Summary
En presis og reproduserbar metode for in vivo nukleosider/nukleotider kvantifisering i planter er beskrevet her. Denne metoden bruker en HPLC-MS/MS.
Abstract
Nukleosider/nukleotider er byggesteiner av nukleinsyrer, deler av kosubstrater og koenzymer, cellesignalmolekyler og energibærere, som er involvert i mange celleaktiviteter. Her beskriver vi en rask og pålitelig metode for absolutt kvalifisering av nukleosid/nukleotidinnhold i planter. Kort sagt ble 100 mg homogenisert plantemateriale ekstrahert med 1 ml ekstraksjonsbuffer (metanol, acetonitril og vann i forholdet 2:2:1). Senere ble prøven konsentrert fem ganger i en frysetørker og deretter injisert i en HPLC-MS/MS. Nukleotider ble separert på en porøs grafittisk karbonkolonne (PGC) og nukleosider ble separert på en C18-kolonne. Masseovergangene til hver nukleoside og nukleotid ble overvåket av massespektrometri. Innholdet i nukleosider og nukleotider ble kvantifisert mot deres eksterne standarder (ESTDs). Ved hjelp av denne metoden kan forskerne derfor enkelt kvantifisere nukleosider/nukleotider i forskjellige planter.
Introduction
Nukleosider/nukleotider er sentrale metabolske komponenter i alle levende organismer, som er forløperne for nukleinsyrer og mange koenzymer, som nikotinamid adenin dinukleotid (NAD), og viktig i syntesen av makromolekyler som fosfolipider, glykolipider og polysakkarider. Strukturelt inneholder nukleoside en nukleobase, som kan være en adenin, guanin, uracil, cytosin eller tymin, og en sukkermoiety, som kan være en ribose eller en deoxyribose1,2. Nukleotider har opptil tre fosfatgrupper som binder seg til 5-karbonposisjonen til sukkermoiety av nukleosidene3. Metabolismen av nukleotider i planter er avgjørende for frøspredning og bladvekst4,5,6. For bedre å forstå deres fysiologiske roller i planteutvikling, bør metodene for absolutt kvantifisering av ulike nukleosider/nukleotider in vivo etableres.
En av de mest brukte tilnærmingene for å måle nukleosider/nukleotider bruker en høyytelses væskekromatografi (HPLC) kombinert med en ultrafiolett synlig (UV-VIS)detektor 4,7,8,9,10,11. I 2013 kvantifiserte bruk av HPLC, Dahncke og Witte flere typer nukleosider i Arabidopsis thaliana7. De identifiserte et forbedret guanosininnhold i en T-DNA-innsettingsmutant rettet mot guanosindeaminasegenet sammenlignet med villtypeanlegget. En annen pyrimidinkjerne, cytidin, ble også kvantitativt påvist i planter som brukte denne metoden, noe som resulterte i identifisering av et bona fide cytidin deaminase gen4. Basert på UV-detektoren kan denne metoden imidlertid ikke lett skille nukleosidene som har lignende spektrum og oppbevaringstider, for eksempel guanosin eller xantosin. Deteksjonsgrensen for HPLC-metoden er relativt høy, derfor brukes den ofte til måling av høyt innhold av nukleosider in vivo, som cytidin, uridin og guanosin.
I tillegg kan gasskromatografi koblet til massespektrometri (GC-MS) også brukes i nukleosidmåling. Dra nytte av det, Hauck et. al. vellykket oppdaget uridin og urinsyre, som er en nedstrøms metabolitt av nukleoside katabolsk bane, i frøene til A. thaliana12. GC brukes imidlertid vanligvis til å skille flyktige forbindelser, men ikke egnet for de termisk labile stoffene. Derfor er en flytende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS /MS) sannsynligvis en mer egnet og nøyaktig analytisk teknikk for in vivo-identifisering, separasjon og kvantifisering av nukleosidene / nukleotidene13,14. Flere tidligere studier rapporterte at en HILIC-kolonne kan brukes til nukleosider og nukleotider separasjon15,16 og isotopisk merket interne standarder ble brukt for sammensatt kvantifisering17. Imidlertid er begge komponentene relativt dyre, spesielt de kommersielle isotopmerkede standardene. Her rapporterer vi en økonomisk anvendelig LC-MS/MS-tilnærming for nukleosider/nukleotider. Denne metoden har allerede blitt brukt til kvantitet av forskjellige nukleosider / nukleotider, inkludert ATP, N6-metyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidin og pseudouridin1,5,6,18, i planter og Drosophila. Videre kan metoden vi rapporterer her også brukes i andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Plantevekst og materialsamling
- Forsikre deg om at Arabidopsis frø steriliseres i 70% etanol i 10 min og sådd på agarplatene, som ble tilberedt med en halv styrke Murashige og Skoog næringsstoffer.
- Inkuber platene som inneholder Arabidopsis frø under mørke ved 4 °C i 48 timer, og overfør dem deretter til et kontrollert vekstkammer under 16 timers lys på 55 μmol m-2 s-1 ved 22 °C og 8 timer mørkt ved 20 °C.
- Høst 100 mg 2-ukers frøplanter (frisk vekt) og frys i flytende nitrogen for metabolittutvinning.
FORSIKTIG: Forskeren bør bruke hansker, vernebriller og en labfrakk på riktig måte for å unngå humanvevsforurensning under materialsamlingen.
2 Nukleosider/Nukleotider ekstraksjon
- Malt 100 mg frossent plantevev med 7-8 stålperler i en forkjølet mikserfabrikk i 5 min med en frekvens på 60 Hz.
- Forbered ekstraksjonsløsningen, som inneholder metanol, acetonitril og vann i forholdet 2:2:1.
- Resuspend de homogeniserte materialene (inkludert de fleste metabolitter, men ikke proteiner) med 1 ml ekstraksjonsløsning.
- Sentrifuger den resulterende oppløsningen ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
- Overfør 0,5 ml av suspensjonen til et nytt 1,5 ml rør og frys i det flytende nitrogenet.
- Fordamp den frosne prøven i en frysefargestoff og resuspend i 0,1 ml 5% acetonitril og 95% vann.
- Sentrifuger den resulterende løsningen (0,1 ml) ved 40 000 x g i 10 min ved 4 °C. Legg supernatanten i et hetteglass for LC-MS/MS-måling.
3 LC-MS/MS-måling
- Forbered en 10 mM ammoniumacetatbuffer ved å oppløse 1,1 g ammoniumacetat i 2 L dobbelt deionisert vann (mobil fase A). Juster pH til 9,5 med 10% ammonium og acetatsyre.
- Forbered 2 L ultraren 100% metanol (mobil fase B1) for nukleosidmåling. Forbered også 2 L ultraren 100% acetonitril (mobil fase B2) for nukleotider måling.
- Injiser 0,02 ml forhåndsbehandlet metabolittutvinning av hver prøve fra trinn 2.7 i et HPLC-system med binære pumper (LC) kombinert med et trippel quadrupole massespektrometer (MS).
FORSIKTIG: HPLC-systemet bruker en C18-kolonne (50 x 4,6 mm, partikkelstørrelse 5 μm; arbeid ved 25 °C) bufring med mobil fase A og B1 (Figur 1A) for nukleosidseparasjonen og bruk en porøs grafittisk karbonkolonne (PGC) (50 x 4,6 mm, partikkelstørrelse 5 μm, arbeid ved 25 °C) med mobil fase A og B2 (Figur 1B) for nukleotider separasjon. Hvert utvalg ble satt inn tre ganger for den tekniske replikeringen. - Programmer metoden som vist i tabell 1 for C18-kolonnen, og metoden som vist i tabell 2 for PGC-kolonnen. Angi en strømningshastighet på 0,65 ml min-1.
MERK: Masseovergangene (tabell 3) ble overvåket av massespektrometer. Massespektrumanalysebetingelsene for åtte nukleosider og fem nukleotider som inneholder kanoniske og modifiserte, er oppført i tabell 3. - Registrer toppområdene for hver målsammensetning (figur 1).
4 Generering av standard kalibreringskurver
- Utvalg seks prøveekstraksjoner sammen, som ble produsert etter beskrivelsen i avsnitt 2, og virvel den. Deretter aliquot det til seks ekstraksjoner (samme volum) igjen for å få hver bakgrunn.
- Tilsett seks forskjellige konsentrasjoner av hver standard til disse seks ekstraksjonene, henholdsvis, og injiser dem en etter en etter trinn 3.3.
- Registrer toppområdene i hver standard ved forskjellige konsentrasjoner via masseovergangene som beskrevet i trinn 3.4 og 3.5.
- Plott toppområdet mot den nominelle konsentrasjonen av hver standard for å generere en sekspunktskurve.
MERK: Toppområdene til nukleosider/nukleotider som er registrert i trinn 3.5, bør falle i området med standard kalibreringskurver. - Beregne ligningen for en rett linje for hver standardsammensetning: Y = aX + b
5 Metabolittenes kvantifisering
- Beregn metabolittenes innhold ved hjelp av toppområdet som er registrert i trinn 3.5 og ligningen fra trinn 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi identifisering ogkvantifisering av N 1-metyladenosin, en kjent modifisert kjerneside, i 2 uker gamle Arabidopsis villtype (Col-0) frøplanter som et eksempel. Massespektrometriprofil indikerer at produktionene som genereres fra standarden N1-metyladenosin, er 150 m/z og 133 m/z (figur 2A), og samme profil observeres også i Kol-0-ekstraksjon (figur 2B). På grunn av høy overflod av produktionen på 150 m/ z, er masseovergangen på 282,1til 150 (m / z) valgt for N 1-metyladenosin kvantifisering. I tillegg er oppbevaringstiden (RT) for måltoppen (figur 3B) 7,05 min, som er den samme som RT for N1-metyladenosinstandard (figur 3A). Tatt i betraktning dataene nevnt ovenfor, viser vi at villtype frøplanter inneholder in vivo N1-metyladenosinbasseng.
En konsentrasjonsseriemed N 1-metyladenosinstandarder (0, 1, 2,5, 5, 10 og 50 ng/ml) ble tilsatt i seks prøveekstraksjoner produsert i henholdsvis trinn 4.1 og 4.2 (Figur 4A). 0,02 ml av hver standardprøve ble injisert i LC-MS/MS,og de økte toppområdene i N 1-metyladenosin ble plottet inn mot de nominelle konsentrasjonene av N 1-methyadenosinstandarder. Ligningen for den rette linjen er Y = 0,0004X - 0,163 (figur 4B).
Tre replikeringer av Col-0 frøplanter ble ekstrahert og forhåndsbehandlet som beskrevet ovenfor. Topparealet på N1-metyladenosin i disse tre prøvene ble registrert som 8 659, 12 147 og 12 711. Tatt i betraktning fem ganger berikelse under utvinningen (se trinn 2,5 og 2,6) og bruk av ligningen Y = 0,0004X - 0,163, N1-metyladenosinkonsentrasjon ble beregnet i tre ville type linjer til henholdsvis 0,66, 0,94 og 0,98 ng / ml. Derfor ble 100 mg av hver vill type frøplanter brukt til utvinning og resuspendert i 1 ml ekstraksjonsbuffer. Derfor ble 8,6 ± 1,7 ng N 1-metyladenosin kvantifisert i 1 g 2 uker gamle Arabidopsis villtype frøplanter.
| Tid | Strømningshastighet (mlmin-1) | Mobil fase A (%) | Mobil fase B (metanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabell 1: Metoden for C18-kolonnen. Skjematisk representasjon av løsningsmiddelendringer for likevekt av C18-kolonnen. Mobil fase A = 10 mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fase B = 100% metanol.
| Tid | Strømningshastighet (mlmin-1) | Mobil fase A (%) | Mobil fase B (acetonitril %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabell 2: Metoden for PGC-kolonnen. Skjematisk representasjon av løsningsmiddelendringer for likevekt av PGC-kolonne. Mobil fase A = 10mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fase B = 100% acetonitril.
| Nukleosider/nukleotider | Masseovergang (m/z) | polaritet | Fragmentor | Kollisjonsenergi (eV) | Celle akselerator spenning | Oppbevaringstid (min) | Oppbevaringsvindu (min) | Overvåkingsmodus | |
| Forløper ion | Produkt ion | ||||||||
| Adenosin | 268.1 | 136 | Positiv | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-metyladenosin | 282.12 | 150 | Positiv | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| guanosin | 284.1 | 135 | Positiv | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-metylguanosin | 298.12 | 166 | Positiv | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| inosin | 269.1 | 136.9 | Positiv | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| uridin | 245.21 | 133 | Positiv | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| pseudouridin | 245.21 | 125 | Positiv | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| cytidin | 244.2 | 112 | Positiv | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| Amp | 348.07 | 136 | Positiv | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP | 364.07 | 152 | Positiv | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| skøyer | 348.9 | 137 | Positiv | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positiv | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | Positiv | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
Tabell 3: MS-analyseforhold for nukleosider og nukleotider oppdaget av massespektrometer. Forløperionen og produktionen av åtte nukleosider og seks nukleotider er oppført her og kan overvåkes av MS for sammensatt identifikasjon og kvantifisering.
Figur 1: De kromatografiske toppene på åtte nukleosider og fem nukleotider. Separasjonsprofilene til åtte nukleosider ved C18-kolonnen (A) og fem nukleotider ved PGC-kolonnen (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Identifisering av N1-metyladenosin ved masseovergang. MS/MS-spektra av forløper ion m/z 282.1 og produktioner m/z 150 og m/z 133 oppdaget fra N1-metyladenosinstandard (A) og Col-0-prøver (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Den kromatografiske toppen av N1-metyladenosin. Masseovergangen på 282,1 til 150ble overvåket for N 1-metyladenosin kvantifisering. Oppbevaringstidene for N 1-metyladenosintopper i standard- og prøvemålingen var like. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Generering av standardkurven N1-metyladenosin. (A) Seks forskjellige konsentrasjoner av N 1-metyladenosin ble tilsatt i henholdsvis seks prøveekstraksjonsmatriser. Og det ble registrert en økning i toppområdene. (B) Kalibreringskurven til N1-metyladenosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organismer inneholder ulike nukleosider/nukleotider, inkludert kanoniske og avvikende. Imidlertid er opprinnelsen og metabolske endepunktene til dem, spesielt modifiserte nukleosider, fortsatt uklare. Videre gjenstår den nåværende forståelsen av funksjonen og homeostase av nukleosider / nukleotider metabolisme å bli utforsket og utvidet. For å undersøke dem, må en presis og gullstandard metode for disse metabolittene identifikasjon og kvantifisering brukes. Her beskrev vi en protokoll ved hjelp av massespekteret for nukleosider/nukleotider. Ved å ta N 1-metyladenosin som et eksempel, kan denne metoden oppdage så lavt som 0,02 ng standard, og nøyaktigheten av kalibreringskurven er ganske høy (R2 = 0,999; Figur 4B). Sammenlignet med HPLC-metoden gir en MS-basert protokoll mye bedre deteksjonsgrense og nøyaktighet. Enda viktigere er at denne metoden enkelt kan utføres av forskere i et biologisk laboratorium som har en LC-MS / MS. Videre kan den også brukes til identifisering av andre strukturer kjente metabolitter i planter.
For in vivo absolutt kvantifisering av nukleosider / nukleotider innhold, kommersielle standard kjemikalier er nødvendig. De produserer de rette standardkurvene, som gjør det mulig å beregne målmetabolittene i prøver gjennom toppområder registrert av massespektrometri. Det er viktig at rekkevidden av toppområder i standard kalibreringskurver skal dekke toppområdet for målmetabolitt lest i MS. Videre bør en konsentrasjonsserie av standarder legges til prøveekstraksjonene, men ikke oppløses i vann for kalibreringskurvegenerering. Dette er fordi det vil unngå matriseeffekten, noe som er enormt viktig for kvantifiseringsnøyaktighet.
Metoden beskrevet her gir et kraftig verktøy for nukleosider / nukleotider kvantifisering. Dens anvendelse kan strekke seg til alle planter og til og med andre organismer. Hele prosedyren for prøvers forbehandling må holde seg kald og rask for å unngå metabolitter nedbrytning, selv om ekstraksjonsbufferen inneholder 80% organiske kjemikalier, noe som kan utløse de fleste proteiner (enzymer). Denne metoden er imidlertid ikke egnet for ukjent målidentifikasjon. Identifisering og kvantifisering av målkjemikalier i denne metoden avhenger i stor grad av de kommersielle kjemiske standardene. En annen begrensning ved denne metoden er at måling av nukleosider og nukleotider må gjøres separat ved å bruke henholdsvis en C18-kolonne og en PGC-kolonne. Det er fordi ytelsen til C18-kolonnen, selv om den er mer stabil og reproduserbar enn PGC-kolonnen, sistnevnte kan spesielt skille nukleotider mye bedre (Figur 1B).
Til slutt tillater den presenterte metoden in vivo kvantifisering av nukleosider / nukleotider i planter. Fra frøplanter vekst til å oppnå de endelige resultatene, kan forsøkene fullføres innen 3 uker. Komplette prøver før behandlinger og LC-MS/MS-analyser tar omtrent 2 dager for et sett med 10 til 20 prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansielt støttet av Fundamental Research Funds for central universities (KJQN202060), National Natural Science Foundation of China (31900907), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190528), International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) til M.C., og de grunnleggende forskningsmidlene for de sentrale universitetene (LGZD202004) til X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
