Summary
I denna studie presenterar vi en realtidsavbildningsmetod med konfokal mikroskopi för att observera celler som rör sig mot skadad vävnad genom ex vivo inkubation med cochlear epitel som innehåller Cortis organ.
Abstract
För att studera effekterna av mesenkymala stamceller (MSC) på cellregenerering och behandling spårar denna metod MSC-migration och morfologiska förändringar efter samkultur med cochlear epitel. Cortis organ immobiliserades på en plastlock genom att trycka på en del av Reissners membran som genererades under dissekeringen. MsCs begränsas av en glascylinder migrerade mot cochlear epitel när cylindern togs bort. Deras dominerande lokalisering observerades i modiolus av organet Corti, i linje i en riktning som liknar nervfibrerna. Vissa MSCs var dock lokaliserade i limbus området och visade en horisontellt långsträckt form. Dessutom ökades migrationen till hårcellsområdet, och morfologin hos MSCs ändrades till olika former efter kanamycinbehandling. Sammanfattningsvis visar resultaten av denna studie att kokultur av MSC med cochlear epitel kommer att vara användbart för utveckling av terapier via celltransplantation och för studier av cellregenerering som kan undersöka olika tillstånd och faktorer.
Introduction
Hörselnedsättning kan uppstå medfödda eller kan orsakas gradvis av flera faktorer, inklusive åldrande, droger och buller. Hörselnedsättning är ofta svår att behandla eftersom det är mycket utmanande att återställa nedsatt funktion när hårcellerna som ansvarar för hörseln är skadade1. Enligt Världshälsoorganisationen beräknas 461 miljoner människor världen över ha hörselnedsättning, vilket utgör 6,1 procent av världens befolkning. Av dem med hörselnedsättning är 93 procent vuxna och 7 procent är barn.
Ett antal tillvägagångssätt har försökt behandla hörselnedsättning. I synnerhet har en regenereringsstrategi med hjälp av msc-grupper framkommit som en lovande behandling. När vävnaden skadas frigörs msc naturligt i cirkulationssystemet och migrerar till skadestället där de utsöndrar olika molekyler för att bilda en mikromiljö som främjar regenerering2. Därför är det viktigt att utveckla en metod för att behandla skadade vävnader genom migrering av externt implanterade MSC till målorgan och deras efterföljande utsöndring av molekyler som orsakar potent immunreglering, angiogenes och antiapoptos för att förbättra återställandet av skadad cellfunktion3,4,5.
Den hamstringsprocess där msc migrerar till skadade vävnader kan vara det viktigaste hindret att övervinna. MsCs har en systemisk homing mekanism med sekventiella steg av tjudring / rullande, aktivering, gripande, transmigration / diapedesis ochmigrering 6,7,8. För närvarande pågår ansträngningar för att identifiera sätt att förbättra dessa steg. Olika strategier, inklusive genetisk modifiering, cellytasteknik, in vitro-priming och magnetisk vägledning, har testats6,7. Dessutom har flera försök gjorts att främja skydd och regenerering av hörselhårceller genom att föra msc till platsen för skadad cochlea. Att spåra MSCs in vivo är dock tidskrävande och arbetsintensivt och kräver högspecialiserade färdigheter9.
För att lösa detta problem utvecklades en metod för att observera hamstring av MSC i cochlea genom tidsfördröjning konfokal mikroskopi som fotograferar migreringen av celler under flera timmar (Figur 1). Det utvecklades i början av 1900-talet och har nyligen blivit ett kraftfullt verktyg för att studera migration av specifika celler.
Bild 1: Grafiskt abstrakt. (A) Efter att Cortis dissekerade organ har fästs på ett plastlock med tång placeras täcket på en 35 mm glasbottnad konfokal mikroskopisk skål, och (B) glascylindern är placerad. c)Efter att ha fyllt glascylinderns insida med medium tillsätts (D) GFP-märkta MSC med medium försiktigt utanför cylindern. ( E) Efter inkubation över natten,(F) tas glascylindern bort och bilder tas med ett konfokalt mikroskop. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; MSC = mesenchymala stamceller. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla forskningsprotokoll som omfattade ICR-möss godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Yonsei University vid Wonju College of Medicine. Experiment utfördes enligt Världsmedicinska föreningens etiska kodex. I detta protokoll hölls gravida ICR möss i en 12/12 h ljus / mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
1. Cochleae dissekering
- Sterilisera den laminära flödesvävnadskulturhuven genom att slå på ultraviolett ljus i ~ 30 min och spraya alla ytor med 70% etanol före användning. Låt ytorna torka.
- Placera dissekeringsinstrument i 70% etanol i 10 min och torka innan du använder dem.
- Använd ett manöverblad för att halshugga postnatala 3-4 dagslena möss(figur 2A).
- Placera skallen under ett stereomikroskop i laminär flödeshuv och blötlägg vävnaden i 70% etanol.
- Blötlägg snabbt vävnaden i vävnadsdesektionslösning (1x Hanks balanserade saltlösning, 1 mM HEPES) för att ta bort etanolen.
- Skär skallens mittlinje med ett kirurgiskt blad (Figur 2B,C).
- Utsätt skallen genom att dra ner huden fram och skära av örats yttre hörselkanal (figur 2D).
- Skär från den främre till den bakre delen av kraniet över ögonlinjen(figur 2E).
- Öppna skallen och ta bort framhjärnan, lillhjärnan och hjärnstammen med trubbiga tångar (Figur 2F,G).
- Använd mikrotänger och separera cochlea från tinningbenet (Figur 2H).
- Överför cochleae till en Petri-skål som innehåller vävnadsdesektionslösning.
- Dissekera försiktigt hela den cochlear otic kapseln, lämnar endast den inre cochlear mjukvävnaden(Figur 2I,J).
- Håll cochleaes modiolus med tång och cochlearkanalen med ett annat par tångar och separera långsamt de två vävnaderna (Figur 2K).
- Ta bort striavaskuläris och tekonteriellt membran genom att försiktigt skala bort dem (Figur 2L,M).
- Placera ett steriliserat plastlock i en ny vävnadsdesektionslösning och placera sedan Cortis organ på ett täckglas med en diameter av 9 mm, se till att basilarmembranet är vänt nedåt (Figur 2N-P).
- Immobilisera vävnaden genom att trycka på Reissners membran och den återstående modiolusvävnaden på täcket med tång (Figur 2N-P).
- Överför täckglaset med den inbäddade vävnaden till mitten av en konfokal skål med 35 mm diameter.
- Placera glasklolindern på skålen, med cochlear explant placerad i mitten av skålen, och tillsätt 100 μL explantkulturmedium (DMEM/F12, 10% fetala nötkreatursserum (FBS), 1% N2 tillägg, ampicillin (10 μg/mL))10 inuti cylindern (Figur 2Q).
- Platta 5 × 103 celler av musbenmärgs-härlett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta MSC i 2 ml odlingsmedium (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% N2 tillägg, 10 μg/mL ampicillin) utanför glascylindern (Figur 2R).
- När MSC är 80-90% konfluent, passera dem genom att lossa dem med trypsin-etylendiamin tetraacetika syra.
- Överför försiktigt den konfokala skålen till en fuktad inkubator och inkubera över natten vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär.
- Aspirera på allt medium inuti och utanför cylindern och ta sedan bort glascylindern från den konfokala skålen.
- Tillsätt 2 ml färskt odlingsmedium till den konfokala skålen och inkubera vävnadskulturskålen i en fuktad inkubator tills den är klar för analys.
Figur 2. Dissekering av en mus cochlea och kokultur av organet i Corti och MSCs. a)Halshuggning av musen,B)ochC)mellansittande sagittal dissekering av huvudet,(D)och(E)koronal dissekering av hjärnan,(F)och(G)avlägsnande av hjärnan och tinningbenet,(H)cochlea,(I)avlägsnande av den beniga cochlearväggen,(J)isolering av cochlea,k)separation av cochlearkanalen från modiolus,l)Separation av stria vascularis (SV) och spiralligament (SL) från Organet i Corti,(M)avlägsnande av tectorialmembranet,(N-P)fixering av cochlea på en plastkåpa slip, (Q) placering av täcklip och glascylinder i konfokal skål, (R) inokulering av MSC. Vit skala bar (A-E) = 1 cm; Orange (F, G, P) och gul skalstång (H,I) = 1 mm; grön skalbar (J-O) = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Timelapse-avbildning
- För de experiment som presenteras här, använd ett konfokalt mikroskopisystem med ett scentoppinkubatorsystem.
- Slå på det konfokala mikroskopet, lysrörsljuset och datorn.
- Ställ in förhållandena för inkubatorn på scenen i det konfokala mikroskopet till 37 °C och 5 % CO2-atmosfär.
- Placera provskålen på diskkärlet, täck med skålens fixeringslock och stäng kammaren med det övre värmelocket.
- Justera zoomen och fokus för att lokalisera organet för Corti och MSCs inom synfältet.
- Öppna bildbehandlingsprogrammet. Under alternativet hitta väljer du ett 20x Plan-Apochromat-mål (numerisk bländare 0,8) och en 0,5x beskärningsareal.
- Klicka påsmart installation under Förvärv och välj EGFP.
- Öppna kanalfliken under Förvärvoch ställ in lasereffekten på 0,2%, pinhole till 44 μm, mastervinsten till 750 V, och den digitala vinsten till 1,0.
- Klicka på ESID under bildinställningoch ställ in ESID-vinsten på 4 och den digitala vinsten till 7,5.
- Klicka på Kakel och insats för att producera 210 brickor.
- Öppna fokusstrategin och välj fokusläge.
- Under tidsserierställer du in varaktigheten till 24 timmar och intervallet till 10 min.
- Under Anskaffningställer du in bildrutestorleken på 512 x 512 pixlar, skanningshastigheten till 8 , riktningen dubbelriktad, medelvärdet till 4xoch bitarna per pixel till 16.
- Klicka på starta experimentet för att starta experimentet.
3. Ändring av bildfil
- Under bearbetningenklickar du på sömmaroch ställer in det minimala överlägget på 5% och det maximala skiftet till 10%.
- Klicka på filmexport, ställ in okomprimeradoch ställ in hastigheten på 7,5.
4. Immunostaining
- Aspirera mediet försiktigt och tvätta provet två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 5 minuter.
- Fixera provet med 4% formalin i PBS i 15 min och tvätta provet 3 gånger med PBS i 5 minuter.
- Permeabilisera provet i 0,1% Triton X-100 i PBS i 10 min och tvätta 3 gånger med PBS i 5 minuter.
- Tillsätt 250 μL falloidin-iFluor 647-reagens (1:1000 utspädning i PBS) och inkubera provet i 1 timme vid rumstemperatur på skakapparaten.
- Tvätta provet 3 gånger med PBS i 5 minuter.
- Överför täckglaset på glasrutschbanan och tillsätt 2 droppar monteringslösning.
- Placera försiktigt ett täckglas på bilden.
- Försegla täcket med klart nagellack och förvara vid 4 °C i mörker tills celler observeras.
- Avbilda bilden med ett konfokalt mikroskop med lämpligt filter vid excitation/emission (Ex/Em)=650/665 nm för falloidin och vid Ex/Em=488/507 nm för EGFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-migrering av msc i tredimensionellt läge har bedömts av ett Transwell-system eller med den traditionella sårläkningsmetoden för att observera migration i tvådimensionellt (2D) läge11. Cortis organ är en komplex struktur som består av olika celler som Boettcher-celler, Claudius-celler, Deitersceller, pelarceller, Hensens celler, yttre hårceller, inre hårceller, nervfibrer, basilarmembran och retikulär lamina12. När msc-ämnen transplanteras till vävnad som består av sådana komplexa celler är användningen av teknik för att fastställa var celler rekryteras och stabiliseras avgörande för att förstå mekanismen för cellterapi och regenerering med hjälp av msc. Dessutom, för att bestämma hur MSCs lokaliseras i närvaro eller frånvaro av skador, är en 2D-metod som en sårläkningsmetod mer lämplig än ett Transwell-system där celler rör sig slumpmässigt nedåt i en riktning.
I denna studie spårades den tvådimensionella vägen för MSC i en sårläkningsmetod genom att helt enkelt använda en glascylinder som en barriär mellan MSC och Cortis organ och ta bort cylindern efter att MSC: erna har fästs. När Cortis organ odlades växte fibroblaster mycket snabbt utåt från de yttre hårcellerna som finns i det yttersta lagret (Figur 3, Video 1). Därför verkade de flesta GFP-märkta MSCs drivas ut av snabbväxande fibroblaster (Video 1). Icke desto mindre trängde vissa GFP-märkta MSC in i skiktet av fibroblaster och migrerade framgångsrikt till Cortis organ (Figur 3, Video 1).
Bild 3. Konfokal bild av organet i Corti och GFP-märkta MSCs. Efter avlägsnandet av glascylindern och ytterligare 4 h inkubation utfördes fixering och färgning. Skalstång =100 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; MsCs: mesenchymala stamceller. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Tidsfördröjning konfokal mikroskopi av organet i Corti och GFP-märkta MSCs. Efter avlägsnandet av glascylindern och ytterligare 4 h inkubation utfördes fixering och färgning. Skalstång =100 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; MsCs: mesenchymala stamceller. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Resultaten från 72 h inkubation visade att MSCs migrerade till organet i Corti och var huvudsakligen lokaliserade i modiolus och det område där cochlear nerv fibrer separeras från modiolus samlades; Morfologin hos msc ändrades till en radiell form som liknar nervfibrer (figur 4B). Intressant nog omvandlades celler till en linjär form längs limbuslinjen snarare än hårcellsområdet (Figur 4E, se pil). Även om de apatiska och basala ändarna av Cortis organ kombinerades för att förhindra att msc:erna flyttade till den mediala sidan av basilarmembranet, kunde MSC migrera och växa i nervfiberuppsamlingsområdet genom att penetrera de olika cellskikten och de fysiska barriärerna (figur 4E). När skador på hårceller inducerades genom behandling med 1 mM kanamycin i 16 h, och celler odlades i ytterligare 72 h efter avlägsnandet av kanamycin, mscs lokaliserades inte bara i modiolus, men också i de yttre hårcellerna (Figur 4C,D).
Figur 4. Konfokala bilder av organet i Corti och GFP-märkta MSC: er. A)Efter avlägsnandet av glascylindern och ytterligare 16 h inkubation togs en bild efter fixering och färgning. Skala bommar för =200 μm. (B) MSC delades huvudsakligen ut i modiolusområdet, fjällstång =20 μm. Efter avlägsnandet av glascylindern från skålen inkuberades cellerna ytterligare med 1,0 mM kanamycin i 16 h, odlade med kanamycinfritt medium i 72 h och sedan fixerade och målade. Bilder av (C) yttre hårcellsregionen, skalstång= 20 μm; D)Modiolusregionen, skalstång= 50 μm. och (E) hela cochlea, skalbar= 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessa resultat tyder på att det experimentella systemet som demonstreras i denna studie skulle vara ett användbart testverktyg för att utveckla cellterapeutiska strategier med hjälp av MSC och kan tillämpas specifikt för att studera hörselnedsättning orsakad av olika faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantation av MSC till skadade platser för att främja regenerering av skadade celler har studerats utförligt, och den terapeutiska effekten är uppenbar. Transplantation och efterföljande differentiering av MSC har rapporterats återställa hörseln hos råttor med hörselnedsättning inducerad av 3-nitropropionsyra13. Även om Lee et al. applicerade MSCs på människor trans-venously, uppnådde de inte någon betydande förbättring i hörsel14. Fram till nyligen genomfördes nästan 12 experiment för att återställa hörseln i gnagarmodellen genom MSC-transplantation. Även om resultatet är något oklart på grund av heterogenitet finns det vissa indikationer på att medlemsstaterna kan främja hörseln.
Olika tillväxtfaktorer och kemokiner relaterade till kemoattraktion är involverade i migrationen av transplanterade stamceller till skadade områden, oavsett heterogenitet eller homogenitet15. Kemokiner är viktiga regulatorer av cellmigration för vävnad homeostas, immunsvar och sårläkning. Chemokine-inducerad chemoattraction in vivo kanske inte fungerar på samma sätt som det gör in vitro på grund av skillnaderna mellan in vivo och in vitro experimentella villkor. Även om försöksbetingelse in vitro har sina egna begränsningar är det mycket svårt att genomföra in vivo-studier för att främja effektiv migration, rekrytering och regenerering av celler16.
Även om spårning av MSCs transplanteras för hörselåterställning är viktigt i regenerativ medicin forskning, in vivo experiment, särskilt de som innebär hörsel, är arbetsintensiva i de flesta fall och är därför extremt svåra att utföra med stora provstorlekar. Därför är resultatens homogenitet låg och förspänningen allvarlig. Därför skulle det vara effektivt att först studera sådana migrationsbaserade händelser under in vitro-förhållanden. De flesta in vitro-studier om cellmigration har utförts med transwell- eller sårläkningsmetoder.
En coincubation metod för explanting cochleae med MSCs inrättades för att spåra migrerande stamceller, som känner igen skadeplatser och rör sig mot dem. De flesta studier har använt en metod för att fästa ett organ av Corti på glaslock belagda med β-mercaptoethanol efter explantation. Även om samma metod användes här, var det svårt att undersöka vävnaderna eftersom de ofta lossnade eller rullades upp från täcket. Därför utfördes en ny studie för att göra det lättare att övervaka vävnaden. Först placerades ett organ av Corti på ett plastlock, och sedan immobiliserades vävnaden på täcket genom att trycka på den återstående delen av Reissners membran som genererades under dissekeringen med hjälp av tång.
Detta möjliggjorde den stabila fastsättningen av Cortis organ till täckglaset så att en bild kunde förvärvas framgångsrikt genom konfokal mikroskopi. Även om vävnadskulturmetoden som presenteras här är en billig och tidsbesparande, tar utvecklingen av färdigheter i dissekering lite tid. Kända vävnadskulturmetoder inkluderar fastsättning av vävnaden genom att täcka täcket med poly-L-ornitin och laminin16; applicera organotypiska cellkulturinsatser som inte kräver lim- ellerbeläggningsmaterial 17 och därigenom eliminera behovet av självhäftande ämnen, vilket minskar explantskador; och med hjälp av ett vävnadslim bestående av proteiner som extraherats från marina musslor10. Detta protokoll kräver varken beläggningsmaterial eller organotypiska membran eller vävnadslim. en billig plastlock är tillräcklig. Bättre bilder kan förvärvas om en yta på 8 mm x 8 mm beaktas tillsammans med en Z-stapel av vävnadstjockleken i Cortis organ. Med tanke på den stora mängd data som ska lagras och lämplig tid för tidsfördröjning, förvärvades bilder av hela cellrörelser, med fokus på mscs istället för Cortis organ.
Resultaten i figur 4 verkar antyda att både Cortis och MSC:s organ kan visualiseras som tydliga videobilder när bilderna som tas är 2 mm långa och Z-stacken kombineras med en tidsfördröjning. Här, även om ett samkultursexperiment utfördes med MSC och en explant, kan den här inställningen tillämpas på olika celltyper eller villkor för framtida studier. Det kommer till exempel att bidra till att tillämpa detta protokoll för att undersöka effekterna av droger eller exosomer som skyddar skadorna av cochlea. Embryonala stamceller (EIC) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kan funktionellt och morfologiskt regenerera till mekanosensiiva hårcellsliknande celler18. Därför kan detta protokoll tillämpas för att studera differentiering av iPSCs eller EPC: er i auditiva hårceller eller stödceller. Denna ex vivo-metod kan hjälpa till att regenerativ medicin för att återställa hörseln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsanslag (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) från National Research Foundation (NRF) i Korea och Hallym University Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% Formalin | T&I | BPP-9004 | |
| Ampicillin | sigma | A5354-10ml | |
| BSA | sigma | A4503-100G | |
| confocal dish | SPL | 200350 | |
| confocal microscope | ZEISS | LSM800 | |
| coverslip | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild with DAPI | sigma | F6057 | |
| Forcep | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher scientific | 15630080 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Phalloidin-iFluor 647 Reagent | abcam | ab176759 | |
| Stage Top Incubator | TOKAI HIT | WELSX | |
| Strain C57BL/6 mouse messenchymal stem cells with GFP | cyagen | MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | T8787 |
References
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L.
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
- Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
- Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
- Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
- Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
- Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
- Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
- Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
