Summary
Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.
Abstract
Nucleosídeos/nucleotídeos são blocos de construção de ácidos nucleicos, partes de cosubstrates e coenzimas, moléculas de sinalização celular e portadores de energia, que estão envolvidos em muitas atividades celulares. Aqui, descrevemos um método rápido e confiável para a qualificação absoluta do conteúdo nucleosídeo/nucleotídeo nas plantas. Resumidamente, 100 mg de material vegetal homogeneizado foram extraídos com 1 mL de tampão de extração (metanol, acetonitrilo e água a uma razão de 2:2:1). Mais tarde, a amostra foi concentrada cinco vezes em um secador congelado e, em seguida, injetada em um HPLC-MS/MS. Nucleotídeos foram separados em uma coluna de carbono grafitado poroso (PGC) e nucleosídeos foram separados em uma coluna C18. As transições em massa de cada nucleosídeo e nucleotídeo foram monitoradas pela espectrometria de massa. O conteúdo dos nucleosídeos e nucleotídeos foram quantificados em relação aos seus padrões externos (ESTDs). Usando este método, portanto, os pesquisadores podem facilmente quantificar nucleosídeos/nucleotídeos em diferentes plantas.
Introduction
Nucleosídeos/Nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos, que são os precursores de ácidos nucleicos e muitos coenzymes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), e importante na síntese de macromoléculas como fosfolipídios, glicólipídios e polissacarídeos. Estruturalmente, o nucleosídeo contém uma nucleobase, que pode ser uma adenina, guanina, uracil, citosina ou timina, e um moiety de açúcar, que pode ser uma ribose ou uma desoxiribose1,2. Os nucleotídeos têm até três grupos fosfatos ligados à posição de 5 carbonos da moiety açucarada dos nucleosídeos3. O metabolismo dos nucleotídeos nas plantas é essencial para a germinação de sementes e o crescimento da folha4,5,6. Para entender melhor seus papéis fisiológicos no desenvolvimento das plantas, devem ser estabelecidos os métodos para a quantificação absoluta de diferentes nucleosídeos/nucleotídeos in vivo.
Uma das abordagens mais utilizadas para medir nucleosídeos/nucleotídeos emprega uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) juntamente com um detector ultravioleta visível (UV-VIS)detector 4,7,8,9,10,11. Em 2013, usando HPLC, Dahncke e Witte quantificaram vários tipos de nucleosídeos em Arabidopsis thaliana7. Eles identificaram um conteúdo melhorado de guanosina em um mutante de inserção T-DNA no gene guanosina deaminase em comparação com a planta do tipo selvagem. Outro nucleosídeo pirimidina, o citidina, também foi detectado quantitativamente nas plantas que empregam esse método, o que resultou na identificação de um gene deaminase de citidina de boa fé 4. Com base no detector UV, este método, no entanto, não pode distinguir facilmente os nucleosídeos que têm espectros e tempos de retenção semelhantes, por exemplo, guanosina ou xanthosina. O limite de detecção do método HPLC é relativamente alto, portanto, é frequentemente utilizado para a medição de alto teor de nucleosídeos in vivo, como citidina, uridina e guanosina.
Além disso, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) também pode ser usada na medição nucleosídea. Beneficiando-se disso, Hauck et. al. detectou com sucesso uridina e ácido úrico, que é um metabólito a jusante da via catabólica nucleosídeo, nas sementes de A. thaliana12. No entanto, o GC é normalmente usado para separar compostos voláteis, mas não é adequado para as substâncias termicamente labile. Portanto, uma cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) é provavelmente uma técnica analítica mais adequada e precisa para a identificação in vivo, separação e quantificação dos nucleosídeos/nucleotídeos13,14. Vários estudos anteriores relataram que uma coluna HILIC pode ser usada para a separação de nucleosídeos e nucleotídeos15,16 e padrões internos isotopicamente rotulados foram empregados para a quantificação composta17. No entanto, ambos os componentes são relativamente caros, especialmente os padrões comerciais rotulados de isótopos. Aqui, relatamos uma abordagem LC-MS/MS economicamente aplicável para medição de nucleosídeos/nucleotídeos. Este método já foi utilizado com sucesso para a quantitação de diversos nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, em plantas e Drosophila. Além disso, o método que relatamos aqui também pode ser usado em outros organismos.
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Protocol
1 Crescimento de plantas e coleta de materiais
- Certifique-se de que as sementes arabidopsis sejam esterilizadas em 70% de etanol por 10 minutos e semeadas nas placas de ágar, que foram preparadas com nutrientes Murashige e Skoog de meia-resistência.
- Incubar as placas contendo sementes arabidopsis sob escuras a 4 °C por 48 h, e depois transferi-las para uma câmara de crescimento controlada sob luz de 16 h de luz de 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C e 8h escuras a 20 °C.
- Colher 100 mg de mudas de 2 semanas (peso fresco) e congelar em nitrogênio líquido para extração de metabólitos.
ATENÇÃO: Os pesquisadores devem usar luvas, óculos de proteção e um jaleco para evitar a contaminação do tecido humano durante a coleta de materiais.
2 Extração de nucleosídeos/nucleotídeos
- Moído 100 mg de tecidos vegetais congelados com 7-8 contas de aço em um moinho de mistura pré-frio por 5 min a uma frequência de 60 Hz.
- Prepare a solução de extração, que contém metanol, acetonitrila e água em uma proporção de 2:2:1.
- Resuspengem os materiais homogeneizados (incluindo a maioria dos metabólitos, mas não proteínas) com 1 mL de solução de extração.
- Centrifugar a solução resultante a 12.000 x g para 15 min a 4 °C.
- Transfira 0,5 mL da suspensão para um novo tubo de 1,5 mL e congele no nitrogênio líquido.
- Evaporar a amostra congelada em um dique congelado e resuspend em 0,1 mL de acetonitrilo de 5% e 95% de água.
- Centrifugar a solução resultante (0,1 mL) a 40.000 x g por 10 min a 4 °C. Carregue o supernatante em um frasco para a medição LC-MS/MS.
3 medição LC-MS/MS
- Prepare um tampão de acetato de amônio de 10 mM dissolvendo 1,1 g de acetato de amônio em 2 L de água desionizada dupla (fase móvel A). Ajuste o pH para 9,5 por 10% de amônio e ácido acetato.
- Prepare 2 L de ultrapure 100% metanol (fase móvel B1) para medição de nucleosídeos. Além disso, prepare 2 L de ultrapure 100% acetonitrila (fase móvel B2) para medição de nucleotídeos.
- Injete 0,02 mL de extração de metabólitos pré-tratados de cada amostra da etapa 2.7 em um sistema HPLC com bombas binárias (LC) juntamente com um espectrômetro de massa quadrupole triplo (MS).
ATENÇÃO: O sistema HPLC emprega uma coluna C18 (50 x 4,6 mm, tamanho da partícula 5 μm; trabalhando a 25 °C) tampão com fase móvel A e B1(Figura 1A) para a separação dos nucleosídeos e usar uma coluna de carbono grafítico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, tamanho da partícula 5 μm; trabalhando a 25 °C) com fase móvel A e B2(Figura 1B) para a separação de nucleotídeos. Cada amostra foi injetada três vezes para a replicação técnica. - Programe o método conforme mostrado na Tabela 1 para a coluna C18 e o método conforme mostrado na Tabela 2 para a coluna PGC. Estabeleça uma taxa de fluxo de 0,65 mL min-1.
NOTA: As transições de massa(Tabela 3)foram monitoradas pelo espectrômetro de massa. As condições de análise de espectro de massa de oito nucleosídeos e cinco nucleotídeos contendo os canônicos e os modificados estão listados na Tabela 3. - Regissão de pico de cada composto alvo(Figura 1).
4 Geração das curvas de calibração padrão
- Agrupar seis extrações de amostras juntas, que foram produzidas seguindo a descrição na seção 2, e vórtice. Em seguida, aliquot-lo a seis extrações (mesmo volume) novamente para obter cada fundo.
- Adicione seis concentrações diferentes de cada padrão a essas seis extrações, respectivamente, e injete-as uma a uma etapa seguinte 3.3.
- Regissão das áreas de pico de cada padrão em diferentes concentrações através das transições em massa, conforme descrito nas etapas 3.4 e 3.5.
- Plote a área de pico contra a concentração nominal de cada padrão para gerar uma curva de seis pontos.
NOTA: As áreas de pico de nucleosídeos/nucleotídeos registradas na etapa 3.5 devem cair na faixa das curvas de calibração padrão. - Calcule a equação de uma linha reta para cada composto padrão: Y = aX + b
5 Quantificação de Metabólitos
- Calcule o conteúdo dos metabólitos utilizando a área de pico registrada na etapa 3.5 e a equação da etapa 4.5.
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Representative Results
Aqui, mostramos a identificação e quantificação da N1-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas silvestres arabidopsis de 2 semanas de idade (Col-0) como exemplo. O perfil de espectrometria de massa indica que os íons do produto gerados a partir do padrão N1-metiladenosina são de 150 m/z e 133 m/z (Figura 2A),e o mesmo perfil também é observado na extração Col-0(Figura 2B). Devido à alta abundância do íon do produto de 150 m/z, a transição em massa de 282,1 para 150 (m/z) é selecionada para a quantificação N1-metiladenosina. Além disso, o tempo de retenção (RT) do pico alvo (Figura 3B) é de 7,05 min, o mesmo que o RT do padrão N1-metiladenosine(Figura 3A). Considerando os dados mencionados acima, demonstramos que as mudas do tipo selvagem contêm in vivo N1-piscina de metiladenosina.
Uma série de concentração de n1-metiladenosine (0, 1, 2,5, 5, 10 e 50 ng / mL) foi adicionada em seis extrações amostrais produzidas seguindo as etapas 4.1 e 4.2, respectivamente (Figura 4A). 0,02 mL de cada amostra padrão foi injetado no LC-MS/MS, e as áreas de pico aumentadas de N1-metiladenosina foram traçadas contra as concentrações nominais dos padrões n1-mehiadenosine. A equação da linha reta é Y = 0,0004X - 0,163 (Figura 4B).
Três réplicas de mudas Col-0 foram extraídas e pré-tratadas conforme descrito acima. A área de pico de N1-metiladenosina nessas três amostras foi registrada como 8.659, 12.147 e 12.711. Considerando o enriquecimento de cinco vezes durante a extração (ver etapas 2.5 e 2.6) e utilizando-se a equação Y = 0,0004X - 0,163, N1-concentração de metiladenosina foram calculadas em três linhas tipo selvagem para 0,66, 0,94 e 0,98 ng / mL, respectivamente. Assim, foram utilizadas 100 mg de cada muda de tipo selvagem para extração e resuspenquedas em tampão de extração de 1 mL. Portanto, 8,6 ± 1,7 ng de N1-metiladenosina foi quantificada em 1 g de mudas tipo arabidopsis de 2 semanas de idade.
| Hora | Taxa de fluxo (mL min-1) | Fase móvel A (%) | Fase móvel B (metanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabela 1: O método para a coluna C18. Representação esquemática de mudanças de solventes para o equilíbrio da coluna C18. Fase móvel A = acetato de amônio de 10 mM, pH 9,5. Fase móvel B = 100% metanol.
| Hora | Taxa de fluxo (mL min-1) | Fase móvel A (%) | Fase móvel B (acetonitrilo %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabela 2: O método para a coluna PGC. Representação esquemática de mudanças de solventes para o equilíbrio da coluna PGC. Fase móvel A = acetato de amônio de 10mM, pH 9,5. Fase móvel B = 100% acetonitrila.
| Núcleos/nucleotídeos | Transição em massa (m/z) | polaridade | Fragmentor | Energia de colisão (eV) | Tensão do acelerador de células | Tempo de retenção (min) | Janela de retenção (min) | Modo de monitoramento | |
| Íon precursor | Íon do produto | ||||||||
| adenosina | 268.1 | 136 | Positivo | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-metiladenosina | 282.12 | 150 | Positivo | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| guanosina | 284.1 | 135 | Positivo | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-metilguanosina | 298.12 | 166 | Positivo | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| Inosina | 269.1 | 136.9 | Positivo | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| uridina | 245.21 | 133 | Positivo | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| pseudouridina | 245.21 | 125 | Positivo | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| citidina | 244.2 | 112 | Positivo | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| AMP | 348.07 | 136 | Positivo | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP | 364.07 | 152 | Positivo | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| diabrete | 348.9 | 137 | Positivo | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positivo | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | Positivo | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
Tabela 3: Condições de análise de MS de nucleosídeos e nucleotídeos detectados pelo espectrômetro de massa. O íon precursor e o íon produto de oito nucleosídeos e seis nucleotídeos estão listados aqui e podem ser monitorados por MS para identificação e quantificação composta.
Figura 1: Os picos cromatográficos de oito nucleosídeos e cinco nucleotídeos. Os perfis de separação de oito nucleosídeos pela coluna C18 (A)e cinco nucleotídeos pela coluna PGC(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de N1-metiladenosina por transição de massa. Espectros MS/MS de íon precursor m/z 282,1 e íons de produto m/z 150 e m/z 133 detectados a partir das amostras N1-metiladenosina(A) e Col-0(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O pico cromatográfico de N1-metiladenosina. A transição em massa de 282,1 para 150 foi monitorada para quantificação de n1-metiladenosina. Os tempos de retenção dos picos de n1-metiladenosina no padrão e medição da amostra foram semelhantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Geração da curva padrão N1-metiladenosina. (A) Seis concentrações diferentes de N1-metiladenosina foram adicionadas em seis matrizes de extração amostral, respectivamente. E o aumento das áreas de pico foi registrado. (B) A curva de calibração de N1-metiladenosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os organismos contêm vários nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo os canônicos e aberrantes. No entanto, a origem e os pontos finais metabólicos deles, especialmente os nucleosídeos modificados, ainda são obscuros. Além disso, o entendimento atual da função e da homeostase do metabolismo nucleosídeos/nucleotídeos continua a ser explorado e expandido. Para investigá-los, é necessário utilizar um método preciso e padrão-ouro para esses metabólitos de identificação e quantificação. Aqui, descrevemos um protocolo usando o espectro de massa para detecção de nucleosídeos/nucleotídeos. Tomando n1-metiladenosina como exemplo, este método poderia detectar tão baixo quanto 0,02 ng padrão, e a precisão da curva de calibração é bastante alta (R2 = 0,999; Figura 4B). Em comparação com o método HPLC, um protocolo baseado em MS fornece um limite de detecção e precisão muito melhores. Mais importante, esse método pode ser facilmente realizado por pesquisadores em um laboratório biológico que possui LC-MS/MS. Além disso, também pode ser utilizado para a identificação de outras estruturas conhecidas em plantas.
Para a quantificação absoluta in vivo do conteúdo de nucleosídeos/nucleotídeos, são necessários produtos químicos padrão comercial. Eles produzem as curvas padrão retas, que permitem calcular os metabólitos em amostras através de áreas de pico registradas pela espectrometria de massa. É importante que a faixa de áreas de pico em curvas de calibração padrão deve cobrir a área de pico do meta metabólico lido em MS. Além disso, uma série de padrões de concentração devem ser adicionadas às extrações amostrais, mas não dissolvidas em água para geração de curvas de calibração. Isso porque evitará o efeito matricial, que é tremendamente significativo para a precisão da quantificação.
O método descrito aqui fornece uma ferramenta poderosa para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos. Sua aplicação pode se estender a todas as plantas e até mesmo a outros organismos. Todo o procedimento do pré-tratamento das amostras precisa permanecer frio e rápido para evitar a degradação dos metabólitos, embora o tampão de extração contenha 80% de produtos químicos orgânicos, o que poderia precipitar a maioria das proteínas (enzimas). No entanto, este método não é adequado para identificação de alvos desconhecidos. A identificação e quantificação de produtos químicos alvo neste método depende em grande parte das normas químicas comerciais. Outra limitação deste método é que a medição de nucleosídeos e nucleotídeos deve ser feita separadamente, empregando uma coluna C18 e uma coluna PGC, respectivamente. É porque o desempenho da coluna C18, embora seja mais estável e reprodutível que a coluna PGC, este último poderia especialmente distinguir nucleotídeos muito melhor(Figura 1B).
Em conclusão, o método apresentado permite quantificação in vivo de nucleosídeos/nucleotídeos nas plantas. Desde o crescimento das mudas até a obtenção dos resultados finais, os experimentos podem ser concluídos dentro de 3 semanas. As amostras completas pré-tratamentos e análises de LC-MS/MS levam cerca de 2 dias para um conjunto de 10 a 20 amostras.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (KJQN202060), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900907), a Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20190528), o Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia (CRP/CHN20-04_EC) para M.C., e os Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (LGZD202004) para X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
