Summary
Eine präzise und reproduzierbare Methode zur in vivo Nukleoside/Nukleotidquantifizierung in Pflanzen wird hier beschrieben. Diese Methode verwendet eine HPLC-MS/MS.
Abstract
Nukleoside/Nukleotide sind Bausteine von Nukleinsäuren, Teilen von Cosubstraten und Coenzymen, Zellsignalmolekülen und Energieträgern, die an vielen Zellaktivitäten beteiligt sind. Hier beschreiben wir eine schnelle und zuverlässige Methode zur absoluten Qualifizierung von Nukleosid-/Nukleotidgehalten in Pflanzen. Kurz gesagt, 100 mg homogenisiertes Pflanzenmaterial wurden mit 1 ml Extraktionspuffer (Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1) extrahiert. Später wurde die Probe fünfmal in einem Gefriertrockner konzentriert und dann in eine HPLC-MS/MS injiziert. Nukleotide wurden auf einer porösen Graphitkohlenstoffsäule (PGC) und Nukleoside auf einer C18-Säule getrennt. Die Massenübergänge jedes Nukleosids und Nukleotids wurden massenspektrometisch überwacht. Die Gehalte der Nukleoside und Nukleotide wurden anhand ihrer externen Standards (ESTDs) quantifiziert. Mit dieser Methode können Forscher daher Nukleoside/Nukleotide in verschiedenen Pflanzen leicht quantifizieren.
Introduction
Nukleoside/ Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen, die die Vorläufer für Nukleinsäuren und viele Coenzyme wie Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) sind und wichtig für die Synthese von Makromolekülen wie Phospholipiden, Glykolipiden und Polysacchariden sind. Strukturell enthält Nukleosid eine Nukleobase, die ein Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin oder Thymin sein kann, und einen Zuckerteil, der eine Ribose oder eine Desoxyribose1,2sein kann. Nukleotide haben bis zu drei Phosphatgruppen, die an die 5-Kohlenstoff-Position des Zuckerteils der Nukleosidebinden 3. Der Stoffwechsel von Nukleotiden in Pflanzen ist essentiell für die Samenkeimung und das Blattwachstum4,5,6. Um ihre physiologische Rolle in der Pflanzenentwicklung besser zu verstehen, sollten die Methoden zur absoluten Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide in vivo etabliert werden.
Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze zur Messung von Nukleosiden/ Nukleotiden verwendet eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem ultraviolett-sichtbaren (UV-VIS)Detektor 4,7,8,9,10,11. Im Jahr 2013 quantifizierten Dahncke und Witte mit HPLC verschiedene Arten der Nukleoside in Arabidopsis thaliana7. Sie identifizierten einen erhöhten Guanosingehalt in einer T-DNA-Insertionsmutante, die auf das Guanosin-Deaminase-Gen abzielt, verglichen mit der Wildtyppflanze. Ein weiteres Pyrimidinnukleosid, Cytidin, wurde ebenfalls quantitativ in Pflanzen nachgewiesen, die diese Methode anwenden, was zur Identifizierung eines echten Cytidin-Deaminase-Gens4führte. Basierend auf dem UV-Detektor kann diese Methode jedoch nicht leicht die Nukleoside unterscheiden, die ähnliche Spektren und Retentionszeiten aufweisen, z. B. Guanosin oder Xanthosin. Die Nachweisgrenze der HPLC-Methode ist relativ hoch, daher wird sie häufig für die Messung eines hohen Gehalts an Nukleosiden in vivo wie Cytidin, Uridin und Guanosin verwendet.
Darüber hinaus kann die gaschromatographische gekoppelte Massenspektrometrie (GC-MS) auch in der Nukleosidmessung eingesetzt werden. Davon profitieren Hauck et. al. erfolgreich Uridin und Harnsäure, die ein nachgeschalteter Metabolit des Nukleosid-Katabolweges ist, in den Samen von A. thaliana12nachgewiesen wurden. GC wird jedoch normalerweise zur Trennung flüchtiger Verbindungen verwendet, ist jedoch nicht für die thermisch labilen Substanzen geeignet. Daher ist eine mit der Massenspektrometrie gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC-MS/MS) wahrscheinlich eine geeignetere und genauere Analysetechnik zur In-vivo-Identifizierung, Trennung und Quantifizierung der Nukleoside/Nukleotide13,14. Mehrere frühere Studien berichteten, dass eine HILIC-Säule für Nukleoside und Nukleotide-Trennung15,16 verwendet werden kann und isotopisch markierte interne Standards für die Compound-Quantifizierung17verwendet wurden. Beide Komponenten sind jedoch relativ teuer, insbesondere die kommerziellen isotopenmarkierten Standards. Hier berichten wir über einen wirtschaftlich anwendbaren LC-MS/MS-Ansatz zur Nukleoside/Nukleotid-Messung. Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide, einschließlich ATP, N6-Methyl-AMP, AMP, GMP, Uridin, Cytidin und Pseudouridin1, 5,6,18, in Pflanzen und Drosophilaeingesetzt. Darüber hinaus kann die Methode, über die wir hier berichten, auch in anderen Organismen angewendet werden.
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Protocol
1 Pflanzenwachstum und Materialsammlung
- Stellen Sie sicher, dass Arabidopsis-Samen für 10 Minuten in 70% Ethanol sterilisiert und auf die Agarplatten gesät werden, die mit halbstarken Murashige- und Skoog-Nährstoffen zubereitet wurden.
- Die Platten, die Arabidopsis-Samen enthalten, werden 48 h lang unter Dunkel bei 4 °C inkubiert und dann in eine kontrollierte Wachstumskammer unter 16 h Licht von 55 μmolm-2 s-1 bei 22 °C und 8 h dunkel bei 20 °C überführen.
- Ernten Sie 100 mg 2-wöchige Sämlinge (Frischgewicht) und frieren Sie in flüssigem Stickstoff für die Metabolitenextraktion ein.
VORSICHT: Forscher sollten handschuhe, schutzbrillen und einen Laborkittel angemessen tragen, um die Kontamination des menschlichen Gewebes während der Materialsammlung zu vermeiden.
2 Nukleoside/Nukleotidextraktion
- 100 mg gefrorenes Pflanzengewebe mit 7-8 Stahlperlen in einer vorkalten Mischermühle für 5 min bei einer Frequenz von 60 Hz gemahlen.
- Bereiten Sie die Extraktionslösung vor, die Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1 enthält.
- Die homogenisierten Materialien (einschließlich der meisten Metaboliten, aber nicht der Proteine) werden mit 1 ml Extraktionslösung resuspendiert.
- Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- 0,5 ml der Suspension in ein neues 1,5 ml Röhrchen geben und im flüssigen Stickstoff einfrieren.
- Die gefrorene Probe in einem Gefrierfärber verdampfen und in 0,1 ml 5% Acetonitril und 95% Wasser wieder auffüllen.
- Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung (0,1 ml) bei 40.000 x g für 10 min bei 4 °C. Laden Sie den Überstand zur LC-MS/MS-Messung in eine Durchstechflasche.
3 LC-MS/MS Messung
- Bereiten Sie einen 10 mM Ammoniumacetatpuffer vor, indem Sie 1,1 g Ammoniumacetat in 2 L doppelt deionisiertem Wasser (mobile Phase A) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 9,5 x 10% Ammonium- und Acetatsäure ein.
- Bereiten Sie 2 L hochreines 100% Methanol (mobile Phase B1) für die Nukleosidemessung vor. Bereiten Sie auch 2 L hochreines 100% Acetonitril (Mobile Phase B2) für die Nukleotidmessung vor.
- Injizieren Sie 0,02 ml vorbehandelte Metabolitenextraktion jeder Probe aus Schritt 2.7 in ein HPLC-System mit Binärenpumpen (LC) in Verbindung mit einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
ACHTUNG: Das HPLC-System verwendet eine C18-Säule (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) Pufferung mit mobiler Phase A und B1 (Abbildung 1A) für die Nukleosidentrennung und verwendet eine poröse Graphitkohlenstoffsäule (PGC) (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) mit mobiler Phase A und B2 (Abbildung 1B) für die Nukleotidabscheidung. Jede Probe wurde dreimal für die technische Replikation injiziert. - Programmieren Sie die Methode wie in Tabelle 1 für die Spalte C18 und die Methode wie in Tabelle 2 für die SPALTE PGC dargestellt. Stellen Sie eine Durchflussrate von 0,65 mL min-1 ein.
HINWEIS: Die Massenübergänge (Tabelle 3) wurden mit einem Massenspektrometer überwacht. Die Massenspektrumanalysebedingungen von acht Nukleotiden und fünf Nukleotiden, die kanonische und modifizierte Nukleoside enthalten, sind in Tabelle 3aufgeführt. - Erfassen Sie die Spitzenbereiche jeder Zielverbindung (Abbildung 1).
4 Generierung der Standard-Kalibrierkurven
- Sechs Probenextraktionen, die nach der Beschreibung in Abschnitt 2 hergestellt wurden, bündeln und vortexieren. Dann aliquot es wieder auf sechs Extraktionen (gleiches Volumen), um jeden Hintergrund zu erhalten.
- Fügen Sie diesen sechs Extraktionen jeweils sechs verschiedene Konzentrationen jedes Standards hinzu und injizieren Sie sie nach Schritt 3.3 nacheinander.
- Erfassen Sie die Spitzenbereiche jedes Standards in unterschiedlichen Konzentrationen über die Massenübergänge, wie in den Schritten 3.4 und 3.5 beschrieben.
- Zeichnen Sie die Peakfläche gegen die Nominalkonzentration jedes Standards auf, um eine Sechs-Punkte-Kurve zu erzeugen.
HINWEIS: Die in Schritt 3.5 erfassten Spitzenbereiche von Nukleosiden/Nukleotiden sollten in den Bereich der Standardkalibrierungskurven fallen. - Berechnen Sie die Gleichung einer geraden Linie für jede Standardverbindung: Y = aX + b
5 Quantifizierung der Metaboliten
- Berechnen Sie den Inhalt der Metaboliten anhand der in Schritt 3.5 aufgezeichneten Peakfläche und der Gleichung aus Schritt 4.5.
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Representative Results
Hier zeigen wir beispielsweise die Identifizierungund Quantifizierung von N1-Methyladenosin, einem bekannten modifizierten Nukleosid, in 2 Wochen alten Arabidopsis Wildtyp -Sämlingen (Col-0). Das Massenspektrometrieprofil zeigt an, dass dieaus dem N1-Methyladenosin-Standard erzeugten Produktionen 150 m/z und 133 m/z betragen (Abbildung 2A), und das gleiche Profil wird auch bei der Col-0-Extraktion beobachtet (Abbildung 2B). Aufgrund der hohen Häufigkeit des Produktions von 150 m/z wird für die N1-Methyladenosin-Quantifizierung der Massenübergang von 282,1 bis150(m/z) gewählt. Darüber hinaus beträgt die Retentionszeit (RT) des Zielpeaks (Abbildung 3B) 7,05 min, was dem RT des N1-Methyladenosin-Standards entspricht (Abbildung 3A). Unter Berücksichtigung der oben genannten Daten zeigen wir,dass Wildtyp-Sämlinge in vivo N 1-Methyladenosin-Pool enthalten.
Eine Konzentrationsserievon N1-Methyladenosin-Standards (0, 1, 2,5, 5, 10 und 50 ng / ml) wurde in sechs Probenextraktionen zugegeben, die nach den Schritten 4.1 bzw. 4.2 hergestellt wurden (Abbildung 4A). 0,02 ml jeder Standardproben wurden in die LC-MS/MS injiziert, unddie erhöhten Spitzenbereiche von N1-Methyladenosin wurden gegen die Nominalkonzentrationen von N1-Methyadenosin-Standards aufgezeichnet. Die Gleichung der geraden Linie ist Y = 0,0004X - 0,163 (Abbildung 4B).
Drei Replikate von Col-0-Sämlingen wurden extrahiert und wie oben beschrieben vorbehandelt. Die Spitzenfläche vonN1-Methyladenosin in diesen drei Proben wurde mit 8.659, 12.147 und 12.711 aufgezeichnet. Unter Berücksichtigung der fünffachen Anreicherung während der Extraktion (siehe Schritte 2.5 und 2.6) und unter Verwendung der GleichungY = 0,0004X - 0,163 wurde die N1-Methyladenosinkonzentration in drei Wildtyplinien auf 0,66, 0,94 bzw. 0,98 ng/ml berechnet. Daher wurden 100 mg jeder Wildtyp-Sämlinge für die Extraktion verwendet und in 1 ml Extraktionspuffer resuspendiert. Daher wurden 8,6 ± 1,7 ng N1-Methyladenosin in 1 g 2 Wochen alter Arabidopsis-Wildtypsämlinge quantifiziert.
| Zeit | Durchfluss (ml min-1) | Mobile Phase A (%) | Mobile Phase B (Methanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabelle 1: Die Methode für die C18-Spalte. Schematische Darstellung der Lösungsmitteländerungen für das Gleichgewicht der C18-Säule. Mobile Phase A = 10 mM Ammoniumacetat, pH 9,5. Mobile Phase B = 100% Methanol.
| Zeit | Durchfluss (ml min-1) | Mobile Phase A (%) | Mobile Phase B (Acetonitril ) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabelle 2: Die Methode für die PGC-Spalte. Schematische Darstellung von Lösungsmitteländerungen für das Gleichgewicht der PGC-Säule. Mobile Phase A = 10mM Ammoniumacetat, pH 9,5. Mobile Phase B = 100% Acetonitril.
| Nukleoside/Nukleotide | Massenübergang (m/z) | Polarität | Fragmentor | Kollisionsenergie (eV) | Spannung des Zellbeschleunigers | Verweildauer (min) | Aufbewahrungsfenster (min) | Überwachungsmodus | |
| Vorläufer-Ionen | Produktion | ||||||||
| Adenosin | 268.1 | 136 | Positiv | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | Mrm |
| N1-Methyladenosin | 282.12 | 150 | Positiv | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | Mrm |
| Guanosin | 284.1 | 135 | Positiv | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | Mrm |
| O6-Methylguanosin | 298.12 | 166 | Positiv | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | Mrm |
| Inosin | 269.1 | 136.9 | Positiv | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | Mrm |
| Uridin | 245.21 | 133 | Positiv | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | Mrm |
| Pseudouridin | 245.21 | 125 | Positiv | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | Mrm |
| Cytidin | 244.2 | 112 | Positiv | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | Mrm |
| Amp | 348.07 | 136 | Positiv | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | Mrm |
| Gmp | 364.07 | 152 | Positiv | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | Mrm |
| Imp | 348.9 | 137 | Positiv | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | Mrm |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positiv | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | Mrm |
| Cmp | 324 | 112 | Positiv | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | Mrm |
Tabelle 3: MS-Analysebedingungen von Nukleosiden und Nukleotiden, die mit einem Massenspektrometer nachgewiesen wurden. Das Vorläuferion und das Produktion von acht Nukleotiden und sechs Nukleotiden sind hier aufgeführt und können von MS zur Identifizierung und Quantifizierung von Verbindungen überwacht werden.
Abbildung 1: Die chromatographischen Peaks von acht Nukleotiden und fünf Nukleotiden. Die Trennprofile von acht Nukleosiden durch die C18-Säule (A) und fünf Nukleotiden durch die PGC-Säule (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Identifizierung von N1-Methyladenosin durch Massenübergang. MS/MS-Spektren der Vorläuferionen m/z 282.1 und der Produktionen m/z 150und m/z 133, nachgewiesen aus N1-Methyladenosin-Standard(A)- und Col-0-Proben(B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der chromatographische Peak von N1-Methyladenosin. Der Massenübergang von 282,1 zu 150wurde auf N1-Methyladenosin-Quantifizierung überwacht. Die Retentionszeitenvon N1-Methyladenosin-Peaks in der Standard- und Probenmessung waren ähnlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erzeugung der N1-Methyladenosin-Standardkurve. (A) Sechs verschiedene Konzentrationen von N1-Methyladenosin wurden in jeweils sechs Probenextraktionsmatrizen zugegeben. Und die daraus resultierenden Anstiegsspitzenbereiche wurden aufgezeichnet. (B) Die Kalibrierkurve von N1-Methyladenosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Organismen enthalten verschiedene Nukleoside/ Nukleotide, einschließlich kanonischer und abweichender. Der Ursprung und die metabolischen Endpunkte von ihnen, insbesondere modifizierte Nukleoside, sind jedoch noch unklar. Darüber hinaus muss das aktuelle Verständnis der Funktion und Homöostase des Nukleoside/Nukleotidstoffwechsels noch erforscht und erweitert werden. Um sie zu untersuchen, muss eine präzise und goldstandardhafte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Metaboliten eingesetzt werden. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das das Massenspektrum für den Nachweis von Nukleotiden / Nukleotiden verwendet. Am Beispiel von N1-Methyladenosin konnte diese Methode bis zu 0,02 ng Standard nachweisen, und die Genauigkeit der Kalibrierkurve ist ziemlich hoch (R2 = 0,999; Abbildung 4B). Im Vergleich zur HPLC-Methode bietet ein MS-basiertes Protokoll eine viel bessere Nachweisgrenze und Genauigkeit. Noch wichtiger ist, dass diese Methode leicht von Forschern in einem biologischen Labor mit LC-MS / MS durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann es auch zur Identifizierung anderer Strukturen verwendet werden, die bekannten Metaboliten in Pflanzen bekannt sind.
Für die absolute In-vivo-Quantifizierung des Nukleoside-/Nukleotidgehalts sind handelsübliche Standardchemikalien erforderlich. Sie erzeugen die geraden Standardkurven, die es ermöglichen, die Zielmetaboliten in Proben durch Massenspektrometrie aufgezeichnete Peakbereiche zu berechnen. Es ist wichtig, dass der Bereich der Peakbereiche in Standardkalibrierungskurven den Peakbereich des in MS abgelesenen Zielmetaboliten abdeckt. Darüber hinaus sollte den Probenextraktionen eine Konzentrationsreihe von Standards hinzugefügt, aber nicht in Wasser zur Erzeugung der Kalibrierkurve gelöst werden. Dies liegt daran, dass dadurch der Matrixeffekt vermieden wird, der für die Quantifizierungsgenauigkeit enorm wichtig ist.
Die hier beschriebene Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Quantifizierung von Nukleotiden/Nukleotiden. Seine Anwendung kann sich auf alle Pflanzen und sogar andere Organismen erstrecken. Das gesamte Verfahren der Probenvorbehandlung muss kalt und schnell bleiben, um den Abbau von Metaboliten zu vermeiden, obwohl der Extraktionspuffer 80% organische Chemikalien enthält, die die meisten Proteine (Enzyme) ausfallen könnten. Diese Methode eignet sich jedoch nicht zur unbekannten Zielidentifikation. Die Identifizierung und Quantifizierung der Zielchemikalie in dieser Methode hängt weitgehend von den kommerziellen chemischen Standards ab. Eine weitere Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass die Messung von Nukleotiden und Nukleotiden getrennt durch Verwendung einer C18-Säule bzw. einer PGC-Säule erfolgen muss. Denn die Leistung der C18-Säule ist zwar stabiler und reproduzierbarer als die PGC-Säule, letztere konnte insbesondere Nukleotide deutlich besser unterscheiden(Abbildung 1B).
Zusammenfassend ermöglicht die vorgestellte Methode die In-vivo-Quantifizierung von Nukleosiden/Nukleotiden in Pflanzen. Vom Sämlingswachstum bis zum Erzielen der Endergebnisse können die Experimente innerhalb von 3 Wochen abgeschlossen werden. Komplette Probenvorbehandlungen und LC-MS/MS-Analysen dauern etwa 2 Tage für einen Satz von 10 bis 20 Proben.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Grundlagenforschungsfonds für die Zentralen Universitäten (KJQN202060), die National Natural Science Foundation of China (31900907), die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20190528), das International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) bis M.C. und die Fundamental Research Funds for the Central Universities (LGZD202004) bis X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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