Summary
इस अध्ययन में, हम कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक वास्तविक समय इमेजिंग विधि प्रस्तुत करते हैं ताकि पूर्व वीवो इनक्यूबेशन द्वारा कॉर्टी के अंग वाले कॉकलियर एपिथेलियम के साथ क्षतिग्रस्त ऊतकों की ओर बढ़ने वाली कोशिकाओं का निरीक्षण किया जा सके।
Abstract
सेल पुनर्जनन और उपचार पर मेसेंचिमल स्टेम सेल (एमएससी) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, यह विधि कॉकलियर एपिथेलियम के साथ सह-संस्कृति के बाद एमएससी माइग्रेशन और रूपात्मक परिवर्तनों को ट्रैक करती है। कॉर्टी के अंग को विच्छेदन के दौरान उत्पन्न रिस्नर की झिल्ली के एक हिस्से को दबाकर प्लास्टिक कवरलिप पर स्थिर किया गया था। एक ग्लास सिलेंडर द्वारा सीमित एमएससी जब सिलेंडर हटा दिया गया था कॉकलियर एपिथेलियम की ओर चले गए । उनका प्रमुख स्थानीयकरण कॉर्टी के अंग के मोडिओलस में देखा गया था, जो तंत्रिका फाइबर के समान दिशा में गठबंधन किया गया था। हालांकि, कुछ एमएससी को लिम्बस क्षेत्र में स्थानीयकृत किया गया था और एक क्षैतिज विस्तारित आकार दिखाया गया था। इसके अलावा हेयर सेल एरिया में माइग्रेशन बढ़ा और कानामाइसिन ट्रीटमेंट के बाद एमएससी की मॉर्फोलॉजी विभिन्न रूपों में बदल गई। अंत में, इस अध्ययन के परिणामों से संकेत मिलता है कि कॉकलियर एपिथेलियम के साथ एमएससी की सहसंस्कृति कोशिका प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकित्सीय के विकास के लिए और सेल पुनर्जनन के अध्ययन के लिए उपयोगी होगी जो विभिन्न स्थितियों और कारकों की जांच कर सकती है।
Introduction
सुनवाई हानि सौहार्दपूर्ण ढंग से हो सकती है या उम्र बढ़ने, दवाओं और शोर सहित कई कारकों द्वारा उत्तरोत्तर कारण हो सकती है। श्रवण हानि का इलाज करना अक्सर कठिन होता है क्योंकि एक बार श्रवण के लिए उत्तरदायी बाल कोशिकाओं के क्षतिग्रस्त होने के बाद बिगड़ा कार्य को बहाल करना बहुत चुनौतीपूर्ण होता है1. विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, दुनिया भर में ४६१,०,० लोगों को सुनवाई हानि का अनुमान है, जो दुनिया की आबादी का ६.१% के लिए खातों । सुनवाई हानि के साथ उन में से, ९३% वयस्क हैं, और 7% बच्चे हैं ।
कई दृष्टिकोणों को सुनवाई हानि का इलाज करने का प्रयास किया गया है; विशेष रूप से, एमएससी का उपयोग करके एक पुनर्जनन दृष्टिकोण एक आशाजनक उपचार के रूप में उभरा है। जब ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो एमएससी को स्वाभाविक रूप से संचार प्रणाली में छोड़ा जाता है और चोट स्थल पर स्थानांतरित कर दिया जाता है जहां वे विभिन्न अणुओं को एक माइक्रोएनवायरमेंट बनाने के लिए स्रावित करते हैं जो पुनर्जनन2को बढ़ावा देता है। इसलिए,क्षतिग्रस्त कोशिका समारोह3,4,5की बहाली को बढ़ाने के लिए बाहरी रूप से प्रत्यारोपित एमएससी के प्रवास के माध्यम से क्षतिग्रस्त ऊतकों के इलाज के लिए एक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है जो अंगों को लक्षित करने के लिए और अणुओं के उनके बाद के स्राव का कारण बनता है जो शक्तिशाली प्रतिरक्षा विनियमन, एंजियोजेनेसिस और एंटी-एपोप्टोसिस का कारण बनता है।
होमिंग प्रक्रिया जिसमें एमएससी क्षतिग्रस्त ऊतकों में स्थानांतरित होते हैं, दूर करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बाधा हो सकती है। एमएससी में टेदरिंग/रोलिंग, एक्टिवेशन, गिरफ्तारी,ट्रांसफ्यूजन/डायपेडेसिस और माइग्रेशन6,7,8के अनुक्रमिक कदमों के साथ एक प्रणालीगत होमिंग तंत्र है । वर्तमान में, इन कदमों को बेहतर बनाने के तरीकों की पहचान करने के प्रयास चल रहे हैं । आनुवंशिक संशोधन, सेल सरफेस इंजीनियरिंग, इन विट्रो प्राइमिंग और चुंबकीय मार्गदर्शन सहित विभिन्न रणनीतियों का परीक्षण किया गया है6,7। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त कोचलिया की साइट पर एमएससी होमिंग द्वारा श्रवण बाल कोशिकाओं के संरक्षण और उत्थान को बढ़ावा देने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । हालांकि, वीवो में एमएससी पर नज़र रखने में समय लेने वाली और श्रम-प्रधान है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कौशल9की आवश्यकता होती है।
इस समस्या को हल करने के लिए, समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कोकलिया में एमएससी के होमिंग का निरीक्षण करने के लिए एक विधि विकसित की गई थी जो कई घंटों(चित्र 1)से अधिक कोशिकाओं के प्रवास की तस्वीरों को चित्रित करती है। यह 20वीं शताब्दी की शुरुआत में विकसित किया गया था और हाल ही में विशिष्ट कोशिकाओं के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है।
चित्र 1:ग्राफिकल सार। (ए)कॉर्टी के विच्छेदित अंग का पालन करने के बाद एक प्लास्टिक कवरलिप पर संदंश का उपयोग करके, कवरस्लिप को 35 मिमी ग्लास-तली कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक डिश पर रखा जाता है, और(ख)ग्लास सिलेंडर तैनात किया जाता है। (ग)ग्लास सिलेंडर के अंदर मीडियम भरने के बाद(डी)जीएफपी लेबल वाले एमएससी को मीडियम के साथ सिलेंडर के बाहर सावधानी से जोड़ा जाता है । (ई)रातभर इनक्यूबेशन के बादग्लाससिलेंडर को हटा दिया जाता है, और इमेज को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से लिया जाता है । संक्षिप्त रूप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; MSCs = mesenchymal स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Protocol
आईसीआर चूहों से जुड़े सभी शोध प्रोटोकॉल को वोंजू कॉलेज ऑफ मेडिसिन में योनसेई विश्वविद्यालय की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) ने मंजूरी दी थी । प्रयोग विश्व चिकित्सा संघ की आचार संहिता के अनुसार किए गए । इस प्रोटोकॉल में गर्भवती आईसीआर चूहों को 12/12 घंटे के हल्के/डार्क साइकिल में रखा गया था, जिसमें भोजन और पानी की मुफ्त पहुंच थी ।
1. कॉकली विच्छेदन
- ~ 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश को चालू करके लैमिनार प्रवाह ऊतक संस्कृति हुड को स्टरलाइज करें, और उपयोग से पहले 70% इथेनॉल के साथ सभी सतहों को स्प्रे करें। सतहों को सूखने दें।
- 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में विच्छेदन उपकरण रखें, और उपयोग करने से पहले सूखें।
- प्रसवोत्तर 3-4 दिन पुराने चूहों(चित्रा 2A)को काटना करने के लिए एक ऑपरेटिंग ब्लेड का उपयोग करें ।
- खोपड़ी को लैमिनार फ्लो हुड में स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें, और ऊतक को 70% इथेनॉल में भिगो दें।
- इथेनॉल को हटाने के लिए ऊतक विच्छेदन समाधान (1x हैंक का संतुलित नमक समाधान, 1 mm HEPES) में ऊतक को जल्दी से भिगो दें।
- खोपड़ी की सेंटरलाइन को सर्जिकल ब्लेड(चित्रा 2B,C)से काटें।
- त्वचा को पूर्वकाल में खींचकर और कान की बाहरी श्रवण नहर(चित्र 2डी)को काटकर खोपड़ी का पर्दाफाश करें।
- पूर्वकाल से आंखों की रेखा(चित्रा 2E)के पार कपाल के पीछे के हिस्से में कटें।
- खोपड़ी खोलें और कुंद संदंश(चित्रा 2F,जी)के साथ अग्रेब्राण, सेरिबैलम, और ब्रेनस्टेम को हटा दें।
- माइक्रो फोर्स्प का उपयोग करके, कॉकलिया को शंख हड्डी(चित्रा 2H)से अलग करते हैं।
- कॉकली को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें ऊतक विच्छेदन समाधान होता है।
- ध्यान से कॉकलियर otic कैप्सूल के सभी विच्छेदन, केवल आंतरिक कॉकलियर नरम ऊतक(चित्रा 2I,जम्मू)जा रहा है ।
- संदंश और संदंश की एक और जोड़ी के साथ कॉकलियर वाहिनी के साथ कॉकलियोस पकड़ो, और धीरे से दो ऊतकों(चित्रा 2K)अलग ।
- स्ट्रारिया वैस्कुलरिस और टेक्टरल झिल्ली को धीरे-धीरे छीलकर हटा दें(चित्रा 2L,M)।
- नए ऊतक विच्छेदन समाधान में एक निष्फल प्लास्टिक कवरलिप रखें, और फिर कॉर्टी के अंग को 9 मिमी व्यास के कवरलिप पर रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि बेसलर झिल्ली नीचे की ओर आ रही है(चित्रा 2N-P)।
- रिइसनर की झिल्ली और शेष मोडिओलस ऊतक को संदंश(चित्र 2N-P)के साथ कवरस्लिप पर दबाकर ऊतक को स्थिर करें।
- एम्बेडेड ऊतक के साथ कवरलिप को 35 मिमी व्यास के कॉन्फोकल डिश के केंद्र में स्थानांतरित करें।
- डिश पर ग्लास क्लोनिंग सिलेंडर रखें, डिश के केंद्र में तैनात कॉकलियर एक्सप्लांट के साथ, और एक्सप्लांट कल्चर मीडियम (DMEM/F12, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% N2 पूरक, एम्पीसिलिन (10 μg/mL)) 10 सिलेंडर के अंदर(चित्रा 2Q)के१०० माइक्रोन जोड़ें ।
- प्लेट 5 × माउस बोन मैरो की3 3 कोशिकाएं-व्युत्पन्न ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) - ग्लास सिलेंडर(चित्रा2) के बाहर 2 एमसीएल संस्कृति माध्यम (45% डीएमईएम + 45% डीएमईएम/एफ12, 10% एफबीएस, 1% एन2 पूरक, 10 माइक्रोग्राम/एमएल ऑफ एम्पीसिलिन) में टैग किया गया।
- जब एमएससी 80-90% कॉन्फ्लूंट होते हैं, तो उन्हें ट्राइप्सिन-एथिलेंडाइमाइन टेट्राएकेटिक एसिड से अलग करके मार्ग करें।
- कॉन्फोकल डिश को एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में सावधानी से स्थानांतरित करें और 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- सिलेंडर के अंदर और बाहर सभी माध्यमों को एस्पिरेट करें, और फिर कॉन्फोकल डिश से ग्लास सिलेंडर निकालें।
- कॉन्फोकल डिश में ताजा संस्कृति माध्यम के 2 एमसीएल जोड़ें, और विश्लेषण के लिए तैयार होने तक एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में ऊतक संस्कृति पकवान को इनक्यूबेट करें।
चित्रा 2। कॉर्टी और एमएससी के अंग के माउस कॉकलिया और सहसंस्कृति का विच्छेदन। (A)माउस का डेपुटेशन,(ख)और(C)सिर के मिडलाइन सैसिटल विच्छेदन,(घ)और(ई)मस्तिष्क के कोरोनल विच्छेदन,(एफ)और(जी)मस्तिष्क और लौकिक हड्डी को हटाने,(एच)कॉकलियर दीवार को हटाने,(जम्मू)cochlea के अलगाव,(कश्मीर)मोदी के से cochlear क्टर की जुदाई,(L)स्ट्रारिया वैस्कुलरिस (एसवी) और सर्पिल स्नायु (एसएल) को कोर्टी के अंग से अलग करना,(एम)टेक्टरल झिल्ली को हटाना,(एन-पी)प्लास्टिक कवर स्लिप पर कोचलिया का निर्धारण,(क्यू)कॉन्फोकल डिश में कवरलिप और ग्लास सिलेंडर का स्थान,(आर)एमएससी का टीका । व्हाइट स्केल बार(ए-ई)= 1 सेमी; नारंगी(एफ, जी, पी)और पीला स्केल बार(एच,मैं)= 1 मिमी; ग्रीन स्केल बार(J-O)= 0.5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
2. समय-चूक इमेजिंग
- यहां प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, एक स्टेज टॉप इनक्यूबेटर सिस्टम के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी सिस्टम का उपयोग करें।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, फ्लोरोसेंट लाइट और कंप्यूटर चालू करें।
- कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के स्टेज पर रखे स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर की शर्तों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 वायुमंडल में सेट करें।
- डिश फिक्सिंग पोत पर नमूना पकवान रखें, डिश फिक्सिंग ढक्कन के साथ कवर करें, और शीर्ष हीटर ढक्कन के साथ चैंबर बंद करें।
- ज़ूम को समायोजित करें और देखने के क्षेत्र में कोर्टी और एमएससी के अंग को स्थानीयकृत करने के लिए ध्यान केंद्रित करें।
- इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर खोलें। खोज विकल्प के तहत, 20x प्लान-एप्रोक्रोमेट ऑब्जेक्ट (न्यूमेरिकल अपर्चर 0.8) और 0.5x फसल क्षेत्रका चयन करें।
- अधिग्रहणके तहत स्मार्ट सेटअप पर क्लिक करें और ईजीएफपीका चयन करें ।
- अधिग्रहणके तहत चैनल टैब खोलें, और लेजर पावर को 0.2%, पिनहोल को 44 माइक्रोन,मास्टर गेन टू 750 वीऔर डिजिटल गेन को 1.0सेट करें।
- इमेजिंग सेटअपके तहत ईएसआईडी पर क्लिक करें, और ईएसआईडी लाभ को 4 और डिजिटल लाभ को 7.5पर सेट करें।
- 210 टाइल्स का उत्पादन करने के लिए टाइल्स और हिस्सेदारी पर क्लिक करें।
- फोकस रणनीति खोलें और फोकस मोडका चयन करें।
- समय श्रृंखलाके तहत , अवधि को 24 घंटे और अंतराल को 10 मिनटतक निर्धारित करें ।
- अधिग्रहणके तहत, फ्रेम का आकार 512 x 512 पिक्सल, स्कैन गति को 8करने के लिए, द्विदिशात्मककी दिशा, 4xके औसत और प्रति पिक्स पिक्सल 16के लिए बिट्स सेट करें।
- प्रयोग शुरू करने के लिए शुरू प्रयोग पर क्लिक करें.
3. छवि फ़ाइल संशोधन
- प्रसंस्करणके तहत, सिलाईपर क्लिक करें , और न्यूनतम ओवरले को 5% तक सेट करें और अधिकतम बदलाव 10% तक।
- फिल्म निर्यातपर क्लिक करें , असंभावितसेट करें और गति को 7.5पर सेट करें।
4. इम्यूनोदाता
- माध्यम को ध्यान से एएसपिरेट करें, और 5 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ दो बार नमूना धोएं।
- पीबीएस में 4% फॉर्मलिन के साथ नमूना को 15 मिनट के लिए ठीक करें, और 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार नमूना धोएं।
- पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 में 10 मिनट के लिए नमूना को पार करें, और 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
- 250 μL फ़लाइडिन-आईफ्लोर 647 रिएजेंट (पीबीएस में 1:1000 कमजोर पड़ने) जोड़ें, और शेकर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए नमूना इनक्यूबेट करें।
- 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार नमूना धोएं।
- कवरलिप को ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें, और बढ़ते समाधान की 2 बूंदें जोड़ें।
- स्लाइड पर धीरे-धीरे एक कवरलिप रखें।
- स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरलिप को सील करें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि कोशिकाओं को मनाया न जाए।
- छवि स्लाइड उत्तेजन/उत्सर्जन (Ex/Em) = 650/665 nm पर एक उपयुक्त फिल्टर के साथ एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर phalloidin के लिए और पूर्व में/
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Representative Results
त्रि-आयामी मोड में एमएससी के इन विट्रो माइग्रेशन का मूल्यांकन ट्रांसवेल प्रणाली द्वारा या पारंपरिक घाव उपचार विधि द्वारा दो आयामी (2डी) मोड11में माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए किया गया है। कोर्टी का अंग एक जटिल संरचना है जो विभिन्न कोशिकाओं जैसे बोइचर कोशिकाओं, क्लॉडियस कोशिकाओं, डेटर्स कोशिकाओं, स्तंभ कोशिकाओं, हेनसेन की कोशिकाओं, बाहरी बाल कोशिकाओं, आंतरिक बाल कोशिकाओं, तंत्रिका फाइबर, बेसिलर झिल्ली, और रेटिकुलर लैमिना12से बना है। जब एमएससी को ऐसी जटिल कोशिकाओं से बने ऊतकों में प्रत्यारोपित किया जाता है, तो यह पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी का उपयोग जहां कोशिकाओं की भर्ती और स्थिर होती है, वह एमएससी का उपयोग करके सेल थेरेपी और पुनर्जनन के तंत्र को समझने के लिए निर्णायक है । इसके अलावा, यह निर्धारित करने के लिए कि क्षति की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एमएससी को कैसे स्थानीयकृत किया जाता है, एक 2डी विधि जैसे घाव भरने की विधि ट्रांसवेल सिस्टम की तुलना में अधिक उपयुक्त है जिसमें कोशिकाएं एक दिशा में बेतरतीब ढंग से नीचे की ओर बढ़ती हैं।
इस अध्ययन में, एमएससी के दो आयामी पथ को केवल एमएससी और कॉर्टी के अंग के बीच एक बाधा के रूप में एक ग्लास सिलेंडर का उपयोग करके और एमएससी संलग्न होने के बाद सिलेंडर को हटाने के द्वारा घाव भरने की विधि में ट्रैक किया गया था। जब कोर्टी का अंग सुसंस्कृत था, तो सबसे बाहरी परत(चित्र 3, वीडियो 1)में मौजूद बाहरी बाल कोशिकाओं से फाइब्रोब्लास्ट बहुत जल्दी बाहर बढ़ गया। इसलिए, अधिकांश जीएफपी-लेबल वाले एमएससी को तेजी से बढ़ते फाइब्रोब्लास्ट(वीडियो 1)द्वारा बाहर धकेल दिया गया लग रहा था। फिर भी, कुछ जीएफपी-लेबल वाले एमएससी ने फाइब्रोब्लास्ट की परत में प्रवेश किया और सफलतापूर्वक कॉर्टी(चित्र 3, वीडियो 1)के अंग में चले गए।
चित्रा 3। कोर्टी और जीएफपी-लेबल वाले एमएससी के अंग की कॉन्फोकल इमेज। कांच के सिलेंडर को हटाने और इनक्यूबेशन के एक अतिरिक्त 4 घंटे के बाद, निर्धारण और धुंधला प्रदर्शन किया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एमएससी: मेसेंचिमल स्टेम सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 1: कोर्टी और जीएफपी-लेबल वाले एमएससी के अंग की समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी। कांच के सिलेंडर को हटाने और इनक्यूबेशन के एक अतिरिक्त 4 घंटे के बाद, निर्धारण और धुंधला प्रदर्शन किया गया। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एमएससी: मेसेंचिमल स्टेम सेल। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
इनक्यूबेशन के 72 घंटे के परिणामों से पता चला है कि एमएससी कॉर्टी के अंग में चले गए और मुख्य रूप से मोडिओलस और उस क्षेत्र में स्थानीयकृत थे जहां मोडिओलस से अलग कॉकलियर तंत्रिका फाइबर इकट्ठे हुए थे; एमएससी की आकृति विज्ञान को तंत्रिका फाइबर(चित्रा 4B)के समान एक रेडियल आकार में बदल दिया गया था। दिलचस्प बात यह है कि कोशिकाओं को बाल कोशिका क्षेत्र(चित्रा 4E,तीर देखें) के बजाय लिम्बस लाइन के साथ एक रैखिक आकार में बदल दिया गया था। यद्यपि कॉर्टी के अंग के एपिकल और बेसल सिरों को एमएससी को बेसिलर झिल्ली के मध्यीय पक्ष में जाने से रोकने के लिए संयुक्त किया गया था, लेकिन एमएससी विभिन्न कोशिका परतों और भौतिक बाधाओं(चित्रा 4E)को भेदकर तंत्रिका फाइबर संग्रह क्षेत्र में स्थानांतरित करने और विकसित करने में सक्षम थे। जब बाल कोशिकाओं को नुकसान 16 घंटे के लिए 1 mm kanamycin के साथ उपचार से प्रेरित किया गया था, और कोशिकाओं को एक और ७२ घंटे के लिए संस्कारी थे kanamycin हटाने के बाद, MSCs न केवल मोदीओलस में, लेकिन यह भी बाहरी बाल कोशिकाओं(चित्रा 4C,डी)में स्थानीयकृत थे ।
चित्रा 4। कोर्टी और जीएफपी-लेबल वाले एमएससी के अंग की कॉन्फोकल छवियां। (क)कांच के सिलेंडर को हटाने और इनक्यूबेशन के अतिरिक्त 16 एच के बाद, निर्धारण और धुंधला होने के बाद एक छवि ली गई थी। स्केल बार = 200 माइक्रोन(बी)एमएससी मुख्य रूप से मोडिओलस क्षेत्र में वितरित किए गए थे, स्केल बार = 20 माइक्रोन। पकवान से कांच के सिलेंडर को हटाने के बाद, कोशिकाओं को आगे 16 घंटे के लिए १.० mm kanamycin के साथ इनक्यूबेटेड किया गया, ७२ घंटे के लिए Kanamycin मुक्त माध्यम के साथ सुसंस्कृत, और फिर तय और दाग । (C)बाहरी बाल सेल क्षेत्र, स्केल बार = 20 माइक्रोन की छवियां; (घ)मोडिओलस क्षेत्र, स्केल बार = 50 माइक्रोन; और(ई)पूरे cochlea, स्केल बार = १०० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस अध्ययन में प्रदर्शित प्रायोगिक प्रणाली MSCs का उपयोग कर सेल चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए एक उपयोगी परीक्षण उपकरण होगा और विशेष रूप से विभिन्न कारकों की वजह से सुनवाई हानि का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
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Discussion
क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए क्षतिग्रस्त स्थलों में एमएससी के प्रत्यारोपण का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और चिकित्सीय प्रभाव स्पष्ट है । 3-नाइट्रोप्रोपोनिक एसिड13द्वारा प्रेरित श्रवण हानि के साथ चूहों में सुनवाई बहाल करने के लिए एमएससी के प्रत्यारोपण और बाद में भेदभाव की सूचना दी गई है । हालांकि ली एट अल ने मनुष्यों के लिए एमएससी लागू किया, लेकिन उन्होंने14सुनवाई में कोई महत्वपूर्ण सुधार हासिल नहीं किया । हाल ही में जब तक, एमएससी प्रत्यारोपण द्वारा कृंतक मॉडल में सुनवाई बहाल करने के लिए लगभग 12 प्रयोग किए गए थे । हालांकि परिणाम विषमता की वजह से कुछ अस्पष्ट है, वहां कुछ संकेत है कि MSCs सुनवाई को बढ़ावा दे सकते हैं ।
केमोट्रेक्शन से संबंधित विभिन्न विकास कारक और रसायनकीयएं प्रत्यारोपित स्टेम कोशिकाओं के क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में प्रवास में शामिल हैं, चाहे विषमता या एकरूपता15हो। केमोकिन ऊतक होमोस्टेसिस, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और घाव भरने के लिए सेल माइग्रेशन के प्रमुख नियामक हैं। वीवो में केमोकेन-प्रेरित केमोट्रेक्शन उसी तरह काम नहीं कर सकता है जैसा कि विवो और इन विट्रो प्रायोगिक स्थितियों के बीच मतभेदों के कारण विट्रो में करता है। हालांकि इन विट्रो प्रायोगिक स्थितियों की अपनी सीमाएं हैं, लेकिन कुशल माइग्रेशन, भर्ती और कोशिकाओं के पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए वीवो अध्ययन में आचरण करना बहुत मुश्किल है16।
हालांकि सुनवाई बहाली के लिए प्रत्यारोपित MSCs की ट्रैकिंग पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान में महत्वपूर्ण है, वीवो प्रयोगों में, विशेष रूप से सुनवाई से जुड़े उन, ज्यादातर मामलों में श्रम गहन है और इसलिए बड़े नमूना आकार के साथ प्रदर्शन करने के लिए बहुत मुश्किल हैं । इसलिए, परिणामों की एकरूपता कम है, और पूर्वाग्रह गंभीर है। इसलिए, इन विट्रो स्थितियों के तहत इस तरह के माइग्रेशन आधारित घटनाओं का पहले अध्ययन करना कुशल होगा। ट्रांसवेल या घाव भरने के तरीकों का उपयोग करके सेल माइग्रेशन पर अधिकांश इन विट्रो अध्ययन किए गए हैं।
एमएससी के साथ कॉकलाई को बाहर निकालने की एक सिक्का विधि माइग्रेट स्टेम सेल को ट्रैक करने के लिए स्थापित की गई थी, जो चोट साइटों को पहचानती है और उनकी ओर बढ़ती है । अधिकांश अध्ययनों ने उच्चारण के बाद β-मर्केप्टोथेनॉल के साथ लेपित ग्लास कवरस्लिप पर कॉर्टी के अंग को संलग्न करने की विधि का उपयोग किया है। हालांकि यहां एक ही विधि का उपयोग किया गया था, ऊतकों की जांच करना मुश्किल था क्योंकि वे अक्सर कवरस्लिप से अलग या लुढ़का हुआ था। इसलिए, ऊतक की निगरानी करना आसान बनाने के लिए एक नया परीक्षण किया गया था। सबसे पहले, कॉर्टी के एक अंग को प्लास्टिक कवर्लिप पर रखा गया था, और फिर ऊतक को संदंश का उपयोग करके विच्छेदन के दौरान उत्पन्न रीसनर की झिल्ली के शेष हिस्से को दबाकर कवरस्लिप पर स्थिर किया गया था।
इसने कॉर्टी के अंग को कवरस्लिप में स्थिर लगाव में सक्षम बनाया ताकि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा एक छवि को सफलतापूर्वक प्राप्त किया जा सके। हालांकि ऊतक संस्कृति विधि यहां प्रस्तुत एक सस्ती और समय की बचत है, विच्छेदन में प्रवीणता के विकास में कुछ समय लगता है । ज्ञात ऊतक संस्कृति विधियों में पॉली-एल-ऑर्निथिन और लैमिनिन16के साथ कवरस्लिप को कोटिंग करके ऊतक का लगाव शामिल है । ऑर्गेनोटिपिक सेल कल्चर आवेषण लागू करना जिन्हें चिपकने वाली या कोटिंग सामग्री की आवश्यकता नहीं होती है17 जिससे चिपकने वाले पदार्थों की आवश्यकता को समाप्त किया जा सकता है, जो एक्सप्लांट क्षति को कम करता है; और एक समुद्री मसल्स10से निकाले प्रोटीन से बना टिशू चिपकने वाला का उपयोग करना . इस प्रोटोकॉल के लिए न तो कोटिंग सामग्री की आवश्यकता होती है और न ही ऑर्गेनोटीपिक झिल्ली और न ही ऊतक चिपकने वाले; एक सस्ती प्लास्टिक कवरस्लिप पर्याप्त है। यदि कॉर्टी के अंग की ऊतक मोटाई के जेड-स्टैक के साथ 8 मिमी x 8 मिमी के क्षेत्र को माना जाता है तो बेहतर छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है। संग्रहीत किए जाने वाले डेटा की विशाल मात्रा और समय चूक के लिए उपयुक्त समय को ध्यान में रखते हुए, पूरे सेल आंदोलन की छवियों का अधिग्रहण किया गया था, जो कोर्टी के अंग के बजाय एमएससी पर ध्यान केंद्रित कर रहे थे।
चित्रा 4 में दिखाए गए परिणाम यह सुझाते हैं कि कॉर्टी और एमएससी दोनों अंगों को स्पष्ट वीडियो छवियों के रूप में कल्पना की जा सकती है जब ली गई छवियां 2 मिमी लंबी होती हैं, और जेड-स्टैक को समय चूक के साथ जोड़ा जाता है। यहां, हालांकि एमएससी और एक एक्सप्लांट के साथ सह-संस्कृति प्रयोग किया गया था, इस सेटिंग को भविष्य के अध्ययनों के लिए विभिन्न सेल प्रकारों या शर्तों पर लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह कॉकलिया के नुकसान की रक्षा करने वाली दवाओं या एक्सोसोम्स के प्रभावों की जांच करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने में मदद करेगा। भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएसएससी) या प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) कार्यात्मक रूप से और रूपात्मक रूप से मेकेनोसेंसिव हेयर सेल जैसी कोशिकाओं में पुनयोनित कर सकते हैं18। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को श्रवण बाल कोशिकाओं या समर्थन कोशिकाओं में आईपीएससी या ईएससी के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। यह पूर्व वीवो विधि सुनवाई बहाल करने के लिए पुनर्योजी दवा में सहायता कर सकती है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) और हैलिम यूनिवर्सिटी रिसर्च फंड से रिसर्च ग्रांट (एनआरएफ-2018-R1D1A1B0705050175, HURF-2017-66) का समर्थन मिला ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
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