し、高度に専門的なスキルを必要と^{します 9}.

この問題を解決するために、数時間にわたって細胞の移動を撮影するタイムラプス共焦点顕微鏡を介して、内腔内のMSCのホーミングを観察する方法が開発された(図1)。それは20^世紀 初めに開発され、最近特定の細胞の移動を研究するための強力なツールとなっています。

図1:図1:(A)コルティの解剖された器官が鉗子を用いてプラスチックカバースリップに付着した後、カバースリップは35mmガラス底の共焦点顕微鏡皿に置かれ、(B)ガラスシリンダーが配置される。(C)ガラスシリンダーの内部を媒体で充填した後、(D)GFPラベル付きMSCを媒体で慎重にシリンダーの外に追加する。(E)一晩のインキュベーション後、ガラスシリンダーを取り外し、画像を共焦点顕微鏡で撮影する。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC = 間葉系幹細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

ICRマウスを含むすべての研究プロトコルは、元州医科大学延世大学の施設動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験は世界医師会倫理規定に従って行われた。このプロトコルでは、妊娠中のICRマウスを12/12時間の明暗サイクルに保ち、食物および水に自由にアクセスした。

1. コクリー解剖

1. 紫外線を30分間オンにして層流組織培養フードを殺菌し、使用前に70%エタノールで全ての表面をスプレーします。表面を乾かします。
2. 解剖器を70%エタノールに10分間入れ、使用する前に乾燥させます。
3. 手術用ブレードを使用して、出生後3-4日齢のマウスの首を切り落とします(図2A)。
4. 頭蓋骨を層流フードの実体顕微鏡の下に置き、組織を70%エタノールに浸します。
5. 組織を組織解剖液(1xハンクスバランス塩溶液、1 mM HEPES)に素早く浸し、エタノールを除去する。
6. 外科用ブレードで頭蓋骨の中心線を切る(図2B、C)。
7. 皮膚を前から引き下げ、耳の外耳道を切断して頭蓋骨を露出させる(図2D)。
8. 眼線を横切って頭蓋骨の前部から後部に切り取る(図2E)。
9. 頭蓋骨を開き、前脳、小脳、脳幹を鈍い鉗子で取り除く(図2F、G)。
10. マイクロ鉗子を用いて、側頭骨から内耳を分離する(図2H)。
11. 組織解離液を含むペトリ皿にコクリーを移します。
12. 内の人工内軟組織のみを残して、すべての人工内臓のオティックカプセルを慎重に解剖する(図2I、J)。
13. 鉗子と別の鉗子のペアで人工内耳管の変化を保持し、ゆっくりと2つの組織を分離する(図2K)。
14. ストリア血管症とテクトリアル膜を静かに剥がして取り除く(図2L、M)。
15. 新しい組織解剖液に殺菌プラスチックカバースリップを入れ、コルティの器官を直径9mmのカバースリップに置き、バジラー膜が下向きであることを確認する(図2N-P)。
16. Reissnerの膜と残りの変形組織を鉗子でカバースリップに押し込んで組織を固定化する(図2N-P)。
17. 埋め込みティッシュのカバースリップを直径35mmの共焦点皿の中心に移す。
18. 皿の中央に位置する人工内草を持つガラスクローニングシリンダーを皿の上に置き、100 μLの外植培養培地(DMEM/F12、10%胎児血清(FBS)、1%N2サプリメント、アンピシリン(10μg/mL))をシリンダー内に¹⁰を加える(図2Q)。
19. プレート5×マウス骨髄由来緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きMSPの10^細胞を2mLの培養培地(45%DMEM+ 45%DMEM/F12、10%FBS、1%N2サプリメント、アンピシリン10μg/mL)の外ガラスシリンダー外(図2R)
    1. MSCが80〜90%コンフルエントである場合、トリプシンエチレンジアミンテトラ酢酸でそれらを取り外すことによってそれらを通過させる。
20. コンフォーカルディッシュを加湿インキュベーターに慎重に移し、5%CO2雰囲気で37°Cで一晩インキュベートします。
21. すべての媒体をシリンダーの内側と外側に吸い込み、ガラスシリンダーをコンフォーカル皿から取り外します。
22. 共焦点皿に2mLの新鮮な培養培地を加え、分析の準備ができるまで加湿インキュベーターで組織培養皿をインキュベートする。

図 2.マウスの内臓の解剖とコルチとMSCの器官の共培養.(A)マウスの切断、 (B) および (C) 頭部の中線矢頭解剖、 (D) および (E) 脳の角膜解剖、 (F) および (G) 脳と側頭骨の除去、 (H) 人工内壁の除去、 ( H)骨内壁の除去、 (J)人工内骨の分離、 ( (L) コルチの器官からのストリア血管症 (SV) とスパイラル靭帯 (SL) の分離、 (M) プレート膜の除去、 (N-P) プラスチックカバースリップ上の内骨膜の固定、(Q) コンフォーカルディッシュにおけるカバースリップとガラスシリンダーの位置、 (R) 白スケールバー (A-Ecm = 1)オレンジ(F、G、P)と黄色のスケールバー(H、I)=1mm;緑色のスケールバー(J-O)=0.5 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. タイムラプスイメージング

1. ここで示す実験では、ステージトップインキュベーターシステムを備えた共焦点顕微鏡システムを使用してください。
2. 共焦点顕微鏡、蛍光灯、コンピュータの電源を入れます。
3. 共焦点顕微鏡のステージ上に配置したステージトップインキュベーターの条件を37°C、5%CO2雰囲気に設定します。
4. 皿の固定容器の上にサンプル皿を置き、皿の固定蓋で覆い、上ヒーターの蓋でチャンバーを閉じます。
5. 視野のコルティとMSCの器官を局地化するためにズームとフォーカスを調整します。
6. 画像処理ソフトウェアを開きます。 [位置指定 ]オプションで 、20x Plan-Apochromat の目的(0.8 の数値) と 0.5x トリミング領域を選択します。
7. [ 取得] で スマート セットアップ をクリックし 、[EGFP]を選択します。
8. [取得] の下のチャネルタブを開き、レーザーパワーを0.2% に、ピンホールを44 μmに、マスター ゲインを750 Vに、デジタルゲインを1.0に設定します。
9. イメージング設定の下の[ESID]をクリックし、ESIDゲインを4に、デジタルゲインを7.5に設定します。
10. 210タイルを生成するためにタイルとステークをクリックしてください。
11. フォーカス戦略を開き、フォーカスモードを選択します。
12. [ 時系列] で、 期間 を 24 時間 、 間隔 を 10 分に設定します。
13. [取得] で、フレーム サイズを512 x 512 ピクセル、スキャン速度を8ピクセル、方向を双方向に設定し、平均を4倍に設定し、ピクセルあたりのビット数を16に設定します。
14. 実験を 開始 するをクリックして実験を開始します。

3. 画像ファイルの変更

1. [ 処理] で [ ステッチ] をクリックし、 最小オーバーレイ を 5% に設定し、 最大シフト を 10%に設定します。
2. [ ムービーのエクスポート] をクリックし、 非圧縮に設定し、 速度 を 7.5に設定します。

4. 免疫染色

1. 培地を慎重に吸引し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)でサンプルを5分間洗浄します。
2. サンプルをPBSで4%ホルマリンで15分間固定し、サンプルをPBSで3回5分間洗浄します。
3. PBSで0.1%トリトンX-100でサンプルを10分間透過し、PBSで3回5分間洗浄します。
4. 250 μLのファロイジン-iFluor 647試薬(PBSで1:1000希釈)を加え、シェーカーの室温でサンプルを1時間インキュベートします。
5. サンプルをPBSで3回5分間洗います。
6. カバースリップをガラススライドに移し、2滴の取り付け溶液を追加します。
7. スライドにカバースリップをそっと置きます。
8. 透明なマニキュアでカバースリップを密封し、細胞が観察されるまで暗闇の中で4°Cで保管してください。
9. 励起/放出(Ex/Em)=650/665 nmのファロイジンおよびEGFPのEx/Em=488/507 nmで、適切なフィルターを備えた共焦点顕微鏡を使用してスライドをイメージします。

Representative Results

3次元モードにおけるMSCのインビトロ移行は、トランスウェルシステムまたは従来の創傷治癒法によって評価され、2次元(2D)モード¹¹での移動を観察する。コルティの器官は、ボエッチャー細胞、クラウディウス細胞、Deiters細胞、ピラー細胞、ヘンセン細胞、外毛細胞、内毛細胞、神経線維、バジル膜、および網状層層などの様々な細胞から構成される複雑な^{構造である。}このような複雑な細胞で構成される組織にMSCを移植する場合、細胞がどこでリクルートされ、安定されているかを確かめる技術を使用することは、MSCを用いた細胞療法と再生のメカニズムを理解する上で極めて重要です。また、MSCが損傷の有無に局在する方法を決定するために、創傷治癒法のような2D法は、細胞が一方向にランダムに下方に移動するトランスウェルシステムよりも適している。

本研究では、MSCとコルチの器官との間の障壁としてガラスシリンダーを使用し、MSCが取り付けられた後にシリンダーを取り除くことによって、MSCの2次元経路を創傷治癒法で追跡した。コルティの器官が培養されると、線維芽細胞は最外層に存在する外毛細胞から非常に迅速に外側に成長した(図3、ビデオ1)。したがって、ほとんどのGFPラベル付きMSCは、急速に成長している線維芽細胞によって押し出されているように見えました(ビデオ1)。それにもかかわらず、いくつかのGFP標識されたMSCは線維芽細胞の層を貫通し、正常にコルティの器官に移動した(図3、ビデオ1)。

図 3.コルチとGFP標識のMSCの器官の共焦点像。 ガラスシリンダーの除去後、さらに4時間のインキュベーションを行い、固定および染色を行った。スケールバー =100 μm。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC:間葉系幹細胞。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:コルチとGFP標識されたMSCの器官のタイムラプス共焦点顕微鏡。ガラスシリンダーの除去後、さらに4時間のインキュベーションを行い、固定および染色を行った。スケールバー =100 μm。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;MSC:間葉系幹細胞。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

72時間のインキュベーションの結果、MSCはコルチの器官に移行し、主にモデオラスと、モデオレウスから分離された人工内神経線維が集まった領域に局在していた。MSCの形態は神経線維と同様の放射状に変化した(図4B)。興味深いことに、細胞は、毛細胞領域ではなく、手足の線に沿って直線状に変形した(図4E、矢印参照)。コルティの器官の先端と基礎端を組み合わせて、MSCがバジル膜の内側側に移動するのを防ぐが、MSCは様々な細胞層と物理的障壁を貫通することによって神経線維採取領域内で移動し成長することができた(図4E)。1mMカナマイシンを16時間処理して毛髪細胞への損傷を誘発した場合、カナマイシンを除去した後に更に72時間培養した細胞を、MCは、モデオラスだけでなく外毛細胞にも局在した(図4C、D)。

図 4.コルチとGFPラベル付きMSCの器官の共焦点画像。(A)ガラスシリンダーの取り外しと16時間のインキュベーションを加えた後、固定と染色後に画像を撮影した。スケールバー =200 μm(B)MSC は主に、スケールバー =20 μm のモディオーラス領域に分布していました。皿からガラスシリンダーを除去した後、細胞をさらに1.0 mMカナマイシンで16時間培養し、72時間カナマイシンフリー培地で培養し、次いで固定して染色した。(C)外髪細胞領域の画像、スケールバー=20μm;(D)の透析領域、スケールバー=50 μm;そして(E)全体の内痛、スケールバー=100 μm。この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。

これらの結果は、この研究で実証された実験システムが、MSCを用いた細胞治療戦略を開発するための有用な試験ツールとなり、様々な要因によって引き起こされる難聴を研究するために具体的に適用できることを示している。

Discussion

損傷した細胞の再生を促進するために、損傷部位へのMSCの移植が広範囲に研究されており、治療効果が明らかである。移植とその後のMCの分化は、3-ニトロプロピオン酸¹³によって誘発される難聴を有するラットの聴力を回復させることが報告されている。Leeらはヒトに対してMSCをトランスベンで適用したが、彼らは聴覚¹⁴において有意な改善を達成しなかった。最近まで、MSC移植によるげっ歯類モデルの聴覚を回復させるために、ほぼ12の実験が行われました。結果は異質性のためにやや不明であるが、MSCが聴覚を促進することができるといういくつかの兆候がある。

化学吸引に関連する様々な成長因子およびケモカインは、異質性または均質性¹⁵に関係なく、損傷した領域への移植幹細胞の移動に関与している。ケモカインは、組織ホメオスタシス、免疫応答、創傷治癒のための細胞移動の主要な調節因子です。生体内のケモカイン誘導化学引力は、インビボとインビトロの実験条件の違いのために、インビトロと同じように動作しない可能性があります。インビトロ実験条件には独自の制限があるが、細胞¹⁶の効率的な移動、採用、再生を促進するために生体内研究を行うことは非常に困難である。

再生医療研究では、再生医療のために移植されたMSCの追跡は重要ですが、生体内実験、特に聴覚を伴う実験は、ほとんどの場合、労働集約的であり、したがって、大きなサンプルサイズで行うことは非常に困難です。したがって、結果の均質性は低く、偏りは厳しいです。したがって、まず、インビトロ条件下でこのような移行ベースのイベントを研究することが効率的であろう。細胞の移動に関するほとんどのインビトロ研究は、トランスウェルまたは創傷治癒方法を使用して行われてきた。

人工内生をMCsで外植するコインキュベーション法を確立し、傷害部位を認識してそれらに向かって移動する移動幹細胞を追跡しました。ほとんどの研究は、排泄後にβメルカプトエタノールでコーティングされたガラスカバーリップにコルティの器官を取り付ける方法を使用しています。ここでも同じ方法を使用しましたが、カバースリップから切り離されたり巻き上げたりすることが多いため、組織を調べるのが難しかったです。したがって、組織を監視しやすくするために新しい試験が行われました。まず、コルティの器官をプラスチックカバースリップに置き、次に鉗子を使用して解剖中に発生したライスナーの膜の残りの部分を押して、組織をカバースリップに固定化した。

これにより、コルティの器官がカバースリップに安定して付着し、共焦点顕微鏡で画像を正常に取得することができました。ここで提示される組織培養法は安価で時間の節約であるが、解剖の習熟度の発達には時間がかかる。既知の組織培養方法は、ポリ-L-オルニチンおよびラミニン¹⁶でカバースリップをコーティングすることにより組織の付着を含む;接着剤やコーティング材料^を 必要としないorganotypic細胞培養挿入物を適用すると、粘着物質の必要性が排除され、外植の損傷が減少する。そして、海洋ムール貝¹⁰から抽出されたタンパク質から構成される組織接着剤を使用する。このプロトコルは、コーティング材料も組織性膜も組織接着剤も必要としません。安価なプラスチックカバースリップで十分です。8 mm x 8 mm の領域がコルティの器官の組織の厚さの Z スタックと一緒に考慮される場合、より良い画像を取得できます。膨大な量のデータが保存され、タイムラプスの適切な時間を考慮すると、細胞全体の動きの画像が取得され、コルティの器官の代わりにMSCに焦点を当てた。

図4に示す結果は、撮影した画像の長さ2mmの場合、コルティとMSCの両方の器官を鮮明な映像画像として可視化し、Zスタックをタイムラプスと組み合わせることが可能であることを示唆しているようです。ここでは、MSCと外植で共培養実験を行ったが、この設定は、将来の研究のために異なる細胞の種類または条件に適用することができる。例えば, それは、コクリーの損傷を保護する薬物やエキソソームの効果を調べるために、このプロトコルを適用するのに役立ちます.胚性幹細胞(ESC)または誘導多能性幹細胞(iPSC)は、機能的および形態学的にメカノイ感受性の毛細胞様細胞¹⁸に再生することができる。したがって、このプロトコルは、iPSCまたはESCの聴覚ヘアセルまたはサポートセルへの分化を研究するために適用することができます。このex vivo法は、再生医療で聴覚を回復するのに役立つ可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X PBS Buffer	GenDEPOT	P2100-104
4% Formalin	T&I	BPP-9004
Ampicillin	sigma	A5354-10ml
BSA	sigma	A4503-100G
confocal dish	SPL	200350
confocal microscope	ZEISS	LSM800
coverslip	SPL	20009
DMEM/F12	Gibco	10565-018
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher scientific	16140071
Fluorsheild with DAPI	sigma	F6057
Forcep	Dumont	0508-L5-P0
HBSS	Thermo Fisher scientific	14065056
HEPES	Thermo Fisher scientific	15630080
N2 supplement	Gibco	17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reagent	abcam	ab176759
Stage Top Incubator	TOKAI HIT	WELSX
Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP	cyagen	MUBMX-01101
Triton X-100	sigma	T8787