Summary
En exakt och reproducerbar metod för in vivo-nukleosider/nukleotider kvantifiering i växter beskrivs här. Den här metoden använder hplc-ms/ms.
Abstract
Nukleosider/nukleotider är byggstenar av nukleinsyror, delar av cosubstrates och koenzymer, cellsignaleringsmolekyler och energibärare, som är involverade i många cellaktiviteter. Här beskriver vi en snabb och pålitlig metod för absolut kvalificering av nukleosid/nukleotidinnehåll i växter. Kortfattat extraherades 100 mg homogeniserat växtmaterial med 1 ml extraktionsbuffert (metanol, acetonitril och vatten vid ett förhållande av 2:2:1). Senare koncentrerades provet fem gånger i en frystork och injicerades sedan i en HPLC-MS/MS. Nukleotider separerades på en porös grafitisk kolkolonn (PGC) och nukleosider separerades på en C18-kolumn. Massövergångar av varje nukleosid och nukleotid övervakades av masspektrometri. Innehållet i nukleosider och nukleotider kvantifierades mot deras externa standarder (ESTDs). Med denna metod kan forskare därför enkelt kvantifiera nukleosider/nukleotider i olika växter.
Introduction
Nukleoider/nukleotider är centrala metaboliska komponenter i alla levande organismer, som är prekursorer för nukleinsyror och många coenzymer, såsom nikotinamidadenin dinukleotid (NAD), och viktiga vid syntesen av makromolekyler som fosfolipider, glykolpider och polysackarider. Strukturellt innehåller nukleosid en nukleobas, som kan vara en adenin, guanin, uracil, cytosin eller tymin, och en sockermoiety, som kan vara en ribos eller en deoxyribose1,2. Nukleotider har upp till tre fosfatgrupper som är bindande för 5-kolpositionen i kärnsockermoiety i nukleosiderna3. Metabolismen av nukleotider i växter är viktig för fröspirering och bladtillväxt4,5,6. För att bättre förstå deras fysiologiska roller i växtutveckling bör metoderna för absolut kvantifiering av olika nukleosider/nukleotider in vivo fastställas.
En av de vanligaste metoderna för att mäta nukleosider / nukleotider använder en högpresterande flytande kromatografi (HPLC) i kombination med en ultraviolett synlig (UV-VIS)detektor 4,7,8,9,10,11. År 2013 kvantifierade användning av HPLC, Dahncke och Witte flera typer av nukleosider i Arabidopsis thaliana7. De identifierade en förbättrad guanosinhalt i en T-DNA insättnings mutant inriktning i guanosin deaminase genen jämfört med vilda-typ växten. En annan pyrimidin nukleosid, cytidin, upptäcktes också kvantitativt i växter som använder denna metod, vilket resulterade i identifiering av en äkta cytidin deaminase gen4. Baserat på UV-detektorn kan denna metod dock inte lätt skilja de nukleoser som har liknande spektrum och retentionstider, t.ex. guanosin eller xantosin. Detektionsgränsen för HPLC-metoden är relativt hög, därför används den ofta för mätning av högt innehåll av nukleosider in vivo, såsom cytidin, uridin och guanosin.
Dessutom kan gaskromatografi i kombination med masspektrometri (GC-MS) också användas vid nukleosidmätning. Drar nytta av det, Hauck et. framgångsrikt detekterat uridin och urinsyra, som är en nedströms metabolit av nukleosidkatabolisk väg, i fröna till A. thaliana12. GC används dock normalt för att separera flyktiga föreningar men inte lämplig för termiskt labila ämnen. Därför är en flytande kromatografi i kombination med masspektrometri (LC-MS/MS) förmodligen en lämpligare och mer exakt analysteknik för in vivo-identifiering, separation och kvantifiering av nukleosider/nukleotider13,14. Flera tidigare studier rapporterade att en HILIC-kolumn kan användas för nukleosider och nukleotider separation15,16 och isotopiskt märkta interna standarder användes för den sammansatta kvantifieringen17. Båda komponenterna är dock relativt dyra, särskilt de kommersiella isotopmärkta standarderna. Här rapporterar vi en ekonomiskt tillämplig LC-MS/MS-metod för nukleosider/nukleotider. Denna metod har redan framgångsrikt använts för kvantifiering av olika nukleosider / nukleotider, inklusive ATP, N6-metyl-AMP, AMP, GMP, uridin, cytidin och pseudouridin1,5,6,18, i växter och Drosophila. Dessutom kan den metod vi rapporterar här också användas i andra organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Växttillväxt och materialsamling
- Se till att Arabidopsisfrön steriliseras i 70% etanol i 10 min och sås på agarplattorna, som framställdes med en halv styrka Murashige och Skoog näringsämnen.
- Inkubera plattorna som innehåller Arabidopsisfrön under mörker vid 4 °C i 48 timmar och överför dem sedan till en kontrollerad tillväxtkammare under 16 h ljus på 55 μmol m-2 s-1 vid 22 °C och 8 h mörk vid 20 °C.
- Skörda 100 mg 2-veckorsplantor (färsk vikt) och frys i flytande kväve för metaboliter extraktion.
VARNING: Forskare bör använda handskar, skyddsglasögon och en labbrock på lämpligt sätt för att undvika förorening av mänsklig vävnad under materialinsamlingen.
2 Nukleosider/Nukleotider extraktion
- Slipad 100 mg frysta växtvävnader med 7-8 stålpärlor i ett förkylt blandarbruk i 5 minuter med en frekvens av 60 Hz.
- Förbered extraktionslösningen, som innehåller metanol, acetonitril och vatten i ett förhållande av 2:2:1.
- Återanvänd de homogeniserade materialen (inklusive de flesta metaboliter men inte proteiner) med 1 ml extraktionslösning.
- Centrifugera den resulterande lösningen vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Överför 0,5 ml fjädring till ett nytt 1,5 ml-rör och frys in det flytande kvävet.
- Avdunsta det frysta provet i en frysfärg och återanvänd i 0,1 ml 5% acetonitril och 95% vatten.
- Centrifug den resulterande lösningen (0,1 ml) vid 40 000 x g i 10 min vid 4 °C. Ladda supernaten i en injektionsflaska för LC-MS/MS-mätning.
3 LC-MS/MS-mätning
- Förbered en 10 mM ammoniumacetatbuffert genom att lösa upp 1,1 g ammoniumacetat i 2 L dubbeljoniserat vatten (mobil fas A). Justera pH-talet till 9,5 med 10 % ammonium och acetatsyra.
- Förbered 2 L ultrapure 100% metanol (Mobil fas B1) för mätning av nukleosider. Förbered också 2 L ultrapure 100% acetonitril (Mobil fas B2) för nukleotidmätning.
- Injicera 0,02 ml förbehandlad metabolitextraktion av varje prov från steg 2,7 i ett HPLC-system med binära pumpar (LC) i kombination med en trippel fyrdubbel masspektrometer (MS).
VARNING: HPLC-systemet använder en C18-kolumn (50 x 4,6 mm, partikelstorlek 5 μm; arbeta vid 25 °C) buffring med mobil fas A och B1 (figur 1A) för nukleosidereseparationen och använda en porös grafitisk kolkolonn (PGC) (50 x 4,6 mm, partikelstorlek 5 μm; arbeta vid 25 °C) med mobil fas A och B2 (figur 1B) för nukleotidsseparationen. Varje prov injicerades tre gånger för den tekniska replikeringen. - Programmera metoden enligt tabell 1 för kolumnen C18 och metoden som visas i tabell 2 för kolumnen PGC. Ställ in ett flöde på 0,65 ml min-1.
OBS: Massövergångar(tabell 3)övervakades av masspektrometer. Masspektrumanalysförhållandena för åtta nukleosider och fem nukleotider som innehåller kanoniska och modifierade är listade i tabell 3. - Registrera toppområdena för varje målförening (figur 1).
4 Generering av standardkalibreringskurvorna
- Pool sex provextraktioner tillsammans, som producerades enligt beskrivningen i avsnitt 2, och virvel det. Aliquot det sedan till sex extraktioner (samma volym) igen för att få varje bakgrund.
- Tillsätt sex olika koncentrationer av varje standard till dessa sex extraktioner och injicera dem en efter en efter steg 3.3.
- Registrera toppområdena för varje standard vid olika koncentrationer via massövergångar enligt beskrivningen i steg 3.4 och 3.5.
- Rita toppområdet mot den nominella koncentrationen av varje standard för att generera en sexpunktskurva.
OBS: De toppområden av nukleosider/nukleotider som registreras i steg 3.5 bör falla inom intervallet för standardkalibreringskurvor. - Beräkna ekvationen för en rak linje för varje standardförening: Y = aX + b
5 Metaboliter kvantifiering
- Beräkna metaboliternas innehåll med hjälp av topparealen som registrerats i steg 3.5 och ekvationen från steg 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi identifiering och kvantifieringav N 1-metyladnosin, en känd modifierad nukleosid, i 2 veckor gamla Arabidopsis vilda typ (Col-0) plantor som exempel. Masspektrometriprofilen anger att de produktjonersom genereras från standarden N 1-metyladenosin är 150 m/z och 133 m/z (figur 2A), och samma profil observeras också vid Col-0-extraktion (figur 2B). På grund av högt överflöd av produktjonen på 150 m/z väljs massövergången 282,1 till 150 (m/z) för kvantifieringen N1-metyladnosin. Dessutom är retentionstiden (RT) för måltoppen(figur 3B)7,05 min, vilket är samma som RT för N 1-metyladenosinstandard (figur 3A). Med tanke på de data som nämns ovan visar vi att vilda plantor innehåller in vivo N1-methyladenosin pool.
En koncentrationsseriemed N 1-metyladenosinstandarder (0, 1, 2,5, 5, 10 och 50 ng/ml) tillsattes i sex provextraktioner som producerades enligt steg 4.1 respektive 4.2 (figur 4A). 0,02 ml av varje standardprov injicerades i LC-MS/MS, och de ökade toppområdena på N1-metyladenosin plottades mot de nominella koncentrationerna av N1-metyadenosinstandarder. Ekvationen för den raka linjen är Y = 0,0004X - 0,163 (Bild 4B).
Tre replikat av Col-0 plantor extraherades och förbehandlades som beskrivits ovan. Topparealen N1-metyladnosin i dessa tre prover registrerades som 8 659, 12 147 och 12 711. Med tanke på den fem gånger anrikningen under extraktionen (se steg 2,5 och 2, 6) och med hjälp av ekvationen Y = 0,0004X - 0, 163, N1-metylladenosinkoncentrationen beräknades i tre vilda linjer till 0, 66, 0, 94 respektive 0, 98 ng / mL. Därför användes 100 mg av varje vild typ plantor för extraktion och återanvändes i 1 ml extraktionsbuffert. Därför kvantifierades 8,6 ± 1,7ng N 1-metylladenosin i 1 g 2 veckor gamla Arabidopsis vilda plantor.
| Tid | Flödeshastighet (mL min-1) | Mobil fas A (%) | Mobil fas B (metanol %) |
| 0 | 0.65 | 95 | 5 |
| 2 | 0.65 | 95 | 5 |
| 5.5 | 0.65 | 85 | 15 |
| 9.5 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11 | 0.65 | 15 | 85 |
| 11.1 | 0.65 | 95 | 5 |
| 20 | 0.65 | 95 | 5 |
Tabell 1: Metoden för kolumnen C18. Schematisk representation av lösningsmedel ändringar för jämvikt av C18 kolumn. Mobil fas A = 10 mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fas B = 100% metanol.
| Tid | Flödeshastighet (mL min-1) | Mobil fas A (%) | Mobil fas B (acetonitril %) |
| 0 | 0.65 | 90 | 10 |
| 9 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.4 | 0.65 | 0 | 100 |
| 10.6 | 0.65 | 90 | 10 |
| 21 | 0.65 | 90 | 10 |
Tabell 2: Metoden för PGC-kolumnen. Schematisk representation av lösningsmedel ändringar för jämvikt av PGC kolumn. Mobil fas A = 10mM ammoniumacetat, pH 9,5. Mobil fas B = 100% acetonitril.
| Nukleosider/nukleotider | Massövergång (m/z) | polaritet | Fragmentor | Kollisionsenergi (eV) | Cellacceleratorspänning | Retentionstid (min) | Lagringsfönster (min) | Övervakningsläge | |
| Föregångare ion | Produktjon | ||||||||
| adenosin | 268.1 | 136 | Positiv | 86 | 15 | 4 | 9.3 | 1.5 | MRM (mrm) |
| N1-metylladenosin | 282.12 | 150 | Positiv | 88 | 19 | 4 | 8.1 | 1.5 | MRM (mrm) |
| guanosin | 284.1 | 135 | Positiv | 90 | 45 | 4 | 7.9 | 1.5 | MRM (mrm) |
| O6-metylguanosin | 298.12 | 166 | Positiv | 68 | 19 | 4 | 9.8 | 1.5 | MRM (mrm) |
| inosin | 269.1 | 136.9 | Positiv | 55 | 14 | 4 | 7.2 | 1.5 | MRM (mrm) |
| uridin | 245.21 | 133 | Positiv | 85 | 14 | 4 | 3.7 | 1.5 | MRM (mrm) |
| pseudouridin | 245.21 | 125 | Positiv | 68 | 15 | 4 | 1.9 | 1.5 | MRM (mrm) |
| cytidin | 244.2 | 112 | Positiv | 150 | 10 | 4 | 2.6 | 1.5 | MRM (mrm) |
| ampere | 348.07 | 136 | Positiv | 111 | 17 | 4 | 11.8 | 2 | MRM (mrm) |
| GMP (GMP) | 364.07 | 152 | Positiv | 80 | 45 | 4 | 11.6 | 2 | MRM (mrm) |
| busfrö | 348.9 | 137 | Positiv | 79 | 15 | 4 | 10.9 | 2 | MRM (mrm) |
| Ump | 325.01 | 212.9 | Positiv | 98 | 3 | 4 | 9.4 | 2 | MRM (mrm) |
| CMP (CMP) | 324 | 112 | Positiv | 90 | 12 | 4 | 9.1 | 2 | MRM (mrm) |
Tabell 3: MS-analysförhållanden för nukleosider och nukleotider som detekteras med masspektrometer. Prekursorjonen och produktjonen för åtta nukleosider och sex nukleotider listas här och kan övervakas av MS för sammansatt identifiering och kvantifiering.
Figur 1: De kromatografiska topparna på åtta nukleosider och fem nukleotider. Separationsprofilerna för åtta nukleosider med kolumnen C18 (A) och fem nukleotider av PGC-kolumnen (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Identifiering av N1-metyladnosin genom massövergång. MS/MS-spektra av prekursorjon m/z 282.1 och produktjoner m/z 150 och m/z 133 upptäckta från N1-metyladenosinstandard(A)och Col-0-prover ( B ). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Den kromatografiska toppen av N1-metyladenosin. Massövergång på 282,1 till 150 övervakades för N 1-metyladenosin kvantifiering. Retentionstiderna för N 1-metyladenosintoppar i standard- och provmätningen var likartade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Generering avstandardkurvanN 1 -methyladenosin. A)Sex olika koncentrationer av N1-metyladenosin tillsattes i sex extraktionsmatriser. Och den resulterande ökningen toppade områden registrerades. B)Kalibreringskurvan för N 1-metylladenosin. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organismer innehåller olika nukleosider/nukleotider, inklusive kanoniska och avvikande sådana. Ursprunget och metabola endpoints av dem, särskilt modifierade nukleosider, är dock fortfarande dunkla. Dessutom återstår den nuvarande förståelsen av funktionen och homeostas av nukleosider / nukleotider metabolism att utforskas och utökas. För att undersöka dem måste en exakt och guldstandardmetod för dessa metaboliter identifiering och kvantifiering användas. Här beskrev vi ett protokoll med masspektrumet för nukleosider/nukleotider detektion. Med N1-metyladenosin som exempel kan denna metod upptäcka så låg som 0,02 ng-standard, och kalibreringskurvans noggrannhet är ganska hög (R2 = 0,999; Figur 4B). Jämfört med HPLC-metoden ger ett MS-baserat protokoll mycket bättre detekteringsgräns och noggrannhet. Ännu viktigare är att denna metod lätt kan utföras av forskare i ett biologiskt laboratorium som har en LC-MS/ MS. Dessutom kan det också användas för identifiering av andra strukturer som är kända metaboliter i växter.
För absolut kvantifiering in vivo av nukleosider/nukleotider krävs kommersiella standardkemikalier. De producerar de raka standardkurvorna, vilket gör det möjligt att beräkna målmetaboliterna i prover genom toppområden som registreras av masspektrometri. Det är viktigt att utbudet av toppområden i standardkalibreringskurvor täcker toppområdet för målmetabolit som avläses i MS. Dessutom bör en koncentrationsserie av standarder läggas till i provextraktionerna men inte lösas upp i vatten för kalibreringskurvagenerering. Detta beror på att det kommer att undvika matriseffekten, som är oerhört signifikant för kvantifieringsnoggrannhet.
Metoden som beskrivs här ger ett kraftfullt verktyg för nukleosider/nukleotider kvantifiering. Dess tillämpning kan sträcka sig till alla växter och även andra organismer. Hela förfarandet för provers förbehandling måste förbli kallt och snabbt för att undvika metaboliters nedbrytning, även om extraktionsbufferten innehåller 80% organiska kemikalier, vilket kan fälla ut de flesta proteiner (enzymer). Denna metod är dock inte lämplig för okänd målidentifiering. Identifiering och kvantifiering av målkemikalie i denna metod beror till stor del på de kommersiella kemiska standarderna. En annan begränsning av denna metod är att mätningen av nukleosider och nukleotider måste göras separat genom att använda en C18-kolumn respektive en PGC-kolumn. Det beror på att C18-kolumnens prestanda, även om den är stabilare och reproducerbar än PGC-kolumnen, kan den senare särskilt skilja nukleotider mycket bättre (figur 1B).
Sammanfattningsvis tillåter den presenterade metoden in vivo-kvantifiering av nukleosider/nukleotider i växter. Från planttillväxt till att få de slutliga resultaten kan experimenten slutföras inom 3 veckor. Kompletta prover förbehandlingar och LC-MS/MS-analyser tar ca 2 dagar för en uppsättning av 10 till 20 prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Fundamental Research Funds for the Central Universities (KJQN202060), National Natural Science Foundation of China (31900907), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190528), International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (CRP/CHN20-04_EC) till M.C., och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (LGZD202004) till X.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
References
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M.
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
