Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التعديل الوراثي القائم على التثقيب الكهربائي للخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

لقد طورنا بروتوكولا لنقل الخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية عن طريق التثقيب الكهربائي باستخدام عامل مشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) باستخدام نظام ترانسبوزون Sleeping Beauty (SB). تم إثبات النقل الناجح من خلال تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) ، والنشاف المناعي ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

Abstract

يؤدي مجتمعنا المسن بشكل متزايد إلى تزايد حالات الأمراض التنكسية العصبية. حتى الآن ، لا يتم فهم الآليات المرضية بشكل كاف ، مما يعوق إنشاء علاجات محددة. تعتبر العلاجات الجينية المضافة القائمة على الخلايا لزيادة التعبير عن عامل وقائي خيارا واعدا لعلاج الأمراض التنكسية العصبية ، مثل الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD). لقد طورنا طريقة للتعبير المستقر للعامل المشتق من ظهارة الصباغ المشفر للجين (PEDF) ، والذي يتميز بأنه بروتين وقائي عصبي ومضاد لتولد الأوعية في الجهاز العصبي ، في جينوم الخلايا الظهارية الصباغية البشرية الأولية (PE) باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم (SB). تم عزل خلايا PE الأولية من عيون المتبرعين البشريين والحفاظ عليها في الثقافة. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تم تعليق 1 × 104 خلايا في 11 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق ودمجها مع 2 ميكرولتر من محلول نقي يحتوي على 30 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزاز SB (SB100X) مفرط النشاط و 470 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزون PEDF. تم إجراء التعديل الوراثي باستخدام نظام التثقيب الكهربائي الشعري باستخدام المعلمات التالية: نبضتان بجهد 1100 فولت وعرض 20 مللي ثانية. تم نقل الخلايا المنقولة إلى ألواح استزراع تحتوي على وسط مكمل بمصل بقري جنيني. تمت إضافة المضادات الحيوية ومضادات الميكروبات مع أول تبادل متوسط. تم إثبات النقل الناجح في التجارب التي أجريت بشكل مستقل. أظهر تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) زيادة التعبير عن جين التحوير PEDF. كان إفراز PEDF مرتفعا بشكل ملحوظ وظل مستقرا ، كما تم تقييمه بواسطة النشاف المناعي ، وتم قياسه كميا بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). سمح النقل بوساطة SB100X بتكامل جين PEDF مستقر في جينوم خلايا PE وضمن الإفراز المستمر ل PEDF ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير علاج إضافة الجينات القائم على الخلايا لعلاج AMD أو الأمراض التنكسية الأخرى في شبكية العين. علاوة على ذلك ، أشار تحليل ملف تعريف تكامل ترانسبوزون PEDF في خلايا PE البشرية إلى توزيع جينومي عشوائي تقريبا.

Introduction

يوصف التقدم في العمر بأنه الخطر الرئيسي للأمراض التنكسية العصبية. التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو مرض متعدد الجينات يؤدي إلى فقدان البصر الشديد لدى المرضى الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما ، ينتمي إلى الأسباب الأربعة الأكثر شيوعا للعمى وضعف البصر1 ومن المتوقع أن يرتفع إلى 288 مليون شخص في عام 20402. تساهم اختلالات ظهارة الصباغ الشبكية (RPE) ، وهي طبقة واحدة من الخلايا المعبأة بإحكام تقع بين المشيمية والمستقبلات الضوئية للشبكية ، في التسبب في AMD. يؤدي RPE مهام متعددة ضرورية لوظيفة الشبكية الطبيعية3 ويفرز مجموعة متنوعة من عوامل النمو والعوامل الأساسية للحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكية والمشيمية الشعرية ، وبالتالي دعم بقاء المستقبلات الضوئية وتوفير أساس للدورة الدموية وإمدادات المواد الغذائية.

في العيون السليمة ، العامل المشتق من ظهارة الصباغ (PEDF) مسؤول عن موازنة تأثيرات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ويحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا المبرمج ، ويمنع تكاثر الخلايا البطانية ، ويثبت البطانة الشعرية. ترتبط نسبة VEGF إلى PEDF المتغيرة بالأوعية الدموية الجديدة للعين ، والتي لوحظت في النماذج الحيوانية 4,5 وكذلك في عينات من المرضى الذين يعانون من الأوعية الدموية المشيمية (CNV) بسبب AMD واعتلال الشبكية السكري التكاثري6،7،8،9،10 . تركيز VEGF المعزز هو الهدف للعلاج القياسي الحالي. تعمل الأدوية المضادة ل VEGF بيفاسيزوماب ورانيبيزوماب وأفليبيرسيبت ومؤخرا برولوسيزوماب على تحسين حدة البصر في حوالي ثلث مرضى CNV أو بالأحرى تثبيت الرؤية في 90٪ من الحالات11،12،13. ومع ذلك ، فإن الحقن داخل الجسم الزجاجي المتكررة ، وغالبا ما تكون شهرية ، تحمل مخاطر الأحداث الضائرة14 ، وتضعف امتثال المريض ، وتمثل عبئا اقتصاديا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية15. علاوة على ذلك ، فإن نسبة معينة من المرضى (2٪ -20٪) لا يستجيبون أو يتفاعلون بشكل سيئ فقط مع العلاج المضاد ل VEGF16،17،18،19. تتطلب هذه المصاحبة السلبية تطوير علاجات بديلة ، على سبيل المثال ، الغرسات داخل العين ، والنهج العلاجية الخلوية و / أو الجينية.

تطور العلاج الجيني كعلاج واعد للأمراض الوراثية وغير الوراثية ويهدف إلى استعادة تسلسل الجينات غير الوظيفية أو قمع التسلسلات المعطلة. بالنسبة للأمراض متعددة الجينات ، حيث يصعب تحديد العوامل المسببة واستبدالها ، تهدف الاستراتيجيات إلى التسليم المستمر لعامل الحماية. في حالة AMD ، تم تطوير العديد من العلاجات المضافة ، مثل التعبير المستقر عن الإندوستاتين والأنجيوستاتين 20 ، ومضاد VEGF القابل للذوبان مثل التيروزين كيناز -1 (sFLT-1) 21،22 ، ومجموعة البروتين التنظيمية التكميلية للتمايز 59 (CD59) 23 أو PEDF24,25 . تعد العين ، وخاصة شبكية العين ، هدفا ممتازا للأدوية القائمة على الجينات بسبب البنية المغلقة ، وسهولة الوصول ، وصغر حجمها ، وامتيازها المناعي ، مما يسمح بالتسليم الموضعي لجرعات علاجية منخفضة ويجعل عمليات الزرع أقل عرضة للرفض. علاوة على ذلك ، تتيح العين المراقبة غير الغازية ، ويمكن فحص شبكية العين بواسطة تقنيات تصوير مختلفة.

النواقل الفيروسية هي ، بسبب كفاءتها العالية في النقل ، الوسيلة الرئيسية لتوصيل الجينات العلاجية إلى الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، اعتمادا على الناقل الفيروسي المستخدم ، تم وصف ردود فعل سلبية مختلفة ، مثل الاستجابات المناعية والالتهابية26 ، والتأثيرات المطفرة والمسرطنة 27,28 ، أو الانتشار في الأنسجة الأخرى29. تشمل القيود العملية حجم العبوةالمقيد 30 بالإضافة إلى الصعوبات والتكاليف المرتبطة بإنتاج مجموعات الصفالسريري 31,32. وقد عززت هذه العيوب زيادة تطوير النواقل غير الفيروسية القائمة على البلازميد التي يتم نقلها عن طريق ليبو-/بوليبلكس، الموجات فوق الصوتية أو التثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، لا يتم عادة تعزيز التكامل الجيني للجين المحوري في الجينوم المضيف مع ناقلات البلازميد ، مما يؤدي إلى تعبير عابر.

الترانسبوزونات هي شظايا الحمض النووي التي تحدث بشكل طبيعي والتي تغير موقعها داخل الجينوم ، وهي خاصية تم تبنيها للعلاج الجيني. نظرا لآلية التكامل النشطة ، تسمح أنظمة النواقل القائمة على الترانسبوزون بالتعبير المستمر والمستمر عن جين التحوير المدرج. إن ترانسبوزون الجمال النائم (SB) ، الذي أعيد تشكيله من ترانسبوزون قديم من نوع Tc1 / مارينر موجود في الأسماك33 وتم تحسينه بشكل أكبر من خلال التطور الجزيئي مما أدى إلى متغير فرط النشاط SB100X34 ، مكن من النقل الفعال في الخلايا الأولية المختلفة واستخدم لتصحيح النمط الظاهري في نماذج الأمراض المختلفة35. في الوقت الحاضر ، تم بدء 13 تجربة سريرية باستخدام نظام SB transposon. يتكون نظام الترانسبوزون SB100X من مكونين: الترانسبوزون ، الذي يتألف من الجين محل الاهتمام المحاط بالتكرارات المقلوبة الطرفية (TIRs) ، والترانسبوزاز ، الذي يحشد الترانسبوزون. بعد توصيل الحمض النووي البلازميد إلى الخلايا ، يربط الترانسبوزاز TIRs ويحفز استئصال ودمج الترانسبوزون في جينوم الخلية.

لقد قمنا بتطوير علاج مضاف غير فيروسي قائم على الخلايا لعلاج AMD الوعائي الجديد. يشتمل النهج على إدخال جين PEDF القائم على التثقيب الكهربائي في الخلايا الظهارية الصبغية الأولية (PE) عن طريق نظام ترانسبوزون SB100X 36،37،38. يتم توفير المعلومات الوراثية ل transposase و PEDF على بلازميدات منفصلة ، مما يتيح تعديل نسبة الترانسبوزون SB100X إلى PEDF المثالية. يتم إجراء التثقيب الكهربائي باستخدام نظام نقل شعري قائم على الماصة يتميز بحجم فجوة كبير بين الأقطاب الكهربائية مع تقليل مساحة سطحها. وقد تبين أن الجهاز يحقق معدلات نقل ممتازة في مجموعة واسعة من خلايا الثدييات39،40،41. توفر مساحة سطح القطب الصغير مجالا كهربائيا موحدا وتقلل من الآثار الجانبية المختلفة للتحليل الكهربائي42.

تم عرض الوظيفة المضادة لتولد الأوعية الدموية ل PEDF التي تفرزها الخلايا الظهارية الصبغية المنقولة في تجارب مختلفة في المختبر تحلل نبتة وهجرة وموت الخلايا المبرمج للخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية43. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر زرع الخلايا المنقولة PEDF في نموذج أرنب من الأوعية الدموية القرنية44 بالإضافة إلى نموذج الفئران من CNV43،45،46 انخفاضا في الأوعية الدموية الجديدة.

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا للإدخال المستقر لجين PEDF في خلايا RPE البشرية الأولية عبر نظام transposon SB100X باستخدام نظام نقل الشعيرات الدموية. تم الاحتفاظ بالخلايا المنقولة في المزرعة لمدة 21 يوما وتم تحليلها لاحقا من حيث التعبير الجيني PEDF عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ومن حيث إفراز بروتين PEDF عن طريق النشاف المناعي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA ، الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على عيون متبرع بشري من بنك آخن للقرنية التابع لقسم طب العيون (مستشفى جامعة RWTH آخن) بعد الحصول على موافقة مستنيرة وفقا لبروتوكولات إعلان هلسنكي. تمت الموافقة على إجراءات جمع واستخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية.

1. عزل خلايا RPE البشرية الأولية

  1. وضع الملابس والقفازات واقية معقمة. ضع ستارة معقمة تحت تدفق رقائقي.
  2. ضع أدوات التحضير المعقمة وغيرها من المعدات المعقمة الضرورية تحت التدفق الرقائقي.
  3. سجل استلام كرات العين ، وبداية التحضير وكذلك التشوهات المحتملة. تسجيل عمر المتبرع وجنسه وسبب الوفاة والفترة بين وقت الوفاة وإزالة العين.
  4. ضع كرة العين في ضغط شاش معقم وأمسكها بيد واحدة.
  5. افصل الجزء الأمامي عن الجزء الخلفي عن طريق قطع محيطي حوالي 3.5 مم من الخلف إلى الحافة باستخدام مشرط ومقص عين مدبب دقيق للغاية.
  6. بعد إمالة الجزء الخلفي لأسفل ، قم بإزالة الجسم الزجاجي والشبكية بعناية باستخدام ملقط كوليبري.
  7. أعد ترتيب مجمع RPE / choroidea المنهار بتكتم باستخدام ملقط قزحية مستقيم ثم ثبته في موضعه باستخدام ملقط قزحية منحني.
  8. املأ كوب العين الخلفي ب 1 مل من خليط المغذيات F-12 من Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 80 وحدة / مل بنسلين و 80 ميكروغرام / مل ستربتومايسين (Pen / Strep) و 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B (AmphoB).
    ملاحظة: على عكس عزل خلايا RPE الأولية من عيون الخنازير أو الأبقار36,37 ، لا يلزم ملء كوب العين الخلفي وتحضينه بالتريبسين.
  9. احصد خلايا RPE عن طريق تنظيف ظهارة صبغة الشبكية برفق من العصب البصري باتجاه الحافة باستخدام ماصة باستور الزجاجية المنحنية المصقولة بالنار ، مع تثبيت مجمع RPE / choroidea في النسيان باستخدام ملقط كوليبري. نقل تعليق الخلية إلى طبق بتري.
  10. كرر الخطوتين 1.8 و 1.9 واجمع كل الخلايا في طبق بتري. أعد تعليق تعليق الخلية بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة أحادية القناة (100-1000 ميكرولتر).
  11. قم بزرع معلق خلية RPE لكل كرة عين في ثلاثة آبار من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا واملأها حتى 1 مل باستخدام DMEM / F12 المكمل ب FBS و Pen / Strep و AmphoB.
  12. حافظ على مزارع خلايا RPE عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 95٪ هواء و 5٪ CO2 حتى يتم الوصول إلى التقاء. تغيير وسط ثقافة الخلية مرتين في الأسبوع.

2. التثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية

  1. تحضير خليط بلازميد الترانسبوزون SB100X / PEDF
    1. تنقية SB100X transposase و PEDF transposon plasmid DNA باستخدام مجموعات تنقية البلازميد العرفية ، والتي تم تحديدها لتكون مناسبة للاستخدام في تطبيقات مثل transfection ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. تحديد محتويات الحمض النووي البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم وضبطها على تركيز 250 نانوغرام / ميكرولتر مع 10 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8.5).
    3. امزج جزءا واحدا من 250 نانوغرام / ميكرولتر SB100X transposase plasmid DNA (على سبيل المثال ، 2.5 ميكرولتر) مع 16 جزءا من 250 نانوغرام / ميكرولتر PEDF transposon plasmid DNA (على سبيل المثال ، 40 ميكرولتر). يمكن تخزين خليط البلازميد المتبقي عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة المتعددة لخليط البلازميد.
    4. ضع 2 ميكرولتر من خليط بلازميد ترانسبوزون SB100X / PEDF transposon ، الذي يحتوي على 29.4 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزاز SB100X و 470.6 نانوغرام من بلازميد ترانسبوزون PEDF ، في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل آمن. يحفظ على الثلج حتى يختلط بالخلايا.
  2. إعداد نظام نقل الشعيرات الدموية
    ملاحظة: تم إجراء التثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية عبر نظام نقل شعري باستخدام مجموعة 10 ميكرولتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يتكون النظام من جهاز النقل ، وماصة النقل ، ومحطة الماصة. تحتوي المجموعة على 10 ميكرولتر من أطراف النقل ، وأنابيب عازلة ، ومخزن كهربائي E (المخزن المؤقت E) ، ومخزن إعادة التعليق R (المخزن المؤقت R).
    1. قم بتوصيل محطة الماصة بجهاز النقل.
    2. املأ أنبوبا عازلا ب 3 مل من المخزن المؤقت E وأدخله في محطة الماصة حتى يسمع صوت نقرة.
      ملاحظة: تأكد من توصيل القطب الجانبي للأنبوب العازل بالمكبس الكروي الجانبي لمحطة الماصة.
    3. للتثقيب الكهربائي لخلايا RPE البشرية الأولية ، اضبط شروط النبض التالية على جهاز النقل: 1100 فولت (جهد النبض) ، 20 مللي ثانية (عرض النبضة) ، نبضتان (رقم النبضة).
  3. تحضير خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة
    1. توثيق شكل ومورفولوجيا مزارع خلايا RPE الأولية عبر الفحص المجهري لتباين الطور. خذ صورا مجهرية منخفضة التكبير لإثبات نمو خلايا RPE إلى طبقة أحادية متقاربة ومتكاملة بالإضافة إلى صور مجهرية مكبرة أعلى للإشارة إلى مورفولوجيا الحصى النموذجية لخلايا RPE.
    2. نضح وسط زراعة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل محلول ملحي فوسفات مخزن (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
    3. التربسينات خلايا RPE البشرية الأولية مع 0.5 مل 0.05٪ تربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 95٪ هواء و 5٪ CO2 لمدة 7-15 دقيقة (كحد أقصى). تحقق من انفصال الخلية مجهريا.
    4. أوقف التربسين مع 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS. خذ حصة 20 ميكرولتر لعد الخلايا باستخدام مقياس الدم. جهاز طرد مركزي لنظام تعليق خلية RPE عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
    5. امزج القسمة 20 ميكرولتر مع محلول تريبان أزرق 20 ميكرولتر. ماصة 10 ميكرولتر في كل نصف من مقياس الدم وعد الخلايا تحت مجهر تباين الطور.
    6. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات خلية RPE في 1 مل من PBS.
    7. خذ 10000-100000 خلية RPE لكل تفاعل نقل وطرد مركزي لها عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: بجانب تفاعلات النقل مع تطبيق المجال الكهربائي وإضافة الحمض النووي البلازميد ، يتضمن كل نهج أيضا ثقافتين مختلفتين للتحكم: (1) بدون تطبيق المجال الكهربائي وبدون الحمض النووي البلازميد. (2) مع تطبيق المجال الكهربائي ، ولكن بدون الحمض النووي البلازميد.
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 11 ميكرولتر من المخزن المؤقت R وادمجها مع 2 ميكرولتر من خليط بلازميد ترانسبوزون SB100X transposase / PEDF (انظر الخطوة 2.1.4).
      ملاحظة: بعد إعادة التعليق في المخزن المؤقت R ، يجب معالجة الخلايا في غضون 15 دقيقة لتجنب انخفاض صلاحية الخلية وكفاءة النقل.
    9. أدخل رأس ماصة النقل في طرف النقل 10 ميكرولتر حتى يلتقط المشبك جذع التثبيت للمكبس بالكامل. ارسم محلول الخلية / البلازميد في طرف النقل.
      ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء وشفطها في طرف النقل.
    10. قم بتوفير 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS ، ولكن بدون Pen / Strep وبدون AmphoB ، في العدد المطلوب من الآبار للوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا.
  4. عملية التثقيب الكهربائي
    1. أدخل ماصة النقل في الأنبوب العازل الموجود في محطة الماصة (انظر الخطوة 2.2.2) حتى يسمع صوت نقرة.
      ملاحظة: تأكد من توصيل الرأس المعدني لماصة النقل بالمكبس الكروي داخل محطة الماصة والأنبوب العازل.
    2. اضغط على ابدأ على شاشة اللمس لجهاز النقل. قبل تطبيق النبضة الكهربائية ، يتحقق الجهاز تلقائيا مما إذا كان الأنبوب العازل وماصة النقل قد تم إدخالهما بشكل صحيح. بعد توصيل النبضات الكهربائية ، يتم عرض Complete على شاشة اللمس.
    3. قم بإزالة ماصة النقل بعناية من محطة الماصة وحرر الخلايا المكهربة على الفور من طرف النقل 10 ميكرولتر عن طريق سحب محلول الخلية / البلازميد في الآبار المحضرة للوحة زراعة الخلايا (انظر الخطوة 2.3.10).
    4. الحفاظ على مزارع خلايا RPE المنقولة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ CO2. أضف القلم / العقدية و AmphoB مع أول تبادل متوسط بعد 3 أيام من التثقيب الكهربائي.

3. تحليلات خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة

  1. إعداد العينة
    1. بعد وقت زراعة مدته 3 أسابيع ، قم في النهاية باحتضان مزارع خلايا RPE بحجم محدد يبلغ 1.0 مل DMEM / F12 مع FBS و Pen / Strep و AmphoB لفترة محددة تبلغ 24 ساعة.
    2. خذ طاف زراعة الخلايا وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة في وقت قريب أو عند -80 درجة مئوية للعينات غير المستقرة حراريا والتخزين طويل الأجل.
    3. قم بالتريبسين بزراعة خلايا RPE المنقولة مع 0.5 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق.
    4. أوقف التربسين مع 1 مل من DMEM / F12 المكمل ب FBS. خذ حصصا صغيرة لعد الخلايا باستخدام مقياس الدم (انظر الخطوة 2.3.5). جهاز طرد مركزي لنظام تعليق خلية RPE عند 106 × جم لمدة 10 دقائق.
    5. قم بتخزين كريات خلية RPE عند -80 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية.
  2. تقييم إفراز PEDF عن طريق النشاف الغربي
    ملاحظة: لإجراء تقييم نوعي، يتم تحليل المواد الطافية لزراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.1.2) عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) والنشاف الغربي اللاحق. اعتمادا على PEDF الحمض النووي البلازميد transposon المستخدمة ، يجب معالجة المواد الطافية بشكل مختلف.
    1. تنقية بروتينات اندماج PEDF الموسومة من طاف زراعة الخلايا
      1. خذ ملاط حمض النيكل والنيتريلوتريسيتيك (Ni-NTA) 30 ميكرولتر لكل عينة باستخدام طرف مقطوع شطبة وحبيبات راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      2. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن الحضانة 1x (50 mM NaH 2 PO4 ، 300 mM NaCl ، 10 mM imidazole ، pH 8.0) وحبيباته بالطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      3. كرر الخطوة السابقة.
      4. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام مخزن حضانة 40 ميكرولتر 4x (200 mM NaH 2 PO4 ،1.2M NaCl ، 40 mM imidazole ، درجة حموضة 8.0) لكل عينة.
      5. امزج 900 ميكرولتر من طافي زراعة الخلايا مع 260 ميكرولتر من محلول الحضانة 4x و 55 ميكرولتر من ملاط Ni-NTA المعالج مسبقا (انظر الخطوة 3.2.1.4).
      6. احتضان الخليط على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
      7. بيليه راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2660 × جم لمدة 60 ثانية).
      8. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 175 ميكرولتر من مخزن الحضانة 1x وراتنج الحبيبات عن طريق الطرد المركزي (2660 × جم لمدة 60 ثانية).
      9. كرر الخطوة السابقة.
      10. أعد تعليق راتنج Ni-NTA بعناية باستخدام 30 ميكرولتر من محلول الشطف (50 mM NaH2PO4 ، 300 mM NaCl ، 250 mM imidazole ، درجة الحموضة 8.0) واحتضان الخليط على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      11. بيليه راتنج Ni-NTA عن طريق الطرد المركزي (2,660 × جم لمدة 30 ثانية).
      12. خذ الطافية بعناية واخلطها مع 2x SDS عينة عازلة47.
      13. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وافصلي البروتينات المنقاة Ni-NTA على جل SDS-polyacrylamide بنسبة 10٪.
      14. قم بإجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Penta-His (الفأر أحادي النسيلة ، 1: 500) والأجسام المضادة المضادة للفأر المترافقة بيروكسيديز الفجل (HRP) (أرنب متعدد النسيلة ، 1: 1,000) كما هو موضح سابقا36,37.
    2. التحليل المباشر لبروتينات PEDF غير الموسومة
      1. خذ 15 ميكرولتر من طاف زراعة الخلايا واخلطه مع 2x SDS عينة عازلة47.
      2. سخني الخليط على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وافصلي البروتينات على جل SDS-polyacrylamide بنسبة 10٪.
      3. قم بإجراء النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة PEDF المضادة للإنسان (أرنب متعدد النسيلة ، 1: 4000) وأجسام مضادة للأرانب مقترنة HRP (الماعز متعدد النسيلة ، 1: 2000) كما هو موضح سابقا38.
    3. القياس الكمي لإفراز PEDF بواسطة ELISA
      1. تحليل طاف زراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.1.2) باستخدام مجموعة PEDF ELISA البشرية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. اربط كمية PEDF المفرزة بالوقت ورقم الخلية المحددين لكل تفاعل نقل (انظر الخطوة 3.1.4).
    4. تحليل التعبير الجيني PEDF في خلايا RPE المنقولة
      1. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من كريات خلايا RPE (انظر الخطوة 3.1.5) باستخدام مجموعة متاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. تحديد محتويات الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
      3. قم بإجراء النسخ العكسي على 0.1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام نظام النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      4. قم بإجراء qPCR في الوقت الفعلي كما هو موضح سابقا38.
    5. تحليل مواقع إدخال الجينات المحورة في خلايا RPE المنقولة
      1. عزل الحمض النووي الجينومي من كريات خلايا RPE (انظر الخطوة 3.1.5) باستخدام مجموعة متاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      2. تحديد محتويات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
      3. قم بإنشاء مكتبات موقع الإدراج باستخدام مخطط PCR الخاص ب hemi بمساعدة الحساب كما هو موضح سابقا38.
      4. إجراء التحليل الحسابي كما هو موضح سابقا38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

زراعة خلايا RPE البشرية الأولية والتثقيب الكهربائي لها
لقد أظهرنا أن بذر عدد كاف من خلايا RPE الأولية ذات الأصل الحيواني يسمح بالزراعة والنمو إلى طبقة أحادية متكاملة من الخلايا المصطبغة سداسية الشكل36،37،48. تعكس قدرتها على تكوين تقاطعات ضيقة ، وإظهار نشاط البلعمة ، والتعبير عن جينات علامة محددة في المختبر48 مهام كبيرة لظهارة صبغة الشبكية في الجسم الحي. أظهرت خلايا RPE الأولية المزروعة المعزولة عن عيون المتبرع البشري أيضا مورفولوجيا الحصى النموذجية ، بغض النظر عن عمر المتبرع (65.3 ± 9.94 أ ، دقيقة: 49 أ ، الحد الأقصى: 83 أ ، ن = 12) ، وقت العزل بعد الوفاة (37.3 ± 17.0 ساعة ، دقيقة: 16 ساعة ، الحد الأقصى: 68 ساعة ، ن = 12) ، ووقت الزراعة (27.6 ± 14.1 د ، دقيقة: 13 د ، الحد الأقصى: 61 د ، ن = 12) (الشكل 2 ، اللوحة اليسرى). لم يؤثر تطبيق النبضات الكهربائية قصيرة المدى على خلايا RPE البشرية الأولية باستخدام نظام النقل الشعري سلبا على التشكل الظهاري (الشكل 2 ، اللوحة اليمنى). كشف اختبار المعلمات الكهربائية المختلفة أن نبضتين بجهد نبضي يبلغ 1200 فولت وعرض نبضة يبلغ 20 مللي ثانية قد حققتا كفاءات نقل جيدة ومستقرة وأكبر عدد من خلايا RPE القابلة للحياة (بيانات غير منشورة).

إدخال جين PEDF بوساطة SB100X في خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة
لقد اختبرنا نسب الحمض النووي البلازميد من SB100X-to-PEDF transposon تتراوح من 250 نانوغرام (0.08 بمول) SB100X transposase بالإضافة إلى 250 نانوغرام (0.052 بمول) ترانسبوزون PEDF إلى 12.2 نانوغرام (0.0039 بمول) SB100X ترانسبوزاز بالإضافة إلى 487.8 نانوغرام (0.1 بمول) ترانسبوزون PEDF. حدد هذا النهج المجموعتين 29.4 نانوغرام (0.0094 بمول) SB100X transposase بالإضافة إلى 470.6 نانوغرام (0.098 بمول) PEDF transposon و 23.8 نانوغرام (0.0076 بمول) بالإضافة إلى 476.2 نانوغرام (0.099 بمول) باعتبارها تلك التي حصلت على أفضل كفاءات تبديل37. في خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة ، سمح توصيل جين التحوير PEDF باستخدام نظام transposon SB100X بزيادة التعبير الجيني PEDF باستمرار وإفراز بروتين PEDF. بالنسبة ل PEDF المؤتلف الموسوم به ، أظهر تحليل اللطخة الغربية لوسائط زراعة الخلايا من خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة إفراز PEDF بمستويات ثابتة دون إسكات الجينات المحورة لأكثر من 500 يوم (الشكل 3 أ). بالنسبة ل PEDF غير الموسومة ، تبين أيضا أن الإفراز في خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة يزداد بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا غير المنقولة38. أشار تحليل اللطخة الغربية التمثيلية لوسائط زراعة الخلايا من عمليات النقل التي تم إجراؤها بشكل متسلسل بوضوح إلى معدل إفراز PEDF الأعلى عالميا بعد 21 يوما من النقل (الشكل 3 ب) ، وفي ثقافة لاحقة ، تم إثبات إفراز PEDF المرتفع على المدى الطويل لمدة 165 يوما على الأقل (الشكل 3C). أظهر القياس الكمي القائم على ELISA زيادة بمقدار 20 ضعفا في إجمالي إفراز PEDF في خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة مقارنة بخلايا التحكم غير المنقولة (الشكل 3D). تم تأكيد هذه الزيادة أيضا على مستوى التعبير الجيني ، حيث تم رفع إجمالي تعبير PEDF أكثر من 30 ضعفا (الشكل 3E).

Figure 1
الشكل 1: سير العمل لإدخال جين PEDF القائم على التثقيب الكهربائي في خلايا RPE البشرية الأولية عن طريق نظام ترانسبوزون SB100X. يصف المخطط المسار الزمني ل (أ) عزل خلايا RPE البشرية الأولية وزراعتها اللاحقة إلى طبقة أحادية متقاربة ، (ب) الخطوات الفردية لعملية التثقيب الكهربائي ، بما في ذلك تنقية ترانسبوزاز SB100X والحمض النووي البلازميد الترانسبوزوني PEDF ، وإعداد SB100X transposase / PEDF خليط بلازميد ترانسبوزون ، وإعداد نظام نقل الشعيرات الدموية ، وإعداد خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة ، والتثقيب الكهربائي ، والبذر ، وزراعة خلايا RPE المنقولة ، وكذلك (ج) تحليلات خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة ، والتي تشمل تحضير طاف زراعة الخلايا وعينات الخلايا المنقولة ، تقييم وقياس إفراز PEDF ، وتحليل التعبير الجيني PEDF. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: صور مجهرية لتباين الطور لخلايا RPE معزولة عن عيون متبرعين مختلفين. مزارع خلايا RPE البشرية الأولية ، تختلف في عمر المتبرع ، ووقت العزل بعد الوفاة ، ووقت الزراعة قبل تطبيقها للتثقيب الكهربائي (اللوحة اليسرى) ، وكذلك مزارع خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة ، المعرضة للمعلمات الكهربائية 1100 فولت (جهد النبض) ، 20 مللي ثانية (عرض النبضة) ، ونبضتان (عدد النبضات) باستخدام نظام النقل الشعري (اللوحة اليمنى ) ، أظهرت طبقة أحادية متكاملة متقاربة من الخلايا المصطبغة في نمط يشبه الحصى (قضبان المقياس: 500 ميكرومتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: إفراز PEDF والتعبير الجيني PEDF بعد النقل بوساطة SB100X لخلايا RPE البشرية الأولية. (أ-ج) التحليلات القائمة على المناعة لاستقرار إفراز PEDF في خلايا RPE البشرية الأولية المزروعة المنقولة بمزيج من 29.4 نانوغرام (0.0094 بمول) SB100X ترانسبوماز بلازميد زائد 470.6 نانوغرام (0.098 بمول) بلازميد ترانسبوزون PEDF باستخدام نظام النقل الشعري. (أ) تم نقل خلايا RPE المأخوذة من متبرع يبلغ من العمر 26 عاما (أنثى ، وقت العزل بعد الوفاة: 26 ساعة ، وقت الزراعة قبل التثقيب الكهربائي: 14 يوما) والاحتفاظ بها في المزرعة لأكثر من 500 يوم. تم تنقية PEDF المؤتلف الموسوم به (~ 48 كيلو دالتون) من وسائط زراعة الخلايا في نقاط زمنية مختلفة وتم تقييمها بواسطة النشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة ل Penta-His . (ب) بالنسبة ل PEDF المؤتلف غير الموسوم ، تم عزل خلايا RPE من متبرع يبلغ من العمر 53 عاما (أنثى ، وقت العزل بعد الوفاة: 28 ساعة ، وقت الزراعة قبل النقل: 19 يوما) بالكهرباء بدون الحمض النووي البلازميد (مزارع التحكم # 1 و # 2) أو مع إضافة الحمض النووي البلازميد (مزارع الخلايا المنقولة PEDF # 3 إلى # 7) والحفاظ عليها في الثقافة لمدة 21 يوما. لم يتم تنقية المواد الطافية لزراعة الخلايا ، ولكن تم تحليلها مباشرة عن طريق النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة ل PEDF. أظهر تحليل اللطخة الغربية لمحللات الخلايا مستوى PEDF داخل الخلايا في الضوابط (الثقافات # 1 و # 2) والخلايا المنقولة (الثقافات # 3 و # 4). تمت الإشارة إلى تحميل كميات مماثلة من البروتين من خلال الكثافة المتساوية لنطاقات بروتين GAPDH (~ 36 كيلو دالتون). (ج) لتحليل إفراز PEDF على المدى الطويل ، تم الاحتفاظ بخلايا RPE من متبرع يبلغ من العمر 63 عاما (ذكر ، وقت العزل بعد الوفاة: 26 ساعة ، وقت الزراعة قبل النقل: 15 يوما) بالكهرباء بدون الحمض النووي البلازميد (مزارع التحكم # 1 و # 2) أو مع الحمض النووي البلازميد (زراعة الخلايا المنقولة PEDF # 3) والحفاظ عليها في الثقافة لمدة 165 يوما على الأقل. لم يتم تنقية وسائط زراعة الخلايا ، ولكن تم تحليلها مباشرة عن طريق النشاف المناعي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل PEDF. (د) القياس الكمي القائم على ELISA لإفراز PEDF الكلي في خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة (عينتان) وخلايا التحكم غير المنقولة (أربع عينات). تمت مقارنة إفراز الخلايا المنقولة بإفراز الخلايا غير المنقولة (* p = 0.0264 ، اختبار t غير المزاوج مع تصحيح ويلش). (ه) كان التعبير الجيني PEDF الداخلي والكلي (الداخلي بالإضافة إلى المؤتلف) في خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة مرتبطا بالتعبير في خلايا التحكم غير المنقولة ، والتي تم ضبط تعبيرها على 1 (خط متقطع). يتم تقديم البيانات كمخطط مربع وشارب (شعيرات: من دقيقة إلى كحد أقصى). تمت مقارنة التعبير الجيني الكلي ل PEDF بالتعبير الجيني PEDF الداخلي (ليس اختبارا مهما وغير مزاوج مع تصحيح ويلش). تمثل نتائج PEDF المؤتلف غير الموسوم (B-E) وحدتين من مجموعة البيانات الكاملة لخلايا RPE الأولية من ما يصل إلى 27 متبرعا تم نقلها بنسبة نقل SB100X إلى PEDF تبلغ 29.4 نانوغرام (0.0094 بمول) بالإضافة إلى 470.6 نانوغرام (0.098 بمول) ، والتي وصفها Thumann et al. 2017 38. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في مشروعنا ، نهدف إلى الإنتاج غير الفيروسي لخلايا RPE البشرية الأولية المعدلة وراثيا والتي تفرط باستمرار في التعبير عن عامل فعال وتفرز من أجل استخدام الخلايا المنقولة كعلاج طويل الأجل لإنشاء بيئة واقية والحفاظ عليها. لقد أنشأنا إدخال الترميز الجيني PEDF ، وهو بروتين متعدد الوظائف يتم التعبير عنه في كل مكان مع وظائف مضادة لتولد الأوعية الدموية والحماية العصبية. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لنقل خلايا RPE البشرية الأولية بشكل ثابت وقابل للتكرار باستخدام نظام transposon SB100X . يتم إجراء توصيل الحمض النووي وإدخاله في خلايا RPE باستخدام نظام نقل شعري قائم على الماصة ، والذي يستخدم نصائح محددة كغرفة تثقيب كهربائي بدلا من cuvettes.

يتأثر إثراء مزارع RPE الأولية التي تتكون من خلايا متمايزة شكليا لاستخدامها في عمليات النقل اللاحقة بعدة عوامل تتعلق بالمتبرع البشري (العمر والحالة الصحية العامة) بالإضافة إلى تلقي العينين (وقت عزل الخلايا بعد الوفاة). تحتاج خلايا RPE الأولية المعزولة حديثا والمصنفة إلى 2 أسابيع على الأقل لتطوير طبقة أحادية من الخلايا سداسية الشكل. كقاعدة عامة ، أظهرت مزارع الخلايا التي احتاجت إلى مزيد من الوقت للوصول إلى التقاء قبل النقل أيضا تباطؤا في الالتزام والانتشار بعد النقل. كما يتم إعاقة التصاق الخلايا وانتشارها عن طريق ترسب الصباغ الحر من خلايا RPE التالفة أثناء عزل الخلية أو عملية النقل.

نظام SB transposon هو أداة وراثية مستخدمة على نطاق واسع تمكن من التوصيل الفعال والآمن لتسلسلات النوكليوتيدات ذات الصلة علاجيا إلى أنواع مختلفة من الخلايا ليتم تطبيقها لاحقا في العلاجات الخلوية القائمة على الجينات. على وجه الخصوص ، يجمع البديل المحسن SB100X بين مزايا النواقل الفيروسية والحمض النووي البلازميد غير الفيروسي. يضمن وضع العمل المتكامل تكاملا جينوميا مستقرا لشريط التعبير في جينوم الخلية المضيفة ويتيح التعبير المستمر عن الجين أو التسلسل محل الاهتمام. على عكس ناقلات الفيروسات القهقرية ، التي تندمج بشكل تفضيلي في وحدات النسخ النشطة مع ارتفاع مخاطر الطفرات المحتملة وتكوين الأورام27,28 ، فإن ملف تعريف التكامل المستند إلى SB عشوائي. وقد تجلى ذلك في عدد كبير من الدراسات التي استخدمت مختلف خلايا الثدييات المستزرعة والأولية ، بما في ذلك الخلايا البشرية49،50،51،52 ، وكذلك للفئران الأولية وخلايا RPE البشرية38،46. علاوة على ذلك ، فإن تطبيق نظام ترانسبوزون SB كحمض نووي بلازميد يوفر مناعة منخفضة ويسهل عملية التصنيع.

يعد توصيل المعلومات الوراثية ل SB100X transposase وجين التحوير PEDF على بلازميدات منفصلة جانبا مهما ، لأنه يسمح بتعديل دقيق لنسبة transposon SB100X إلى PEDF المثلى. كما هو موضح سابقا ، فإن نظام transposon SB حساس لوجود فائض من تعبير transposase ، مما يؤدي إلى تثبيط نشاط النقل53. لاحظنا أيضا هذا التأثير لخلايا ARPE-19 ، وهو خط خلية متطور تلقائيا يتم تنقيته عن طريق التربسين الانتقائي لثقافة RPE البشرية الأولية54 ، وخلايا RPE الأولية. هنا ، أدى النقل بنسب نقل SB100X إلى PEDF تصل إلى 55.6 نانوغرام (0.018 بمول) SB100X transposase بالإضافة إلى 444.4 نانوغرام (0.093 بمول) PEDF transposon أدى إلى انخفاض واضح في معدلات إفراز PEDF 37. يجب تحديد النسبة المثالية للترانسبوزاز إلى الترانسبوزون لكل بلازميد ترانسبوزون تم إنشاؤه حديثا.

يمكن نقل النواقل غير الفيروسية القائمة على البلازميد عبر lipo-/ polyplexes أو الجسيمات النانوية أو الليزر أو الموجات فوق الصوتية أو التثقيب الكهربائي. لقد أظهرنا بالفعل أن النقل القائم على الدهون لخلايا PE الأولية لم يكن فعالا وبالتالي تحول إلى نقل الجينات القائم على التثقيب الكهربائي36. يعرف التثقيب الكهربائي بأنه تطبيق مجال كهربائي قصير المدة على الخلايا ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الغشاء وتكوين مسام مائية ، يمكن من خلالها دخول الحمض النووي البلازميد إلى الخلية. بشكل عام ، يتم ملء خليط من الخلايا والحمض النووي البلازميد والمخزن المؤقت الموصل في غرفة تثقيب كهربائي محددة بين قطبين كهربائيين متصلين بجهاز التثقيب الكهربائي الذي يولد النبضات الكهربائية. في هذا الإعداد الكهربائي السائب ، تتميز غرفة التثقيب الكهربائي التقليدية من كوفيت بقطبين متوازيين من نوع اللوحة ، تكون المسافة متغيرة (0.1-0.4 مم) ، اعتمادا على نوع الخلية وعدد الخلايا المستخدمة لكل تفاعل تثقيب كهربائي. على الرغم من كفاءات النقل الجيدة ، قد تؤثر الآثار الجانبية المختلفة سلبا على بقاء الخلايا المنقولة ، على سبيل المثال ، تغيرات الأس الهيدروجيني ، وتطور الحرارة ، وتوليد الفقاعات ، والتدفق المضطرب. يخفف نظام النقل الشعري على الأقل من الآثار الجانبية القائمة على الكوفيت من خلال امتلاك أقطاب كهربائية ذات مساحة سطح صغيرة وحجم فجوة أكبر بينهما42 وكذلك باستخدام إعادة تعليق محددة ومخازن كهربائية ؛ ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن مؤلفاتهم.

على الرغم من التحسينات داخل إعداد التثقيب الكهربائي السائب ، مما أدى إلى زيادة بقاء الخلية ، فإن الضرر الذي لا رجعة فيه لنسبة معينة من الخلايا أمر لا مفر منه. علاوة على ذلك ، لا يمكن التحكم الدقيق في كمية البلازميد المدمجة في الخلايا. سمح التطوير الأحدث لأنظمة التثقيب الكهربائي المصغر بإجراء تحسينات إضافية من خلال تقليل القيود المرتبطة بالتثقيب الكهربائي بالجملة. تعتمد هذه الأجهزة الجديدة على الأقطاب الكهربائية الدقيقة أو الموائع الدقيقة أو الهياكل النانوية. أنها توفر وجهات نظر تطبيق جديدة في مجالات العلاج الجيني ، والطب التجديدي ، والتحقيق داخل الخلايا في الموقع (راجعها Chang et al. و Shi et al.) 55,56.

لقد أثبتنا أن التثقيب الكهربائي ، الذي تم إجراؤه في البداية باستخدام نظام قائم على كوفيت وتم إنشاؤه لاحقا باستخدام نظام شعري قائم على الماصة ، هو طريقة مناسبة وفعالة لنقل كل من خط الخلايا الظهارية الصبغية ARPE-19 وكذلك خلايا PE الأولية36،37،38،57،58 . اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة ، من المهم تحديد بروتوكولات التثقيب الكهربائي المناسبة التي تطبق المعلمات التي تسمح بكفاءة نقل جيدة وبقاء الخلية. تمنع المجالات الكهربائية غير الكافية الخلايا من التلف ولكنها تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل. مع زيادة شدة المجال الكهربائي ، يتم تحقيق كفاءات نقل معززة. ومع ذلك ، تؤدي المعلمات الكهربائية المرتفعة أيضا إلى نسب أعلى من الخلايا الميتة بسبب تلف الخلايا الذي لا رجعة فيه. بالنسبة لخط خلايا ARPE-19 ، باستخدام نظام النقل الشعري ، تبين أن معلمات التثقيب الكهربائي البالغة 1350 فولت و 20 مللي ثانية ونبضتين تؤدي إلى كفاءة نقل أولية بنسبة 100٪ 37. أدى تطبيق هذه المعلمات لنقل خلايا RPE الأولية إلى كفاءات جيدة أيضا ، ولكن أيضا في عدد أقل من الخلايا المزروعة بعد النقل عند مقارنتها بمعلمات التثقيب الكهربائي البالغة 1100 فولت و 20 مللي ثانية ونبضتين (البيانات غير معروضة). لذلك ، تم اتخاذ قرار باختيار معلمات التثقيب الكهربائي الأكثر اعتدالا لمنع تلف الخلايا وقبول الخلايا الأقل نقلا.

يكمن الهدف العام من هذا النهج في التطبيق السريري للخلايا المنقولة PEDF لعلاج المرضى الذين يعانون من AMD الوعائي الجديد. يشتمل العلاج على إدخال مستقر لجين التحوير PEDF في الخلايا الظهارية الصبغية الذاتية خارج الجسم الحي بناء على نظام transposon SB100X ، يليه زرع الخلايا المنقولة إلى الفضاء تحت الشبكية للمريض. وبالتالي ، من المهم التأكد من أن الخلايا المنقولة PEDF لا تتمايز ولا تكتسب شكلا ليفيا وسلوك نمو. من المهم أيضا إثبات أن الخلايا المنقولة تسمح بإفراز مستمر ومتسق ل PEDF. علاوة على ذلك ، من الأهمية بمكان معرفة الكمية الدقيقة من PEDF التي يفرزها عدد معين من الخلايا لفترة زمنية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

زولتان إيفيكس وزسوزانا إيزفاك مخترعان في العديد من براءات الاختراع على تقنية SB transposon

Acknowledgments

وحظي هذا العمل بدعم البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي للبحث والتطوير التكنولوجي والبيان العملي، اتفاق المنحة رقم 305134. تم تمويل Zsuzsanna Izsvák من قبل مجلس البحوث الأوروبي ، ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). يود المؤلفون أن يشكروا آنا دوبياس وأنتجي شيفر (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) على الدعم الفني الممتاز ، وبنك آخن القرنية (قسم طب العيون ، مستشفى جامعة RWTH آخن) لتوفير عيون المتبرع البشري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

الطب ، العدد 168 ، التنكس البقعي المرتبط بالعمر ، AMD ، نظام التثقيب الكهربائي الشعري ، النقل غير الفيروسي ، العامل المشتق من ظهارة الصباغ ، PEDF ، الخلايا الظهارية الصبغية الأولية ، نظام ترانسبوزون الجمال النائم ، SB
التعديل الوراثي القائم على التثقيب الكهربائي للخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter