Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Elektroporationsbaserad genetisk modifiering av primära mänskliga pigmentepitelceller med hjälp av Törnrosa Transposon System

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

Vi har utvecklat ett protokoll för att transfektera primära humana pigmentepitelceller genom elektroporering med genen som kodar för pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Framgångsrik transfektion demonstrerades genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA).

Abstract

Vårt allt äldre samhälle leder till en växande förekomst av neurodegenerativa sjukdomar. Hittills är de patologiska mekanismerna otillräckligt förstådda, vilket hindrar upprättandet av definierade behandlingar. Cellbaserade additiva genterapier för ökat uttryck av en skyddande faktor anses vara ett lovande alternativ för att medicinera neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi har utvecklat en metod för stabilt uttryck av den genkodande pigmentepitel-härledda faktorn (PEDF), som karakteriseras som ett neuroprotektivt och antiangiogent protein i nervsystemet, in i genomet hos primära humana pigmentepitelceller (PE) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Primära PE-celler isolerades från mänskliga donatorögon och upprätthölls i odling. Efter att ha nått sammanflödet suspenderades 1 x 104 celler i 11 μl resuspensionsbuffert och kombinerades med 2 μL av en renad lösning innehållande 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposasplasmid och 470 ng PEDF-transposonplasmid. Genetisk modifiering utfördes med ett kapillärelektroporationssystem med användning av följande parametrar: två pulser med en spänning på 1 100 V och en bredd på 20 ms. Transfekterade celler överfördes till odlingsplattor innehållande medium kompletterat med fetalt bovint serum; Antibiotika och antimykotika tillsattes med det första medieutbytet. Framgångsrik transfektion demonstrerades i självständigt utförda experiment. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) visade det ökade uttrycket av PEDF-transgenen. PEDF-sekretionen var signifikant förhöjd och förblev stabil, vilket utvärderades genom immunoblotting och kvantifierades med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). SB100X-medierad överföring möjliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet hos PE-celler och säkerställde kontinuerlig utsöndring av PEDF, vilket är avgörande för utvecklingen av en cellbaserad genadditionsterapi för att behandla AMD eller andra retinala degenerativa sjukdomar. Dessutom indikerade analys av integrationsprofilen för PEDF-transposonen till mänskliga PE-celler en nästan slumpmässig genomisk fördelning.

Introduction

Hög ålder beskrivs som den största risken för neurodegenerativa sjukdomar. Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen sjukdom som leder till svår synförlust hos patienter äldre än 60 år, tillhör de fyra vanligaste orsakerna till blindhet och synnedsättning1 och förväntas öka till 288 miljoner människor 20402. Dysfunktioner i retinal pigmentepitel (RPE), ett enda lager av tätt packade celler belägna mellan choriocapillaris och retinala fotoreceptorer, bidrar till patogenesen av AMD. RPE uppfyller flera uppgifter som är väsentliga för en normal retinal funktion3 och utsöndrar en mängd olika tillväxtfaktorer och faktorer som är väsentliga för att upprätthålla den strukturella integriteten hos näthinnan och choriokapillaris, vilket stöder fotoreceptoröverlevnad och ger en grund för cirkulationen och tillförseln av näringsämnen.

I friska ögon är pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) ansvarig för att balansera effekterna av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och skyddar neuroner mot apoptos, förhindrar endotelcellsproliferation och stabiliserar kapillärendotelet. Ett skiftat VEGF-till-PEDF-förhållande är relaterat till okulär neovaskularisering, vilket observerades i djurmodeller 4,5 samt i prover av patienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grund av AMD och proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den förbättrade VEGF-koncentrationen är målet för den nuvarande standardbehandlingen. Anti-VEGF-läkemedlen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept och senast brolucizumab förbättrar synskärpan hos cirka en tredjedel av CNV-patienterna eller snarare stabiliserar synen i 90% av fallen11,12,13. De frekventa, ofta månatliga, intravitreala injektionerna medför dock risken för biverkningar14, försämrar patienternas efterlevnad och utgör en betydande ekonomisk börda för hälso- och sjukvårdssystemen15. Dessutom svarar en viss andel av patienterna (2%-20%) inte eller reagerar bara dåligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Dessa negativa samtidiga kräver utveckling av alternativa behandlingar, t.ex. intraokulära implantat, cell- och/eller genterapeutiska metoder.

Genterapi har utvecklats som lovande behandling för ärftliga och icke-ärftliga sjukdomar och avser att återställa icke-funktionella gensekvenser eller undertrycka felaktiga sådana. För polygena sjukdomar, där identifiering och ersättning av orsaksfaktorerna knappast är möjlig, syftar strategierna till kontinuerlig leverans av en skyddande faktor. När det gäller AMD har olika additiva terapier utvecklats, såsom det stabila uttrycket av endostatin och angiostatin 20, VEGF-antagonisten lösligt fms-liknande tyrosinkinas-1 (sFLT-1)21,22, komplementet reglerande proteinkluster av differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Ögat, och särskilt näthinnan, är ett utmärkt mål för en genbaserad medicinering på grund av den slutna strukturen, god tillgänglighet, liten storlek och immunprivilegium, vilket möjliggör en lokal leverans av låga terapeutiska doser och gör transplantationer mindre mottagliga för avstötning. Dessutom möjliggör ögat icke-invasiv övervakning, och näthinnan kan undersökas med olika bildtekniker.

Virala vektorer är, på grund av deras höga transduktionseffektivitet, det viktigaste fordonet för att leverera terapeutiska gener till målceller. Beroende på vilken virusvektor som används har dock olika biverkningar beskrivits, såsom immun- och inflammatoriska svar26, mutagena och onkogena effekter 27,28 eller spridning i andra vävnader29. Praktiska begränsningar inkluderar en begränsad förpackningsstorlek30 samt svårigheter och kostnader i samband med produktionen av partier31,32 av klinisk kvalitet. Dessa nackdelar har främjat den fortsatta utvecklingen av icke-virala, plasmidbaserade vektorer som överförs via lipo-/polyplexer, ultraljud eller elektroporering. Emellertid främjas inte genomisk integration av transgenen i värdgenomet vanligtvis inte med plasmidvektorer, vilket resulterar i ett övergående uttryck.

Transposoner är naturligt förekommande DNA-fragment som ändrar sin position i genomet, en egenskap som har antagits för genterapi. På grund av en aktiv integrationsmekanism möjliggör transposonbaserade vektorsystem ett kontinuerligt och konstant uttryck av den införda transgenen. Törnrosa (SB) transposon, rekonstituerad från en gammal Tc1/mariner-typ transposon som hittades i fisk33 och förbättrades ytterligare genom molekylär evolution vilket resulterade i den hyperaktiva varianten SB100X34, möjliggjorde effektiv transponering i olika primära celler och användes för fenotypisk korrigering i olika sjukdomsmodeller35. För närvarande har 13 kliniska prövningar inletts med hjälp av SB-transposonsystemet. SB100X-transposonsystemet består av två komponenter: transposonen, som består av genen av intresse flankerad av terminala inverterade upprepningar (TIR), och transposaset, som mobiliserar transposonen. Efter plasmid-DNA-leverans till cellerna binder transposaset TIR: erna och katalyserar excisionen och integrationen av transposonen i cellens genom.

Vi har utvecklat en icke-viral cellbaserad additiv terapi för behandling av neovaskulär AMD. Tillvägagångssättet omfattar elektroporationsbaserad införande av PEDF-genen i primära pigmentepitelceller (PE) med hjälp av SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiska informationen om transposas och PEDF tillhandahålls på separata plasmider, vilket möjliggör justering av det ideala SB100X-till-PEDF-transposonförhållandet. Elektroporering utförs med hjälp av ett pipettbaserat kapillärtransfektionssystem som kännetecknas av en maximerad gapstorlek mellan elektroderna samtidigt som deras ytarea minimeras. Enheten visade sig uppnå utmärkta transfektionshastigheter i ett brett spektrum av däggdjursceller 39,40,41. Den lilla elektrodytan ger ett jämnt elektriskt fält och minskar de olika biverkningarna av elektrolys42.

Den anti-angiogena funktionaliteten hos PEDF som utsöndras av transfekterade pigmentepitelceller visades i olika in vitro-experiment som analyserade spridning, migration och apoptos av humana navelvenendotelceller43. Dessutom visade transplantation av PEDF-transfekterade celler i en kaninmodell av hornhinnans neovaskularisering44 samt en råttmodell av CNV43,45,46 nedgång av neovaskularisering.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för stabil insättning av PEDF-genen i primära humana RPE-celler via SB100X-transposonsystemet med hjälp av ett kapillärtransfektionssystem. De transfekterade cellerna hölls i odling i 21 dagar och analyserades därefter med avseende på PEDF-genuttryck genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) och i termer av PEDF-proteinsekretion genom immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA, figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mänskliga donatorögon erhölls från Aachen Cornea Bank vid avdelningen för oftalmologi (Universitetssjukhuset RWTH Aachen) efter att ha fått informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationens protokoll. Förfaranden för insamling och användning av humanprover har godkänts av den institutionella etiska kommittén.

1. Isolering av primära humana RPE-celler

  1. Lägg ut sterila skyddskläder och handskar. Placera ett sterilt draperi under ett laminärt flöde.
  2. Placera sterila beredningsinstrument och annan nödvändig steril utrustning under det laminära flödet.
  3. Spela in kvittot på ögongloberna, början av beredningen samt eventuella avvikelser. Registrera donatorns ålder, kön, dödsorsak och perioden mellan tidpunkten för dödsfallet och ögonborttagningen.
  4. Placera ögongloben i en steril gasbindning och håll den i ena handen.
  5. Separera det främre segmentet från det bakre segmentet med ett omkretssnitt cirka 3,5 mm bakom limbus med hjälp av en skalpell och en extra fin spetsig ögonsax.
  6. Efter att ha lutat det bakre segmentet nedåt, ta försiktigt bort glaskroppen och näthinnan med colibri-pincett.
  7. Ordna diskret om det kollapsade RPE/choroidea-komplexet med raka iristångar och håll det därefter på plats med böjda iristångar.
  8. Fyll den bakre ögonkoppen med 1 ml Dulbeccos modifierade örnmedium/skinka F-12 näringsblandning (DMEM/F12) kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS), 80 U/ml penicillin och 80 μg/ml streptomycin (Pen/Strep) och 2,5 μg/ml amfotericin B (AmphoB).
    OBS: I motsats till isoleringen av primära RPE-celler från gris- eller nötkreaturögon36,37 behöver den bakre ögonkoppen inte fyllas och inkuberas med trypsin.
  9. Skörda RPE-cellerna genom att försiktigt borsta retinalpigmentepitelet från synnerven mot limbus med en eldpolerad böjd glaspasteurpipett, medan du fixerar RPE / choroidea-komplexet vid limbus med colibri-pincett. Överför cellsuspensionen till en petriskål.
  10. Upprepa stegen 1.8 och 1.9 och samla alla celler i petriskålen. Återsuspendera cellsuspensionen försiktigt genom att pipettera upp och ner med en enkanalspipett (100-1 000 μl).
  11. Frö RPE-cellsuspensionen av varje ögonglob i tre brunnar i en 24-brunns cellodlingsplatta och fyll dem upp till 1 ml med DMEM / F12 kompletterat med FBS, Pen / Strep och AmphoB.
  12. Håll RPE-cellkulturerna vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 95 % luft och 5 %CO2 tills sammanflödet har uppnåtts. Byt cellodlingsmedium två gånger i veckan.

2. Elektroporering av primära humana RPE-celler

  1. Beredning av SB100X-transposas/PEDF-transposonplasmidblandningen
    1. Rena SB100X-transposas - och PEDF-transposonplasmid-DNA med hjälp av vanliga plasmidreningssatser, som identifieras som lämpliga för användning i applikationer som transfektion, enligt tillverkarens protokoll.
    2. Kvantifiera plasmid-DNA-innehållet med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer och justera dem till en koncentration av 250 ng/μL med 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Blanda en portion 250 ng/μL SB100X transposasplasmid-DNA (t.ex. 2,5 μL) med 16 portioner 250 ng/μL PEDF-transposonplasmid-DNA (t.ex. 40 μL). Kvarvarande plasmidblandning kan förvaras vid -20 °C.
      OBS: Flera upprepade frys- och upptiningscykler av plasmidblandningen bör undvikas.
    4. Placera 2 μL av SB100X-transposas/PEDF-transposonplasmidblandningen, innehållande 29,4 ng SB100X-transposasplasmid och 470,6 ng PEDF-transposonplasmid, i ett sterilt 1,5 ml säkert låst mikrocentrifugrör. Håll på is tills det blandas med celler.
  2. Installation av kapillärtransfektionssystemet
    OBS: Elektroporering av primära humana RPE-celler har utförts via ett kapillärtransfektionssystem med användning av 10 μL-satsen enligt tillverkarens protokoll. Systemet består av transfektionsanordningen, transfektionspipetten och pipettstationen. Satsen innehåller 10 μL transfektionsspetsar, buffertrör, elektrolytisk buffert E (buffert E) och resuspensionsbuffert R (buffert R).
    1. Anslut pipettstationen till transfektionsanordningen.
    2. Fyll ett buffertrör med 3 ml buffert E och sätt in det i pipettstationen tills ett klickljud hörs.
      OBS: Se till att buffertrörets sidoelektrod är ansluten till pipettstationens sidokulkolv.
    3. För elektroporering av primära humana RPE-celler, ställ in följande pulsförhållanden på transfektionsanordningen: 1 100 V (pulsspänning), 20 ms (pulsbredd), två pulser (pulsnummer).
  3. Beredning av de odlade primära humana RPE-cellerna
    1. Dokumentera form och morfologi för de primära RPE-cellkulturerna via faskontrastmikroskopi. Ta mikrografer med låg förstoring för att demonstrera tillväxten av RPE-cellerna till ett sammanflytande och integrerat monolager samt mikrografer med högre förstoring för att påpeka RPE-cellernas typiska kullerstensmorfologi.
    2. Aspirera cellodlingsmediet och tvätta cellerna två gånger med 1 ml buffrad fosfatsaltlösning (PBS, pH 7,4).
    3. Trypsinisera primära humana RPE-celler med 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 95% luft och 5% CO2 i 7-15 min (maximalt). Kontrollera cellavskiljningen mikroskopiskt.
    4. Stoppa trypsinisering med 1 ml DMEM/F12 kompletterat med FBS. Ta en alikvot på 20 μL för cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera RPE-cellsuspensionen vid 106 x g i 10 minuter.
    5. Blanda 20 μl alikvot med 20 μL trypanblå lösning. Pipettera 10 μL i varje halva av hemocytometern och räkna cellerna under ett faskontrastmikroskop.
    6. Efter centrifugering, återsuspendera RPE-cellpelleten i 1 ml PBS.
    7. Ta 10 000-100 000 RPE-celler per transfektionsreaktion och centrifugera dem vid 106 x g i 10 minuter.
      OBS: Förutom transfektionsreaktionerna med elektrisk fältapplikation och tillsats av plasmid-DNA inkluderar varje tillvägagångssätt också två olika kontrollkulturer: (1) utan elektrisk fältapplikation och utan plasmid-DNA; (2) med elektrisk fältapplikation, men utan plasmid-DNA.
    8. Återsuspendera cellpelleten i 11 μl buffert R och kombinera den med 2 μl av SB100X-transposas/PEDF-transposonplasmidblandningen (se steg 2.1.4).
      OBS: Efter återsuspension i buffert R måste cellerna bearbetas inom 15 minuter för att undvika en minskning av cellviabiliteten och transfektionseffektiviteten.
    9. För in transfektyrpipettens huvud i 10 μl transfektionsspetsen tills klämman helt tar upp kolvens monteringsstam. Dra upp cellen/plasmidlösningen i transfektionsspetsen.
      OBS: Undvik generering av luftbubblor och deras aspiration i transfektionsspetsen.
    10. Ge 1 ml DMEM/F12 kompletterat med FBS, men utan Pen/Strep och utan AmphoB, i det erforderliga antalet brunnar i en 24-brunns cellodlingsplatta.
  4. Elektroporeringsprocess
    1. För in transfektionspipetten i buffertröret som placeras i pipettstationen (se steg 2.2.2) tills ett klickljud hörs.
      OBS: Se till att transfektyrpipettens metallhuvud är anslutet till kulkolven inuti pipettstationen och till buffertröret.
    2. Tryck på Start på transfektionsenhetens pekskärm. Före applicering av den elektriska pulsen kontrollerar enheten automatiskt om buffertröret och transfektionspipetten är korrekt införda. Efter leverans av de elektriska pulserna visas Complete på pekskärmen.
    3. Avlägsna försiktigt transfektionspipetten från pipettstationen och släpp omedelbart de elektroporerade cellerna från 10 μl transfektionsspetsen genom att pipettera cellen/plasmidlösningen i de förberedda brunnarna på cellodlingsplattan (se steg 2.3.10).
    4. Håll transfekterade RPE-cellkulturer vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 95 % luft och 5 %CO2. Tillsätt Pen/Strep och AmphoB med det första mediumutbytet 3 dagar efter elektroporering.

3. Analyser av transfekterade primära humana RPE-celler

  1. Beredning av prov
    1. Efter en odlingstid på 3 veckor inkubera slutligen RPE-cellkulturerna i en definierad volym på 1,0 ml DMEM/F12 kompletterat med FBS, Pen/Strep och AmphoB under en definierad tid på 24 timmar.
    2. Ta cellodlingssupernatanterna och förvara dem vid -20 °C tills ytterligare bearbetning i nära tid eller vid -80 °C för termiskt instabila prover och långtidsförvaring.
    3. Trypsinisera transfekterade RPE-cellkulturer med 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA vid 37 °C i en fuktad atmosfär av 95% luft och 5% CO2 i 10 minuter.
    4. Stoppa trypsinisering med 1 ml DMEM/F12 kompletterat med FBS. Ta små alikvoter för cellräkning med hjälp av en hemocytometer (se steg 2.3.5). Centrifugera RPE-cellsuspensionerna vid 106 x g i 10 minuter.
    5. Förvara RPE-cellpelletsen vid -80 °C tills vidare bearbetning.
  2. Utvärdering av PEDF-utsöndring genom western blotting
    OBS: För en kvalitativ bedömning analyseras cellodlingssupernatanter (se steg 3.1.2) via natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och efterföljande western blotting. Beroende på PEDF transposon plasmid-DNA används, supernatanterna måste bearbetas annorlunda.
    1. Rening av His-märkta PEDF-fusionsproteiner från cellodlingssupernatanter
      1. Ta 30 μl nickel-nitrilotriättiksyra (Ni-NTA) uppslamning per prov med hjälp av en avfasad spets och pelletera Ni-NTA-hartset genom centrifugering (2,660 x g i 30 s).
      2. Återsuspendera försiktigt Ni-NTA-hartset med 200 μL 1x inkubationsbuffert (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) och pelletera det genom centrifugering (2660 x g i 30 s).
      3. Upprepa föregående steg.
      4. Återsuspendera försiktigt Ni-NTA-hartset med 40 μL 4x inkubationsbuffert (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) per prov.
      5. Blanda 900 μl cellodlingssupernatant med 260 μl 4x inkubationsbuffert och 55 μl förbehandlad Ni-NTA-uppslamning (se steg 3.2.1.4).
      6. Inkubera blandningen på en gungande shaker vid rumstemperatur i 60 min.
      7. Pellet Ni-NTA-hartset genom centrifugering (2660 x g i 60 s).
      8. Återsuspendera försiktigt Ni-NTA-hartset med 175 μL 1x inkubationsbuffert och pelletsharts genom centrifugering (2 660 x g i 60 s).
      9. Upprepa föregående steg.
      10. Återsuspendera försiktigt Ni-NTA-hartset med 30 μl elueringsbuffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) och inkubera blandningen på en gungande shaker vid rumstemperatur i 20 minuter.
      11. Pellet Ni-NTA-hartset genom centrifugering (2 660 x g i 30 s).
      12. Ta försiktigt supernatanten och blanda den med 2x SDS-provbuffert47.
      13. Värm blandningen vid 95 °C i 5 minuter och separera de Ni-NTA-renade proteinerna på en 10% SDS-polyakrylamidgel.
      14. Utför western blotting med anti-Penta-His antikroppar (mus monoklonal, 1:500) och pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerade antimusantikroppar (kaninpolyklonala, 1:1 000) som tidigare beskrivits36,37.
    2. Direkt analys av icke-märkta PEDF-proteiner
      1. Ta 15 μL cellodlingssupernatant och blanda den med 2x SDS-provbuffert47.
      2. Värm blandningen vid 95 °C i 5 minuter och separera proteinerna på en 10% SDS-polyakrylamidgel.
      3. Utför western blotting med anti-humana PEDF-antikroppar (kaninpolyklonala, 1:4 000) och HRP-konjugerade antikaninantikroppar (getpolyklonala, 1:2 000) som tidigare beskrivits38.
    3. Kvantifiering av PEDF-utsöndring med ELISA
      1. Analysera cellodlingssupernatanter (se steg 3.1.2) med hjälp av ett humant PEDF ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll.
      2. Relatera mängden utsöndrad PEDF till den tid och det cellantal som bestämts för varje transfektionsreaktion (se steg 3.1.4).
    4. Analys av PEDP-genuttryck i transfekterade RPE-celler
      1. Isolera totalt RNA från RPE-cellpellets (se steg 3.1.5) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens protokoll.
      2. Kvantifiera RNA-innehåll med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer.
      3. Utför omvänd transkription på 0,1 μg RNA med hjälp av ett omvänd transkriptionssystem enligt tillverkarens protokoll.
      4. Utför qPCR i realtid som tidigare beskrivits38.
    5. Analys av transgeninsättningsställen i transfekterade RPE-celler
      1. Isolera genomiskt DNA från RPE-cellpellets (se steg 3.1.5) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens protokoll.
      2. Kvantifiera DNA-innehåll med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer.
      3. Generera infogningswebbplatsbibliotek med hjälp av ett beräkningsassisterat hemi-specifikt PCR-schema enligt tidigare beskrivet38.
      4. Utföra beräkningsanalys enligt tidigare beskrivet38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Odling och elektroporering av primära humana RPE-celler
Vi har visat att sådd av ett tillräckligt antal primära RPE-celler av animaliskt ursprung möjliggör odling och tillväxt till ett integrerat monolager av pigmenterade, sexkantigt formade celler36,37,48. Deras förmåga att bilda täta korsningar, att uppvisa fagocytisk aktivitet och att uttrycka specifika markörgener in vitro48 återspeglar betydande uppgifter för retinalpigmentepitelet in vivo. Odlade primära RPE-celler isolerade från mänskliga donatorögon visade också den typiska kullerstensmorfologin, oavsett givarens ålder (65,3 ± 9,94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), tiden för isolering efter slakt (37,3 ± 17,0 h, min: 16 h, max: 68 h, n = 12) och odlingstiden (27,6 ± 14,1 d, min: 13 d, max: 61 d, n = 12) (figur 2, vänster panel). Tillämpningen av kortvariga elektriska pulser på primära humana RPE-celler med kapillärtransfektionssystemet påverkade inte epitelmorfologin negativt (figur 2, höger panel). Testning av olika elektriska parametrar visade att två pulser med en pulsspänning på 1 200 V och en pulsbredd på 20 ms gav god och stabil transfektionseffektivitet och det högsta antalet livskraftiga RPE-celler (opublicerade data).

SB100X-medierad insättning av PEDF-genen i odlade primära humana RPE-celler
Vi har testat plasmid-DNA-förhållanden för SB100X-till-PEDF-transposon som sträcker sig från 250 ng (0,08 pmol) SB100X-transposas plus 250 ng (0,052 pmol) PEDF-transposon till 12,2 ng (0,0039 pmol) SB100X-transposas plus 487,8 ng (0,1 pmol) PEDF-transposon. Detta tillvägagångssätt identifierade de två kombinationerna 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X-transposas plus 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF-transposon och 23,8 ng (0,0076 pmol) plus 476,2 ng (0,099 pmol) som de som uppnådde bäst överföringseffektivitet37. I odlade primära humana RPE-celler möjliggjorde leverans av PEDF-transgenen med hjälp av SB100X-transposonsystemet ett kontinuerligt ökat PEDF-genuttryck och PEDF-proteinsekretion. För His-taggad rekombinant PEDF visade western blot-analys av cellodlingsmedier från transfekterade primära humana RPE-celler PEDF-utsöndring vid konstanta nivåer utan transgendämpning i mer än 500 dagar (figur 3A). För icke-taggad PEDF visade sig sekretionen i transfekterade primära humana RPE-celler också öka signifikant jämfört med icke-transfekterade celler38. En representativ western blot-analys av cellodlingsmedier från seriellt utförda transfektioner indikerade tydligt den universellt högre PEDF-sekretionshastigheten vid 21 dagar efter transfektion (figur 3B), och i en eftersträvad kultur bevisades långvarig förhöjd PEDF-utsöndring i minst 165 dagar (figur 3C). ELISA-baserad kvantifiering visade en 20-faldig ökning av den totala PEDF-sekretionen i transfekterade primära humana RPE-celler jämfört med respektive icke-transfekterade kontrollceller (figur 3D). Denna ökning bekräftades också på genuttrycksnivå, där det totala PEDF-uttrycket höjdes mer än 30 gånger (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för elektroporationsbaserad införande av PEDP-genen i primära humana RPE-celler med hjälp av SB100X-transposonsystemet. Schemat beskriver det kronologiska förloppet för (A) isoleringen av primära humana RPE-celler och deras efterföljande odling till ett sammanflytande monolager, (B) de enskilda stegen i elektroporeringsprocessen, inklusive rening av SB100X-transposaset och PEDF-transposonplasmid-DNA, beredningen av SB100X-transposas / PEDF transposonplasmidblandning, uppbyggnaden av kapillärtransfektionssystemet, beredningen av de odlade primära humana RPE-cellerna, elektroporeringen, sådden och odlingen av de transfekterade RPE-cellerna samt (C) analyserna av de transfekterade primära humana RPE-cellerna, innefattande beredning av cellodlingssupernatanter och transfekterade cellprover, utvärdering och kvantifiering av PEDP-sekretion och analys av PEDF-genuttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Faskontrastmikrografer av RPE-celler isolerade från olika givarögon. Kulturer av primära humana RPE-celler, olika i givarålder, post-mortem-tid för isolering och odlingstid före deras applicering för elektroporering (vänster panel), liksom kulturer av transfekterade primära humana RPE-celler, exponerade för de elektriska parametrarna 1,100 V (pulsspänning), 20 ms (pulsbredd) och 2 pulser (antal pulser) med kapillärtransfektionssystemet (höger panel ), uppvisade ett sammanflytande integrerat monolager av pigmenterade celler i ett kullerstensliknande mönster (skalstänger: 500 μm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: PEDF-sekretion och PEDF-genuttryck efter SB100X-medierad transfektion av primära humana RPE-celler. (A-C) Immunoblotbaserade analyser av PEDF-sekretionsstabilitet i odlade primära humana RPE-celler transfekterade med en blandning av 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposasplasmid plus 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF-transposonplasmid med kapillärtransfektionssystemet. (A) RPE-celler från en 26-årig donator (hona, isoleringstid efter slakt: 26 timmar, odlingstid före elektroporering: 14 dagar) transfekterades och hölls i odling i mer än 500 dagar. Hans taggade rekombinanta PEDF (~ 48 kDa) renades från cellodlingsmedier vid olika tidpunkter och utvärderades genom western blotting med hjälp av anti-Penta-His antikroppar. (B) För icke-taggad rekombinant PEDF elektroporerades RPE-celler från en 53-årig donator (hona, isoleringstid efter slakt: 28 timmar, odlingstid före transfektion: 19 dagar) utan plasmid-DNA (kontrollkulturer #1 och #2) eller med tillsats av plasmid-DNA (PEDF-transfekterade cellkulturer #3 till #7) och bibehölls i odling i 21 dagar. Cellodlingssupernatanter renades inte utan analyserades direkt genom immunoblotting med användning av anti-PEDF-antikroppar. Western blot-analys av celllysater visade nivån av intracellulär PEDF i kontroller (kulturer #1 och #2) och transfekterade celler (kulturer #3 och #4). Laddning av liknande proteinmängder indikerades av den lika densiteten hos GAPDH-proteinband (~ 36 kDa). (C) För analys av långvarig PEDF-utsöndring elektroperades RPE-celler från en 63-årig donator (hane, post-mortem-tid för isolering: 26 timmar, odlingstid före transfektion: 15 dagar) utan plasmid-DNA (kontrollkulturer #1 och #2) eller med plasmid-DNA (PEDF-transfekterad cellkultur #3) och bibehölls i odling i minst 165 dagar. Cellodlingsmedier renades inte utan analyserades direkt genom immunoblotting med användning av anti-PEDF-antikroppar. D) ELISA-baserad kvantifiering av den totala PEDF-sekretionen i transfekterade primära humana RPE-celler (två prover) och icke-transfekterade kontrollceller (fyra prover). Utsöndringen av de transfekterade cellerna jämfördes med utsöndringen av de icke-transfekterade cellerna (*p = 0,0264, oparat t-test med Welchs korrigering). (E) Endogent och totalt (endogent plus rekombinant) PEDF-genuttryck i transfekterade primära humana RPE-celler var relaterade till uttrycket i icke-transfekterade kontrollceller, vars uttryck var inställt på 1 (streckad linje). Data presenteras som en box-and-whisker-plot (whiskers: min till max). Totalt PEDF-genuttryck jämfördes med endogent PEDF-genuttryck (inte signifikant, oparat t-test med Welchs korrigering). Resultaten för den icke-taggade rekombinanta PEDF (B-E) representerar två enheter av hela datauppsättningen av primära RPE-celler från upp till 27 givare transfekterade med ett SB100X-till-PEDF-transposonförhållande på 29,4 ng (0,0094 pmol) plus 470,6 ng (0,098 pmol), vilket beskrevs av Thumann et al. 201738. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vårt projekt strävar vi efter icke-viral produktion av genetiskt modifierade primära humana RPE-celler som kontinuerligt överuttrycker och utsöndrar en effektiv faktor för att kunna använda de transfekterade cellerna som långsiktig terapeutisk för etablering och underhåll av en skyddande miljö. Vi har etablerat introduktionen av genen som kodar för PEDF, ett allestädes närvarande uttryckt multifunktionellt protein med anti-angiogena och neuroprotektiva funktioner. Protokollet som beskrivs här kan användas för att stabilt och reproducerbart transfektera primära humana RPE-celler med hjälp av SB100X-transposonsystemet . DNA-leverans och introduktion i RPE-cellerna utförs med ett pipettbaserat kapillärtransfektionssystem, som använder specifika tips som elektroporationskammare istället för kyvetter.

Anrikningen av primära RPE-kulturer bestående av morfologiskt väldifferentierade celler som ska användas för efterföljande transfektioner påverkas av flera faktorer relaterade till den mänskliga givaren (ålder och allmän hälsostatus) samt mottagandet av ögonen (post-mortem-tid för cellisolering). Nyisolerade och sådda primära RPE-celler behöver minst 2 veckor för att utveckla ett monolager av sexkantigt formade celler. Som en allmän regel visade cellkulturer som behövde mer tid för att nå sammanflöde före transfektion också en retarderad vidhäftning och spridning efter transfektion. Cellvidhäftning och spridning hindras också av fri pigmentavsättning från RPE-celler som skadats under cellisolering eller transfektionsprocessen.

SB-transposonsystemet är ett allmänt använt genetiskt verktyg som möjliggör effektiv och säker leverans av terapeutiskt relevanta nukleotidsekvenser till olika typer av celler som därefter kan tillämpas i genbaserade cellterapier. Speciellt kombinerar dess förbättrade variant SB100X fördelarna med virala vektorer och icke-viralt plasmid-DNA. Det integrerande verkningssättet säkerställer en stabil genomisk integration av uttryckskassetten i värdcellens genom och möjliggör ett hållbart uttryck av genen eller sekvensen av intresse. Till skillnad från retrovirala vektorer, som företrädesvis integreras i aktiva transkriptionsenheter med hög risk för potentiell mutagenes och onkogenes27,28, är den SB-baserade integrationsprofilen slumpmässig. Detta visades i ett stort antal studier med olika odlade och primära däggdjursceller, inklusive mänskliga celler 49,50,51,52, samt för primära rått- och humana RPE-celler 38,46. Dessutom ger applicering av SB-transposonsystemet som plasmid-DNA minskad immunogenicitet och underlättar tillverkningsprocessen.

Leverans av den genetiska informationen om SB100X-transposaset och PEDF-transgenen på separata plasmider är en viktig aspekt, eftersom det möjliggör en exakt justering av det optimala SB100X-till-PEDF-transposonförhållandet. Som beskrivits tidigare är SB-transposonsystemet känsligt för ett överskott av transposasuttryck, vilket resulterar i hämning av transpositionsaktiviteten53. Vi observerade också denna effekt för ARPE-19-celler, en spontant utvecklad cellinje renad genom selektiv trypsinisering av en primär human RPE-kultur54 och primära RPE-celler. Här resulterade transfektion med SB100X-till-PEDF-transposonförhållanden upp till 55,6 ng (0,018 pmol) SB100X-transposas plus 444,4 ng (0,093 pmol) PEDF-transposon i tydligt minskade PEDF-sekretionshastigheter 37. Det ideala transposas-till-transposon-förhållandet måste bestämmas för varje nykonstruerad transposonplasmid.

Icke-virala plasmidbaserade vektorer kan överföras via lipo-/polyplexer, nanopartiklar, laser, ultraljud eller elektroporation. Vi har redan visat att lipofektionsbaserad transfektion av primära PE-celler inte var effektiv och därmed bytte till den elektroporationsbaserade genöverföringen36. Elektroporering definieras som tillämpning av ett kortvarigt elektriskt fält på celler, vilket resulterar i en ökning av membranets permeabilitet och bildandet av vattenhaltiga porer, genom vilka plasmid-DNA kan komma in i cellen. I allmänhet fylls en blandning av celler, plasmid-DNA och ledande buffert i en specifik elektroporationskammare mellan två elektroder, vilka är anslutna till elektroporationsanordningen som genererar de elektriska pulserna. I denna så kallade bulkelektroporationsinställning kännetecknas en konventionell kyvettelektroporationskammare av två parallella elektroder av platttyp, vars avstånd är variabelt (0,1-0,4 mm), beroende på celltyp och antalet celler som används per elektroporationsreaktion. Trots god transfektionseffektivitet kan olika biverkningar påverka de transfekterade cellernas överlevnad negativt, t.ex. pH-förändringar, värmeutveckling, bubbelgenerering och turbulent flöde. Kapillärtransfektionssystemet dämpar åtminstone de kyvettbaserade biverkningarna genom att ha elektroder med en minimerad ytarea och en maximerad mellanrumsstorlek mellan dem42 samt genom att använda specifika resuspensions- och elektrolytiska buffertar; emellertid avslöjas inte deras kompositioner.

Trots förbättringarna inom bulkelektroporeringsuppsättningen, vilket ledde till en ökad cellöverlevnad, är irreversibel skada på en viss andel celler oundviklig. Dessutom är en exakt kontroll av mängden plasmid integrerad i cellerna inte möjlig. Den nyare utvecklingen av miniatyriserade elektroporeringssystem har möjliggjort ytterligare förbättringar genom att ytterligare minska begränsningarna i samband med bulkelektroporering. Dessa nya enheter är baserade på mikroelektroder, mikrofluidik eller nanostrukturer. De erbjuder nya applikationsperspektiv inom genterapi, regenerativ medicin och in situ intracellulär undersökning (granskad av Chang et al. och Shi et al.) 55,56.

Vi har visat att elektroporering, som initialt utfördes med hjälp av ett kyvettbaserat system och därefter etablerades med hjälp av ett pipettbaserat kapillärsystem, är en lämplig och effektiv metod för att transfektera både pigmentepitelcellinjen ARPE-19 såväl som primära PE-celler 36,37,38,57,58 . Beroende på vilken celltyp som används är det viktigt att definiera lämpliga elektroporationsprotokoll som tillämpar parametrar som möjliggör både god transfektionseffektivitet och cellöverlevnad. Otillräckliga elektriska fält förhindrar att cellerna skadas men resulterar i låg transfektionseffektivitet. Med ökningen av elektrisk fältstyrka uppnås förbättrad transfektionseffektivitet. Förhöjda elektriska parametrar leder emellertid också till högre procentandelar av döda celler på grund av irreversibel cellskada. För ARPE-19-cellinjen, med hjälp av kapillärtransfektionssystemet, visade sig elektroporeringsparametrar på 1 350 V, 20 ms och 2 pulser resultera i initial transfektionseffektivitet på 100%37. Tillämpningen av dessa parametrar för transfektion av primära RPE-celler resulterade också i god effektivitet, men också i ett lägre antal odlade celler efter transfektion jämfört med elektroporationsparametrar på 1 100 V, 20 ms och 2 pulser (data visas inte). Därför togs beslutet att välja de mildare elektroporationsparametrarna för att förhindra cellskador och acceptera mindre transfekterade celler.

Det övergripande syftet med detta tillvägagångssätt ligger i klinisk tillämpning av PEDF-transfekterade celler för behandling av patienter som lider av neovaskulär AMD. Terapin omfattar en stabil introduktion av PEDF-transgenen i autologa pigmentepitelceller ex vivo baserat på SB100X-transposonsystemet , följt av transplantation av de transfekterade cellerna till patientens subretinala utrymme. Således är det viktigt att se till att de PEDF-transfekterade cellerna inte transdifferentierar och inte förvärvar en fibroblastisk form och tillväxtbeteende. Det är också viktigt att bevisa att de transfekterade cellerna möjliggör en ihållande och konsekvent utsöndring av PEDF. Dessutom är det viktigt att känna till den exakta mängden PEDF som utsöndras av ett visst antal celler under en viss tidsperiod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Zoltán Ivics och Zsuzsanna Izsvák är uppfinnare på flera patent på SB-transposonteknik

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Europeiska unionens sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration, bidragsavtal nr 305134. Zsuzsanna Izsvák finansierades av Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Författarna vill tacka Anna Dobias och Antje Schiefer (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för utmärkt teknisk support och Aachen Cornea Bank (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för att ge de mänskliga donatorögonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

Medicin utgåva 168 åldersrelaterad makuladegeneration AMD kapillärelektroporationssystem icke-viral transfektion pigmentepitel-härledd faktor PEDF primära pigmentepitelceller Törnrosa transposonsystem SB
Elektroporationsbaserad genetisk modifiering av primära mänskliga pigmentepitelceller med hjälp av Törnrosa Transposon System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter