Summary
Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).
Abstract
Notre société de plus en plus vieillissante entraîne une incidence croissante de maladies neurodégénératives. Jusqu’à présent, les mécanismes pathologiques sont mal compris, ce qui empêche la mise en place de traitements définis. Les thérapies géniques additives cellulaires pour l’expression accrue d’un facteur de protection sont considérées comme une option prometteuse pour traiter les maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous avons développé une méthode pour l’expression stable du gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), qui est caractérisé comme une protéine neuroprotectrice et anti-angiogénique dans le système nerveux, dans le génome des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires (PE) en utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). Les cellules PE primaires ont été isolées des yeux de donneurs humains et maintenues en culture. Après avoir atteint la confluence, 1 x 104 cellules ont été suspendues dans 11 μL de tampon de remise en suspension et combinées avec 2 μL d’une solution purifiée contenant 30 ng de plasmide transposase SB hyperactif (SB100X) et 470 ng de plasmide de transposon PEDF . La modification génétique a été réalisée avec un système d’électroporation capillaire utilisant les paramètres suivants: deux impulsions d’une tension de 1 100 V et d’une largeur de 20 ms. Les cellules transfectées ont été transférées dans des plaques de culture contenant un milieu complété par du sérum fœtal bovin; Des antibiotiques et des antimycotiques ont été ajoutés avec le premier échange de milieu. Une transfection réussie a été démontrée dans des expériences réalisées indépendamment. La réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) a montré l’expression accrue du transgène PEDF . La sécrétion de PEDF était significativement élevée et restait stable, telle qu’évaluée par immunoblotting, et quantifiée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Le transfert médié par SB100X a permis une intégration stable du gène PEDF dans le génome des cellules PE et a assuré la sécrétion continue de PEDF , ce qui est essentiel pour le développement d’une thérapie génique à base de cellules pour traiter la DMLA ou d’autres maladies dégénératives de la rétine. De plus, l’analyse du profil d’intégration du transposon PEDF dans les cellules PE humaines a indiqué une distribution génomique presque aléatoire.
Introduction
L’âge avancé est décrit comme le principal risque de maladies neurodégénératives. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique entraînant une perte de vision sévère chez les patients âgés de plus de 60 ans, fait partie des quatre causes les plus fréquentes de cécité et de déficience visuelle1 et devrait atteindre 288 millions de personnes en 20402. Les dysfonctionnements de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une couche unique de cellules étroitement emballées situées entre le choriocapillaris et les photorécepteurs rétiniens, contribuent à la pathogenèse de la DMLA. L’EPR remplit de multiples tâches essentielles à une fonction rétinienne normale3 et sécrète une variété de facteurs de croissance et de facteurs essentiels pour maintenir l’intégrité structurelle de la rétine et de la choriocapillaris, soutenant ainsi la survie des photorécepteurs et fournissant une base pour la circulation et l’apport de nutriments.
Dans les yeux sains, le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) est responsable de l’équilibre des effets du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et protège les neurones contre l’apoptose, empêche la prolifération des cellules endothéliales et stabilise l’endothélium capillaire. Un rapport VEGF-/ PEDF décalé est lié à la néovascularisation oculaire, qui a été observée dans les modèles animaux4,5 ainsi que dans des échantillons de patients atteints de néovascularisation choroïdienne (CNV) due à la DMLA et à la rétinopathie diabétique proliférante 6,7,8,9,10 . La concentration accrue de VEGF est la cible du traitement standard actuel. Les produits pharmaceutiques anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept et, plus récemment, brolucizumab améliorent l’acuité visuelle chez environ un tiers des patients atteints de CNV ou plutôt stabilisent la vision dans 90% des cas11,12,13. Cependant, les injections intravitréennes fréquentes, souvent mensuelles, comportent un risque d’événements indésirables14, nuisent à l’observance du patient et représentent un fardeau économique important pour les systèmes de santé15. De plus, un certain pourcentage de patients (2%-20%) ne répondent pas ou ne réagissent que mal au traitement anti-VEGF16,17,18,19. Ces concomitants négatifs nécessitent le développement de traitements alternatifs, par exemple, des implants intraoculaires, des approches thérapeutiques cellulaires et/ou géniques.
La thérapie génique a évolué en tant que traitement prometteur pour les maladies héréditaires et non héréditaires et vise à restaurer les séquences de gènes non fonctionnelles ou à supprimer celles qui ont mal fonctionné. Pour les maladies polygéniques, où l’identification et le remplacement des facteurs de causalité sont difficilement possibles, les stratégies visent l’administration continue d’un facteur de protection. Dans le cas de la DMLA, diverses thérapies additives ont été développées, telles que l’expression stable de l’endostatine et de l’angiostatine20, l’antagoniste du VEGF soluble de la tyrosine kinase-1 (sFLT-1)21,22, le groupe de protéines régulatrices du complément de différenciation 59 (CD59)23 ou PEDF 24,25 . L’œil, et en particulier la rétine, est une excellente cible pour un médicament à base de gènes en raison de sa structure fermée, de sa bonne accessibilité, de sa petite taille et de son privilège immunitaire, permettant ainsi une administration localisée de faibles doses thérapeutiques et rendant les greffes moins sensibles au rejet. De plus, l’œil permet une surveillance non invasive et la rétine peut être examinée par différentes techniques d’imagerie.
Les vecteurs viraux sont, en raison de leur grande efficacité de transduction, le principal véhicule pour délivrer des gènes thérapeutiques dans les cellules cibles. Cependant, selon le vecteur viral utilisé, différents effets indésirables ont été décrits, tels que les réponses immunitaires et inflammatoires26, les effets mutagènes et oncogènes 27,28, ou la dissémination dans d’autres tissus29. Les limitations pratiques comprennent une taille d’emballage restreinte30 ainsi que des difficultés et des coûts associés à la production de lots de qualité clinique31,32. Ces inconvénients ont favorisé le développement de vecteurs plasmidiques non viraux qui sont transférés via des lipo / polyplexes, des ultrasons ou des électroporations. Cependant, l’intégration génomique du transgène dans le génome de l’hôte n’est généralement pas favorisée avec les vecteurs plasmidiques, ce qui entraîne une expression transitoire.
Les transposons sont des fragments d’ADN naturels qui changent de position dans le génome, une caractéristique qui a été adoptée pour la thérapie génique. Grâce à un mécanisme d’intégration actif, les systèmes vectoriels basés sur les transposons permettent une expression continue et constante du transgène inséré. Le transposon de la Belle au bois dormant (SB), reconstitué à partir d’un ancien transposon de type Tc1/marin trouvé chez les poissons33 et encore amélioré par l’évolution moléculaire aboutissant à la variante hyperactive SB100X34, a permis une transposition efficace dans diverses cellules primaires et a été utilisé pour la correction phénotypique dans différents modèles de maladie35. À l’heure actuelle, 13 essais cliniques ont été lancés à l’aide du système de transposons SB . Le système de transposons SB100X se compose de deux composants: le transposon, qui comprend le gène d’intérêt flanqué de répétitions inversées terminales (TIR), et la transposase, qui mobilise le transposon. Après l’administration de l’ADN plasmidique aux cellules, la transposase lie les TIR et catalyse l’excision et l’intégration du transposon dans le génome de la cellule.
Nous avons développé une thérapie additive non virale à base de cellules pour le traitement de la DMLA néovasculaire. L’approche comprend l’insertion par électroporation du gène PEDF dans les cellules épithéliales pigmentaires primaires (PE) au moyen du système de transposons SB100X 36,37,38. L’information génétique de la transposase et de la PEDF est fournie sur des plasmides séparés, permettant ainsi l’ajustement du rapport transposon SB100X / PEDF idéal. L’électroporation est réalisée à l’aide d’un système de transfection capillaire à pipette qui se caractérise par une taille d’espace maximisée entre les électrodes tout en minimisant leur surface. Il a été démontré que le dispositif atteignait d’excellents taux de transfection dans un large éventail de cellules de mammifères 39,40,41. La petite surface de l’électrode fournit un champ électrique uniforme et réduit les différents effets secondaires de l’électrolyse42.
La fonctionnalité anti-angiogénique de la PEDF sécrétée par les cellules épithéliales pigmentaires transfectées a été démontrée dans diverses expériences in vitro analysant la germination, la migration et l’apoptose des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine43. De plus, la transplantation de cellules transfectées par PEDF dans un modèle de lapin de néovascularisation cornéenne44 ainsi qu’un modèle de rat de CNV43,45,46 ont montré un déclin de la néovascularisation.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’insertion stable du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires via le système de transposon SB100X en utilisant un système de transfection capillaire. Les cellules transfectées ont été conservées en culture pendant 21 jours, puis analysées en termes d’expression du gène PEDF par réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) et en termes de sécrétion de protéines PEDF par immunoblot et dosage immuno-enzymatique (ELISA, Figure 1).
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Protocol
Les yeux de donneurs humains ont été obtenus auprès de la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle du Département d’ophtalmologie (Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) après avoir obtenu un consentement éclairé conformément aux protocoles de la Déclaration d’Helsinki. Les procédures de prélèvement et d’utilisation des échantillons humains ont été approuvées par le comité d’éthique de l’établissement.
1. Isolement des cellules EPR humaines primaires
- Disposez des vêtements et des gants de protection stériles. Placer un champ stérile sous un flux laminaire.
- Placez les instruments de préparation stérile et tout autre équipement stérile nécessaire sous le flux laminaire.
- Enregistrez la réception des globes oculaires, le début de la préparation ainsi que les anomalies possibles. Inscrivez l’âge, le sexe, la cause du décès du donneur et la période entre le moment du décès et le prélèvement oculaire.
- Placez le globe oculaire dans une compresse de gaze stérile et tenez-le dans une main.
- Séparer le segment antérieur du segment postérieur par une coupe circonférentielle d’environ 3,5 mm en arrière du limbe à l’aide d’un scalpel et d’un ciseau extra-fin pour les yeux pointus.
- Après avoir incliné le segment postérieur vers le bas, retirez délicatement le vitré et la rétine à l’aide d’une pince colibri.
- Réarrangez discrètement le complexe RPE/choroidea effondré à l’aide d’une pince à iris droite et maintenez-le ensuite en position avec une pince à iris incurvée.
- Remplissez la coupelle postérieure avec 1 mL de mélange nutritionnel Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 80 U/mL de pénicilline et 80 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep) et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B (AmphoB).
REMARQUE: Contrairement à l’isolement des cellules RPE primaires des yeux de porc ou de bovin36,37, la coupelle oculaire postérieure n’a pas besoin d’être remplie et incubée avec de la trypsine. - Récoltez les cellules EPR en brossant doucement l’épithélium pigmentaire rétinien du nerf optique vers le limbe avec une pipette Pasteur en verre incurvé poli au feu, tout en fixant le complexe EPR / choroidea au limbe à l’aide d’une pince colibri. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri.
- Répétez les étapes 1.8 et 1.9 et collectez toutes les cellules de la boîte de Pétri. Remettez soigneusement en suspension la cellule en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette à canal unique (100-1 000 μL).
- Ensemencer la suspension cellulaire EPR de chaque globe oculaire dans trois puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits et les remplir jusqu’à 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS, Pen/Strep et AmphoB.
- Maintenir les cultures cellulaires EPR à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Changez le milieu de culture cellulaire deux fois par semaine.
2. Électroporation des cellules EPR humaines primaires
- Préparation du mélange plasmide transposase/transposon SB100X
- Purifier la transposase SB100X et l’ADN plasmidique du transposon PEDF à l’aide des kits de purification plasmidique habituels, qui sont identifiés comme étant adaptés à une utilisation dans des applications telles que la transfection, conformément au protocole du fabricant.
- Quantifier le contenu de l’ADN plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et l’ajuster à une concentration de 250 ng/μL avec 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5).
- Mélanger une portion d’ADN plasmidique transposase SB100X de 250 ng/μL (p. ex. 2,5 μL) avec 16 portions d’ADN plasmidique de transposon PEDF de 250 ng/μL (p. ex. 40 μL). Le mélange plasmidique résiduel peut être conservé à -20 °C.
REMARQUE : Les cycles répétés de congélation et de décongélation répétés du mélange plasmidique doivent être évités. - Placer 2 μL du mélange plasmidique transposase SB100X/transposon PEDF, contenant 29,4 ng de plasmide transposase SB100X et 470,6 ng de plasmide transposonique PEDF, dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL. Garder sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit mélangée avec des cellules.
- Mise en place du système de transfection capillaire
REMARQUE: L’électroporation des cellules EPR humaines primaires a été réalisée via un système de transfection capillaire utilisant le kit de 10 μL selon le protocole du fabricant. Le système comprend le dispositif de transfection, la pipette de transfection et la station de pipette. Le kit contient des embouts de transfection de 10 μL, des tubes tampons, un tampon électrolytique E (tampon E) et un tampon de remise en suspension R (tampon R).- Connectez la station de pipette au dispositif de transfection.
- Remplissez un tube tampon avec 3 ml de tampon E et insérez-le dans la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
REMARQUE: Assurez-vous que l’électrode latérale du tube tampon est connectée au piston à bille latérale de la station de pipette. - Pour l’électroporation des cellules EPR humaines primaires, réglez les conditions d’impulsion suivantes sur le dispositif de transfection : 1 100 V (tension d’impulsion), 20 ms (largeur d’impulsion), deux impulsions (nombre d’impulsions).
- Préparation des cellules EPR humaines primaires cultivées
- Documenter la forme et la morphologie des cultures cellulaires primaires de l’EPR par microscopie à contraste de phase. Prenez des micrographies à faible grossissement pour démontrer la croissance des cellules EPR en une monocouche confluente et intégrée, ainsi que des micrographies à fort grossissement pour souligner la morphologie pavée typique des cellules EPR.
- Aspirer le milieu de culture cellulaire et laver les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée de phosphate de 1 mL (PBS, pH 7,4).
- Trypsiniser les cellules humaines primaires d’EPR avec 0,5 mL 0,05% trypsine-EDTA à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95% d’air et 5% de CO2 pendant 7-15 min (maximum). Vérifiez le détachement de la cellule au microscope.
- Arrêtez la trypsinisation avec 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS. Prenez une partie aliquote de 20 μL pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger la suspension cellulaire RPE à 106 x g pendant 10 min.
- Mélanger la partie aliquote de 20 μL avec la solution de bleu de trypan de 20 μL. Pipeter 10 μL dans chaque moitié de l’hémocytomètre et compter les cellules au microscope à contraste de phase.
- Après centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellule RPE dans 1 mL de PBS.
- Prendre 10 000 à 100 000 cellules EPR par réaction de transfection et les centrifuger à 106 x g pendant 10 min.
NOTE: Outre les réactions de transfection avec application de champ électrique et ajout d’ADN plasmidique, chaque approche comprend également deux cultures témoins différentes: (1) sans application de champ électrique et sans ADN plasmidique; (2) avec application de champ électrique, mais sans ADN plasmidique. - Resuspendre la pastille de cellule dans 11 μL de tampon R et la combiner avec 2 μL du mélange plasmidique transposase/transposon PEDF SB100X (voir étape 2.1.4).
REMARQUE: Après remise en suspension dans le tampon R, les cellules doivent être traitées dans les 15 minutes pour éviter une réduction de la viabilité de la cellule et de l’efficacité de la transfection. - Insérez la tête de la pipette de transfection dans l’embout de transfection de 10 μL jusqu’à ce que la pince capte complètement la tige de montage du piston. Aspirer la solution cellulaire/plasmidique dans l’embout de transfection.
REMARQUE: Évitez la génération de bulles d’air et leur aspiration dans l’embout de transfection. - Fournir 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS, mais sans stylo/streptocoque et sans amphoB, dans le nombre requis de puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits.
- Procédé d’électroporation
- Insérez la pipette de transfection dans le tube tampon placé dans la station de pipette (voir étape 2.2.2) jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
REMARQUE : Assurez-vous que la tête métallique de la pipette de transfection est connectée au piston à billes à l’intérieur de la station de pipette et au tube tampon. - Appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile du dispositif de transfection. Avant l’application de l’impulsion électrique, l’appareil vérifie automatiquement si le tube tampon et la pipette de transfection sont correctement insérés. Après la livraison des impulsions électriques, Complete s’affiche sur l’écran tactile.
- Retirer délicatement la pipette de transfection de la station de pipette et libérer immédiatement les cellules électroporées de l’extrémité de transfection de 10 μL en pipetant la solution cellulaire/plasmidique dans les puits préparés de la plaque de culture cellulaire (voir étape 2.3.10).
- Maintenir les cultures cellulaires EPR transfectées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2. Ajouter Pen/Strep et AmphoB avec le premier échange de milieu 3 jours après l’électroporation.
- Insérez la pipette de transfection dans le tube tampon placé dans la station de pipette (voir étape 2.2.2) jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
3. Analyses de cellules EPR humaines primaires transfectées
- Préparation des échantillons
- Après un temps de culture de 3 semaines, incuber finalement les cultures cellulaires EPR dans un volume défini de 1,0 mL DMEM/F12 complété par FBS, Pen/Strep et AmphoB pendant une durée définie de 24 h.
- Prélever les surnageants de culture cellulaire et les conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités à un moment proche ou à -80 °C pour les échantillons thermiquement instables et le stockage à long terme.
- Trypsiniser des cultures cellulaires EPR transfectées avec 0,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2 pendant 10 min.
- Arrêtez la trypsinisation avec 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS. Prélever de petites aliquotes pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre (voir étape 2.3.5). Centrifuger les suspensions de cellules RPE à 106 x g pendant 10 min.
- Conserver les pastilles de cellules EPR à -80 °C jusqu’à la poursuite du traitement.
- Évaluation de la sécrétion de FDPE par transfert Western
REMARQUE : Pour une évaluation qualitative, les surnageants de culture cellulaire (voir l’étape 3.1.2) sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par transfert Western subséquent. En fonction de l' PEDF transposon plasmidique ADN utilisé, les surnageants doivent être traités différemment.- Purification des protéines de fusion PEDF marquées par His à partir de surnageants de culture cellulaire
- Prélever 30 μL de suspension d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) par échantillon à l’aide d’une pointe conique et enduire la résine Ni-NTA en granulés par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
- Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 200 μL de tampon d’incubation 1x (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0) et granulez-la par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
- Répétez l’étape précédente.
- Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec un tampon d’incubation 4x 40 μL (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8,0) par échantillon.
- Mélanger 900 μL de surnageant de culture cellulaire avec 260 μL de tampon d’incubation 4x et 55 μL de suspension de Ni-NTA prétraitée (voir étape 3.2.1.4).
- Incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 60 min.
- Enduire la résine Ni-NTA par centrifugation (2660 x g pendant 60 s).
- Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 175 μL de tampon d’incubation 1x et de résine de pastilles par centrifugation (2 660 x g pendant 60 s).
- Répétez l’étape précédente.
- Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 30 μL de tampon d’élution (50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0) et incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 20 min.
- Enduire la résine Ni-NTA par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
- Prenez soigneusement le surnageant et mélangez-le avec 2x tampon d’échantillonSDS 47.
- Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min et séparer les protéines purifiées Ni-NTA sur un gel de polyacrylamide SDS à 10%.
- Effectuer le transfert Western à l’aide d’anticorps anti-Penta-His (monoclonal de souris, 1:500) et d’anticorps anti-souris conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (polyclonal de lapin, 1:1 000) comme décrit précédemment36,37.
- Analyse directe des protéines PEDF non marquées
- Prenez 15 μL de surnageant de culture cellulaire et mélangez-le avec 2x tampon d’échantillon SDS47.
- Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min et séparer les protéines sur un gel de polyacrylamide SDS à 10%.
- Effectuer le Western blot en utilisant des anticorps anti-PEDF humains (polyclonal de lapin, 1:4 000) et des anticorps anti-lapin conjugués HRP (polyclonal de chèvre, 1:2 000) comme décrit précédemment38.
- Quantification de la sécrétion de PEDF par ELISA
- Analyser les surnageants de culture cellulaire (voir étape 3.1.2) à l’aide d’un kit ELISA PEDF humain selon le protocole du fabricant.
- Relier la quantité de PEDF sécrétée au temps et au nombre de cellules déterminés pour chaque réaction de transfection (voir étape 3.1.4).
- Analyse de l’expression du gène PEDF dans les cellules RPE transfectées
- Isoler l’ARN total des pastilles cellulaires d’EPR (voir étape 3.1.5) à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce conformément au protocole du fabricant.
- Quantifier la teneur en ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
- Effectuer la transcription inverse sur 0,1 μg d’ARN à l’aide d’un système de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
- Effectuer une qPCR en temps réel comme décrit précédemment38.
- Analyse des sites d’insertion des transgènes dans les cellules EPR transfectées
- Isoler l’ADN génomique des granules cellulaires EPR (voir étape 3.1.5) à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce conformément au protocole du fabricant.
- Quantifier le contenu de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
- Générez des bibliothèques de sites d’insertion à l’aide d’un schéma de PCR hémi-spécifique assisté par calcul, comme décrit précédemment38.
- Effectuer l’analyse informatique comme décrit précédemment38.
- Purification des protéines de fusion PEDF marquées par His à partir de surnageants de culture cellulaire
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Representative Results
Culture et électroporation de cellules EPR humaines primaires
Nous avons montré que l’ensemencement d’un nombre suffisant de cellules primaires EPR d’origine animale permet la culture et la croissance vers une monocouche intégrée de cellules pigmentées de forme hexagonale36,37,48. Leur capacité à former des jonctions serrées, à présenter une activité phagocytaire et à exprimer des gènes marqueurs spécifiques in vitro48 reflète des tâches substantielles de l’épithélium pigmentaire rétinien in vivo. Les cellules EPR primaires cultivées isolées des yeux de donneurs humains ont également montré la morphologie typique des pavés, indépendamment de l’âge du donneur (65,3 ± 9,94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), du temps d’isolement post-mortem (37,3 ± 17,0 h, min: 16 h, max: 68 h, n = 12) et du temps de culture (27,6 ± 14,1 jours, min: 13 jours, max. : 61 d, n = 12) (figure 2, panneau de gauche). L’application d’impulsions électriques à court terme aux cellules humaines primaires de l’EPR à l’aide du système de transfection capillaire n’a pas eu d’effet négatif sur la morphologie épithéliale (Figure 2, panneau de droite). Les tests de divers paramètres électriques ont révélé que deux impulsions avec une tension d’impulsion de 1 200 V et une largeur d’impulsion de 20 ms donnaient des rendements de transfection bons et stables et le plus grand nombre de cellules RPE viables (données non publiées).
Insertion médiée par SB100X du gène PEDF dans des cellules RPE humaines primaires cultivées
Nous avons testé les rapports d’ADN plasmidique du transposon SB100X au PEDF allant de 250 ng (0,08 pmol) de transposase SB100X plus 250 ng (0,052 pmol) de transposon PEDF à 12,2 ng (0,0039 pmol) de transposase SB100X plus 487,8 ng (0,1 pmol) de transposon PEDF. Cette approche a permis d’identifier les deux combinaisons 29,4 ng (0,0094 pmol) de transposase SB100X plus 470,6 ng (0,098 pmol) de transposon PEDF et 23,8 ng (0,0076 pmol) plus 476,2 ng (0,099 pmol) comme étant celles qui ont obtenu les meilleurs rendements de transposition37. Dans les cellules RPE humaines primaires cultivées, l’administration du transgène PEDF à l’aide du système de transposon SB100X a permis une augmentation continue de l’expression du gène PEDF et de la sécrétion de protéines PEDF. Pour le PEDF recombinant marqué His, l’analyse par transfert Western de milieux de culture cellulaire provenant de cellules EPR humaines primaires transfectées a démontré une sécrétion de PEDF à des niveaux constants sans silençage transgénique pendant plus de 500 jours (Figure 3A). Pour le PEDF non marqué, la sécrétion dans les cellules EPR humaines primaires transfectées s’est également avérée significativement augmentée par rapport aux cellules non transfectées38. Une analyse représentative par transfert Western de milieux de culture cellulaire provenant de transfections effectuées en série a clairement indiqué le taux de sécrétion de PEDF universellement plus élevé 21 jours après la transfection (figure 3B), et dans une culture poursuivie, une sécrétion élevée de PEDF à long terme a été prouvée pendant au moins 165 jours (figure 3C). La quantification basée sur ELISA a démontré une multiplication par 20 de la sécrétion totale de PEDF dans les cellules EPR humaines primaires transfectées par rapport aux cellules témoins non transfectées respectives (Figure 3D). Cet accroissement a également été confirmé au niveau de l’expression génique, où l’expression totale de DEPED a été multipliée par plus de 30 (Figure 3E).
Figure 1 : Flux de travail pour l’insertion par électroporation du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires au moyen du système de transposons SB100X. Le schéma décrit le déroulement chronologique de (A) l’isolement des cellules RPE humaines primaires et leur culture ultérieure dans une monocouche confluente, (B) les étapes uniques du processus d’électroporation, y compris la purification de la transposase SB100X et de l’ADN plasmidique du transposon PEDF, la préparation de la transposase SB100X / PEDF le mélange plasmidique transposon, la mise en place du système de transfection capillaire, la préparation des cellules RPE humaines primaires cultivées, l’électroporation, l’ensemencement et la culture des cellules EPR transfectées, ainsi que (C) les analyses des cellules EPR humaines primaires transfectées, comprenant la préparation des surnageants de culture cellulaire et des échantillons de cellules transfectées, l’évaluation et la quantification de la sécrétion de PEDF, et l’analyse de l’expression des gènes PEDF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Micrographies à contraste de phase de cellules EPR isolées de différents yeux de donneurs. Cultures de cellules EPR humaines primaires, différant par l’âge du donneur, le temps d’isolement post-mortem et le temps de culture avant leur application pour l’électroporation (panneau de gauche), ainsi que des cultures de cellules EPR humaines primaires transfectées, exposées aux paramètres électriques 1 100 V (tension d’impulsion), 20 ms (largeur d’impulsion) et 2 impulsions (nombre d’impulsions) utilisant le système de transfection capillaire (panneau de droite ), présentait une monocouche intégrée confluente de cellules pigmentées dans un motif pavé (barres d’échelle : 500 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sécrétion de PEDF et expression du gène PEDF après transfection médiée par SB100X de cellules RPE humaines primaires. (A-C) Analyses immunoblot de la stabilité de la sécrétion de PEDF dans les cellules RPE humaines primaires cultivées transfectées avec un mélange de 29,4 ng (0,0094 pmol) de plasmide transposase SB100X plus 470,6 ng (0,098 pmol) de plasmide de transposon PEDF en utilisant le système de transfection capillaire. (A) Les cellules EPR d’un donneur de 26 ans (femelle, temps d’isolement post-mortem: 26 h, temps de culture avant électroporation: 14 jours) ont été transfectées et maintenues en culture pendant plus de 500 jours. Le PEDF recombinant marqué His (~48 kDa) a été purifié à partir de milieux de culture cellulaire à différents moments et évalué par Western blot à l’aide d’anticorps anti-Penta-He. (B) Pour le PEDF recombinant non marqué, les cellules EPR d’un donneur de 53 ans (femelle, temps d’isolement post-mortem : 28 h, temps de culture avant transfection : 19 jours) ont été électroporées sans ADN plasmidique (cultures témoins #1 et #2) ou avec l’ajout d’ADN plasmidique (cultures cellulaires transfectées par PEDF #3 à #7) et maintenues en culture pendant 21 jours. Les surnageants de culture cellulaire n’ont pas été purifiés, mais directement analysés par immunoblot à l’aide d’anticorps anti-PEDF. L’analyse par transfert Western des lysats cellulaires a montré le niveau de PEDF intracellulaire dans les témoins (cultures #1 et #2) et les cellules transfectées (cultures #3 et #4). La charge de quantités protéiques similaires a été indiquée par la densité égale des bandes de protéines GAPDH (~36 kDa). (C) Pour l’analyse de la sécrétion à long terme de PEDF, les cellules EPR d’un donneur de 63 ans (mâle, temps d’isolement post-mortem: 26 h, temps de culture avant transfection: 15 jours) ont été électroporées sans ADN plasmidique (cultures témoins #1 et #2) ou avec de l’ADN plasmidique (culture cellulaire transfectée PEDF #3) et maintenues en culture pendant au moins 165 jours. Les milieux de culture cellulaire n’ont pas été purifiés, mais analysés directement par immunoblot à l’aide d’anticorps anti-PEDF. (D) Quantification ELISA de la sécrétion totale de PEDF dans les cellules EPR humaines primaires transfectées (deux échantillons) et les cellules témoins non transfectées (quatre échantillons). La sécrétion des cellules transfectées a été comparée à la sécrétion des cellules non transfectées (*p = 0,0264, test t non apparié avec la correction de Welch). (E) L’expression endogène et totale (endogène plus recombinante) du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires transfectées était liée à l’expression dans les cellules témoins non transfectées, dont l’expression a été fixée à 1 (ligne pointillée). Les données sont présentées sous la forme d’un diagramme en boîte et moustaches (moustaches : min à max). L’expression totale du gène PEDF a été comparée à l’expression endogène du gène PEDF (test t non significatif et non apparié avec la correction de Welch). Les résultats pour le PEDF recombinant non marqué (B-E) représentent deux unités de l’ensemble des données de l’ensemble des cellules EPR primaires provenant d’un maximum de 27 donneurs transfectés avec un rapport transposon SB100X / PEDF de 29,4 ng (0,0094 pmol) plus 470,6 ng (0,098 pmol), qui a été décrit par Thumann et al. 201738. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans notre projet, nous visons la production non virale de cellules EPR primaires humaines génétiquement modifiées qui surexpriment et sécrètent continuellement un facteur efficace afin d’utiliser les cellules transfectées comme thérapeutique à long terme pour l’établissement et le maintien d’un environnement protecteur. Nous avons établi l’introduction du gène codant pour la PEDF, une protéine multifonctionnelle omniprésente avec des fonctions anti-angiogéniques et neuroprotectrices. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour transfecter de manière stable et reproductible des cellules RPE humaines primaires à l’aide du système de transposon SB100X . L’administration et l’introduction de l’ADN dans les cellules EPR sont effectuées avec un système de transfection capillaire à base de pipette, qui utilise des pointes spécifiques comme chambre d’électroporation au lieu de cuvettes.
L’enrichissement des cultures primaires d’EPR constituées de cellules morphologiquement bien différenciées à utiliser pour des transfections ultérieures est influencé par plusieurs facteurs liés au donneur humain (âge et état de santé général) ainsi qu’à la réception des yeux (temps post-mortem d’isolement cellulaire). Les cellules primaires EPR fraîchement isolées et ensemencées ont besoin d’au moins 2 semaines pour développer une monocouche de cellules de forme hexagonale. En règle générale, les cultures cellulaires qui avaient besoin de plus de temps pour atteindre la confluence avant la transfection ont également montré une adhérence décélérée et une propagation après la transfection. L’adhérence et la propagation des cellules sont également entravées par le dépôt de pigment libre à partir des cellules EPR endommagées lors de l’isolement cellulaire ou du processus de transfection.
Le système de transposons SB est un outil génétique largement utilisé qui permet l’administration efficace et sûre de séquences nucléotidiques pertinentes sur le plan thérapeutique dans divers types de cellules pour être ensuite appliquées dans des thérapies cellulaires géniques. En particulier, sa variante améliorée SB100X combine les avantages des vecteurs viraux et de l’ADN plasmidique non viral. Le mode d’action intégrateur assure une intégration génomique stable de la cassette d’expression dans le génome de la cellule hôte et permet une expression soutenue du gène ou de la séquence d’intérêt. Contrairement aux vecteurs rétroviraux, qui s’intègrent préférentiellement dans les unités de transcription actives avec un risque élevé de mutagénèse et d’oncogenèsepotentielles 27,28, le profil d’intégration basé sur SB est aléatoire. Cela a été démontré dans un grand nombre d’études utilisant diverses cellules de mammifères primaires et en culture, y compris les cellules humaines 49,50,51,52, ainsi que pour les cellules primaires de rat et d’EPR humaines 38,46. De plus, l’application du système de transposon SB en tant qu’ADN plasmidique réduit l’immunogénicité et facilite le processus de fabrication.
La livraison de l’information génétique de la transposase SB100X et du transgène PEDF sur des plasmides séparés est un aspect important, car elle permet un ajustement précis du rapport optimal des transposons SB100X / PEDF. Comme décrit précédemment, le système de transposons SB est sensible à un excès d’expression de la transposase, ce qui entraîne une inhibition de l’activité de transposition53. Nous avons également observé cet effet pour les cellules ARPE-19, une lignée cellulaire spontanément évoluée purifiée par trypsinisation sélective d’une culture RPE humaine primaire54, et les cellules RPE primaires. Ici, la transfection avec des rapports transposons SB100X à PEDF allant jusqu’à 55,6 ng (0,018 pmol) de transposase SB100X plus 444,4 ng (0,093 pmol) de transposon PEDF a entraîné une nette diminution des taux de sécrétion de PEDF 37. Le rapport transposase/transposon idéal doit être déterminé pour chaque plasmide transposonique nouvellement construit.
Les vecteurs plasmidiques non viraux peuvent être transférés via des lipo / polyplexes, des nanoparticules, un laser, des ultrasons ou une électroporation. Nous avons déjà montré que la transfection basée sur la lipofection des cellules PE primaires n’était pas efficace et nous sommes donc passés au transfert de gènes basé sur l’électroporation36. L’électroporation est définie comme l’application d’un champ électrique de courte durée aux cellules, ce qui entraîne une augmentation de la perméabilité de la membrane et la formation de pores aqueux, par lesquels l’ADN plasmidique peut pénétrer dans la cellule. En général, un mélange de cellules, d’ADN plasmidique et de tampon conducteur est rempli dans une chambre d’électroporation spécifique entre deux électrodes, qui sont connectées au dispositif d’électroporation générant les impulsions électriques. Dans cette configuration dite d’électroporation en vrac, une chambre d’électroporation de cuvette conventionnelle est caractérisée par deux électrodes parallèles de type plaque, dont la distance est variable (0,1-0,4 mm), en fonction du type de cellule et du nombre de cellules utilisées par réaction d’électroporation. Malgré de bonnes efficacités de transfection, différents effets secondaires peuvent affecter négativement la survie des cellules transfectées, par exemple, les changements de pH, le développement de chaleur, la génération de bulles et l’écoulement turbulent. Le système de transfection capillaire atténue au moins les effets secondaires à base de cuvette en possédant des électrodes avec une surface réduite et une taille d’écart maximisée entre elles42 ainsi qu’en utilisant des tampons de remise en suspension et électrolytiques spécifiques; Cependant, leurs compositions ne sont pas divulguées.
Malgré les améliorations apportées à la configuration d’électroporation en vrac, qui ont conduit à une augmentation de la survie cellulaire, des dommages irréversibles à un certain pourcentage de cellules sont inévitables. De plus, un contrôle précis de la quantité de plasmide intégré dans les cellules n’est pas possible. Le développement plus récent de systèmes d’électroporation miniaturisés a permis des améliorations supplémentaires en réduisant davantage les limitations associées à l’électroporation en vrac. Ces nouveaux dispositifs sont basés sur des microélectrodes, microfluidiques, ou nanostructures. Ils offrent de nouvelles perspectives d’application dans les domaines de la thérapie génique, de la médecine régénérative et de l’investigation intracellulaire in situ (examinés par Chang et al. et Shi et al.) 55,56.
Nous avons démontré que l’électroporation, qui a été initialement réalisée à l’aide d’un système à base de cuvette et établie par la suite à l’aide d’un système capillaire à base de pipette, est une méthode appropriée et efficace pour transfecter à la fois la lignée cellulaire épithéliale pigmentaire ARPE-19 ainsi que les cellules PE primaires 36,37,38,57,58 . Selon le type de cellule utilisé, il est important de définir des protocoles d’électroporation appropriés en appliquant des paramètres qui permettent à la fois une bonne efficacité de transfection et la survie cellulaire. Des champs électriques insuffisants empêchent les cellules d’être endommagées, mais entraînent de faibles efficacités de transfection. Avec l’augmentation de l’intensité du champ électrique, des efficacités de transfection améliorées sont obtenues. Cependant, des paramètres électriques élevés conduisent également à des pourcentages plus élevés de cellules mortes en raison de dommages irréversibles aux cellules. Pour la lignée cellulaire ARPE-19, en utilisant le système de transfection capillaire, des paramètres d’électroporation de 1 350 V, 20 ms et 2 impulsions ont donné des rendements de transfection initiaux de 100%37. L’application de ces paramètres pour la transfection des cellules RPE primaires a également entraîné de bonnes efficacités, mais aussi un nombre inférieur de cellules cultivées après la transfection par rapport aux paramètres d’électroporation de 1 100 V, 20 ms et 2 impulsions (données non présentées). Par conséquent, la décision a été prise de choisir les paramètres d’électroporation plus doux pour éviter les dommages cellulaires et accepter moins de cellules transfectées.
L’objectif global de cette approche réside dans l’application clinique de cellules transfectées par PEDF pour le traitement des patients atteints de DMLA néovasculaire. La thérapie comprend l’introduction stable du transgène PEDF dans les cellules épithéliales pigmentaires autologues ex vivo sur la base du système de transposon SB100X , suivie de la transplantation des cellules transfectées dans l’espace sous-rétinien du patient. Ainsi, il est important de s’assurer que les cellules transfectées par le PEDF ne se transdifférencient pas et n’acquièrent pas une forme et un comportement de croissance fibroblastiques. Il est également important de prouver que les cellules transfectées permettent une sécrétion soutenue et constante de PEDF. De plus, il est crucial de connaître la quantité précise de PEDF sécrétée par un nombre particulier de cellules pendant une période de temps spécifique.
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Disclosures
Zoltán Ivics et Zsuzsanna Izsvák sont les inventeurs de plusieurs brevets sur la technologie de transposon SB
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le septième programme-cadre de recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne, la convention de subvention n° 305134. Zsuzsanna Izsvák a été financée par le Conseil européen de la recherche, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Les auteurs tiennent à remercier Anna Dobias et Antje Schiefer (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour leur excellent soutien technique, ainsi que la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour avoir fourni les yeux du donneur humain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
References
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