Summary
In deze studie presenteren we een real-time beeldvormingsmethode met confocale microscopie om cellen te observeren die naar beschadigd weefsel bewegen door ex vivo incubatie met het cochleaire epitheel dat het orgaan van Corti bevat.
Abstract
Om de effecten van mesenchymale stamcellen (MSC's) op celregeneratie en -behandeling te bestuderen, volgt deze methode MSC-migratie en morfologische veranderingen na co-cultuur met cochleair epitheel. Het orgaan van Corti werd geïmmobiliseerd op een plastic deklip door een deel van het membraan van de Reissner te drukken dat tijdens de dissectie werd gegenereerd. MSC's die door een glazen cilinder werden opgesloten, migreerden naar cochleair epitheel toen de cilinder werd verwijderd. Hun overheersende lokalisatie werd waargenomen in de modiolus van het orgaan van Corti, uitgelijnd in een richting die vergelijkbaar is met die van de zenuwvezels. Sommige MSC's werden echter gelokaliseerd in het limbusgebied en vertoonden een horizontaal langwerpige vorm. Bovendien werd de migratie naar het haarcelgebied verhoogd en veranderde de morfologie van de MSC's in verschillende vormen na de behandeling met kanamycine. Concluderend geven de resultaten van deze studie aan dat de cocultuur van MSC's met cochleair epitheel nuttig zal zijn voor de ontwikkeling van therapieën via celtransplantatie en voor studies naar celregeneratie die verschillende aandoeningen en factoren kunnen onderzoeken.
Introduction
Gehoorverlies kan aangeboren optreden of kan geleidelijk worden veroorzaakt door verschillende factoren, waaronder veroudering, medicijnen en lawaai. Gehoorverlies is vaak moeilijk te behandelen omdat het zeer uitdagend is om een verminderde functie te herstellen zodra de haarcellen die verantwoordelijk zijn voor het gehoor zijn beschadigd1. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie hebben naar schatting 461 miljoen mensen wereldwijd gehoorverlies, wat verantwoordelijk is voor 6,1% van de wereldbevolking. Van degenen met gehoorverlies is 93% volwassen en 7% kinderen.
Er is geprobeerd gehoorverlies te behandelen; met name een regeneratiebenadering met behulp van MSC's is een veelbelovende behandeling gebleken. Wanneer weefsel beschadigd is, worden MSC's van nature vrijgegeven in de bloedsomloop en migreren ze naar de plaats van verwondingen waar ze verschillende moleculen afscheiden om een micromilieu te vormen dat regeneratiebevordert 2. Daarom is het belangrijk om een methode te ontwikkelen om beschadigde weefsels te behandelen door de migratie van extern geïmplanteerde MSC's om organen te targeten en hun daaropvolgende afscheiding van moleculen die krachtige immuunregulatie, angiogenese en anti-apoptose veroorzaken om het herstel van beschadigde celfunctie3,4,5te verbeteren .
Het homing-proces waarbij MSC's migreren naar beschadigde weefsels kan het belangrijkste obstakel zijn om te overwinnen. MSC 's hebben een systemisch homingmechanisme met opeenvolgende stappen van tethering/rolling, activering, arrestatie, transmigratie/diapedese en migratie6,7,8. Momenteel worden er inspanningen geleverd om manieren te vinden om deze stappen te verbeteren. Verschillende strategieën, waaronder genetische modificatie, celoppervlaktechniek, in vitro priming en magnetische geleiding, zijn getest6,7. Daarnaast zijn verschillende pogingen gedaan om de bescherming en regeneratie van auditieve haarcellen te bevorderen door MSC's naar de plaats van beschadigd slakkenhuis te brengen. Het volgen van MSC's in vivo is echter tijdrovend en arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde vaardigheden9.
Om dit probleem op te lossen, werd een methode ontwikkeld om de homing van MSC's in het slakkenhuis te observeren door middel van time-lapse confocale microscopie die de migratie van cellen gedurende meerdere uren fotografeert (Figuur 1). Het werd ontwikkeld in het begin van de 20e eeuw en is onlangs uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van migratie van specifieke cellen.
Figuur 1: Grafische samenvatting. (A) Nadat het ontlede orgaan van Corti met behulp van een tang op een plastic afdeklip is gehecht, wordt de afdeklip op een confocale microscopische schaal met glazen bodem van 35 mm geplaatst en (B) de glazen cilinder is geplaatst. (C) Na het vullen van de binnenkant van de glazen cilinder met medium, (D) GFP-gelabelde MSC's met medium worden zorgvuldig toegevoegd buiten de cilinder. (E) Na incubatie 's nachts, (F) wordt de glazen cilinder verwijderd en worden beelden gemaakt met een confocale microscoop. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; MSC's = mesenchymale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderzoeksprotocollen met ICR-muizen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Yonsei University aan het Wonju College of Medicine. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de World Medical Association. In dit protocol werden zwangere ICR-muizen gehouden in een 12/12 uur licht/ donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
1. Cochleae dissectie
- Steriliseer de laminaire stroom weefselkweekkap door het ultraviolette licht gedurende ~ 30 minuten aan te zetten en besproei alle oppervlakken met 70% ethanol voor gebruik. Laat de oppervlakken drogen.
- Plaats dissectie-instrumenten gedurende 10 minuten in 70% ethanol en droog ze voor gebruik.
- Gebruik een operatiemes om postnatale muizen van 3-4 dagen oud te onthoofden (Figuur 2A).
- Plaats de schedel onder een stereomicroscoop in de laminaire stromingskap en week het weefsel in 70% ethanol.
- Week het weefsel snel in weefseldissectieoplossing (1x Hank's Balanced Salt Solution, 1 mM HEPES) om de ethanol te verwijderen.
- Snijd de middellijn van de schedel door met een chirurgisch mes (figuur 2B,C).
- Stel de schedel bloot door de huid voorin de huid naar beneden te trekken en de uitwendige gehoorgang van het oor door te snijden (figuur 2D).
- Snijd van de voorste naar het achterste deel van de schedel over de ooglijn (Figuur 2E).
- Open de schedel en verwijder de voorhersenen, het cerebellum en de hersenstam met een stompe tang (Figuur 2F,G).
- Scheid met behulp van micro-tang het slakkenhuis van het temporale bot (figuur 2H).
- Breng het slakkenhuis over in een petrischaaltje met weefseldissectieoplossing.
- Ontleed voorzichtig alle cochleaire roeicapsules, waarbij alleen het interne cochleaire zachte weefsel overblijft(figuur 2I,J).
- Houd de modiolus van het slakkenhuis met de tang en het cochleair kanaal vast met een ander paar tangen en scheid de twee weefsels langzaam (Figuur 2K).
- Verwijder de stria vascularis en het tectoriale membraan door ze voorzichtig af te pellen(figuur 2L,M).
- Plaats een gesteriliseerde plastic afdeklip in een nieuwe weefseldissectieoplossing en plaats het orgaan van Corti vervolgens op een afdeklip met een diameter van 9 mm, zorg ervoor dat het basilaire membraan naar beneden gericht is (Figuur 2N-P).
- Immobiliseer het weefsel door het membraan van de Reissner en het resterende modiolusweefsel met een tang op de afdeklip te drukken (afbeelding 2N-P).
- Breng de afdeklip met het ingebedde weefsel over naar het midden van een confocale schaal met een diameter van 35 mm.
- Plaats de glazen klooncilinder op de schaal, met de cochleaire explant in het midden van de schaal, en voeg 100 μL explantcultuurmedium (DMEM/F12, 10% foetale runderserum (FBS), 1% N2-supplement, ampicilline (10 μg/ml))10 in de cilinder toe(figuur 2Q).
- Plaat 5 × 103 cellen van muis beenmerg-afgeleide groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabeld MCC's in 2 ml cultuurmedium (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 supplement, 10 μg/ml ampicilline) buiten de glazen cilinder (Figuur 2R).
- Wanneer de MSC's 80-90% samenvloeien, doorloop ze dan door ze los te maken met trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur.
- Breng de confocale schaal voorzichtig over in een bevochtigde incubator en incubeer 's nachts bij 37 °C in een CO2-atmosfeer van 5%.
- Aspireer alle medium binnen en buiten de cilinder en verwijder vervolgens de glazen cilinder uit de confocale schotel.
- Voeg 2 ml vers kweekmedium toe aan de confocale schaal en incubeer de weefselkweekschaal in een bevochtigde incubator totdat deze klaar is voor analyse.
Figuur 2. Dissectie van een muizenslakkenhuis en cocultuur van het orgaan van Corti en MSC's. (A) Onthoofding van de muis, (B) en(C) midline sagittale dissectie van het hoofd, (D) en (E) coronale dissectie van de hersenen, (F) en (G) verwijdering van de hersenen en temporale bot, (H) het slakkenhuis, (I) verwijdering van de benige cochleaire wand, (J) isolatie van het slakkenhuis, (K) scheiding van het cochleair kanaal van de modiolus, (L) scheiding van stria vascularis (SV) en spiraalligment (SL) van het orgaan van Corti, (M) verwijdering van het tectoriale membraan, (N-P) fixatie van het slakkenhuis op een plastic afdekslip, (Q) plaats van de deksels oranje (F, G, P) en gele schaalbalk (H,I) = 1 mm; groene schaalbalk (J-O) = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2. Time-lapse beeldvorming
- Gebruik voor de hier gepresenteerde experimenten een confocale microscopiesysteem met een stage top incubatorsysteem.
- Zet de confocale microscoop, het fluorescerende licht en de computer aan.
- Stel de omstandigheden van de stage-top incubator op het podium van de confocale microscoop in op 37 °C en 5% CO2-atmosfeer.
- Plaats de monsterschaal op het schotelbevestigingsvat, dek af met het deksel van de schotelbevestiging en sluit de kamer met het deksel van de bovenste kachel.
- Pas de zoom en focus aan om het orgaan van Corti en MSC's in het gezichtsveld te lokaliseren.
- Open de beeldverwerkingssoftware. Selecteer onder de zoekoptie een 20x Plan-Apochromat-objectief (numeriek diafragma 0,8) en een 0,5x bijsnijdgebied.
- Klik onder Acquisitieop slimme instellingen en selecteer EGFP.
- Open het kanaaltabblad onder Acquisitieen stel het laservermogen in op 0,2%, het pinhole op 44 μm, de master gain op 750 Ven de digitale gain op 1,0.
- Klik op ESID onder imaging setupen stel de ESID gain in op 4 en de digitale gain op 7.5.
- Klik op Tegels en stake om 210 tegels te produceren.
- Open de focusstrategie en selecteer de scherpstelmodus.
- Stel onder tijdreeksde duur in op 24 uur en het interval op 10 min.
- Stel onder Acquisitiede framegrootte in op 512 x 512 pixels, scansnelheid op 8, de richting naar bidirectioneel, de gemiddelde op 4xen de bits per pixel op 16.
- Klik op experiment starten om het experiment te starten.
3. Wijziging van afbeeldingsbestanden
- Klik tijdens de verwerkingop stikselsen stel de minimale overlay in op 5% en de maximale verschuiving op 10%.
- Klik op filmexport, stel ongecomprimeerdin en stel de snelheid in op 7,5.
4. Immunostaining
- Aspireer het medium voorzichtig en was het monster tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten.
- Bevestig het monster met 4% formaline in PBS gedurende 15 minuten en was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Permeabiliseer het monster in 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten en was 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Voeg 250 μL phalloidine-iFluor 647 reagens (1:1000 verdunning in PBS) toe en incubeer het monster gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de shaker.
- Was het monster 3 keer met PBS gedurende 5 minuten.
- Breng de afdeklip over op de glazen glijbaan en voeg 2 druppels montageoplossing toe.
- Plaats voorzichtig een afdeklip op de glijbaan.
- Sluit de hoezenlip af met heldere nagellak en bewaar bij 4 °C in het donker totdat cellen worden waargenomen.
- Beeld de dia af met een confocale microscoop met een geschikt filter bij excitatie/emissie (Ex/Em)=650/665 nm voor falloïdine en bij Ex/Em=488/507 nm voor EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro migratie van MSC's in driedimensionale modus is beoordeeld door een Transwell-systeem of door de traditionele wondgenezingsmethode om migratie in tweedimensionale (2D) modus11te observeren . Het orgaan van Corti is een complexe structuur die bestaat uit verschillende cellen zoals Boettcher-cellen, Claudius-cellen, Deiters-cellen, pilaarcellen, Hensen-cellen, buitenste haarcellen, binnenste haarcellen, zenuwvezels, basilair membraan en reticulaire lamina12. Wanneer MSC's worden getransplanteerd in weefsel dat bestaat uit dergelijke complexe cellen, is het gebruik van technologie om vast te stellen waar cellen worden gerekruteerd en gestabiliseerd cruciaal om het mechanisme van celtherapie en regeneratie met behulp van MSC's te begrijpen. Bovendien is een 2D-methode zoals een wondgenezingsmethode geschikter dan een Transwell-systeem waarbij cellen willekeurig in één richting naar beneden bewegen om te bepalen hoe MSC's worden gelokaliseerd in de aan- of afwezigheid van schade.
In deze studie werd het tweedimensionale pad van MSC's gevolgd in een wondgenezingsmethode door simpelweg een glazen cilinder te gebruiken als barrière tussen de MSC's en het orgaan van Corti en de cilinder te verwijderen nadat de MSC's zijn bevestigd. Toen het orgaan van Corti werd gekweekt, groeiden fibroblasten zeer snel naar buiten van de buitenste haarcellen die aanwezig waren in de buitenste laag (Figuur 3, Video 1). Daarom leken de meeste MSC's met GFP-label te worden verdrongen door snelgroeiende fibroblasten (Video 1). Niettemin drongen sommige MSC's met het GFP-label door in de laag fibroblasten en migreerden met succes naar het orgaan van Corti (Figuur 3, Video 1).
Figuur 3. Confocale afbeelding van het orgaan van Corti en GFP-gelabelde MSC's. Na het verwijderen van de glazen cilinder en nog eens 4 uur incubatie werden fixatie en kleuring uitgevoerd. Schaalbalk =100 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; MSC's: mesenchymale stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Video 1: Time-lapse confocale microscopie van het orgaan van Corti en GFP-gelabelde MSC's. Na het verwijderen van de glazen cilinder en nog eens 4 uur incubatie werden fixatie en kleuring uitgevoerd. Schaalbalk =100 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; MSC's: mesenchymale stamcellen. Klik hier om deze video te downloaden.
De resultaten van 72 uur incubatie toonden aan dat MSC's migreerden naar het orgaan van Corti en voornamelijk gelokaliseerd waren in de modiolus en het gebied waar de cochleaire zenuwvezels gescheiden van de modiolus werden verzameld; de morfologie van de MSC's werd gewijzigd in een radiale vorm die vergelijkbaar is met die van zenuwvezels (figuur 4B). Intrigerend genoeg werden cellen omgevormd tot een lineaire vorm langs de limbuslijn in plaats van het haarcelgebied(figuur 4E,zie pijl). Hoewel de apicale en basale uiteinden van het orgaan van Corti werden gecombineerd om te voorkomen dat de MSC's naar de mediale kant van het basilaire membraan zouden bewegen, konden MSC's migreren en groeien in het verzamelgebied van zenuwvezels door de verschillende cellagen en fysieke barrières te penetreren (Figuur 4E). Wanneer schade aan haarcellen werd veroorzaakt door behandeling met 1 mM kanamycine gedurende 16 uur, en cellen werden gekweekt voor nog eens 72 uur na het verwijderen van kanamycine, werden MSC's niet alleen gelokaliseerd in de modiolus, maar ook in de buitenste haarcellen (Figuur 4C,D).
Figuur 4. Confocale afbeeldingen van het orgaan van Corti en GFP-gelabelde MSC's. (A) Na het verwijderen van de glazen cilinder en nog eens 16 uur incubatie werd een beeld genomen na fixatie en kleuring. Schaalbalk =200 μm. (B) MSC's werden voornamelijk verdeeld in het modiolusgebied, schaalbalk =20 μm. Na het verwijderen van de glazen cilinder uit de schaal, werden de cellen verder geïncubeerd met 1,0 mM kanamycine gedurende 16 uur, gekweekt met kanamycinevrij medium gedurende 72 uur, en vervolgens bevestigd en gekleurd. Afbeeldingen van het (C) buitenste haarcelgebied, schaalbalk = 20 μm; (D) modiolusgebied, schaalbalk= 50 μm; en (E) heel slakkenhuis, schaalbalk= 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Deze resultaten geven aan dat het experimentele systeem dat in deze studie is aangetoond, een nuttig testinstrument zou zijn voor het ontwikkelen van celtherapeutische strategieën met behulp van MSC's en specifiek kan worden toegepast om gehoorverlies veroorzaakt door verschillende factoren te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantatie van MSC's naar beschadigde locaties om de regeneratie van beschadigde cellen te bevorderen is uitgebreid bestudeerd en het therapeutische effect is duidelijk. De transplantatie en daaropvolgende differentiatie van MSC's zijn gemeld om het gehoor te herstellen bij ratten met gehoorverlies veroorzaakt door 3-nitropropioninezuur13. Hoewel Lee c.s. MSC's trans-veneus op mensen toepasten, bereikten zij geen significante verbetering in het gehoor14. Tot voor kort werden bijna 12 experimenten uitgevoerd om het gehoor in het knaagdiermodel te herstellen door MSC-transplantatie. Hoewel het resultaat enigszins onduidelijk is vanwege heterogeniteit, zijn er aanwijzingen dat MSC's het gehoor kunnen bevorderen.
Verschillende groeifactoren en chemokinen gerelateerd aan chemoattraction zijn betrokken bij de migratie van getransplanteerde stamcellen naar beschadigde gebieden, ongeacht heterogeniteit of homogeniteit15. Chemokinen zijn belangrijke regulatoren van celmigratie voor weefselhomeostase, immuunresponsen en wondgenezing. Chemokine-geïnduceerde chemoattraction in vivo werkt mogelijk niet op dezelfde manier als in vitro vanwege de verschillen tussen in vivo en in vitro experimentele aandoeningen. Hoewel in vitro experimentele omstandigheden hun eigen beperkingen hebben, is het zeer moeilijk om in vivo studies uit te voeren om efficiënte migratie, rekrutering en regeneratie van cellen te bevorderen16.
Hoewel het volgen van MSC's die zijn getransplanteerd voor gehoorherstel belangrijk is in regeneratief medisch onderzoek, zijn in vivo experimenten, vooral die met betrekking tot het gehoor, in de meeste gevallen arbeidsintensief en daarom uiterst moeilijk uit te voeren met grote steekproefgroottes. Daarom is de homogeniteit van de resultaten laag en is de bias ernstig. Daarom zou het efficiënt zijn om dergelijke migratiegebeurtenissen eerst te bestuderen onder in vitro omstandigheden. De meeste in vitro studies over celmigratie zijn uitgevoerd met behulp van Transwell of wondgenezingsmethoden.
Een coincubatiemethode voor het uitplanten van slakkenhuis met MSC's werd vastgesteld om de migrerende stamcellen te volgen, die verwondingsplaatsen herkennen en naar hen toe bewegen. De meeste studies hebben een methode gebruikt om een orgaan van Corti te bevestigen op glazen deklips bedekt met β-mercaptoethanol na explantatie. Hoewel hier dezelfde methode werd gebruikt, was het moeilijk om de weefsels te onderzoeken omdat ze vaak loskwamen of oprolden van de afdeklip. Daarom werd een nieuwe studie uitgevoerd om het gemakkelijker te maken om het weefsel te controleren. Eerst werd een orgaan van Corti op een plastic deklip geplaatst en vervolgens werd het weefsel op de deklip geïmmobiliseerd door het resterende deel van het membraan van de Reissner te drukken dat tijdens de dissectie met behulp van een tang werd gegenereerd.
Dit maakte de stabiele bevestiging van het orgaan van Corti aan de coverslip mogelijk, zodat een afbeelding met succes kon worden verkregen door confocale microscopie. Hoewel de hier gepresenteerde weefselkweekmethode een goedkope en tijdbesparende is, kost de ontwikkeling van dissectievaardigheid enige tijd. Bekende weefselkweekmethoden omvatten de aanhechting van het weefsel door de afdeklip te bedekken met poly-L-ornithine en laminine16; het aanbrengen van organotypische celkweekinzetstukken waarvoor geen lijm- of coatingmaterialen nodig zijn17, waardoor lijmstoffen niet meer nodig zijn, waardoor schade aan explant wordt beperkt; en met behulp van een weefsellijm bestaande uit eiwitten gewonnen uit zeemosselen10. Dit protocol vereist noch coatingmaterialen, noch organotypische membranen, noch weefsellijmen; een goedkope plastic hoeslip is voldoende. Betere beelden kunnen worden verkregen als een gebied van 8 mm x 8 mm wordt overwogen, samen met een Z-stack van de weefseldikte van het orgaan van Corti. Gezien de enorme hoeveelheid gegevens die moest worden opgeslagen en de juiste tijd voor timelapse, werden beelden van hele celbewegingen verkregen, gericht op de MSC's in plaats van het orgaan van Corti.
De resultaten in figuur 4 lijken te suggereren dat zowel het orgaan van Corti als MSC's kunnen worden gevisualiseerd als duidelijke videobeelden wanneer de gemaakte beelden 2 mm lang zijn en de Z-stack wordt gecombineerd met een time-lapse. Hoewel hier een co-kweekexperiment werd uitgevoerd met MSC's en een explant, kon deze instelling worden toegepast op verschillende celtypen of voorwaarden voor toekomstige studies. Het zal bijvoorbeeld helpen om dit protocol toe te passen om de effecten van geneesmiddelen of exosomen te onderzoeken die de schade van slakkenhuis beschermen. Embryonale stamcellen (ESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen functioneel en morfologisch regenereren tot mechanosensitieve haarcelachtige cellen18. Daarom kan dit protocol worden toegepast om de differentiatie van iPSC's of ESC's in auditieve haarcellen of ondersteunende cellen te bestuderen. Deze ex vivo methode kan helpen in regeneratieve geneeskunde om het gehoor te herstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) van de National Research Foundation (NRF) of Korea en Hallym University Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L.
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
