Summary
Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.
Abstract
Nükleozidler/nükleotitler, nükleik asitlerin yapı taşları, kosubstratların ve koenzimlerin parçaları, hücre sinyal molekülleri ve birçok hücre faaliyetinde yer alan enerji taşıyıcılarıdır. Burada, bitkilerdeki nükleozid/ nükleotid içeriğinin mutlak kalifikasyon için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Kısaca, 100 mg homojenize bitki materyali 1 mL ekstraksiyon tamponu (metanol, asetonitril ve su 2:2:1 oranında) ile çıkarıldı. Daha sonra, örnek bir dondurarak kurutucuda beş kez yoğunlaştı ve daha sonra bir HPLC-MS/MS'e enjekte edildi. Her nükleozid ve nükleotitin kütle geçişleri kütle spektrometresi ile izlendi. Nükleozidlerin ve nükleotitlerin içeriği dış standartlarına (ESTD' ler) göre ölçüldür. Bu nedenle, araştırmacılar bu yöntemi kullanarak farklı bitkilerdeki nükleozidleri / nükleotitleri kolayca ölçebilirler.
Introduction
Nükleozidler/Nükleotitler, nükleik asitlerin ve nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi birçok koenzim için öncü olan ve fosfolipidler, glikolipidler ve polisakkaritler gibi makromoleküllerin sentezinde önemli olan tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Yapısal olarak, nükleozid, adenin, guanin, urasil, sitozin veya timin olabilen bir nükleobase ve riboz veya deoksiriboz1,2olabilen bir şeker moiety içerir. Nükleotitler, nükleozidlerin şeker moietysinin 5 karbon pozisyonuna bağlı en fazla üç fosfat grubuna sahiptir3. Bitkilerdeki nükleotitlerin metabolizması tohum çimlenmesi ve yaprak büyümesi için gereklidir4,5,6. Bitki gelişimindeki fizyolojik rollerini daha iyi anlamak için, vivo olarak farklı nükleozidlerin / nükleotitlerin mutlak nicelemesi için yöntemler oluşturulmalıdır.
Nükleozidleri/nükleotidleri ölçmek için en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, ultraviyole görünür (UV-VIS) dedektör 4 ,7,8,9,10,11ile birlikte yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) kullanmaktadır. 2013 yılında, HPLC, Dahncke ve Witte kullanarak Arabidopsis thaliana7'dekinükleozidlerin çeşitli türlerini ölçtü. Vahşi tip bitkiye kıyasla guanosin deaminaz geninde hedef alan bir T-DNA ekleme mutantında gelişmiş bir guanosin içeriği tespit ettiler. Başka bir pirimidin nükleozid, sitidin, bu yöntemi kullanan bitkilerde nicel olarak tespit edildi, bu da iyi niyetli bir sitidin deaminaz geninin tanımlanmasıyla sonuçlandı4. Bununla birlikte, UV dedektörüne dayanarak, bu yöntem, guanosin veya ksantozin gibi benzer spektrumlara ve tutma sürelerine sahip nükleozidleri kolayca ayırt edemez. HPLC yönteminin algılama sınırı nispeten yüksektir, bu nedenle, sitidin, uridin ve guanosin gibi yüksek miktarda nükleozid in vivo ölçümü için sıklıkla kullanılır.
Ayrıca çekirdek ölçümünde kütle spektrometresi (GC-MS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi de kullanılabilir. Bundan faydalanmak, Hauck ve diğerleri. al. A. thaliana12tohumlarında nükleozid katabolik yolun aşağı akış metabolit olan uridin ve ürik asit başarıyla tespit edildi. Bununla birlikte, GC normalde uçucu bileşikleri ayırmak için kullanılır, ancak termal olarak labile maddeler için uygun değildir. Bu nedenle, kütle spektrometresi (LC-MS/ MS) ile birleştirilmiş bir sıvı kromatografisi muhtemelen nükleozidlerin / nükleotitlerin13,14'ünin vivo tanımlanması, ayrılması ve nicelleştirilmesi için daha uygun ve doğru bir analitik tekniktir. Daha önceki birkaç çalışmada, nükleozidler ve nükleotidler ayrımı için bir HILIC sütununun kullanılabileceği bildirilmiştir15,16 ve izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar bileşik niceleme içinkullanılmıştır 17. Bununla birlikte, her iki bileşen de nispeten pahalıdır, özellikle ticari izotop etiketli standartlar. Burada nükleozidler/nükleotidler ölçümü için ekonomik olarak uygulanabilir bir LC-MS/MS yaklaşımı rapor ediyoruz. Bu yöntem, atp, N 6 -metil-AMP, AMP, GMP, üridin, sittin ve psödouridine 1 ,5,6,18, bitkilerde ve Drosophiladahil olmak üzere çeşitli nükleozidlerin / nükleotidlerin niceliği için zaten başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz yöntem diğer organizmalarda da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Bitki büyümesi ve malzeme toplama
- Arabidopsis tohumlarının 10 dakika boyunca% 70 etanolde sterilize edildiğinden ve yarı mukavemetli Murashige ve Skoog besinleri ile hazırlanan agar plakalarına ekilmesinden emin olun.
- Arabidopsis tohumlarını 4 °C'de 48 saat boyunca karanlık altında kuluçkaya yatırın ve ardından 22 °C'de 55 μmol m-2 s -1 ve 20 °C'de 8 saat karanlık olan16 saat ışığı altında kontrollü bir büyüme odasına aktarın.
- 100 mg 2 haftalık fide (taze ağırlık) hasat edin ve metabolit ekstraksiyonu için sıvı nitrojende dondurun.
DİkKAT: Araştırmacılar, malzeme toplama sırasında insan dokusu kirlenmesini önlemek için uygun şekilde eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymelidir.
2 Nükleozid/Nükleotid ekstraksiyonu
- 100 mg dondurulmuş bitki dokusunu 7-8 çelik boncuk ile soğuk öncesi bir karıştırıcı değirmeninde 60 Hz frekansta 5 dakika öğütin.
- Metanol, asetonitril ve su içeren ekstraksiyon çözeltisini 2:2:1 oranında hazırlayın.
- Homojenize malzemeleri (çoğu metabolit dahil ancak proteinler dahil) 1 mL ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden kullanın.
- Elde ettiği çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin.
- Süspansiyonun 0,5 mL'lik kısmını yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve sıvı nitrojende dondurun.
- Donmuş numuneyi donmuş bir boyada buharlaştırın ve % 5 asetonitril ve% 95 su ile 0,1 mL'de yeniden depolayın.
- Elde eden çözeltiyi (0,1 mL) 40.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. LC-MS/MS ölçümü için süpernatant'ı bir şişeye yükleyin.
3 LC-MS/MS ölçümü
- 2 L çift deiyonize suda (Mobil faz A) 1,1 g amonyum asetat eriterek 10 mM amonyum asetat tamponu hazırlayın. pH'ı %10 amonyum ve asetat asit ile 9,5'e ayarlayın.
- Nükleozid ölçümü için 2 L ultra saf %100 metanol (Mobil faz B1) hazırlayın. Ayrıca nükleotid ölçümü için 2 L ultra saf %100 asetonitril (Mobil faz B2) hazırlayın.
- Adım 2.7'den her numunenin önceden işlenmiş metabolit ekstraksiyonunun 0.02 mL'lik kısmını, üçlü dörtlü kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş ikili pompalar (LC) ile bir HPLC sistemine enjekte edin.
DİkKAT: HPLC sisteminde C18 sütunu (50 x 4,6 mm, parçacık boyutu 5 μm; çekirdek ayrımı için mobil faz A ve B1 (Şekil 1A) ile 25 °C'de tamponlamada çalışmak ve çekirdeğe ayrılması için mobil faz A ve B2(Şekil 1B)ile gözenekli bir grafitik karbon (PGC) sütunu (50 x 4.6 mm, partikül boyutu 5 μm; 25 °C'de çalışmak) kullanın. Her örnek teknik çoğaltma için üç kez enjekte edildi. - Yöntemi C18 sütunu için Tablo 1'de gösterildiği gibi ve PGC sütunu için Tablo 2'de gösterildiği gibi programlayın. 0,65 mL min-1akış hızı ayarlayın.
NOT: Kütle geçişleri (Tablo 3) kütle spektrometresi ile izlendi. Sekiz nükleozid ve kanonik olanları ve değiştirilmiş olanları içeren beş nükleotitlerin kütle spektrum analiz koşulları Tablo 3'telistelenmiştir. - Her hedef bileşiğin tepe alanlarını kaydedin (Şekil 1).
4 Standart kalibrasyon eğrilerinin üretimi
- Bölüm 2'deki açıklamanın ardından üretilen havuz altı örnek ekstraksiyonu ve girdap. Sonra, her arka planı almak için tekrar altı ekstraksiyona (aynı hacim) aliquot.
- Bu altı ekstraksiyona sırasıyla her standartın altı farklı konsantrasyonu ekleyin ve 3.3 adımını takiben bunları tek tek enjekte edin.
- 3.4 ve 3.5. adımlarda açıklandığı gibi kütle geçişleri yoluyla her standardın en yüksek alanlarını farklı konsantrasyonlarda kaydedin.
- Altı noktalı bir eğri oluşturmak için tepe alanını her standardın nominal konsantrasyonuna göre çizin.
NOT: 3.5 adımında kaydedilen nükleozidlerin/nükleotitlerin tepe alanları standart kalibrasyon eğrileri aralığına düşmelidir. - Her standart bileşik için düz bir çizgi denklemini hesaplayın: Y = aX + b
5 Metabolitlerin nicelemesi
- 3.5 adımında kaydedilen tepe alanını ve 4.5 adımındaki denklemi kullanarak metabolitlerin içeriğini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, 2 haftalık Arabidopsis vahşi tip (Col-0) fidanlarında bilinen bir modifiye nükleozid olan N1-metildenozinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini örnek olarak gösteriyoruz. Kütle spektrometresi profili, N1-metildenozin standardından üretilen ürün iyonlarının 150 m/z ve 133 m/z (Şekil 2A) olduğunu ve aynı profilin Col-0 ekstraksiyonunda da gözlendiğini gösterir (Şekil 2B). 150 m/z'lik ürün iyonunun yüksek bolluğu nedeniyle, N 1 -metildenozin nicelemesi için 282,1 ila150(m/z) kütle geçişi seçilir. Ek olarak, hedef tepenin tutma süresi (RT) (Şekil 3B) 7,05 dk'dır, bu da N1-metildenozin standardının RT'si ile aynıdır (Şekil 3A). Yukarıda belirtilen verileri göz önünde bulundurarak, yabani tip fidelerin in vivo N1-metildenozin havuzu içerdiğini gösteriyoruz.
Sırasıyla 4.1 ve4.2adımlarını takiben üretilen altı örnek ekstraksiyonuna N 1 -metildenozin standartlarında (0, 1, 2.5, 5, 10 ve 50 ng / mL) bir konsantrasyon serisi eklenmiştir (Şekil 4A). Her standart numunenin 0.02 mL'si LC-MS/MS'e enjekte edildi ve N1-metildenozin'in artan tepe alanları N1-metiyadenozin standartlarının nominal konsantrasyonlarına göre çizildi. Düz çizginin denklemi Y = 0.0004X - 0.163 (Şekil 4B) 'dir.
Col-0 fidelerinin üç çoğaltılması, yukarıda açıklandığı gibi ayıklandı ve ön işlemden geçirildi. Bu üç örnekte N1-metildenozinin pik alanı 8.659, 12.147 ve 12.711 olarak kaydedildi. Ekstraksiyon sırasında beş kez zenginleştirme göz önüne alındığında (bkz. adımlar 2.5 ve 2.6) ve Y = 0.0004X - 0.163 denklemi kullanılarak, N1-metildenozin konsantrasyonu sırasıyla 0.66, 0.94 ve 0.98 ng / mL olmak üzere üç vahşi tip çizgide hesaplanmıştır. Bu nedenle, her vahşi tip fidenin 100 mg'ı ekstraksiyon için kullanıldı ve 1 mL ekstraksiyon tamponunda yeniden kullanıldı. Bu nedenle, 2 haftalık Arabidopsis yabani tip fidelerinin1 g'ında 8.6± 1.7 ng N 1 -metildenozin ölçüldü.
| Saat | Akış hızı (mL min-1) | Mobil faz A (%) | Mobil faz B (metanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tablo 1: C18 sütunu için yöntem. C18 sütununun dengelanması için çözücü değişikliklerinin şematik gösterimi. Mobil faz A = 10 mM amonyum asetat, pH 9.5. Mobil faz B = %100 metanol.
| Saat | Akış hızı (mL min-1) | Mobil faz A (%) | Mobil faz B (asetonitril %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tablo 2: PGC sütunu için yöntem. PGC sütununun dengelanması için çözücü değişikliklerinin şematik gösterimi. Mobil faz A = 10mM amonyum asetat, pH 9.5. Mobil faz B = %100 asetonitril.
| Nükleozidler/nükleotidler | Toplu geçiş (m/z) | Po -larite | Parçalayıcı | Çarpışma enerjisi (eV) | Hücre Hızlandırıcı gerilimi | Saklama süresi (min) | Bekletme Penceresi (min) | İzleme Modu | |
| Öncü iyon | Ürün iyonu | ||||||||
| adenozin | 268.1 | 136 | Pozitif | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-metildenozin | 282.12 | 150 | Pozitif | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| guanosine | 284.1 | 135 | Pozitif | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-metilguanosine | 298.12 | 166 | Pozitif | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| inozin | 269.1 | 136.9 | Pozitif | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| uridine | 245.21 | 133 | Pozitif | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| psödoouridine | 245.21 | 125 | Pozitif | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| sitidin | 244.2 | 112 | Pozitif | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| Amp | 348.07 | 136 | Pozitif | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP | 364.07 | 152 | Pozitif | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| ımp | 348.9 | 137 | Pozitif | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Pozitif | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | Pozitif | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
Tablo 3: Kütle spektrometresi ile tespit edilen nükleozidlerin ve nükleotitlerin MS analiz koşulları. Sekiz nükleozid ve altı nükleotitin öncül iyonu ve ürün iyonu burada listelenmiştir ve bileşik tanımlama ve niceleme için MS tarafından izlenebilir.
Şekil 1: Sekiz nükleozid ve beş nükleotit kromatografik zirveler. Sekiz nükleozidden C18 sütununa (A) ve PGC sütununa göre beş nükleotite (B) göre ayırma profilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: N1-metildenozinin kütle geçişi ile tanımlanması. N 1 -metildenozin standardı (A) ve Col-0 örneklerinden (B) tespit edilen öncül iyon m/z 282.1 ve ürün iyonlarım/z 150ve m/z 133'ün MS/MS spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: N1-metildenozinin kromatografik zirvesi. 282.1'den 150'ye toplu geçiş N1-metildenozin nicelleşmesi için izlendi. Standart ve numune ölçümündeN 1-metildenozin zirvelerinin tutma süreleri benzerdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: N1-metildenozin standart eğrisinin üretimi. (A) Altı örnek ekstraksiyon matrisine sırasıyla altı farklıN 1-metildenozin konsantrasyonu eklendi. Ve ortaya çıkan artış pik alanları kaydedildi. (B) N1-metildenozin kalibrasyon eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organizmalar, kanonik ve sapkın olanlar da dahil olmak üzere çeşitli nükleozidler / nükleotitler içerir. Bununla birlikte, bunların kökeni ve metabolik uç noktaları, özellikle modifiye nükleozidler, hala belirsizdir. Ayrıca, nükleozidler/ nükleotid metabolizmasının fonksiyonu ve homeostazının mevcut anlayışı araştırılmak ve genişletilmeye devam etmektedir. Bunları araştırmak için, bu metabolitlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesi için kesin ve altın standartlı bir yöntemin kullanılmalıdır. Burada nükleozidler/nükleotidlerin tespiti için kitle spektrumu kullanılarak yapılan bir protokol açıkladık. Örnek olarak N1-metildenozin alınarak, bu yöntem 0,02 ng standardı kadar düşük bir standart algılayabilir ve kalibrasyon eğrisinin doğruluğu oldukça yüksektir (R2 = 0,999; Şekil 4B). HPLC yöntemi ile karşılaştırıldığında, MS tabanlı bir protokol çok daha iyi algılama sınırı ve doğruluk sağlar. Daha da önemlisi, bu yöntem araştırmacılar tarafından LC-MS/MS'e sahip biyolojik bir laboratuvarda kolayca gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bitkilerde metabolitler olarak bilinen diğer yapıların tanımlanması için de kullanılabilir.
Nükleozid/nükleotid içeriğinin in vivo mutlak nicelemesi için ticari standart kimyasallar gereklidir. Kütle spektrometresi tarafından kaydedilen tepe bölgelerinden numunelerdeki hedef metabolitleri hesaplamaya izin veren düz standart eğrileri üretirler. Standart kalibrasyon eğrilerindeki tepe alanlarının aralığının MS'te okunan hedef metabolit alanını kapsaması önemlidir. Ayrıca, numune ekstraksiyonlarına bir konsantrasyon standartları eklenmeli, ancak kalibrasyon eğrisi üretimi için suda çözülmemelidir. Bunun nedeni, nicelik doğruluğu için son derece önemli olan matris etkisini önleyecek olmasıdır.
Burada açıklanan yöntem nükleozidler/nükleotidlerin nicelleştirilmesi için güçlü bir araç sağlar. Uygulaması tüm bitkilere ve hatta diğer organizmalara kadar uzanabilir. Ekstraksiyon tamponu proteinlerin (enzimlerin) çoğunu çökeltebilecek% 80 organik kimyasallar içermesine rağmen, numunelerin ön tedavisinin tüm prosedürünün metabolit bozulmasını önlemek için soğuk ve hızlı kalması gerekir. Ancak, bu yöntem bilinmeyen hedef tanımlama için uygun değildir. Bu yöntemde hedef kimyasalın tanımlanması ve nicelleştirilmesi büyük ölçüde ticari kimyasal standartlara bağlıdır. Bu yöntemin bir başka sınırlaması, nükleozidlerin ve nükleotidlerin ölçümünün sırasıyla bir C18 sütunu ve bir PGC sütunu kullanılarak ayrı ayrı yapılması gerektiğidir. Bunun nedeni, C18 sütununun performansının PGC sütunundan daha kararlı ve tekrarlanabilir olmasına rağmen, ikincisinin özellikle nükleotitleri çok daha iyi ayırt edebildiğidir (Şekil 1B).
Sonuç olarak, sunulan yöntem bitkilerde nükleozidlerin / nükleotitlerin in vivo olarak ölçülmesini sağlar. Fidelerin büyümesinden nihai sonuçların elde edilmesine kadar, deneyler 3 hafta içinde tamamlanabilir. Komple numune ön tedavileri ve LC-MS/MS analizleri 10 ila 20 örnek seti için yaklaşık 2 gün sürer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (KJQN202060), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900907), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20190528), Uluslararası Genetik Mühendisliği ve Biyoteknoloji Merkezi (CRP/CHN20-04_EC) tarafından M.C., ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (LGZD202004) X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
