Summary
Qui viene descritto un metodo preciso e riproducibile per la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Questo metodo utilizza un HPLC-MS/MS.
Abstract
Nucleosides/nucleotidi sono elementi costitutivi di acidi nucleici, parti di cosubstrati e coenzimi, molecole di segnalazione cellulare e portatori di energia, che sono coinvolti in molte attività cellulari. Qui descriviamo un metodo rapido e affidabile per la qualificazione assoluta del contenuto nucleoside/nucleotidico nelle piante. In breve, 100 mg di materiale vegetale omogeneizzato sono stati estratti con 1 mL di tampone di estrazione (metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto di 2:2:1). Successivamente, il campione è stato concentrato cinque volte in un essiccatore a congelatore e quindi iniettato in una colonna di HPLC-MS/MS. Le transizioni di massa di ogni nucleoside e nucleotide sono state monitorate dalla spettrometria di massa. Il contenuto dei nucleosidi e dei nucleotidi è stato quantificato in base ai loro standard esterni (ESTD). Utilizzando questo metodo, quindi, i ricercatori possono facilmente quantificare nucleosides / nucleotidi in diverse piante.
Introduction
I nucleosides/nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi, che sono i precursori degli acidi nucleici e di molti coenzimi, come la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), e importanti nella sintesi di macromolecole come fosfolipidi, glicolipidi e polisaccaridi. Strutturalmente, il nucleoside contiene una nucleobase, che può essere un'adenina, guanina, uracile, citosina o timina, e una moiety zuccherina, che può essere un ribosio o un deossiribosio1,2. I nucleotidi hanno fino a tre gruppi fosfatici che si legano alla posizione a 5 atomi di carbonio della moiety zuccherina dei nucleosidi3. Il metabolismo dei nucleotidi nelle piante è essenziale per la germinazione dei semi e la crescita dellefoglie 4,5,6. Per comprendere meglio il loro ruolo fisiologico nello sviluppo delle piante, è necessario stabilire i metodi per la quantificazione assoluta dei diversi nucleosidi/nucleotidi in vivo.
Uno degli approcci più comunemente usati per misurare nucleosidi/ nucleotidi utilizza una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con un rivelatore uv-vis4,7,8,9,10,11. Nel 2013, utilizzando HPLC, Dahncke e Witte hanno quantificato diversi tipi di nucleosidi in Arabidopsis thaliana7. Hanno identificato un contenuto migliorato di guanosina in un mutante di inserimento del DNA T mirato nel gene della deaminasi della guanosina rispetto alla pianta di tipo selvatico. Un altro nucleoside pirimidina, la citidina, è stato anche rilevato quantitativamente nelle piante che utilizzano questo metodo, il che ha portato all'identificazione di un gene di deaminasi citidina in buona fede4. Basato sul rivelatore UV, questo metodo, tuttavia, non può facilmente distinguere i nucleosidi che hanno spettro e tempi di ritenzione simili, ad esempio guanosina o xanthosina. Il limite di rilevamento del metodo HPLC è relativamente alto, quindi, è frequentemente usato per la misurazione di alto contenuto di nucleosidi in vivo, come citidina, uridina e guanosina.
Inoltre, la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) può essere utilizzata anche nella misurazione nucleoside. Beneficiando di esso, Hauck et. al. ha rilevato con successo uridina e acido urico, che è un metabolita a valle della via catabolica nucleoside, nei semi di A. thaliana12. Tuttavia, gc viene normalmente utilizzato per separare i composti volatili ma non adatto alle sostanze termo labili. Pertanto, una cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) è probabilmente una tecnica analitica più adatta e accurata per l'identificazione, la separazione e la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi13,14. Diversi studi precedenti hanno riferito che una colonna HILIC può essere utilizzata per la separazione di nucleosidi e nucleotidi15,16 e standard interni isotopicamente etichettati sono stati utilizzati per la quantificazione composta17. Tuttavia, entrambi i componenti sono relativamente costosi, in particolare gli standard commerciali etichettati isotopici. Qui, segnalamo un approccio LC-MS/MS economicamente applicabile per la misurazione di nucleosidi / nucleotidi. Questo metodo è già stato utilizzato con successo per la quantificazione di diversi nucleosidi /nucleotidi, tra cui ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, nelle piante e Drosophila. Inoltre, il metodo che qui riferiamo può essere utilizzato anche in altri organismi.
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Protocol
1 Crescita delle piante e raccolta dei materiali
- Assicurarsi che i semi di Arabidopsis siano sterilizzati in etanolo al 70% per 10 minuti e seminati sulle piastre di agar, che sono state preparate con nutrienti Murashige e Skoog a metà resistenza.
- Incubare le piastre contenenti semi di Arabidopsis sotto scuro a 4 °C per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce di 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C e 8 h scure a 20 °C.
- Raccogliere 100 mg di piantine di 2 settimane (peso fresco) e congelare l'azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti.
ATTENZIONE: I ricercatori devono indossare in modo appropriato guanti, occhiali protettivi e un camice da laboratorio per evitare la contaminazione dei tessuti umani durante la raccolta dei materiali.
2 Estrazione nucleosidi/nucleotidi
- Macinato 100 mg di tessuti vegetali congelati con 7-8 perline d'acciaio in un miscelatore pre-freddo per 5 minuti ad una frequenza di 60 Hz.
- Preparare la soluzione di estrazione, che contiene metanolo, acetonitrile e acqua in un rapporto di 2:2:1.
- Rimostrare i materiali omogeneizzati (compresa la maggior parte dei metaboliti ma non le proteine) con 1 mL di soluzione di estrazione.
- Centrifugare la soluzione risultante a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
- Trasferire 0,5 ml della sospensione in un nuovo tubo da 1,5 ml e congelare l'azoto liquido.
- Evaporare il campione congelato in un tintore congelante e rimescolare in 0,1 mL di acetonitrile al 5% e 95% di acqua.
- Centrifugare la soluzione risultante (0,1 mL) a 40.000 x g per 10 min a 4 °C. Caricare il supernatante in una fiala per la misurazione LC-MS/MS.
3 Misurazione LC-MS/MS
- Preparare un tampone di acetato di ammonio da 10 mM sciogliendo 1,1 g di acetato di ammonio in 2 L di acqua doppia deionizzata (fase mobile A). Regolare il pH al 9,5 per il 10% di ammonio e acido acetato.
- Preparare 2 L di metanolo ultrapuro al 100% (fase mobile B1) per la misurazione dei nucleosidi. Inoltre, preparare 2 L di acetonitrile ultrapuro al 100% (fase mobile B2) per la misurazione dei nucleotidi.
- Iniettare 0,02 mL di estrazione di metaboliti pretrattati di ciascun campione dal passaggio 2.7 in un sistema HPLC con pompe binarie (LC) accoppiate con un triplo spettrometro di massa quadrupolo (MS).
ATTENZIONE: il sistema HPLC utilizza una colonna C18 (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavoro a 25 °C) tamponamento con fase mobile A e B1(Figura 1A)per la separazione dei nucleosidi e utilizzare una colonna di carbonio grafitico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavorando a 25 °C) con fase mobile A e B2(figura 1B)per la separazione dei nucleotidi. Ogni campione è stato iniettato tre volte per la replica tecnica. - Programmate il metodo come illustrato nella tabella 1 per la colonna C18 e il metodo come illustrato nella tabella 2 per la colonna PGC. Impostare una portata di 0,65 mL min-1.
NOTA: Le transizioni di massa (tabella 3) sono state monitorate da spettrometro di massa. Le condizioni di analisi dello spettro di massa di otto nucleosidi e cinque nucleotidi contenenti quelli canonici e modificati sono elencate nella tabella 3. - Registrare le aree di picco di ogni composto bersaglio (Figura 1).
4 Generazione delle curve di calibrazione standard
- Mettere insieme sei estrazioni di campioni, prodotte seguendo la descrizione della sezione 2, e vortice. Quindi, aliquota di nuovo a sei estrazioni (stesso volume) per ottenere ogni sfondo.
- Aggiungere sei diverse concentrazioni di ogni norma a queste sei estrazioni, rispettivamente, e iniettarle una per una dopo il passaggio 3.3.
- Registrare le aree di picco di ogni standard a diverse concentrazioni attraverso le transizioni di massa come descritto nei passaggi 3.4 e 3.5.
- Tracciate l'area di picco rispetto alla concentrazione nominale di ogni standard per generare una curva a sei punti.
NOTA: Le aree di picco dei nucleosidi/nucleotidi registrate nel passaggio 3.5 dovrebbero rientrare nell'intervallo delle curve di taratura standard. - Calcolare l'equazione di una linea retta per ogni composto standard: Y = aX + b
5 Quantificazione dei metaboliti
- Calcolare il contenuto dei metaboliti utilizzando l'area di picco registrata nel passaggio 3.5 e l'equazione dal passaggio 4.5.
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Representative Results
Qui, mostriamo l'identificazione e la quantificazione della N1-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, nelle piantine di tipo selvatico Arabidopsis (Col-0) di 2 settimane come esempio. Il profilo della spettrometria di massa indica che gli ioni prodotto generati dallo standard N1-metilladenosina sono 150 m/z e 133 m/z(figura 2A), e lo stesso profilo si osserva anche nell'estrazione Col-0(figura 2B). A causa dell'elevata abbondanza dello ione prodotto di 150 m/z, la transizione di massa da 282,1 a 150 (m/z) viene selezionata per la quantificazione N1-metilladenosina. Inoltre, il tempo di ritenzione (RT) del picco target(Figura 3B) è di 7,05 min, che è lo stesso dello standard RT di N1-metilladenosina(Figura 3A). Considerando i dati sopra menzionati, dimostriamo che le piantine di tipo selvatico contengono in vivo N1-metilladenosina piscina.
Una serie di concentrazione di standard N1-metilladenosina (0, 1, 2,5, 5, 10 e 50 ng / mL) è stata aggiunta in sei estrazioni campione prodotte rispettivamente dopo i passaggi 4.1 e 4.2(figura 4A). 0,02 mL di ciascun campione standard sono stati iniettati nella LC-MS/MS e le aree di picco aumentate della N1-metilladenosina sono state tracciate rispetto alle concentrazioni nominali delle norme N1-metiladenosina. L'equazione della linea retta è Y = 0,0004X - 0,163 (Figura 4B).
Tre repliche di piantine Col-0 sono state estratte e pretrattate come descritto sopra. L'area di picco della N1-metilladenosina in questi tre campioni è stata registrata come 8.659, 12.147 e 12.711. Considerando il cinque volte l'arricchimento durante l'estrazione (vedi fasi 2.5 e 2.6) e usando l'equazione Y = 0,0004X - 0,163, la concentrazione di N1-metilladenosina è stata calcolata in tre linee di tipo selvatico rispettivamente di 0,66, 0,94 e 0,98 ng / mL. Pertanto, 100 mg di ogni piantina di tipo selvatico sono stati utilizzati per l'estrazione e rimostrati in tampone di estrazione da 1 mL. Pertanto, 8,6 ± 1,7 ng di N1-metilladenosina è stato quantificato in 1 g di piantine di tipo selvatico Arabidopsis di 2 settimane.
| Ore | Portata (mL min-1) | Fase mobile A (%) | Fase mobile B (metanolo %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabella 1: Metodo per la colonna C18. Rappresentazione schematica dei cambiamenti di solvente per l'equilibrazione della colonna C18. Fase mobile A = acetato di ammonio da 10 mM, pH 9,5. Fase mobile B = 100% metanolo.
| Ore | Portata (mL min-1) | Fase mobile A (%) | Fase mobile B (acetonitrile %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabella 2: Metodo per la colonna PGC. Rappresentazione schematica dei cambiamenti di solvente per l'equilibrazione della colonna PGC. Fase mobile A = acetato di ammonio 10mM, pH 9,5. Fase mobile B = acetonitrile al 100%.
| Nucleosidi/nucleotidi | Transizione di massa (m/z) | polarità | Frammentatore | Energia di collisione (eV) | Tensione dell'acceleratore di celle | Tempo di conservazione (min) | Finestra conservazione (min) | Modalità di monitoraggio | |
| Ione precursore | Ione prodotto | ||||||||
| adenosina | 268.1 | 136 | Positivo | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | Mrm |
| N1-metilladenosina | 282.12 | 150 | Positivo | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | Mrm |
| guanosina | 284.1 | 135 | Positivo | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | Mrm |
| O6-metilguanosina | 298.12 | 166 | Positivo | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | Mrm |
| inosina | 269.1 | 136.9 | Positivo | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | Mrm |
| uridina | 245.21 | 133 | Positivo | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | Mrm |
| pseudouridina | 245.21 | 125 | Positivo | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | Mrm |
| citidina | 244.2 | 112 | Positivo | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | Mrm |
| Amp | 348.07 | 136 | Positivo | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | Mrm |
| GMP | 364.07 | 152 | Positivo | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | Mrm |
| diavoletto | 348.9 | 137 | Positivo | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | Mrm |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positivo | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | Mrm |
| CMP | 324 | 112 | Positivo | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | Mrm |
Tabella 3: Condizioni di analisi MS dei nucleosidi e dei nucleotidi rilevate dallo spettrometro di massa. Lo ione precursore e lo ione prodotto di otto nucleosidi e sei nucleotidi sono elencati qui e possono essere monitorati dalla SM per l'identificazione e la quantificazione dei composti.
Figura 1: Picchi cromatografici di otto nucleosidi e cinque nucleotidi. I profili di separazione di otto nucleosidi per colonna C18 (A) e cinque nucleotidi dalla colonna PGC (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione della N1-metilladenosina mediante transizione di massa. Spettri MS/MS dello ione precursore m/z 282.1 e ioni prodotto m/z 150 e m/z 133 rilevati da campioni N1-metilladenosina standard (A) e Col-0 (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il picco cromatografico della N1-metilladenosina. La transizione di massa da 282,1 a 150 è stata monitorata per la quantificazione N1-metilladenosina. I tempi di ritenzione dei picchi di N1-metilladenosina nella misurazione standard e campione erano simili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Generazione della curva standard N1-metilladenosina. (A) Sei diverse concentrazioni di N1-metilladenosina sono state aggiunte rispettivamente in sei matrici di estrazione del campione. E il risultato è stato registrato l'aumento delle aree di picco. (B) La curva di taratura di N1-metilladenosina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli organismi contengono vari nucleosidi/nucleotidi, inclusi quelli canonici e aberranti. Tuttavia, l'origine e gli endpoint metabolici di essi, in particolare i nucleosidi modificati, sono ancora oscuri. Inoltre, l'attuale comprensione della funzione e dell'omeostasi del metabolismo dei nucleosidi/nucleotidi deve ancora essere esplorata ed ampliata. Per studiarli, è necessario utilizzare un metodo preciso e standard per questi metaboliti di identificazione e quantificazione. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza lo spettro di massa per il rilevamento di nucleosidi / nucleotidi. Prendendo ad esempio N1-metilladenosina, questo metodo potrebbe rilevare fino a 0,02 ng standard e la precisione della curva di calibrazione è piuttosto elevata (R2 = 0,999; Figura 4B). Rispetto al metodo HPLC, un protocollo basato su MS fornisce un limite di rilevamento e una precisione molto migliori. Ancora più importante, questo metodo può essere facilmente eseguito dai ricercatori in un laboratorio biologico che ha un LC-MS / MS. Inoltre, può anche essere utilizzato per l'identificazione di altre strutture note metaboliti nelle piante.
Per la quantificazione assoluta in vivo del contenuto di nucleosidi/nucleotidi, sono necessarie sostanze chimiche standard commerciali. Producono le curve standard dritte, che consentono di calcolare i metaboliti bersaglio nei campioni attraverso le aree di picco registrate dalla spettrometria di massa. È importante che la gamma di aree di picco nelle curve di taratura standard copra l'area di picco del metabolita bersaglio letta negli Stati membri. Inoltre, una serie di norme di concentrazione dovrebbe essere aggiunta nelle estrazioni del campione, ma non sciolta in acqua per la generazione della curva di taratura. Questo perché eviterà l'effetto matrice, che è tremendamente significativo per l'accuratezza della quantificazione.
Il metodo qui descritto fornisce un potente strumento per la quantificazione di nucleosidi/nucleotidi. La sua applicazione può estendersi a tutte le piante e anche ad altri organismi. L'intera procedura di pretrattamento dei campioni deve rimanere fredda e veloce per evitare la degradazione dei metaboliti, sebbene il tampone di estrazione contenga l'80% di sostanze chimiche organiche, che potrebbero precipitare la maggior parte delle proteine (enzimi). Tuttavia, questo metodo non è adatto per l'identificazione del bersaglio sconosciuta. L'identificazione e la quantificazione della sostanza chimica bersaglio in questo metodo dipende in gran parte dalle norme chimiche commerciali. Un'altra limitazione di questo metodo è che la misurazione dei nucleosidi e dei nucleotidi deve essere eseguita separatamente impiegando rispettivamente una colonna C18 e una colonna PGC. È perché le prestazioni della colonna C18, sebbene, sia più stabile e riproducibile della colonna PGC, quest'ultima potrebbe distinguere particolarmente meglio i nucleotidi(Figura 1B).
In conclusione, il metodo presentato consente la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Dalla crescita delle piantine all'ottenimento dei risultati finali, gli esperimenti possono essere completati entro 3 settimane. I pre-trattamenti completi dei campioni e le analisi LC-MS/MS richiedere circa 2 giorni per un set di 10-20 campioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali (KJQN202060), dalla National Natural Science Foundation of China (31900907), dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20190528), dal Centro internazionale per l'ingegneria genetica e le biotecnologie (CRP / CHN20-04_EC) a M.C., e i Fondi di Ricerca Fondamentale per le Università Centrali (LGZD202004) a X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
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