Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Elektroporationsbaseret genetisk modifikation af primære humane pigmentepitelceller ved hjælp af Sleeping Beauty Transposon-systemet

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

Vi har udviklet en protokol til at transficere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporation med genet, der koder for pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Vellykket transfektion blev påvist ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).

Abstract

Vores stadig ældre samfund fører til en stigende forekomst af neurodegenerative sygdomme. Indtil videre er de patologiske mekanismer utilstrækkeligt forstået, hvilket hindrer etableringen af definerede behandlinger. Cellebaserede additive genterapier til øget ekspression af en beskyttende faktor betragtes som en lovende mulighed for at medicinere neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Vi har udviklet en metode til stabil ekspression af den genkodende pigmentepitelafledte faktor (PEDF), der er karakteriseret som et neurobeskyttende og anti-angiogent protein i nervesystemet, ind i genomet af primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler blev isoleret fra humane donorøjne og opretholdt i kultur. Efter at have nået sammenløbet blev 1 x 104 celler suspenderet i 11 μL resuspensionbuffer og kombineret med 2 μL af en oprenset opløsning indeholdende 30 ng hyperaktivt SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposonplasmid. Genetisk modifikation blev udført med et kapillærelektroporationssystem ved hjælp af følgende parametre: to impulser med en spænding på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transinficerede celler blev overført til dyrkningsplader indeholdende medium suppleret med føtalt bovint serum; antibiotika og antimykotika blev tilsat med den første mediumudveksling. Vellykket transfektion blev demonstreret i uafhængigt udførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) viste den øgede ekspression af PEDF-transgenet . PEDF-sekretionen var signifikant forhøjet og forblev stabil, som evalueret ved immunoblotting og kvantificeret ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). SB100X-medieret overførsel muliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet af PE-celler og sikrede kontinuerlig sekretion af PEDF, hvilket er kritisk for udviklingen af en cellebaseret genadditionsterapi til behandling af AMD eller andre retinale degenerative sygdomme. Desuden viste analyse af PEDF-transponens integrationsprofil i humane PE-celler en næsten tilfældig genomisk fordeling.

Introduction

Fremskreden alder beskrives som den største risiko for neurodegenerative sygdomme. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen sygdom, der fører til alvorligt synstab hos patienter over 60 år, hører til de fire mest almindelige årsager til blindhed og synshandicap1 og forventes at stige til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunktioner af retinal pigmentepitel (RPE), et enkelt lag af tæt pakkede celler placeret mellem choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrager til patogenesen af AMD. RPE udfører flere opgaver, der er afgørende for en normal retinal funktion3 og udskiller en række vækstfaktorer og faktorer, der er afgørende for at opretholde nethindens og choriocapillarisens strukturelle integritet, hvilket understøtter fotoreceptoroverlevelse og giver grundlag for cirkulation og tilførsel af næringsstoffer.

I sunde øjne er pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ansvarlig for at afbalancere virkningerne af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og beskytter neuroner mod apoptose, forhindrer endotelcelleproliferation og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskudt VEGF-til-PEDF-forhold er relateret til okulær neovaskularisering, som blev observeret i dyremodeller 4,5 såvel som i prøver af patienter med choroidal neovaskularisering (CNV) på grund af AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den øgede VEGF-koncentration er målet for den nuværende standardbehandling. Anti-VEGF-lægemidlerne bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos ca. en tredjedel af CNV-patienterne eller rettere stabiliserer synet i 90% af tilfældene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injektioner bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, forringer patienternes overholdelse og udgør en betydelig økonomisk byrde for sundhedssystemerne15. Desuden reagerer en vis procentdel af patienterne (2%-20%) ikke eller reagerer kun dårligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Disse negative samtidige nødvendiggør udvikling af alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilgange.

Genterapi har udviklet sig som lovende behandling af arvelige og ikke-arvelige sygdomme og har til hensigt at genoprette ikke-funktionelle gensekvenser eller undertrykke funktionsfejl. For polygene sygdomme, hvor identifikation og udskiftning af årsagsfaktorerne næppe er mulig, sigter strategier mod kontinuerlig levering af en beskyttende faktor. I tilfælde af AMD er der udviklet forskellige additive terapier, såsom den stabile ekspression af endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten opløselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, den komplementregulerende proteinklynge af differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Øjet, og især nethinden, er et glimrende mål for en genbaseret medicin på grund af den lukkede struktur, god tilgængelighed, lille størrelse og immunprivilegium, hvilket muliggør en lokaliseret levering af lave terapeutiske doser og gør transplantationer mindre modtagelige for afvisning. Desuden muliggør øjet ikke-invasiv overvågning, og nethinden kan undersøges ved forskellige billeddannelsesteknikker.

Virale vektorer er på grund af deres høje transduktionseffektivitet det vigtigste middel til at levere terapeutiske gener til målceller. Afhængigt af den anvendte virale vektor er der imidlertid beskrevet forskellige bivirkninger, såsom immun- og inflammatoriske reaktioner26, mutagene og onkogene virkninger 27,28 eller spredning i andre væv29. Praktiske begrænsninger omfatter en begrænset emballagestørrelse30 samt vanskeligheder og omkostninger forbundet med produktion af kliniske kvalitetspartier31,32. Disse ulemper har fremmet den videre udvikling af ikke-virale, plasmidbaserede vektorer, der overføres via lipo-/polyplexer, ultralyd eller elektroporation. Imidlertid fremmes genomisk integration af transgenet i værtsgenomet normalt ikke med plasmidvektorer, hvilket resulterer i et forbigående udtryk.

Transposoner er naturligt forekommende DNA-fragmenter, der ændrer deres position inden for genomet, en egenskab, der er blevet vedtaget til genterapi. På grund af en aktiv integrationsmekanisme giver transposonbaserede vektorsystemer mulighed for en kontinuerlig og konstant ekspression af det indsatte transgen. Tornerose (SB) transposon, rekonstitueret fra en gammel Tc1 / mariner-type transposon fundet i fisk33 og yderligere forbedret ved molekylær evolution, hvilket resulterede i den hyperaktive variant SB100X34, muliggjorde effektiv transponering i forskellige primære celler og blev brugt til fænotypisk korrektion i forskellige sygdomsmodeller35. På nuværende tidspunkt er der indledt 13 kliniske forsøg ved hjælp af SB-transposonsystemet. SB100X transposonsystemet består af to komponenter: transposonen, som omfatter genet af interesse flankeret af terminale inverterede gentagelser (TIR'er), og transposasen, som mobiliserer transposonen. Efter plasmid-DNA-levering til cellerne binder transposasen TIR'erne og katalyserer excisionen og integrationen af transposon i cellens genom.

Vi har udviklet en ikke-viral cellebaseret additiv terapi til behandling af neovaskulær AMD. Fremgangsmåden omfatter den elektroporationsbaserede indsættelse af PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiske information af transposase og PEDF tilvejebringes på separate plasmider, hvilket muliggør justering af det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforhold. Elektroporation udføres ved hjælp af et pipettebaseret kapillærtransfektionssystem, der er kendetegnet ved en maksimeret mellemrumsstørrelse mellem elektroderne, samtidig med at deres overfladeareal minimeres. Enheden viste sig at opnå fremragende transfekktionshastigheder i en bred vifte af pattedyrceller 39,40,41. Det lille elektrodeoverfladeareal giver et ensartet elektrisk felt og reducerer de forskellige bivirkninger af elektrolyse42.

Den anti-angiogene funktionalitet af PEDF udskilt af transinficerede pigmentepitelceller blev vist i forskellige in vitro-eksperimenter, der analyserede spiring, migration og apoptose af humane navlestrengsvenendotelceller43. Derudover viste transplantation af PEDF-transficerede celler i en kaninmodel af hornhinde neovaskularisering44 samt en rottemodel af CNV43,45,46 fald i neovaskularisering.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for stabil indsættelse af PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X-transposonsystemet ved hjælp af et kapillærtransfektionssystem. De transinficerede celler blev holdt i kultur i 21 dage og efterfølgende analyseret med hensyn til PEDF-genekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og med hensyn til PEDF-proteinsekretion ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA, figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige donorøjne blev indhentet fra Aachen Cornea Bank ved Afdelingen for Oftalmologi (Universitetshospitalet RWTH Aachen) efter at have indhentet informeret samtykke i overensstemmelse med Helsingforserklæringens protokoller. Procedurerne for indsamling og anvendelse af prøver fra mennesker er blevet godkendt af den institutionelle etiske komité.

1. Isolering af primære humane RPE-celler

  1. Læg sterilt beskyttelsestøj og handsker ud. Placer en steril drapering under en laminær strømning.
  2. Anbring sterile forberedelsesinstrumenter og andet nødvendigt sterilt udstyr under den laminære strømning.
  3. Optag modtagelsen af øjenkuglerne, begyndelsen af præparatet samt mulige abnormiteter. Registrer donorens alder, køn, dødsårsag og perioden mellem dødstidspunkt og øjenfjernelse.
  4. Placer øjenglobussen i en steril gasbindkomprimering og hold den i den ene hånd.
  5. Adskil det forreste segment fra det bageste segment med et omkredssnit ca. 3,5 mm bagud til limbus ved hjælp af en skalpel og en ekstra fin spids øjensaks.
  6. Når du har vippet det bageste segment nedad, skal du forsigtigt fjerne glaslegemet og nethinden ved hjælp af colibri tang.
  7. Omarranger diskret det kollapsede RPE/choroidea-kompleks ved hjælp af lige iristang, og hold det efterfølgende på plads med buede iristang.
  8. Fyld den bageste øjenkop med 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F12) suppleret med 10% føtalt bovin serum (FBS), 80 U / ml penicillin og 80 μg / ml streptomycin (Pen / Strep) og 2,5 μg / ml amphotericin B (AmphoB).
    BEMÆRK: I modsætning til isolering af primære RPE-celler fra svine- eller kvægøjne36,37, behøver den bageste øjenkop ikke at blive fyldt og inkuberet med trypsin.
  9. Høst RPE-cellerne ved forsigtigt at børste retinal pigmentepitel fra synsnerven mod limbus med en ildpoleret buet glas Pasteur-pipette, mens RPE / choroidea-komplekset fikseres ved limbus ved hjælp af colibri tang. Overfør cellesuspensionen til en petriskål.
  10. Gentag trin 1.8 og 1.9 og saml alle celler i petriskålen. Cellesuspensionen gensuspenderes forsigtigt ved at pipettere op og ned ved hjælp af en enkeltkanalpipette (100-1.000 μL).
  11. Frø RPE-cellesuspensionen af hver øjenklode i tre brønde i en 24-brønds cellekulturplade og fyld dem op til 1 ml med DMEM / F12 suppleret med FBS, Pen / Strep og AmphoB.
  12. RPE-cellekulturerne opretholdes ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2 , indtil sammenløbet er nået. Skift cellekulturmedium to gange om ugen.

2. Elektroporation af primære humane RPE-celler

  1. Fremstilling af SB100X transposase/PEDF transposon plasmidblandingen
    1. Rens SB100X transposase og PEDF transposon plasmid DNA ved hjælp af sædvanlige plasmidrensningssæt, som er identificeret som egnede til brug i applikationer såsom transfektion i henhold til producentens protokol.
    2. Plasmid-DNA-indholdet opgøres ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer, og de justeres til en koncentration på 250 ng/μL med 10 mM Tris-HCI (pH 8,5).
    3. Bland en portion 250 ng/μL SB100X transposaseplasmid-DNA (f.eks. 2,5 μL) med 16 portioner 250 ng/μL PEDF-transposonplasmid-DNA (f.eks. 40 μL). Resterende plasmidblanding kan opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Flere gentagne fryse- og optøningscyklusser af plasmidblandingen bør undgås.
    4. 2 μL af SB100X-transposase/PEDF-transposonplasmidblandingen, der indeholder 29,4 ng SB100X-transposaseplasmid og 470,6 ng PEDF-transposonplasmid, anbringes i et sterilt 1,5 ml safe-lock mikrocentrifugerør. Opbevares på is, indtil den er blandet med celler.
  2. Opsætning af kapillærtransfektionssystemet
    BEMÆRK: Elektroporation af primære humane RPE-celler er blevet udført via et kapillærtransfektionssystem ved hjælp af 10 μL-sættet i henhold til producentens protokol. Systemet omfatter transfektionsanordningen, transfektionspipetten og pipettestationen. Sættet indeholder 10 μL transfektionsspidser, bufferrør, elektrolytisk buffer E (buffer E) og resuspensionsbuffer R (buffer R).
    1. Tilslut pipettestationen til transfektionsanordningen.
    2. Fyld et bufferrør med 3 ml buffer E, og sæt det i pipettestationen, indtil der høres en kliklyd.
      BEMÆRK: Sørg for, at bufferrørets sideelektrode er forbundet med pipettestationens sidekuglestempel.
    3. Til elektroporation af primære humane RPE-celler indstilles følgende pulsbetingelser på transfektionsanordningen: 1.100 V (pulsspænding), 20 ms (pulsbredde), to impulser (pulsnummer).
  3. Fremstilling af de dyrkede primære humane RPE-celler
    1. Dokumentér form og morfologi af de primære RPE-cellekulturer via fasekontrastmikroskopi. Tag mikrografer med lav forstørrelse for at demonstrere væksten af RPE-cellerne til et sammenflydende og integreret monolag samt højere forstørrelsesmikrografer for at påpege RPE-cellernes typiske brostensmorfologi.
    2. Aspirer cellekulturmediet og vask cellerne to gange med 1 ml bufferet fosfatsaltvand (PBS, pH 7,4).
    3. Trypsiniser primære humane RPE-celler med 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 95% luft og 5% CO2 i 7-15 min (maks.). Kontroller celleløsningen mikroskopisk.
    4. Stop trypsinisering med 1 ml DMEM / F12 suppleret med FBS. Tag en 20 μL aliquot til celletælling ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifuger RPE-cellesuspensionen ved 106 x g i 10 min.
    5. Bland 20 μL aliquot med 20 μL trypanblå opløsning. Der pipetteres 10 μL i hver halvdel af hæmocytometeret, og cellerne tælles under et fasekontrastmikroskop.
    6. Efter centrifugering resuspenderes RPE-cellepelleten i 1 ml PBS.
    7. Tag 10.000-100.000 RPE-celler pr. transfektionsreaktion og centrifuger dem ved 106 x g i 10 min.
      BEMÆRK: Ved siden af transfektionsreaktionerne med elektrisk feltapplikation og tilsætning af plasmid-DNA inkluderer hver tilgang også to forskellige kontrolkulturer: (1) uden elektrisk feltapplikation og uden plasmid-DNA; (2) med elektrisk feltanvendelse, men uden plasmid-DNA.
    8. Cellepelleten gensuspenderes i 11 μL buffer R, og den kombineres med 2 μL af SB100X-transposase/PEDF-transposonplasmidblandingen (se trin 2.1.4).
      BEMÆRK: Efter resuspension i buffer R skal cellerne behandles inden for 15 minutter for at undgå en reduktion i cellens levedygtighed og transfektionseffektivitet.
    9. Indsæt transfektionspipettens hoved i 10 μL transfektionsspidsen, indtil klemmen helt opfanger stemplets monteringsstamme. Træk celle/plasmidopløsningen op i transfektionsspidsen.
      BEMÆRK: Undgå generering af luftbobler og deres aspiration i transfektionsspidsen.
    10. Giv 1 ml DMEM / F12 suppleret med FBS, men uden Pen / Strep og uden AmphoB, i det krævede antal brønde i en 24-brønds cellekulturplade.
  4. Elektroporation proces
    1. Transfektionspipetten indsættes i bufferrøret i pipettestationen (se trin 2.2.2), indtil der høres en kliklyd.
      BEMÆRK: Sørg for, at transfektionspipettens metalhoved er forbundet til kuglestemplet inde i pipettestationen og til bufferrøret.
    2. Tryk på Start på berøringsskærmen på transfektionsanordningen. Før den elektriske puls påføres, kontrollerer enheden automatisk, om bufferrøret og transfektionspipetten er korrekt indsat. Efter levering af de elektriske impulser vises Complete på berøringsskærmen.
    3. Transfektionspipetten fjernes forsigtigt fra pipettestationen, og de elektroporerede celler frigives straks fra 10 μL transfektionsspidsen ved at pipettere celle/plasmidopløsningen ind i de forberedte brønde på cellekulturpladen (se trin 2.3.10).
    4. Opretholde transinficerede RPE-cellekulturer ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2. Tilsæt pen/Strep og AmphoB med den første mediumudveksling 3 dage efter elektroporation.

3. Analyser af transinficerede primære humane RPE-celler

  1. Forberedelse af prøver
    1. Efter en dyrkningstid på 3 uger inkuberes i sidste ende RPE-cellekulturerne i et defineret volumen på 1,0 ml DMEM/F12 suppleret med FBS, Pen/Strep og AmphoB i en defineret tid på 24 timer.
    2. Tag cellekulturens supernatanter og opbevar dem ved -20 °C indtil yderligere nærtidsbehandling eller ved -80 °C til termisk ustabile prøver og langtidsopbevaring.
    3. Trypsiniser transinficerede RPE-cellekulturer med 0,5 ml 0,05% trypsin-EDTA ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 95% luft og 5% CO2 i 10 min.
    4. Stop trypsinisering med 1 ml DMEM / F12 suppleret med FBS. Der tages små alikvoter til celletælling ved hjælp af et hæmocytometer (se trin 2.3.5). Centrifuge RPE-cellesuspensionerne ved 106 x g i 10 min.
    5. Cellepillerne fra RPE opbevares ved -80 °C indtil videre behandling.
  2. Evaluering af PEDF-sekretion ved western blotting
    BEMÆRK: For en kvalitativ vurdering analyseres cellekultursupernatanter (se trin 3.1.2) via natriumdodecylsulfatpolyacrylmidgelelektroforese (SDS-PAGE) og efterfølgende western blotting. Afhængigt af PEDF transponplasmid-DNA, der anvendes, skal supernatanterne behandles forskelligt.
    1. Oprensning af his-mærkede PEDF-fusionsproteiner fra cellekultursupernatanter
      1. Der udtages 30 μL nikkel-nitrilotrieddikesyre (Ni-NTA) opslæmning pr. prøve ved hjælp af en skråskåret spids, og Ni-NTA-harpiksen pelleteres ved centrifugering (2.660 x g i 30 s).
      2. Ni-NTA-harpiksen gensuspenderes forsigtigt med 200 μL 1x inkubationsbuffer (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) og pelleteres ved centrifugering (2.660 x g i 30 s).
      3. Gentag det forrige trin.
      4. Ni-NTA-harpiksen gensuspenderes forsigtigt med 40 μL 4x inkubationsbuffer (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) pr. prøve.
      5. 900 μL cellekultursupernatant blandes med 260 μL 4x inkubationsbuffer og 55 μL forbehandlet Ni-NTA-gylle (se trin 3.2.1.4).
      6. Inkuber blandingen på en gyngeryster ved stuetemperatur i 60 min.
      7. Ni-NTA-harpiksen pelleteres ved centrifugering (2660 x g for 60 s).
      8. Ni-NTA-harpiksen gensuspenderes forsigtigt med 175 μL 1x inkubationsbuffer og pilleharpiks ved centrifugering (2.660 x g i 60 s).
      9. Gentag det forrige trin.
      10. Ni-NTA-harpiksen gensuspenderes forsigtigt med 30 μL elutionsbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) og inkuberes blandingen på en gyngeryster ved stuetemperatur i 20 min.
      11. Ni-NTA-harpiksen pelleteres ved centrifugering (2.660 x g i 30 s).
      12. Tag forsigtigt supernatanten og bland den med 2x SDS-prøvebuffer47.
      13. Blandingen opvarmes ved 95 °C i 5 minutter, og de Ni-NTA-rensede proteiner adskilles på en 10% SDS-polyacrylamidgel.
      14. Udfør western blotting ved hjælp af anti-Penta-His antistoffer (mus monoklonal, 1:500) og peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede anti-museantistoffer (kanin polyklonal, 1:1.000) som tidligere beskrevet36,37.
    2. Direkte analyse af ikke-mærkede PEDF-proteiner
      1. Tag 15 μL cellekultursupernatant og bland det med 2x SDS-prøvebuffer47.
      2. Blandingen opvarmes ved 95 °C i 5 minutter og proteinerne adskilles på en 10% SDS-polyacrylamid gel.
      3. Udfør western blotting ved hjælp af anti-humane PEDF-antistoffer (kaninpolyklonale, 1:4.000) og HRP-konjugerede antikaninantistoffer (gedepolyklonale, 1:2.000) som tidligere beskrevet38.
    3. Kvantificering af PEDF-sekretion ved ELISA
      1. Analyser cellekultursupernatanter (se trin 3.1.2) ved hjælp af et humant PEDF ELISA-sæt i henhold til producentens protokol.
      2. Forholdet mellem mængden af udskilt PEDF og det tidsrum og cellenummer, der er bestemt for hver transfektionsreaktion (se trin 3.1.4).
    4. Analyse af PEDF-genekspression i transinficerede RPE-celler
      1. Total RNA isoleres fra RPE-cellepellets (se trin 3.1.5) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens protokol.
      2. Kvantificer RNA-indhold ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
      3. Udfør omvendt transkription på 0,1 μg RNA ved hjælp af et omvendt transkriptionssystem i henhold til producentens protokol.
      4. Udfør qPCR i realtid som tidligere beskrevet38.
    5. Analyse af transgene indsættelsessteder i transinficerede RPE-celler
      1. Isoler genomisk DNA fra RPE-cellepillerne (se trin 3.1.5) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt sæt i henhold til producentens protokol.
      2. Kvantificer DNA-indhold ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
      3. Generer biblioteker på indsættelsesstedet ved hjælp af et beregningsassisteret hemi-specifikt PCR-skema som tidligere beskrevet38.
      4. Udfør beregningsanalyse som tidligere beskrevet38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrkning og elektroporation af primære humane RPE-celler
Vi har vist, at såning af et tilstrækkeligt antal primære RPE-celler af animalsk oprindelse muliggør dyrkning og vækst til et integreret monolag af pigmenterede, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til at danne tætte kryds, udvise fagocytisk aktivitet og udtrykke specifikke markørgener in vitro48 afspejler væsentlige opgaver i retinal pigmentepitel in vivo. Kultiverede primære RPE-celler isoleret fra humane donorøjne viste også den typiske brostensmorfologi, uanset donorens alder (65,3 ± 9,94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), isolationstiden efter slagtning (37,3 ± 17,0 timer, min: 16 h, max: 68 h, n = 12) og dyrkningstiden (27,6 ± 14,1 d, min: 13 d, maks.: 61 d, n = 12) (figur 2, venstre panel). Anvendelsen af kortvarige elektriske impulser på primære humane RPE-celler ved hjælp af kapillærtransfektionssystemet påvirkede ikke epitelmorfologien negativt (figur 2, højre panel). Test af forskellige elektriske parametre afslørede, at to impulser med en pulsspænding på 1.200 V og en pulsbredde på 20 ms gav gode og stabile transfektionseffektiviteter og det højeste antal levedygtige RPE-celler (upublicerede data).

SB100X-medieret indsættelse af PEDF-genet i dyrkede primære humane RPE-celler
Vi har testet plasmid-DNA-forhold af SB100X-til-PEDF-transposon, der spænder fra 250 ng (0,08 pmol) SB100X transposase plus 250 ng (0,052 pmol) PEDF-transposon til 12,2 ng (0,0039 pmol) SB100X transposase plus 487,8 ng (0,1 pmol) PEDF-transposon. Denne tilgang identificerede de to kombinationer 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposase plus 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF transposon og 23,8 ng (0,0076 pmol) plus 476,2 ng (0,099 pmol) som dem, der opnåede de bedste gennemførelseseffektiviteter37. I dyrkede primære humane RPE-celler muliggjorde levering af PEDF-transgenet ved hjælp af SB100X-transposonsystemet en kontinuerligt øget PEDF-genekspression og PEDF-proteinsekretion. For His-mærket rekombinant PEDF viste western blot-analyse af cellekulturmedier fra transinficerede primære humane RPE-celler PEDF-sekretion i konstante niveauer uden transgenhæmning i mere end 500 dage (figur 3A). For ikke-mærkede PEDF blev sekretion i transficerede primære humane RPE-celler også vist at være signifikant forøget sammenlignet med ikke-transinficerede celler38. En repræsentativ western blot-analyse af cellekulturmedier fra serielt udførte transfektioner viste tydeligt den universelt højere PEDF-sekretionshastighed 21 dage efter transfektion (figur 3B), og i en forfulgt kultur blev langvarig forhøjet PEDF-sekretion bevist i mindst 165 dage (figur 3C). ELISA-baseret kvantificering viste en 20-dobling af den samlede PEDF-sekretion i transinficerede primære humane RPE-celler sammenlignet med respektive ikke-transficerede kontrolceller (figur 3D). Denne stigning blev også bekræftet på genekspressionsniveau, hvor den samlede PEDF-ekspression blev hævet mere end 30 gange (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for elektroporationsbaseret indsættelse af PEDF-genet i primære humane RPE-celler ved hjælp af SB100X-transponsystemet. Skemaet beskriver det kronologiske forløb af (A) isoleringen af primære humane RPE-celler og deres efterfølgende dyrkning til et sammenflydende monolag, (B) de enkelte trin i elektroporationsprocessen, herunder oprensning af SB100X-transposase og PEDF-transposonplasmid-DNA, fremstilling af SB100X-transposase / PEDF transponplasmidblanding, opsætning af kapillærtransfektionssystemet, fremstilling af de dyrkede primære humane RPE-celler, elektroporation, såning og dyrkning af de transinficerede RPE-celler samt C) analyser af de transficerede primære humane RPE-celler, der omfatter fremstilling af cellekultursupernatanter og transficerede celleprøver evaluering og kvantificering af PEDF-sekretion og analyse af PEDF-genekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fasekontrastmikrografer af RPE-celler isoleret fra forskellige donorøjne. Kulturer af primære humane RPE-celler, der varierer i donoralder, post mortem-isolationstid og dyrkningstid forud for deres anvendelse til elektroporation (venstre panel) samt kulturer af transinficerede primære humane RPE-celler, udsat for de elektriske parametre 1.100 V (pulsspænding), 20 ms (pulsbredde) og 2 impulser (antal impulser) ved hjælp af kapillærtransfektionssystemet (højre panel ), udviste et sammenflydende integreret monolag af pigmenterede celler i et brostenslignende mønster (skalastænger: 500 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: PEDF-sekretion og PEDF-genekspression efter SB100X-medieret transfektion af primære humane RPE-celler. (A-C) Immunoblot-baserede analyser af PEDF-sekretionsstabilitet i dyrkede primære humane RPE-celler transficeret med en blanding af 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposaseplasmid plus 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF-transposonplasmid ved anvendelse af kapillærtransfektionssystemet. (A) RPE-celler fra en 26-årig donor (hun, post mortem-isolationstid: 26 timer, dyrkningstid før elektroporation: 14 dage) blev transficeret og opretholdt i kultur i mere end 500 dage. Hans-mærkede rekombinante PEDF (~ 48 kDa) blev oprenset fra cellekulturmedier på forskellige tidspunkter og evalueret ved western blotting ved hjælp af anti-Penta-His antistoffer. (B) For ikke-mærket rekombinant PEDF blev RPE-celler fra en 53-årig donor (kvindelig, isolationstid efter slagtning: 28 timer, dyrkningstid før transfektion: 19 dage) elektroporeret uden plasmid-DNA (kontrolkulturer #1 og #2) eller med tilsætning af plasmid-DNA (PEDF-transficerede cellekulturer #3 til #7) og opretholdt i kultur i 21 dage. Cellekultursupernatanter blev ikke oprenset, men direkte analyseret ved immunblotting ved anvendelse af anti-PEDF-antistoffer. Western blot-analyse af cellelysater viste niveauet af intracellulær PEDF i kontroller (kulturer # 1 og # 2) og transinficerede celler (kulturer # 3 og # 4). Belastning af lignende proteinmængder blev indikeret ved den lige tæthed af GAPDH-proteinbånd (~ 36 kDa). (C) Til analyse af langvarig PEDF-sekretion blev RPE-celler fra en 63-årig donor (mandlig, isolationstid: 26 timer, dyrkningstid før transfektion: 15 dage) elektroporeret uden plasmid-DNA (kontrolkulturer #1 og #2) eller med plasmid-DNA (PEDF-transficeret cellekultur #3) og opretholdt i kultur i mindst 165 dage. Cellekulturmedier blev ikke oprenset, men direkte analyseret ved immunblotting ved anvendelse af anti-PEDF-antistoffer. D) ELISA-baseret kvantificering af den samlede PEDF-sekretion i transinficerede primære humane RPE-celler (to prøver) og ikke-transficerede kontrolceller (fire prøver). Udskillelsen af de transinficerede celler blev sammenlignet med udskillelsen af de ikke-transficerede celler (*p = 0,0264, uparret t-test med Welchs korrektion). (E) Endogen og total (endogen plus rekombinant) PEDF-genekspression i transinficerede primære humane RPE-celler var relateret til ekspressionen i ikke-transficerede kontrolceller, hvis ekspression blev indstillet til 1 (stiplet linje). Data præsenteres som et box-and-whisker plot (whiskers: min til max). Total PEDF-genekspression blev sammenlignet med endogen PEDF-genekspression (ikke signifikant, uparret t-test med Welchs korrektion). Resultaterne for den ikke-mærkede rekombinante PEDF (B-E) repræsenterer to enheder af hele datasættet af primære RPE-celler fra op til 27 donorer transficeret med et SB100X-til-PEDF-transposonforhold på 29,4 ng (0,0094 pmol) plus 470,6 ng (0,098 pmol), som blev beskrevet af Thumann et al. 201738. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vores projekt sigter vi mod ikke-viral produktion af genetisk modificerede primære humane RPE-celler, der kontinuerligt overudtrykker og udskiller en effektiv faktor for at bruge de transinficerede celler som langsigtet terapeutisk til etablering og vedligeholdelse af et beskyttende miljø. Vi har etableret introduktionen af genet, der koder for PEDF, et allestedsnærværende udtrykt multifunktionelt protein med anti-angiogene og neurobeskyttende funktioner. Den her beskrevne protokol kan bruges til stabilt og reproducerbart at transficere primære humane RPE-celler ved hjælp af SB100X transposonsystemet. DNA-levering og introduktion i RPE-cellerne udføres med et pipettebaseret kapillærtransfektionssystem, der bruger specifikke spidser som elektroporationskammer i stedet for kuvetter.

Berigelsen af primære RPE-kulturer bestående af morfologisk veldifferentierede celler, der skal anvendes til efterfølgende transfektioner, påvirkes af flere faktorer relateret til den humane donor (alder og generel sundhedsstatus) samt modtagelsen af øjnene (post mortem-tid for celleisolering). Frisk isolerede og seedede primære RPE-celler har brug for mindst 2 uger til at udvikle et monolag af sekskantede celler. Som en generel regel viste cellekulturer, der havde brug for mere tid til at nå sammenløb før transfektion, også en decelereret overholdelse og spredning efter transfektion. Cellebinding og spredning hæmmes også af fri pigmentaflejring fra RPE-celler, der er beskadiget under celleisolering eller transfektionsprocessen.

SB-transposonsystemet er et meget anvendt genetisk værktøj, der muliggør effektiv og sikker levering af terapeutisk relevante nukleotidsekvenser i forskellige typer celler, der efterfølgende kan anvendes i genbaserede celleterapier. Især kombinerer dens forbedrede variant SB100X fordelene ved virale vektorer og ikke-viralt plasmid-DNA. Den integrerende virkningsmåde sikrer en stabil genomisk integration af ekspressionskassetten i værtscellens genom og muliggør en vedvarende ekspression af genet eller sekvensen af interesse. I modsætning til retrovirale vektorer, som fortrinsvis integreres i aktive transkriptionsenheder med høj risiko for potentiel mutagenese og onkogenese27,28, er den SB-baserede integrationsprofil tilfældig. Dette blev påvist i et stort antal undersøgelser med forskellige dyrkede og primære pattedyrceller, herunder humane celler 49,50,51,52, samt for primære rotter og humane RPE-celler 38,46. Desuden giver anvendelsen af SB-transponsystemet som plasmid-DNA reduceret immunogenicitet og letter fremstillingsprocessen.

Levering af den genetiske information af SB100X-transposasen og PEDF-transgenet på separate plasmider er et vigtigt aspekt, da det giver mulighed for en præcis justering af det optimale SB100X-til-PEDF-transposonforhold. Som tidligere beskrevet er SB-transponeringssystemet følsomt over for et overskud af transposaseekspression, hvilket resulterer i hæmning af transponeringsaktiviteten53. Vi observerede også denne effekt for ARPE-19-celler, en spontant udviklet cellelinje oprenset ved selektiv trypsinisering af en primær human RPE-kultur54 og primære RPE-celler. Her resulterede transfektion med SB100X-til-PEDF transposonforhold op til 55,6 ng (0,018 pmol) SB100X transposase plus 444,4 ng (0,093 pmol) PEDF-transposon i klart formindskede PEDF-sekretionshastigheder 37. Det ideelle transposase-til-transposon-forhold skal bestemmes for hvert nykonstrueret transposonplasmid.

Ikke-virale plasmidbaserede vektorer kan overføres via lipo-/polyplexer, nanopartikler, laser, ultralyd eller elektroporation. Vi har allerede vist, at lipofection-baseret transfektion af primære PE-celler ikke var effektiv og dermed skiftede til den elektroporationsbaserede genoverførsel36. Elektroporation defineres som anvendelse af et kortvarigt elektrisk felt på celler, hvilket resulterer i en stigning i membranens permeabilitet og dannelsen af vandige porer, hvorigennem plasmid-DNA kan komme ind i cellen. Generelt fyldes en blanding af celler, plasmid-DNA og ledende buffer i et specifikt elektroporationskammer mellem to elektroder, der er forbundet med elektroporationsanordningen, der genererer de elektriske impulser. I denne såkaldte bulkelektroporationsopsætning er et konventionelt kuvetteelektroporationskammer kendetegnet ved to parallelle pladeelektroder, hvis afstand er variabel (0,1-0,4 mm), afhængigt af celletypen og antallet af celler, der anvendes pr. Elektroporationsreaktion. På trods af god transfektionseffektivitet kan forskellige bivirkninger påvirke overlevelsen af de transinficerede celler negativt, f.eks. pH-ændringer, varmeudvikling, boblegenerering og turbulent flow. Kapillærtransfektionssystemet dæmper i det mindste de kuvettebaserede bivirkninger ved at have elektroder med et minimeret overfladeareal og en maksimeret mellemrumsstørrelse mellem dem42 samt ved at bruge specifikke resuspension og elektrolytiske buffere; deres kompositioner er dog ikke offentliggjort.

På trods af forbedringerne inden for bulk-elektroporationsopsætningen, som førte til en øget celleoverlevelse, er irreversibel skade på en vis procentdel af celler uundgåelig. Desuden er en præcis kontrol af mængden af plasmid integreret i cellerne ikke mulig. Den nyere udvikling af miniaturiserede elektroporationssystemer har givet mulighed for yderligere forbedringer ved yderligere at reducere begrænsningerne forbundet med bulkelektroporation. Disse nye enheder er baseret på mikroelektroder, mikrofluidiske eller nanostrukturer. De tilbyder nye anvendelsesperspektiver inden for genterapi, regenerativ medicin og in situ intracellulær undersøgelse (gennemgået af Chang et al. og Shi et al.) 55,56.

Vi har demonstreret, at elektroporation, som oprindeligt blev udført ved hjælp af et kuvettebaseret system og efterfølgende etableret ved hjælp af et pipettebaseret kapillærsystem, er en egnet og effektiv metode til at transficere både pigmentepitelcellelinjen ARPE-19 såvel som primære PE-celler 36,37,38,57,58 . Afhængigt af den anvendte celletype er det vigtigt at definere passende elektroporationsprotokoller, der anvender parametre, der giver mulighed for både god transfektionseffektivitet og celleoverlevelse. Utilstrækkelige elektriske felter forhindrer cellerne i at blive beskadiget, men resulterer i lav transfektionseffektivitet. Med stigningen i elektrisk feltstyrke opnås forbedret transfektionseffektivitet. Imidlertid fører forhøjede elektriske parametre også til højere procentdele af døde celler på grund af irreversibel celleskade. For ARPE-19-cellelinjen blev det ved hjælp af kapillærtransfektionssystemet vist sig, at elektroporationsparametre på 1.350 V, 20 ms og 2 impulser resulterede i indledende transfektionseffektivitet på 100% 37. Anvendelsen af disse parametre til transfektion af primære RPE-celler resulterede også i god effektivitet, men også i et lavere antal dyrkede celler efter transfektion sammenlignet med elektroporationsparametre på 1.100 V, 20 ms og 2 impulser (data ikke vist). Derfor blev det besluttet at vælge de mildere elektroporationsparametre for at forhindre celleskader og acceptere mindre transinficerede celler.

Det overordnede mål med denne tilgang ligger i den kliniske anvendelse af PEDF-transficerede celler til behandling af patienter, der lider af neovaskulær AMD. Terapien omfatter stabil introduktion af PEDF-transgenet i autologe pigmentepitelceller ex vivo baseret på SB100X-transposonsystemet efterfulgt af transplantation af de transinficerede celler til patientens subretinale rum. Det er således vigtigt at sikre, at de PEDF-transficerede celler ikke transdifferentierer og ikke erhverver en fibroblastisk form og vækstadfærd. Det er også vigtigt at bevise, at de transinficerede celler giver mulighed for en vedvarende og konsekvent sekretion af PEDF. Desuden er det afgørende at kende den nøjagtige mængde PEDF, der udskilles af et bestemt antal celler i en bestemt periode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Zoltán Ivics og Zsuzsanna Izsvák er opfindere på flere patenter på SB transposon teknologi

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af EU's syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration, tilskudsaftale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák blev finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Institut for Oftalmologi, Universitetshospitalet RWTH Aachen) for fremragende teknisk support og Aachen Cornea Bank (Institut for Oftalmologi, Universitetshospital RWTH Aachen) for at give de menneskelige donorøjne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

Medicin udgave 168 aldersrelateret makuladegeneration AMD kapillær elektroporationssystem ikke-viral transfektion pigmentepitelafledt faktor PEDF primære pigmentepitelceller Tornerose transposon system SB
Elektroporationsbaseret genetisk modifikation af primære humane pigmentepitelceller ved hjælp af Sleeping Beauty Transposon-systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter