Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित आनुवंशिक संशोधन

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

हमने स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके जीन एन्कोडिंग पिगमेंट एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। सफल अभिकर्मक मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर), इम्यूनोब्लोटिंग और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा प्रदर्शित किया गया था।

Abstract

हमारे तेजी से बढ़ते बुढ़ापे के समाज से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की बढ़ती घटनाएं होती हैं। अब तक, पैथोलॉजिकल तंत्र अपर्याप्त रूप से समझे जाते हैं, इस प्रकार परिभाषित उपचारों की स्थापना में बाधा डालते हैं। एक सुरक्षात्मक कारक की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए सेल-आधारित योजक जीन थेरेपी को उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को दवा देने के लिए एक आशाजनक विकल्प माना जाता है। हमने जीन एन्कोडिंग पिगमेंट एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए एक विधि विकसित की है, जिसे तंत्रिका तंत्र में न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटी-एंजियोजेनिक प्रोटीन के रूप में जाना जाता है, जो स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला (पीई) कोशिकाओं के जीनोम में होता है। प्राथमिक पीई कोशिकाओं को मानव दाता आंखों से अलग किया गया था और संस्कृति में बनाए रखा गया था। संगम तक पहुंचने के बाद, 1 x 104 कोशिकाओं को 11 μL पुन: निलंबन बफर में निलंबित कर दिया गया और 2 μL के साथ एक शुद्ध घोल के साथ जोड़ा गया जिसमें 30 ng हाइपरएक्टिव एसबी (SB100X) ट्रांसपोसेज प्लास्मिड और 470 एनजी पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड शामिल थे। आनुवंशिक संशोधन निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके एक केशिका इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम के साथ किया गया था: 1,100 वी के वोल्टेज और 20 एमएस की चौड़ाई के साथ दो दालें। संक्रमित कोशिकाओं को कल्चर प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था जिसमें भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक माध्यम था; पहले मध्यम विनिमय के साथ एंटीबायोटिक्स और एंटीमाइकोटिक्स जोड़े गए थे। स्वतंत्र रूप से किए गए प्रयोगों में सफल अभिकर्मक का प्रदर्शन किया गया था। क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) ने पीईडीएफ ट्रांसजेन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को दिखाया। पीईडीएफ स्राव काफी ऊंचा था और स्थिर रहा, जैसा कि इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा निर्धारित किया गया था। एसबी 100 एक्स-मध्यस्थता हस्तांतरण ने पीई कोशिकाओं के जीनोम में एक स्थिर पीईडीएफ जीन एकीकरण की अनुमति दी और पीईडीएफ के निरंतर स्राव को सुनिश्चित किया, जो एएमडी या अन्य रेटिना अपक्षयी रोगों के इलाज के लिए सेल-आधारित जीन जोड़ चिकित्सा के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मानव पीई कोशिकाओं में पीईडीएफ ट्रांसपोसन के एकीकरण प्रोफाइल के विश्लेषण ने लगभग यादृच्छिक जीनोमिक वितरण का संकेत दिया।

Introduction

उन्नत आयु को न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए मुख्य जोखिम के रूप में वर्णित किया गया है। उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), एक पॉलीजेनिक बीमारी जो 60 वर्ष से अधिक उम्र के रोगियों में गंभीर दृष्टि हानि का कारण बनती है, अंधापन और दृष्टि हानि के चार सबसे आम कारणों से संबंधित हैऔर 20402 में 288 मिलियन लोगों तक बढ़ने की उम्मीद है। रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) की शिथिलता, कोरियोकेशिकापिलरिस और रेटिना फोटोरिसेप्टर के बीच स्थित कसकर पैक कोशिकाओं की एक परत, एएमडी के रोगजनन में योगदान करती है। आरपीई कई कार्यों को पूरा करता है जो एक सामान्य रेटिना फ़ंक्शन3 के लिए आवश्यक हैं और रेटिना और कोरियोकेशिकाओं की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक विभिन्न प्रकार के विकास कारकों और कारकों को स्रावित करता है, जिससे फोटोरिसेप्टर अस्तित्व का समर्थन होता है और परिसंचरण और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए आधार प्रदान करता है।

स्वस्थ आंखों में, वर्णक उपकला-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के प्रभावों को संतुलित करने के लिए जिम्मेदार है और एपोप्टोसिस के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा करता है, एंडोथेलियल सेल प्रसार को रोकता है, और केशिका एंडोथेलियम को स्थिर करता है। एक स्थानांतरित वीईजीएफ-टू-पीईडीएफ अनुपात ओकुलर नियोवैस्कुलराइजेशन से संबंधित है, जो पशु मॉडल 4,5 के साथ-साथ एएमडी और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी 6,7,8,9,10 के कारण कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) वाले रोगियों के नमूनों में देखा गया था। . बढ़ी हुई वीईजीएफ एकाग्रता वर्तमान मानक उपचार के लिए लक्ष्य है। एंटी-वीईजीएफ फार्मास्यूटिकल्स बेवासिजुमैब, रेनिबिज़ुमाब, एफ्लिबरसेप्ट और, हाल ही में, ब्रोलुसिज़ुमैब लगभग एक तिहाई सीएनवी रोगियों में दृश्य तीक्ष्णता में सुधार करते हैं या 11,12,13 मामलों में 90% मामलों में दृष्टि को स्थिर करते हैं। हालांकि, लगातार, अक्सर मासिक, इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रतिकूल घटनाओं का जोखिम उठाते हैं14, रोगी अनुपालन को बाधित करते हैं, और स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों के लिए एक महत्वपूर्ण आर्थिक बोझ का प्रतिनिधित्व करतेहैं। इसके अलावा, रोगियों का एक निश्चित प्रतिशत (2% -20%) प्रतिक्रिया नहीं देता है या केवल एंटी-वीईजीएफ थेरेपी 16,17,18,19 के लिए खराब प्रतिक्रिया देता है। इन नकारात्मक सहवर्ती वैकल्पिक उपचारों के विकास की आवश्यकता होती है, जैसे, इंट्राओकुलर प्रत्यारोपण, सेल और / या जीन चिकित्सीय दृष्टिकोण।

जीन थेरेपी वंशानुगत और गैर-वंशानुगत रोगों के लिए आशाजनक उपचार के रूप में विकसित हुई है और गैर-कार्यात्मक जीन अनुक्रमों को बहाल करने या खराब लोगों को दबाने का इरादा रखती है। पॉलीजेनिक रोगों के लिए, जहां प्रेरक कारकों की पहचान और प्रतिस्थापन शायद ही संभव है, रणनीतियों का उद्देश्य एक सुरक्षात्मक कारक के निरंतर वितरण के लिए है। एएमडी के मामले में, विभिन्न योजक उपचार विकसित किए गए हैं, जैसे कि एंडोस्टैटिन और एंजियोस्टैटिन20 की स्थिर अभिव्यक्ति, वीईजीएफ विरोधी घुलनशील एफएमएस-जैसे टायरोसिन किनेज -1 (एसएफएलटी -1)21,22, भेदभाव 59 (सीडी 59)23 या पीईडीएफ24,25 का पूरक नियामक प्रोटीन क्लस्टर . आंख, और विशेष रूप से रेटिना, संलग्न संरचना, अच्छी पहुंच, छोटे आकार और प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के कारण जीन-आधारित दवा के लिए एक उत्कृष्ट लक्ष्य है, इस प्रकार कम चिकित्सीय खुराक के स्थानीय वितरण की अनुमति देता है और प्रत्यारोपण को अस्वीकृति के लिए कम संवेदनशील बनाता है। इसके अलावा, आंख गैर-इनवेसिव निगरानी को सक्षम करती है, और रेटिना की जांच विभिन्न इमेजिंग तकनीकों द्वारा की जा सकती है।

वायरल वैक्टर, उनकी उच्च पारगमन दक्षता के कारण, लक्ष्य कोशिकाओं में चिकित्सीय जीन देने के लिए मुख्य वाहन हैं। हालांकि, उपयोग किए गए वायरल वेक्टर के आधार पर, विभिन्न प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं का वर्णन किया गया है, जैसे कि प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं26, म्यूटाजेनिक और ऑन्कोजेनिक प्रभाव27,28, या अन्यऊतकों में प्रसार 29। व्यावहारिक सीमाओं में एक प्रतिबंधित पैकेजिंग आकार30 के साथ-साथ नैदानिक ग्रेड लॉट31,32 के उत्पादन से जुड़ी कठिनाइयों और लागतों को शामिल किया गया है। इन कमियों ने गैर-वायरल, प्लास्मिड-आधारित वैक्टर के आगे के विकास को बढ़ावा दिया है जो लिपो-/ पॉलीप्लेक्स, अल्ट्रासाउंड या इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से स्थानांतरित होते हैं। हालांकि, मेजबान जीनोम में ट्रांसजीन के जीनोमिक एकीकरण को आमतौर पर प्लास्मिड वैक्टर के साथ बढ़ावा नहीं दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक क्षणिक अभिव्यक्ति होती है।

ट्रांसपोसन स्वाभाविक रूप से होने वाले डीएनए टुकड़े हैं जो जीनोम के भीतर अपनी स्थिति बदलते हैं, एक विशेषता जिसे जीन थेरेपी के लिए अपनाया गया है। एक सक्रिय एकीकरण तंत्र के कारण, ट्रांसपोसन-आधारित वेक्टर सिस्टम सम्मिलित ट्रांसजीन की निरंतर और निरंतर अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं। स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन, मछली33 में पाए जाने वाले एक प्राचीन टीसी 1 / मेरिनर-प्रकार ट्रांसपोसन से पुनर्गठित और आणविक विकास द्वारा और सुधार किया गया, जिसके परिणामस्वरूप हाइपरएक्टिव संस्करण एसबी 100 एक्स34 ने विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं में कुशल ट्रांसपोज़ेशन को सक्षम किया और विभिन्न रोग मॉडल35 में फेनोटाइपिक सुधार के लिए उपयोग किया गया। वर्तमान में, एसबी ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग करके 13 नैदानिक परीक्षण शुरू किए गए हैं। एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम में दो घटक होते हैं: ट्रांसपोसन, जिसमें टर्मिनल इनवर्टेड रिपीट (टीआईआर) से घिरे ब्याज के जीन शामिल होते हैं, और ट्रांसपोसेज, जो ट्रांसपोसन को जुटाता है। कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए वितरण के बाद, ट्रांसपोसेस टीआईआर को बांधता है और सेल के जीनोम में ट्रांसपोसन के छांटने और एकीकरण को उत्प्रेरित करता है।

हमने नियोवास्कुलर एएमडी के उपचार के लिए एक गैर-वायरल सेल-आधारित योजक थेरेपी विकसित की है। दृष्टिकोण में एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम36,37,38 के माध्यम से प्राथमिक वर्णक उपकला (पीई) कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित सम्मिलन शामिल है। ट्रांसपोसेस और पीईडीएफ की आनुवंशिक जानकारी अलग-अलग प्लास्मिड पर प्रदान की जाती है, जिससे आदर्श एसबी 100 एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन अनुपात का समायोजन सक्षम होता है। इलेक्ट्रोपोरेशन एक पिपेट-आधारित केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है जो इलेक्ट्रोड के बीच उनके सतह क्षेत्र को कम करते हुए अधिकतम अंतर आकार की विशेषता है। डिवाइस को स्तनधारी कोशिकाओं 39,40,41 की एक विस्तृत श्रृंखला में उत्कृष्ट अभिकर्मक दर प्राप्त करने के लिए दिखाया गया था। छोटा इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र एक समान विद्युत क्षेत्र प्रदान करता है और इलेक्ट्रोलिसिस42 के विभिन्न दुष्प्रभावों को कम करता है।

ट्रांसक्रिप्टेड पिगमेंट एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित पीईडीएफ की एंटी-एंजियोजेनिक कार्यक्षमता को मानव नाभि शिराएंडोथेलियल कोशिकाओं के अंकुरण, प्रवास और एपोप्टोसिस का विश्लेषण करने वाले विभिन्न इन विट्रो प्रयोगों में दिखाया गया था। इसके अलावा, कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन44 के खरगोश मॉडल में पीईडीएफ-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के साथ-साथ सीएनवी 43,45,46 के चूहे मॉडल ने नियोवैस्कुलराइजेशन की गिरावट दिखाई।

यहां, हम एक केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम के माध्यम से प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन के स्थिर सम्मिलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। संक्रमित कोशिकाओं को 21 दिनों के लिए संस्कृति में रखा गया था और बाद में मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) द्वारा पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में और इम्यूनोब्लोटिंग और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा, चित्रा 1) द्वारा पीईडीएफ प्रोटीन स्राव के संदर्भ में विश्लेषण किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

हेलसिंकी प्रोटोकॉल की घोषणा के अनुसार सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद नेत्र विज्ञान विभाग (विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) के आचेन कॉर्निया बैंक से मानव दाता आंखें प्राप्त की गईं। मानव नमूनों के संग्रह और उपयोग के लिए प्रक्रियाओं को संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. बाँझ सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने बिछाएं। एक लामिनार प्रवाह के नीचे एक बाँझ आवरण रखें।
  2. लामिनार प्रवाह के तहत बाँझ तैयारी उपकरण और अन्य आवश्यक बाँझ उपकरण रखें।
  3. आंखों के ग्लोब की प्राप्ति, तैयारी की शुरुआत के साथ-साथ संभावित असामान्यताओं को रिकॉर्ड करें। दाता की आयु, लिंग, मृत्यु का कारण, और मृत्यु के समय और आंख हटाने के बीच की अवधि दर्ज करें।
  4. आंखों के ग्लोब को बाँझ धुंध संपीड़ित में रखें और इसे एक हाथ में पकड़ें।
  5. एक स्केलपेल और एक अतिरिक्त बारीक नुकीली आंख कैंची का उपयोग करके लिम्बस के लगभग 3.5 मिमी पीछे की ओर एक परिधीय कट द्वारा पूर्ववर्ती खंड को पीछे के खंड से अलग करें।
  6. पीछे के खंड को नीचे की ओर झुकाने के बाद, कोलिब्री फोर्सेस का उपयोग करके विट्रियस और रेटिना को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  7. कोरोआइडिया कॉम्प्लेक्स को सीधे आईरिस फोर्सेस का उपयोग करके व्यवस्थित करें और बाद में इसे घुमावदार आईरिस फोर्सप्स के साथ स्थिति में रखें।
  8. पीछे के आंख के कप को 1 एमएल डलबेक्को के मॉडिफाइड ईगल मीडियम/हैम के एफ-12 पोषक तत्व मिश्रण (डीएमईएम/एफ12) से भरें, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 80 यू/एमएल पेनिसिलिन और 80 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन/स्ट्रेप), और 2.5 μg/mL एम्फोटेरिसिन बी (एम्फोब) शामिल हैं।
    नोट: सुअर या गोजातीय आंखों से प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के अलगावके विपरीत 36,37, पीछे के आंख कप को ट्रिप्सिन के साथ भरने और इनक्यूबेट करने की आवश्यकता नहीं है।
  9. रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम को ऑप्टिक तंत्रिका से लिम्बस की ओर धीरे-धीरे ब्रश करके आरपीई कोशिकाओं को आग से पॉलिश किए गए घुमावदार ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ लें, जबकि कोलिब्री फोर्सेस का उपयोग करके लिम्बस पर आरपीई / कोरोआइडिया कॉम्प्लेक्स को ठीक करें। सेल निलंबन को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  10. चरण 1.8 और 1.9 को दोहराएं और पेट्री डिश में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करें। एकल चैनल पिपेट (100-1,000 μL) का उपयोग करके ऊपर और नीचे पाइप करके सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
  11. प्रत्येक आंख ग्लोब के आरपीई सेल सस्पेंशन को 24-वेल सेल कल्चर प्लेट के तीन कुओं में बीज दें और उन्हें एफबीएस, पेन / स्ट्रेप और एम्फोब के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12 के साथ 1 एमएल तक भरें।
  12. संगम तक पहुंचने तक आरपीई सेल संस्कृतियों को 95% हवा और 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। सप्ताह में दो बार सेल कल्चर माध्यम बदलें।

2. प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का विद्युतीकरण

  1. एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज / पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड मिश्रण की तैयारी
    1. प्रथागत प्लास्मिड शुद्धिकरण किट का उपयोग करके एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज और पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड डीएनए को शुद्ध करें, जिन्हें निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार अभिकर्मक जैसे अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए उपयुक्त माना जाता है।
    2. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लास्मिड डीएनए सामग्री की मात्रा निर्धारित करें और उन्हें 10 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 8.5) के साथ 250 एनजी /
    3. 250 ng/μL SB100X ट्रांसपोसेज प्लास्मिड डीएनए (उदाहरण के लिए, 2.5 μL) के एक भाग को 250 ng/μL PEDF ट्रांसपोसन प्लास्मिड डीएनए (उदाहरण के लिए, 40 μL) के 16 भागों के साथ मिलाएं। अवशिष्ट प्लास्मिड मिश्रण को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: प्लास्मिड मिश्रण के कई बार-बार ठंड और पिघलने चक्रों से बचा जाना चाहिए।
    4. एसबी100एक्स ट्रांसपोसेज/पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड मिश्रण के 2 μL को एक बाँझ 1.5 एमएल सुरक्षित-लॉक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, जिसमें 29.4 ng SB100X ट्रांसपोसेज प्लास्मिड और 470.6 ng PEDF ट्रांसपोसन प्लास्मिड शामिल हैं। कोशिकाओं के साथ मिश्रित होने तक बर्फ पर रखें।
  2. केशिका अभिकर्मक प्रणाली का सेट-अप
    नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 10 μL किट का उपयोग करके एक केशिका अभिकर्मक प्रणाली के माध्यम से प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपोरेशन किया गया है। सिस्टम में अभिकर्मक डिवाइस, अभिकर्मक पिपेट और पिपेट स्टेशन शामिल हैं। किट में 10 μL अभिकर्मक युक्तियां, बफर ट्यूब, इलेक्ट्रोलाइटिक बफर ई (बफर ई), और रीसस्पेंशन बफर आर (बफर आर) शामिल हैं।
    1. पिपेट स्टेशन को अभिकर्मक डिवाइस से कनेक्ट करें।
    2. 3 एमएल बफर ई के साथ एक बफर ट्यूब भरें और इसे पिपेट स्टेशन में डालें जब तक कि एक क्लिक ध्वनि न सुनाई दे।
      नोट: सुनिश्चित करें कि बफर ट्यूब का साइड इलेक्ट्रोड पिपेट स्टेशन के साइड बॉल प्लंजर से जुड़ा हुआ है।
    3. प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, अभिकर्मक डिवाइस पर निम्नलिखित पल्स स्थितियों को सेट करें: 1,100 वी (पल्स वोल्टेज), 20 एमएस (पल्स चौड़ाई), दो पल्स (पल्स नंबर)।
  3. खेती की गई प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की तैयारी
    1. चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राथमिक आरपीई सेल संस्कृतियों के आकार और आकृति विज्ञान का दस्तावेजीकरण। आरपीई कोशिकाओं के विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान को इंगित करने के लिए आरपीई कोशिकाओं के विकास को एक कंफ्लुएंट और एकीकृत मोनोलेयर के साथ-साथ उच्च आवर्धन माइक्रोग्राफ में प्रदर्शित करने के लिए कम आवर्धन माइक्रोग्राफ लें।
    2. सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 1 एमएल बफर फॉस्फेट खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) के साथ दो बार धोएं।
    3. ट्रिप्सिनाइज प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं को 0.5 एमएल 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा और 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में 7-15 मिनट (अधिकतम) के लिए। सेल डिटेचमेंट को सूक्ष्म रूप से जांचें।
    4. एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल के साथ ट्रिप्सिनाइजेशन बंद करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती के लिए 20 μL एलिकोट लें। 10 मिनट के लिए 106 x g पर आरपीई सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. 20 μL ऐलीकोट को 20 μL ट्रिपैन ब्लू घोल के साथ मिलाएं। हेमोसाइटोमीटर के प्रत्येक आधे हिस्से में पिपेट 10 μL और एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गणना करें।
    6. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, आरपीई सेल पेलेट को पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें।
    7. प्रति अभिकर्मक प्रतिक्रिया में 10,000-100,000 आरपीई कोशिकाओं को लें और उन्हें 10 मिनट के लिए 106 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: विद्युत क्षेत्र अनुप्रयोग और प्लास्मिड डीएनए के अतिरिक्त अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं के अलावा, प्रत्येक दृष्टिकोण में दो अलग-अलग नियंत्रण संस्कृतियां भी शामिल हैं: (1) विद्युत क्षेत्र अनुप्रयोग के बिना और प्लास्मिड डीएनए के बिना; (2) विद्युत क्षेत्र अनुप्रयोग के साथ, लेकिन प्लास्मिड डीएनए के बिना।
    8. सेल पेलेट को बफर आर के 11 μL में पुन: निलंबित करें और इसे SB100X ट्रांसपोसेज / PEDF ट्रांसपोसन प्लास्मिड मिश्रण के 2 μL के साथ मिलाएं (चरण 2.1.4 देखें)।
      नोट: बफर आर में पुन: निलंबन के बाद, कोशिका व्यवहार्यता और अभिकर्मक दक्षता में कमी से बचने के लिए कोशिकाओं को 15 मिनट के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए।
    9. अभिकर्मक पिपेट के सिर को 10 μL अभिकर्मक टिप में डालें जब तक कि क्लैंप पिस्टन के बढ़ते तने को पूरी तरह से न उठा ले। प्लास्मिड समाधान को अभिकर्मक टिप में खींचें।
      नोट: अभिकर्मक नोक में हवा के बुलबुले और उनकी आकांक्षा की पीढ़ी से बचें।
    10. 24-वेल सेल कल्चर प्लेट के कुओं की आवश्यक संख्या में एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल प्रदान करें, लेकिन पेन / स्ट्रेप के बिना और एम्फोब के बिना।
  4. विद्युतीकरण प्रक्रिया
    1. जब तक क्लिक ध्वनि सुनाई न दे, तब तक पिपेट स्टेशन में रखे बफर ट्यूब में अभिकर्मक पिपेट डालें (चरण 2.2.2 देखें)।
      नोट: सुनिश्चित करें कि अभिकर्मक पिपेट का धातु सिर पिपेट स्टेशन के अंदर और बफर ट्यूब के अंदर बॉल प्लंजर से जुड़ा हुआ है।
    2. अभिकर्मक डिवाइस की टचस्क्रीन पर प्रारंभ दबाएँ । इलेक्ट्रिक पल्स के आवेदन से पहले, डिवाइस स्वचालित रूप से जांचता है कि बफर ट्यूब और अभिकर्मक पिपेट ठीक से डाले गए हैं या नहीं। इलेक्ट्रिक दालों की डिलीवरी के बाद, टचस्क्रीन पर पूरा प्रदर्शित किया जाता है।
    3. पाइपेट स्टेशन से अभिकर्मक पिपेट को सावधानीपूर्वक हटा दें और सेल कल्चर प्लेट के तैयार कुओं में सेल / प्लास्मिड समाधान को पाइप करके 10 μL अभिकर्मक टिप से इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाओं को तुरंत छोड़ दें (चरण 2.3.10 देखें)।
    4. 95% हवा और 5% सीओ 2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित आरपीई सेलसंस्कृतियों को बनाए रखें। इलेक्ट्रोपोरेशन के 3 दिन बाद पहले मध्यम विनिमय के साथ पेन / स्ट्रेप और एम्फोब जोड़ें।

3. संक्रमित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का विश्लेषण

  1. नमूना तैयार करना
    1. 3 सप्ताह के खेती के समय के बाद, अंततः आरपीई सेल संस्कृतियों को 24 घंटे के परिभाषित समय के लिए एफबीएस, पेन / स्ट्रेप और एम्फोब के साथ पूरक 1.0 एमएल डीएमईएम / एफ 12 की परिभाषित मात्रा में इनक्यूबेट करें।
    2. सेल कल्चर सुपरनैटेंट लें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि आगे के निकट-समय प्रसंस्करण या थर्मल रूप से अस्थिर नमूने और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. ट्रिप्सिनेटेड आरपीई सेल संस्कृतियों को 10 मिनट के लिए 95% हवा और 5% सीओ2 के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 0.5 एमएल के साथ स्थानांतरित करता है।
    4. एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम / एफ 12 के 1 एमएल के साथ ट्रिप्सिनाइजेशन बंद करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती के लिए छोटे एलिकोट लें (चरण 2.3.5 देखें)। आरपीई सेल निलंबन को 10 मिनट के लिए 106 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. आगे की प्रक्रिया तक आरपीई सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीईडीएफ स्राव का मूल्यांकन
    नोट: गुणात्मक मूल्यांकन के लिए, सेल कल्चर सुपरनैटेंट (चरण 3.1.2 देखें) का विश्लेषण सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) और बाद में पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से किया जाता है। पर निर्भर करता है PEDF ट्रांसपोसन प्लास्मिड डीएनए का उपयोग किया जाता है, सुपरनैटेंट को अलग तरह से संसाधित किया जाना चाहिए।
    1. सेल कल्चर सुपरनैटेंट से हिज-टैग किए गए पीईडीएफ संलयन प्रोटीन का शुद्धिकरण
      1. बेवेल-कट टिप का उपयोग करके प्रति नमूना 30 μL निकल-नाइट्रिलोट्रिएसेटिक एसिड (Ni-NTA) घोल लें और सेंट्रीफ्यूजेशन (30 सेकंड के लिए 2,660 x g ) द्वारा Ni-NTA राल को गोली मार दें।
      2. नि-एनटीए राल को सावधानीपूर्वक 1x इनक्यूबेशन बफर (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) के200μL के साथ पुन: निलंबित करें और इसे सेंट्रीफ्यूजेशन (30 सेकंड के लिए 2,660 x g) द्वारा पेलेट करें।
      3. पिछले चरण को दोहराएँ।
      4. नि-एनटीए राल को प्रति नमूने 40 μL 4x इनक्यूबेशन बफर (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) के साथ सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें।
      5. 900 μL सेल कल्चर सुपरनैटेंट को 4x इनक्यूबेशन बफर के 260 μL और पूर्वउपचारित Ni-NTA घोल के 55 μL के साथ मिलाएं (चरण 3.2.1.4 देखें)।
      6. मिश्रण को 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      7. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नी-एनटीए राल को छर्रों (60 सेकंड के लिए 2660 x g )।
      8. सावधानीपूर्वक 1x इनक्यूबेशन बफर के 175 μL के साथ Ni-NTA राल को पुन: निलंबित करें और सेंट्रीफ्यूजेशन (60 s के लिए 2,660 x g ) द्वारा पेलेट राल।
      9. पिछले चरण को दोहराएँ।
      10. 30 μL क्षालन बफर (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl,250mM imidazole, pH 8.0) के साथ Ni-NTA राल को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें और मिश्रण को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें।
      11. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नी-एनटीए राल को छर्रों (30 सेकंड के लिए 2,660 x g )।
      12. ध्यान से सुपरनैटेंट लें और इसे 2x SDS नमूना बफर47 के साथ मिलाएं।
      13. मिश्रण को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल पर नी-एनटीए शुद्ध प्रोटीन को अलग करें।
      14. एंटी-पेंटा-हिज एंटीबॉडी (माउस मोनोक्लोनल, 1: 500) और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित एंटी-माउस एंटीबॉडी (खरगोश पॉलीक्लोनल, 1: 1,000) का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता करें, जैसा कि पहलेवर्णित 36,37 है।
    2. गैर-टैग किए गए पीईडीएफ प्रोटीन का प्रत्यक्ष विश्लेषण
      1. सेल कल्चर सुपरनैटेंट के 15 μL लें और इसे 2x SDS नमूना बफर47 के साथ मिलाएं।
      2. मिश्रण को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और प्रोटीन को 10% एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल पर अलग करें।
      3. एंटी-ह्यूमन पीईडीएफ एंटीबॉडी (खरगोश पॉलीक्लोनल, 1: 4,000) और एचआरपी-संयुग्मित एंटी-खरगोश एंटीबॉडी (बकरी पॉलीक्लोनल, 1: 2,000) का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता करें जैसा कि पहले वर्णित38 है।
    3. एलिसा द्वारा पीईडीएफ स्राव का परिमाणीकरण
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानव पीईडीएफ एलिसा किट का उपयोग करके सेल कल्चर सुपरनैटेंट का विश्लेषण करें (चरण 3.1.2 देखें)।
      2. स्रावित पीईडीएफ की मात्रा को प्रत्येक अभिकर्मक प्रतिक्रिया के लिए निर्धारित समय और सेल संख्या से संबंधित करें (चरण 3.1.4 देखें)।
    4. संक्रमित आरपीई कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरपीई सेल छर्रों से कुल आरएनए को अलग करें (चरण 3.1.5 देखें)।
      2. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।
      3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम का उपयोग करके 0.1 μg आरएनए पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें।
      4. वास्तविक समय QPCR निष्पादित करें जैसा कि पहले वर्णित38 है।
    5. ट्रांसक्रिप्टेड आरपीई कोशिकाओं में ट्रांसजीन सम्मिलन साइटों का विश्लेषण
      1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके आरपीई सेल छर्रों से जीनोमिक डीएनए को अलग करें (चरण 3.1.5 देखें)।
      2. माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।
      3. पहले वर्णित38 के रूप में गणना-सहायता प्राप्त हेमी-विशिष्ट पीसीआर योजना का उपयोग करके सम्मिलन साइट लाइब्रेरी उत्पन्न करें।
      4. कम्प्यूटेशनल विश्लेषण करें जैसा कि पहले वर्णित38 है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की खेती और विद्युतीकरण
हमने दिखाया है कि पशु मूल की प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या की सीडिंग पिगमेंटेड, हेक्सागोनल आकार की कोशिकाओं 36,37,48 के एकीकृत मोनोलेयर की खेती और विकास की अनुमति देती है। तंग जंक्शन बनाने, फागोसाइटिक गतिविधि का प्रदर्शन करने और विट्रो48 में विशिष्ट मार्कर जीन व्यक्त करने की उनकी क्षमता विवो में रेटिना वर्णक उपकला के पर्याप्त कार्यों को दर्शाती है। मानव दाता आंखों से अलग की गई प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं ने भी विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान दिखाया, भले ही दाता की उम्र (65.3 ± 9.94 ए, मिनट: 49 ए, अधिकतम: 83 ए, एन = 12), अलगाव का पोस्टमार्टम समय (37.3 ± 17.0 घंटे, मिनट: 16 घंटे, अधिकतम: 68 घंटे, एन = 12), और खेती का समय (27.6 ± 14.1 डी, मिनट: 13 डी, अधिकतम: 61 डी, एन = 12) (चित्रा 2, बाएं पैनल)। केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के लिए अल्पकालिक विद्युत दालों के आवेदन ने उपकला आकृति विज्ञान (चित्रा 2, दाएं पैनल) पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डाला। विभिन्न विद्युत मापदंडों के परीक्षण से पता चला कि 1,200 वी के पल्स वोल्टेज और 20 एमएस की पल्स चौड़ाई वाली दो दालों ने अच्छी और स्थिर अभिकर्मक क्षमता और व्यवहार्य आरपीई कोशिकाओं की उच्चतम संख्या (अप्रकाशित डेटा) का उत्पादन किया।

एसबी 100 एक्स-मध्यस्थता में पीईडीएफ जीन की खेती प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में सम्मिलन
हमने एसबी100एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन के प्लास्मिड डीएनए अनुपात का परीक्षण किया है, जो 250 एनजी (0.08 पीएमओएल) एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज प्लस 250 एनजी (0.052 पीएमओएल) पीईडीएफ ट्रांसपोसन से लेकर 12.2 एनजी (0.0039 पीमोल) एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज प्लस 487.8 एनजी (0.1 पीमोल) पीईडीएफ ट्रांसपोसन तक है। इस दृष्टिकोण ने दो संयोजनों 29.4 एनजी (0.0094 pmol) SB100X ट्रांसपोसेस प्लस 470.6 ng (0.098 pmol) PEDF ट्रांसपोसन और 23.8 ng (0.0076 pmol) और 476.2 ng (0.099 pmol) की पहचान की, जिन्होंने सबसे अच्छा ट्रांसपोज़ेशन क्षमताप्राप्त की। खेती की गई प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में, एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके पीईडीएफ ट्रांसजेन के वितरण ने लगातार पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति और पीईडीएफ प्रोटीन स्राव में वृद्धि की अनुमति दी। हिज-टैग किए गए पुनः संयोजक पीईडीएफ के लिए, ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं से सेल कल्चर मीडिया के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने 500 से अधिक दिनों के लिए ट्रांसजीन साइलेंसिंग के बिना निरंतर स्तर पर पीईडीएफ स्राव का प्रदर्शन किया (चित्रा 3 ए)। गैर-टैग किए गए पीईडीएफ के लिए, ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में स्राव भी गैर-संक्रमितकोशिकाओं की तुलना में काफी वृद्धि देखी गई थी। क्रमिक रूप से किए गए अभिकर्मकों से सेल कल्चर मीडिया के एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने स्पष्ट रूप से अभिकर्मक (चित्रा 3 बी) के 21 दिनों में सार्वभौमिक रूप से उच्च पीईडीएफ स्राव दर का संकेत दिया, और एक पीछा की गई संस्कृति में, कम से कम 165 दिनों के लिए दीर्घकालिक ऊंचा पीईडीएफ स्राव साबित हुआ (चित्रा 3 सी)। एलिसा-आधारित परिमाणीकरण ने संबंधित गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 3 डी) की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में कुल पीईडीएफ स्राव की 20 गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया। इस वृद्धि को जीन अभिव्यक्ति स्तर पर भी पुष्टि की गई थी, जहां कुल पीईडीएफ अभिव्यक्ति को 30 गुना से अधिक बढ़ाया गया था (चित्रा 3 ई)।

Figure 1
चित्रा 1: एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम के माध्यम से प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन के इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित सम्मिलन के लिए वर्कफ़्लो। यह योजना (ए) प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के अलगाव और बाद में एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर में उनकी खेती के कालानुक्रमिक पाठ्यक्रम का वर्णन करती है, (बी) इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया के एकल चरण, जिसमें एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेस और पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड डीएनए का शुद्धिकरण, एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेस / पीईडीएफ की तैयारी शामिल है। ट्रांसपोसन प्लास्मिड मिश्रण, केशिका अभिकर्मक प्रणाली का सेट-अप, खेती की गई प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की तैयारी, इलेक्ट्रोपोरेशन, सीडिंग, और ट्रांसक्रिप्टेड आरपीई कोशिकाओं की खेती, साथ ही (सी) ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का विश्लेषण, जिसमें सेल कल्चर सुपरनैटेंट और ट्रांसक्रिप्टेड सेल नमूने शामिल हैं, पीईडीएफ स्राव का मूल्यांकन और परिमाणीकरण, और पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न दाता आंखों से अलग आरपीई कोशिकाओं के चरण कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ। प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की संस्कृतियां, दाता की आयु, अलगाव के पोस्टमार्टम समय और इलेक्ट्रोपोरेशन (बाएं पैनल) के लिए उनके आवेदन से पहले खेती के समय के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की संस्कृतियां, केशिका अभिकर्मक प्रणाली (दाएं पैनल) का उपयोग करके विद्युत मापदंडों 1,100 वी (पल्स वोल्टेज), 20 एमएस (पल्स चौड़ाई), और 2 दालों (दालों की संख्या) के संपर्क में आती हैं। ), एक कोबलस्टोन जैसे पैटर्न (स्केल बार: 500 μm) में रंजित कोशिकाओं के एक एकीकृत एकीकृत मोनोलेयर का प्रदर्शन किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के SB100X-मध्यस्थता अभिकर्मक के बाद PEDF स्राव और PEDF जीन अभिव्यक्ति। (A-C) 29.4 ng (0.0094 pmol) SB100X ट्रांसपोसेज प्लास्मिड प्लस 470.6 ng (0.098 pmol) PEDF ट्रांसपोसन प्लास्मिड के मिश्रण के साथ विकसित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में PEDF स्राव स्थिरता का इम्यूनोब्लोट-आधारित विश्लेषण। (ए) 26 वर्षीय दाता से आरपीई कोशिकाओं (महिला, अलगाव का पोस्टमार्टम समय: 26 घंटे, विद्युतीकरण से पहले खेती का समय: 14 दिन) को स्थानांतरित किया गया और 500 दिनों से अधिक समय तक संस्कृति में बनाए रखा गया। उनके टैग किए गए पुनः संयोजक पीईडीएफ (~ 48 केडीए) को अलग-अलग समय बिंदुओं पर सेल कल्चर मीडिया से शुद्ध किया गया था और एंटी-पेंटा-हिज एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन किया गया था। (बी) गैर-टैग किए गए पुनः संयोजक पीईडीएफ के लिए, 53 वर्षीय दाता (महिला, अलगाव का पोस्टमार्टम समय: 28 घंटे, अभिकर्मक से पहले खेती का समय: 19 दिन) से आरपीई कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए (नियंत्रण संस्कृतियों # 1 और # 2) के बिना या प्लास्मिड डीएनए (पीईडीएफ-ट्रांसक्रिप्टेड सेल कल्चर # 3 से # 7) के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और 21 दिनों तक संस्कृति में बनाए रखा गया था। सेल कल्चर सुपरनैटेंट को शुद्ध नहीं किया गया था, लेकिन एंटी-पीईडीएफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा सीधे विश्लेषण किया गया था। सेल लाइसेट के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने नियंत्रण (संस्कृतियों # 1 और # 2) और ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं (संस्कृतियों # 3 और # 4) में इंट्रासेल्युलर पीईडीएफ के स्तर को दिखाया। समान प्रोटीन मात्रा की लोडिंग जीएपीडीएच प्रोटीन बैंड (~ 36 केडीए) के समान घनत्व द्वारा इंगित की गई थी। (सी) दीर्घकालिक पीईडीएफ स्राव के विश्लेषण के लिए, 63 वर्षीय दाता (पुरुष, अलगाव का पोस्टमार्टम-समय: 26 घंटे, अभिकर्मक से पहले खेती का समय: 15 दिन) से आरपीई कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए (नियंत्रण संस्कृतियों # 1 और # 2) या प्लास्मिड डीएनए (पीईडीएफ-ट्रांसक्रिप्टेड सेल कल्चर # 3) के बिना इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और कम से कम 165 दिनों तक संस्कृति में बनाए रखा गया था। सेल कल्चर मीडिया को शुद्ध नहीं किया गया था, लेकिन एंटी-पीईडीएफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा सीधे विश्लेषण किया गया था। (घ) संक्रमित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं (दो नमूने) और गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं (चार नमूने) में कुल पीईडीएफ स्राव का एलिसा-आधारित परिमाणीकरण। संक्रमित कोशिकाओं के स्राव की तुलना गैर-संक्रमित कोशिकाओं के स्राव से की गई थी (* पी = 0.0264, वेल्च के सुधार के साथ अप्रकाशित टी परीक्षण)। (ई) ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में अंतर्जात और कुल (अंतर्जात प्लस पुनः संयोजक) पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं में अभिव्यक्ति से संबंधित थी, जिनकी अभिव्यक्ति 1 (डैश्ड लाइन) पर सेट की गई थी। डेटा को बॉक्स-एंड-मूंछ प्लॉट (मूंछ: न्यूनतम से अधिकतम) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कुल पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति की तुलना अंतर्जात पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति (वेल्च के सुधार के साथ महत्वपूर्ण, अप्रकाशित टी परीक्षण नहीं) से की गई थी। गैर-टैग किए गए पुनः संयोजक पीईडीएफ (बी-ई) के परिणाम प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के पूरे डेटा सेट की दो इकाइयों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो 29.4 एनजी (0.0094 पीएमओएल) और 470.6 एनजी (0.098 पीएमओएल) के एसबी 100 एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन अनुपात के साथ स्थानांतरित 27 दाताओं से हैं, जिसे थ्यूमन एट अल 201738 द्वारा वर्णित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमारी परियोजना में, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के गैर-वायरल उत्पादन का लक्ष्य रखते हैं जो एक सुरक्षात्मक वातावरण की स्थापना और रखरखाव के लिए दीर्घकालिक चिकित्सीय के रूप में ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक प्रभावी कारक को लगातार अतिरंजित और स्रावित करते हैं। हमने जीन एन्कोडिंग पीईडीएफ की शुरूआत स्थापित की है, जो एंटी-एंजियोजेनिक और न्यूरोप्रोटेक्टिव कार्यों के साथ एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त बहु-कार्यात्मक प्रोटीन है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं को स्थिर रूप से और पुन: उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। आरपीई कोशिकाओं में डीएनए वितरण और परिचय एक पिपेट-आधारित केशिका अभिकर्मक प्रणाली के साथ किया जाता है, जो क्यूवेट के बजाय इलेक्ट्रोपोरेशन चैंबर के रूप में विशिष्ट युक्तियों का उपयोग करता है।

प्राथमिक आरपीई संस्कृतियों का संवर्धन जिसमें बाद के अभिकर्मकों के लिए उपयोग की जाने वाली रूपात्मक रूप से अच्छी तरह से विभेदित कोशिकाएं शामिल हैं, मानव दाता (आयु और सामान्य स्वास्थ्य स्थिति) के साथ-साथ आंखों की प्राप्ति (सेल अलगाव का पोस्टमार्टम समय) से संबंधित कई कारकों से प्रभावित होती हैं। ताजा पृथक और बीजित प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं को हेक्सागोनल आकार की कोशिकाओं के मोनोलेयर को विकसित करने के लिए कम से कम 2 सप्ताह की आवश्यकता होती है। एक सामान्य नियम के रूप में, सेल संस्कृतियों को जिन्हें अभिकर्मक से पहले संगम तक पहुंचने के लिए अधिक समय की आवश्यकता होती थी, ने भी अभिकर्मक के बाद एक धीमी पालन और प्रसार दिखाया। सेल अलगाव या अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त आरपीई कोशिकाओं से मुक्त वर्णक जमा होने से सेल पालन और प्रसार भी बाधित होता है।

एसबी ट्रांसपोसन सिस्टम एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला आनुवंशिक उपकरण है जो विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में चिकित्सीय रूप से प्रासंगिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के कुशल और सुरक्षित वितरण को सक्षम बनाता है जिसे बाद में जीन-आधारित सेल थेरेपी में लागू किया जा सकता है। विशेष रूप से, इसका उन्नत संस्करण एसबी 100 एक्स वायरल वैक्टर और गैर-वायरल प्लास्मिड डीएनए के फायदों को जोड़ता है। कार्रवाई का एकीकृत मोड मेजबान सेल के जीनोम में अभिव्यक्ति कैसेट के एक स्थिर जीनोमिक एकीकरण को सुनिश्चित करता है और जीन या रुचि के अनुक्रम की निरंतर अभिव्यक्ति को सक्षम बनाता है। रेट्रोवायरल वैक्टर के विपरीत, जो अधिमानतः संभावित म्यूटेनेसिस और ऑन्कोजेनेसिस27,28 के उच्च जोखिम के साथ सक्रिय प्रतिलेखन इकाइयों में एकीकृत होते हैं, एसबी-आधारित एकीकरण प्रोफ़ाइल यादृच्छिक है। यह विभिन्न सुसंस्कृत और प्राथमिक स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करके बड़ी संख्या में अध्ययनों में प्रदर्शित किया गया था, जिसमें मानव कोशिकाएं 49,50,51,52, साथ ही प्राथमिक चूहे और मानव आरपीई कोशिकाओं 38,46 शामिल हैं। इसके अलावा, प्लास्मिड डीएनए के रूप में एसबी ट्रांसपोसन सिस्टम का अनुप्रयोग कम इम्युनोजेनेसिटी प्रदान करता है और विनिर्माण प्रक्रिया की सुविधा प्रदान करता है।

अलग-अलग प्लास्मिड पर एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेस और पीईडीएफ ट्रांसजेन की आनुवंशिक जानकारी का वितरण एक महत्वपूर्ण पहलू है, क्योंकि यह इष्टतम एसबी 100 एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन अनुपात के सटीक समायोजन की अनुमति देता है। जैसा कि पहले वर्णित है, एसबी ट्रांसपोसन प्रणाली ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति की अधिकता के प्रति संवेदनशील है, जिसके परिणामस्वरूप ट्रांसपोजिशनल गतिविधि53 का निषेध होता है। हमने एआरपीई -19 कोशिकाओं के लिए इस प्रभाव को भी देखा, एक सहज रूप से विकसित सेल लाइन जो प्राथमिक मानव आरपीई संस्कृति54 और प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के चयनात्मक ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा शुद्ध की गई थी। यहां, एसबी 100 एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन अनुपात के साथ अभिकर्मक 55.6 एनजी (0.018 पीएमओएल) एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज प्लस 444.4 एनजी (0.093 पीमोल) पीईडीएफ ट्रांसपोसन के परिणामस्वरूप स्पष्ट रूप से पीईडीएफ स्राव दर37 कम हो गई। प्रत्येक नवनिर्मित ट्रांसपोसन प्लास्मिड के लिए आदर्श ट्रांसपोसेज-टू-ट्रांसपोसन अनुपात निर्धारित किया जाना है।

गैर-वायरल प्लास्मिड-आधारित वैक्टर को लिपो-/पॉलीप्लेक्स, नैनोपार्टिकल्स, लेजर, अल्ट्रासाउंड या इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से स्थानांतरित किया जा सकता है। हमने पहले ही दिखाया है कि प्राथमिक पीई कोशिकाओं का लिपोफेक्शन-आधारित अभिकर्मक कुशल नहीं था और इस प्रकार इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित जीन ट्रांसफर36 पर स्विच किया गया। इलेक्ट्रोपोरेशन को कोशिकाओं के लिए एक छोटी अवधि के विद्युत क्षेत्र के आवेदन के रूप में परिभाषित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली की पारगम्यता में वृद्धि होती है और जलीय छिद्रों का निर्माण होता है, जिसके माध्यम से प्लास्मिड डीएनए कोशिका में प्रवेश कर सकता है। सामान्य तौर पर, कोशिकाओं, प्लास्मिड डीएनए और संचालन बफर का मिश्रण दो इलेक्ट्रोड के बीच एक विशिष्ट इलेक्ट्रोपोरेशन कक्ष में भरा जाता है, जो विद्युत पल्स उत्पन्न करने वाले इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस से जुड़े होते हैं। इस तथाकथित थोक इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप में, एक पारंपरिक क्यूवेट इलेक्ट्रोपोरेशन चैंबर को दो समानांतर प्लेट-प्रकार इलेक्ट्रोड की विशेषता है, जिनकी दूरी परिवर्तनशील (0.1-0.4 मिमी) है, जो सेल प्रकार और प्रति इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रिया में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करती है। अच्छी अभिकर्मक क्षमता के बावजूद, विभिन्न दुष्प्रभाव संक्रमित कोशिकाओं के अस्तित्व को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, पीएच परिवर्तन, गर्मी विकास, बुलबुला उत्पादन और अशांत प्रवाह। केशिका अभिकर्मक प्रणाली कम से कम एक न्यूनतम सतह क्षेत्र के साथ इलेक्ट्रोड रखनेऔर उनके बीच अधिकतम अंतर आकार के साथ-साथ विशिष्ट पुन: निलंबन और इलेक्ट्रोलाइटिक बफर का उपयोग करके क्यूवेट-आधारित दुष्प्रभावों को कम करती है; हालाँकि, उनकी रचनाओं का खुलासा नहीं किया गया है।

थोक इलेक्ट्रोपोरेशन सेट-अप के भीतर वृद्धि के बावजूद, जिसके कारण सेल अस्तित्व में वृद्धि हुई, कोशिकाओं के एक निश्चित प्रतिशत को अपरिवर्तनीय क्षति अपरिहार्य है। इसके अलावा, कोशिकाओं में एकीकृत प्लास्मिड की मात्रा का सटीक नियंत्रण संभव नहीं है। लघु विद्युतीकरण प्रणालियों के हाल के विकास ने थोक इलेक्ट्रोपोरेशन से जुड़ी सीमाओं को और कम करके अतिरिक्त सुधार की अनुमति दी है। ये नए उपकरण माइक्रोइलेक्ट्रोड, माइक्रोफ्लुइडिक या नैनोस्ट्रक्चर पर आधारित हैं। वे जीन थेरेपी, पुनर्योजी चिकित्सा और सीटू इंट्रासेल्युलर जांच (चांग एट अल और शी एट अल द्वारा समीक्षा) के क्षेत्र में नए आवेदन दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। 55,56.

हमने प्रदर्शित किया है कि इलेक्ट्रोपोरेशन, जिसे शुरू में एक क्यूवेट-आधारित प्रणाली का उपयोग करके किया गया था और बाद में पिपेट-आधारित केशिका प्रणाली का उपयोग करके स्थापित किया गया था, वर्णक उपकला सेल लाइन एआरपीई -19 के साथ-साथ प्राथमिक पीई कोशिकाओं 36,37,38,57,58 दोनों को स्थानांतरित करने के लिए एक उपयुक्त और कुशल विधि है। . उपयोग किए गए सेल प्रकार के आधार पर, मापदंडों को लागू करने वाले उपयुक्त इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल को परिभाषित करना महत्वपूर्ण है जो अच्छे अभिकर्मक क्षमता और सेल अस्तित्व दोनों की अनुमति देते हैं। अपर्याप्त विद्युत क्षेत्र कोशिकाओं को क्षति से रोकते हैं लेकिन इसके परिणामस्वरूप कम अभिकर्मक क्षमता होती है। विद्युत क्षेत्र की ताकत में वृद्धि के साथ, अभिकर्मक क्षमता में वृद्धि हुई है। हालांकि, ऊंचा विद्युत पैरामीटर अपरिवर्तनीय सेल क्षति के कारण मृत कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत को भी जन्म देता है। एआरपीई -19 सेल लाइन के लिए, केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके, 1,350 वी, 20 एमएस और 2 दालों के इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर को 100% 37 की प्रारंभिक अभिकर्मक क्षमता के परिणामस्वरूप दिखाया गया था। प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए इन मापदंडों के आवेदन के परिणामस्वरूप अच्छी क्षमता भी हुई, लेकिन 1,100 वी, 20 एमएस और 2 दालों के इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों की तुलना में अभिकर्मक के बाद खेती की गई कोशिकाओं की संख्या भी कम हो गई (डेटा नहीं दिखाया गया)। इसलिए, सेल क्षति को रोकने और कम संक्रमित कोशिकाओं को स्वीकार करने के लिए हल्के इलेक्ट्रोपोरेशन मापदंडों को चुनने का निर्णय लिया गया था।

इस दृष्टिकोण का समग्र उद्देश्य नियोवास्कुलर एएमडी से पीड़ित रोगियों के उपचार के लिए पीईडीएफ-संक्रमित कोशिकाओं के नैदानिक अनुप्रयोग में निहित है। चिकित्सा में एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन प्रणाली के आधार पर ऑटोलॉगस वर्णक उपकला कोशिकाओं में पीईडीएफ ट्रांसजेन का स्थिर परिचय शामिल है, इसके बाद रोगी के उप-स्थान पर स्थानांतरित कोशिकाओं का प्रत्यारोपण होता है। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पीईडीएफ-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाएं अंतर नहीं करती हैं और फाइब्रोब्लास्टिक आकार और विकास व्यवहार प्राप्त नहीं करती हैं। यह साबित करना भी महत्वपूर्ण है कि संक्रमित कोशिकाएं पीईडीएफ के निरंतर और सुसंगत स्राव की अनुमति देती हैं। इसके अलावा, एक विशिष्ट अवधि के लिए कोशिकाओं की एक विशेष संख्या द्वारा स्रावित पीईडीएफ की सटीक मात्रा को जानना महत्वपूर्ण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ज़ोल्टन इविक्स और ज़सुज़साना इज़वेक एसबी ट्रांसपोसन तकनीक पर कई पेटेंट पर आविष्कारक हैं

Acknowledgments

इस काम को अनुसंधान, तकनीकी विकास और प्रदर्शन के लिए यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान समझौता संख्या 305134। Zsuzsanna Izsvak को यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ERC एडवांस्ड (ERC-2011-ADG 294742) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए अन्ना डोबियास और एंटजे शेफर (नेत्र विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) और मानव दाता आंखें प्रदान करने के लिए आचेन कॉर्निया बैंक (नेत्र विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

चिकित्सा अंक 168 उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन एएमडी केशिका इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम गैर-वायरल अभिकर्मक वर्णक उपकला-व्युत्पन्न कारक पीईडीएफ प्राथमिक वर्णक उपकला कोशिकाएं स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम एसबी
स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित आनुवंशिक संशोधन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter