Summary
식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.
Abstract
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.
Introduction
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기4,7,8,9,10,11과결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.
또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드분리(15,16) 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.
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Protocol
1 식물 성장 및 재료 수집
- 아라비도시스 씨앗을 70% 에탄올로 살균하고 1반강도 무라시게와 스쿠그 영양소로 제조된 한천 접시에 뿌려야 합니다.
- 48h에 대해 4°C에서 어둡게 아라비도시스 씨앗을 함유한 플레이트를 배양한 다음, 22°C에서 55 μmolm-2 s-1의 16h 빛 아래 제어된 성장 챔버로 옮기고 20°C에서 8시간 어둡게 옮깁니다.
- 2주 묘목 100mg(신선한 체중)을 수확하고 대사 산물 추출을 위해 액체 질소를 동결하십시오.
주의: 연구원은 재료 수집 중에 인간 조직 오염을 피하기 위해 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트를 적절하게 착용해야합니다.
2 뉴클레오시드/뉴클레오티드 추출
- 60Hz 의 주파수에서 5 분 동안 사전 차가운 믹서 밀에 7-8 강철 구슬이있는 냉동 식물 조직 100 mg을 접지하십시오.
- 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 포함하는 추출 용액을 2:2:1의 비율로 준비한다.
- 1mL의 추출 용액으로 균질화된 물질(대부분의 대사산물포함하지만 단백질은 포함되지 않음)을 다시 중단합니다.
- 4°C에서 15분 동안 12,000 x g의 결과 용액원심분리기.
- 서스펜션의 0.5mL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 액체 질소에서 동결한다.
- 냉동 다이어에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 % 아세토나이트와 95 %의 물0.1 mL로 재주중지하십시오.
- 원심분리기 40,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액(0.1 mL)을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 유리병에 적재합니다.
3 LC-MS/MS 측정
- 이중 증분 수(Mobile phase A)의 2L에서 1.1 g의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 10mM 암모늄 아세테이트 버퍼를 준비한다. pH를 9.5% 암모늄 및 아세테이트산으로 조정합니다.
- 뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올(모바일 상 B1)의 2L를 준비한다. 또한 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 100% 아세토닐릴(Mobile phase B2)의 2L을 준비한다.
- 3중 사중대 질량 분광계(MS)와 결합된 이진 펌프(LC)를 가진 HPLC 시스템에 각 샘플의 전처리 된 대사 산물 추출0.02 mL을 주입한다.
주의: HPLC 시스템은 C18 컬럼(50 x 4.6mm)을 사용합니다. 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동) 뉴클레오시드 분리를 위한 이동상 A 및 B1(도1A)로완충하고 핵조류 분리를 위한 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼(50 x 4.6mm, 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동)을 뉴클레오타이드 분리용 이동상 A 및 B2(도1B)로사용한다. 각 샘플은 기술 복제를 위해 세 번 주입되었다. - C18 열에 대한 표 1에 도시된 메서드와 PGC 열에 대한 표 2에 표시된 메서드를 프로그래밍합니다. 0.65mL min-1의유량을 설정합니다.
참고: 질량전환(표 3)은질량 분광계에 의해 모니터링되었다. 8개의 뉴클레오시드및 5개의 뉴클레오티드의 질량 스펙트럼 분석 조건은 표준화 및 변형된 것들을 포함하는 표 3에열거된다. - 모든 표적 화합물의 피크 영역을 기록합니다(그림1).
표준 교정 곡선 4세대
- 풀 6 샘플 추출, 섹션 2의 설명에 따라 생산 된, 그리고 소용돌이. 그런 다음 각 배경을 얻기 위해 6 개의 추출 (동일한 볼륨)에 다시 알리쿼트합니다.
- 각 표준의 6가지 농도를 각각 6개의 추출에 추가하고 다음 단계 3.3을 하나씩 주입합니다.
- 3.4 단계 및 3.5 단계에 설명된 바와 같이 질량 전이를 통해 각 표준의 피크 영역을 다른 농도로 기록한다.
- 각 표준의 명목 농도에 대해 피크 영역을 플롯하여 6점 곡선을 생성합니다.
참고: 단계 3.5에 기록된 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 피크 영역은 표준 교정 곡선의 범위에 속한다. - 각 표준 화합물에 대해 직선 방정식을 계산합니다: Y = aX + b
5 대사 산물의 정량화
- 3.5단계에서 기록된 피크 영역과 4.5단계에서의 방정식을 사용하여 대사 산물의 내용을 계산합니다.
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Representative Results
여기서, 우리는 2주 된 아라비도시스 야생 형 (Col-0) 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N1-메틸라데로신의 식별 및 정량화를 예로 들 수 있습니다. 질량 분석 프로파일은 N 1-메틸라데로신 표준으로부터 생성된 제품 이온이 150m/z 및 133m/z(도2A)이며동일한 프로파일도 Col-0 추출(도2B)에서관찰된다는 것을 나타낸다. 150m/z의 높은 제품 이온으로 인해 282.1에서 150(m/z)의 질량 전환이N 1-메틸라데노신 정량화에 선택됩니다. 또한, 목표피크(도 3B)의보유 시간(RT)은 7.05분이며, 이는 N 1-메틸라데로신 표준(도3A)의RT와 동일하다. 위에서 언급 한 데이터를 고려하여 야생 유형 모종은 생체 N1-메틸라데로신 풀에 포함되어 있음을 보여줍니다.
N 1-메틸라데로신 표준(0, 1, 2.5, 5, 10 및 50 ng/mL)의 농도 시리즈는 각각 4.1 및 4.2 단계(그림4A)에따라 생성된 6개의 샘플 추출에 첨가되었다. 각 표준 샘플의 0.02 mL은 LC-MS/MS에 주입되었고, N1-메틸라데노신의 증가된 피크 영역은 N1-메티아데노신 표준의 명목 농도에 대하여 플롯되었다. 직선의 방정식은 Y = 0.0004X - 0.163(도 4B)입니다.
상기와 같이 Col-0 모종의 3개의 복제를 추출하고 미리 처리하였다. 이 세 가지샘플에서 N 1-메틸라데노신의 피크 영역은 8,659, 12,147 및 12,711로 기록되었다. 추출 시 5배 농축(단계 2.5 및 2.6 참조) 및 방정식 Y=0.0004X-0.163, N1-메틸라데노신 농도는 각각 0.66, 0.94, 0.98 ng/mL로 3개의 야생형 선으로 계산하였다. 따라서, 각 야생 형 묘목의 100 mg추출에 사용 하 고 1 mL 추출 버퍼에서 재중단. 따라서, N1-메틸라데노사신의 8.6 ± 1.7ng는 2주 된 아라비도시스 야생형 묘목의 1g에서 정량화되었다.
| 시간 | 유량(mL 분-1) | 모바일 단계 A (%) | 모바일 상 B(메탄올%) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
표 1: C18 열에 대한 메서드입니다. C18 컬럼의 평형에 대한 용매 변경의 회로도 표현. 모바일 상 A = 10 mM 암모늄 아세테이트, pH 9.5. 모바일 위상 B = 100% 메탄올.
| 시간 | 유량(mL 분-1) | 모바일 단계 A (%) | 모바일 상 B (아세토닐레%) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
표 2: PGC 열에 대한 메서드입니다. PGC 컬럼의 평형에 대한 용매 변경의 회로도 표현. 모바일 상 A = 10mM 암모늄 아세테이트, pH 9.5. 모바일 위상 B = 100% 아세토나이트.
| 뉴클레오시드/뉴클레오티드 | 질량 전환(m/z) | 극성 | 조각가 | 충돌 에너지(eV) | 셀 가속기 전압 | 보존 시간(최소) | 보존 창 (최소) | 모니터링 모드 | |
| 전구체 이온 | 제품 이온 | ||||||||
| 아데노신 | 268.1 | 136 | 플러스 | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM |
| N1-메틸라데노사인 | 282.12 | 150 | 플러스 | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM |
| 구아노신 | 284.1 | 135 | 플러스 | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM |
| O6-메틸구아노신 | 298.12 | 166 | 플러스 | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM |
| 이노신 | 269.1 | 136.9 | 플러스 | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM |
| 우리딘 | 245.21 | 133 | 플러스 | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM |
| 슈도우리딘 | 245.21 | 125 | 플러스 | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM |
| 시티딘 | 244.2 | 112 | 플러스 | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM |
| 앰프 | 348.07 | 136 | 플러스 | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM |
| GMP | 364.07 | 152 | 플러스 | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM |
| 꼬마 도깨비 | 348.9 | 137 | 플러스 | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM |
| UMP | 325.01 | 212.9 | 플러스 | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM |
| CMP | 324 | 112 | 플러스 | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM |
표 3: 질량 분광계에 의해 검출된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 MS 분석 조건. 8개의 뉴클레오시드 및 6개의 뉴클레오티드의 전구체 이온 및 생성 이온은 여기에 열거되고 화합물 식별 및 정량화를 위해 MS에 의해 감시될 수 있다.
그림 1: 8개의 뉴클레오시드와 5개의 뉴클레오티드의 크로마토그래피 피크. C18 컬럼(A)에 의한 8개의뉴클레오시드의 분리 프로파일과 PGC 컬럼(B)에 의한 5개의 뉴클레오티드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 질량 전환에 의한 N1-메틸라데로신의 식별. 전구체 이온 m/z 282.1 및 제품 이온 m/z 150 m/z 133의MS/MS 스펙트럼은 N 1-메틸라데로신표준(A)및 Col-0샘플(B)에서검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: N1-메틸라데노신의 크로마토그래피 피크. 282.1에서 150의 질량 전환은N 1-메틸라데로신 정량화를 위해 모니터링되었다. 표준 및 샘플측정에서 N 1-메틸라데노신 피크의 보존 시간은 비슷했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: N1-메틸라데노신 표준 곡선의 생성. (A)N 1-메틸라데로신의 6개의 상이한 농도는 각각 6개의 샘플 추출 매트릭스에 첨가되었다. 그리고 그 결과 증가 피크 영역이 기록되었습니다. (B)N1-메틸라데노신의 교정 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법을 채택해야 합니다. 여기서, 우리는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 검출을 위한 질량 스펙트럼을 이용한 프로토콜을 기술했다. 예를 들어 N 1-메틸라데노신을 예로 들면, 이 방법은 0.02 ng 표준으로 낮은 것을 검출할 수 있고 교정 곡선의 정확도는 매우 높다(R2 = 0.999; 그림 4B). HPLC 방법과 비교하여 MS 기반 프로토콜은 훨씬 더 나은 검출 제한과 정확도를 제공합니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 LC-MS/MS가 있는 생물학 실험실에 있는 연구원에 의해 쉽게 수행될 수 있다는 것입니다. 더욱이, 그것은 또한 식물에서 대사 산물로 알려진 다른 구조물의 식별에 사용할 수 있습니다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 생체 내 절대 정량화를 위해서는 상업적 표준 화학 물질이 요구된다. 그들은 질량 분석법에 의해 기록된 피크 영역을 통해 샘플에서 표적 대사 산물을 계산할 수 있는 직선 표준 곡선을 생성합니다. 표준 교정 곡선의 피크 영역 범위는 MS에서 읽은 대상 대사 산물의 피크 영역을 커버하는 것이 중요합니다. 더욱이, 농도 계열의 기준은 시료 추출에 추가되어야 하지만 보정 곡선 생성을 위해 물에 용해되지 않아야 한다. 이는 정량화 정확도에 대단히 중요한 매트릭스 효과를 피하기 때문입니다.
여기에 설명된 방법은 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 강력한 도구를 제공한다. 그것의 응용 프로그램은 모든 식물과 심지어 다른 유기체로 확장 할 수 있습니다. 추출 버퍼에는 대부분의 단백질 (효소)을 침전시킬 수있는 80 %의 유기 화학 물질이 포함되어 있지만 시료의 전처리 절차는 대사 산물 저하를 피하기 위해 차갑고 빠르게 유지해야합니다. 그러나 이 방법은 알 수 없는 대상 식별에 적합하지 않습니다. 이 방법에서 표적 화학 물질의 식별 및 정량화는 주로 상업적 화학 적 표준에 따라 달라집니다. 이 방법의 또 다른 한계는 각각 C18 컬럼과 PGC 컬럼을 사용하여 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 측정을 별도로 수행해야 한다는 것이다. C18 컬럼의 성능이 PGC 컬럼보다 안정적이고 재현가능하지만, 후자는 특히 뉴클레오티드를 훨씬 더 잘 구별할 수 있기때문이다(도 1B).
결론적으로, 제시된 방법은 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 생체 내 정량화를 허용한다. 모종 성장에서 최종 결과를 얻는 것까지 3 주 이내에 실험을 완료 할 수 있습니다. 완전한 샘플 사전 처리 및 LC-MS/MS 분석은 10~20개의 샘플 세트에 약 2일이 소요됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중앙 대학 (KJQN202060), 중국 국립 자연 과학 재단 (31900907), 장쑤성의 자연 과학 재단 (BK20190528), 유전자 공학 및 생명 공학 국제 센터 (CRP / CHN20-04_EC.C) 및 중앙 대학 (LZ20)의 기초 연구 기금 (LZ20)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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