Summary
Vi har utviklet en protokoll for å transfektere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporering med genet som koder for pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Vellykket transfeksjon ble demonstrert ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
Abstract
Vårt stadig aldrende samfunn fører til en økende forekomst av nevrodegenerative sykdommer. Så langt er de patologiske mekanismene utilstrekkelig forstått, og hindrer dermed etableringen av definerte behandlinger. Cellebaserte additive genterapier for økt ekspresjon av en beskyttende faktor anses som et lovende alternativ for å medisinere nevrodegenerative sykdommer, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har utviklet en metode for stabilt uttrykk av genet som koder for pigmentepitel-avledet faktor (PEDF), som er karakterisert som et nevrobeskyttende og antiangiogent protein i nervesystemet, inn i genomet til primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler ble isolert fra menneskelige donorøyne og opprettholdt i kultur. Etter å ha nådd sammenløp ble 1 x 104 celler suspendert i 11 μL resuspenderingsbuffer og kombinert med 2 μL av en renset løsning inneholdende 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposon plasmid. Genmodifisering ble utført med et kapillær elektroporeringssystem ved bruk av følgende parametere: to pulser med en spenning på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transfiserte celler ble overført til kulturplater som inneholdt medium supplert med føtalt bovint serum; Antibiotika og antimykotika ble tilsatt ved første medium utveksling. Vellykket transfeksjon ble demonstrert i uavhengig utførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) viste økt ekspresjon av PEDF-transgenet . PEDF-sekresjonen var signifikant forhøyet og forble stabil, evaluert ved immunblotting, og kvantifisert ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). SB100X-mediert overføring tillot en stabil PEDF-genintegrasjon i genomet til PE-celler og sikret kontinuerlig sekresjon av PEDF , noe som er kritisk for utviklingen av en cellebasert gentilskuddsterapi for å behandle AMD eller andre retinale degenerative sykdommer. Videre indikerte analyse av integrasjonsprofilen til PEDF-transposonet til humane PE-celler en nesten tilfeldig genomisk fordeling.
Introduction
Avansert alder er beskrevet å være den viktigste risikoen for nevrodegenerative sykdommer. Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom som fører til alvorlig synstap hos pasienter eldre enn 60 år, tilhører de fire vanligste årsakene til blindhet og synshemming1 og forventes å øke til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunksjoner av retinalpigmentepitelet (RPE), et enkelt lag med tettpakkede celler som ligger mellom choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrar til patogenesen av AMD. RPE oppfyller flere oppgaver som er avgjørende for en normal retinal funksjon3 og utskiller en rekke vekstfaktorer og faktorer som er avgjørende for å opprettholde den strukturelle integriteten til netthinnen og choriocapillaris, og støtter dermed fotoreseptoroverlevelse og gir grunnlag for sirkulasjon og tilførsel av næringsstoffer.
I sunne øyne er pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ansvarlig for å balansere effekten av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og beskytter nevroner mot apoptose, forhindrer endotelcelleproliferasjon og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskjøvet VEGF-til-PEDEF-forhold er relatert til okulær neovaskularisering, som ble observert i dyremodeller4,5 samt i prøver av pasienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grunn av AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den forbedrede VEGF-konsentrasjonen er målet for dagens standardbehandling. Anti-VEGF-legemidlene bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos omtrent en tredjedel av CNV-pasientene eller rettere stabiliserer synet i 90% av tilfellene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injeksjonene bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, svekker pasientetterlevelsen og representerer en betydelig økonomisk byrde for helsevesenet15. Videre reagerer en viss prosentandel av pasientene (2% -20%) ikke eller reagerer bare dårlig på anti-VEGF-terapien16,17,18,19. Disse negative sammenhengene nødvendiggjør utvikling av alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilnærminger.
Genterapi har utviklet seg som lovende behandling for arvelige og ikke-arvelige sykdommer og har til hensikt å gjenopprette ikke-funksjonelle gensekvenser eller undertrykke funksjonsfeil. For polygene sykdommer, hvor identifisering og erstatning av årsaksfaktorene knapt er mulig, tar strategier sikte på kontinuerlig levering av en beskyttende faktor. Når det gjelder AMD, er det utviklet forskjellige additive terapier, for eksempel stabilt ekspresjon av endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten løselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1) 21,22, komplementregulerende proteinklynge av differensiering 59 (CD59) 23 eller PEDF 24,25 . Øyet, og spesielt netthinnen, er et utmerket mål for en genbasert medisinering på grunn av den lukkede strukturen, god tilgjengelighet, liten størrelse og immunprivilegi, noe som muliggjør en lokalisert levering av lave terapeutiske doser og gjør transplantasjoner mindre utsatt for avvisning. Videre muliggjør øyet ikke-invasiv overvåking, og netthinnen kan undersøkes ved hjelp av forskjellige bildebehandlingsteknikker.
Virale vektorer er, på grunn av deres høye transduksjonseffektivitet, det viktigste kjøretøyet for å levere terapeutiske gener til målceller. Avhengig av hvilken virusvektor som brukes, er det imidlertid beskrevet forskjellige bivirkninger, for eksempel immun- og inflammatoriske responser26, mutagene og onkogene effekter 27,28 eller spredning i andre vev29. Praktiske begrensninger inkluderer en begrenset emballasjestørrelse30, samt vanskeligheter og kostnader forbundet med produksjon av kliniske partier31,32. Disse ulempene har fremmet videreutvikling av ikke-virale, plasmidbaserte vektorer som overføres via lipo- / polyplexer, ultralyd eller elektroporering. Imidlertid blir genomisk integrasjon av transgenet i vertsgenomet vanligvis ikke fremmet med plasmidvektorer, noe som resulterer i et forbigående uttrykk.
Transposoner er naturlig forekommende DNA-fragmenter som endrer sin posisjon i genomet, en egenskap som er vedtatt for genterapi. På grunn av en aktiv integrasjonsmekanisme tillater transposonbaserte vektorsystemer et kontinuerlig og konstant uttrykk for det innsatte transgenet. Tornerosetransposonen, rekonstituert fra en gammel Tc1/mariner-type transposon funnet i fisk 33 og ytterligere forbedret ved molekylær evolusjon som resulterte i den hyperaktive varianten SB100X34, muliggjorde effektiv transposisjon i forskjellige primærceller og ble brukt til fenotypisk korreksjon i forskjellige sykdomsmodeller 35. For tiden er 13 kliniske studier initiert ved bruk av SB transposon-systemet. SB100X transposon-systemet består av to komponenter: transposonet, som består av genet av interesse flankert av terminale inverterte repetisjoner (TIR), og transposasen, som mobiliserer transposonet. Etter plasmid-DNA-levering til cellene binder transposasen TIR-ene og katalyserer eksisjonen og integrasjonen av transposonet i cellens genom.
Vi har utviklet en ikke-viral cellebasert additiv terapi for behandling av neovaskulær AMD. Tilnærmingen omfatter elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av SB100X transposonsystemet36,37,38. Den genetiske informasjonen til transposasen og PEDF er gitt på separate plasmider, og muliggjør dermed justering av det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforholdet. Elektroporering utføres ved hjelp av et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem som er preget av en maksimert gapstørrelse mellom elektrodene samtidig som overflatearealet minimeres. Enheten ble vist å oppnå gode transfeksjonshastigheter i et bredt spekter av pattedyrceller 39,40,41. Den lille elektrodeoverflaten gir et jevnt elektrisk felt og reduserer de ulike bivirkningene av elektrolyse42.
Den anti-angiogene funksjonaliteten til PEDF utskilt av transfekterte pigmentepitelceller ble vist i forskjellige in vitro-eksperimenter som analyserte spiring, migrasjon og apoptose av humane navlestrengendotelceller43. I tillegg viste transplantasjon av PEDF-transfekterte celler i en kaninmodell av hornhinnen neovaskularisering44 samt en rottemodell av CNV43,45,46 nedgang i neovaskularisering.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for stabil innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X transposon-systemet ved hjelp av et kapillærtransfeksjonssystem. De transfiserte cellene ble holdt i kultur i 21 dager og deretter analysert i form av PEDF-genuttrykk ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og i form av PEDF-proteinsekresjon ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA, figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Donorøyne hos mennesker ble innhentet fra Aachen Cornea Bank ved Øyeavdelingen (Universitetssykehuset RWTH Aachen) etter å ha innhentet informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonens protokoller. Prosedyrer for innsamling og bruk av prøver fra mennesker er godkjent av institusjonens etiske komité.
1. Isolering av primære humane RPE-celler
- Legg ut sterile verneklær og hansker. Plasser en steril drapering under en laminær strøm.
- Plasser sterile forberedelsesinstrumenter og annet nødvendig sterilt utstyr under den laminære strømmen.
- Registrer mottak av øyekulene, begynnelsen av preparatet samt mulige abnormiteter. Registrer donorens alder, kjønn, dødsårsak og perioden mellom dødstidspunkt og øyefjerning.
- Plasser øyekulen i en steril gasbindkompress og hold den i en hånd.
- Skill det fremre segmentet fra det bakre segmentet med et omkretskutt ca. 3,5 mm bakre til limbus ved hjelp av en skalpell og en ekstra fin spiss øyesaks.
- Etter å ha vippet det bakre segmentet nedover, fjern forsiktig glasslegemet og netthinnen ved hjelp av colibri tang.
- Diskret omorganisere det kollapsede RPE / choroidea-komplekset ved hjelp av rette iris-tang og hold det deretter på plass med buede iris-tang.
- Fyll den bakre øyekoppen med 1 ml Dulbeccos Modified Eagle's Medium / Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM / F12) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 80 U / ml penicillin og 80 μg / ml streptomycin (Pen / Strep) og 2,5 μg / ml amfotericin B (AmphoB).
MERK: I motsetning til isoleringen av primære RPE-celler fra gris- eller storfeøyne36,37, trenger ikke den bakre øyekoppen å fylles og inkuberes med trypsin. - Høst RPE-cellene ved forsiktig å børste retinalpigmentepitelet fra optisk nerve mot limbus med en brannpolert buet glasspasteurpipette, mens du fikser RPE / choroidea-komplekset ved limbus ved hjelp av colibri tang. Overfør cellesuspensjonen til en petriskål.
- Gjenta trinnene 1.8 og 1.9 og samle alle cellene i petriskålen. Resuspend cellesuspensjonen forsiktig ved å pipettere opp og ned ved hjelp av en enkeltkanals pipette (100-1000 μL).
- Frø RPE-cellesuspensjonen av hver øyekule i tre brønner med en 24-brønns cellekulturplate og fyll dem opp til 1 ml med DMEM / F12 supplert med FBS, Pen / Strep og AmphoB.
- Oppretthold RPE-cellekulturene ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2 til samløpet er nådd. Bytt cellekulturmedium to ganger i uken.
2. Elektroporering av primære humane RPE-celler
- Fremstilling av SB100X transposase / PEDF transposon plasmidblanding
- Rens SB100X-transposasen og PEDF-transposonplasmid-DNA ved hjelp av vanlige plasmidrensingssett, som er identifisert for å være egnet for bruk i applikasjoner som transfeksjon, i henhold til produsentens protokoll.
- Kvantifiser plasmid-DNA-innholdet ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer og juster dem til en konsentrasjon på 250 ng / μL med 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
- Bland en porsjon 250 ng / μL SB100X transposase plasmid DNA (f.eks. 2,5 μL) med 16 porsjoner 250 ng / μL PEDF transposon plasmid DNA (f.eks. 40 μL). Resterende plasmidblanding kan lagres ved -20 °C.
MERK: Flere gjentatte fryse- og tinesykluser av plasmidblandingen bør unngås. - Plasser 2 μL av SB100X transposase / PEDF transposon plasmidblanding, som inneholder 29,4 ng SB100X transposase plasmid og 470,6 ng PEDF transposon plasmid, i et sterilt 1,5 ml safe-lock mikrocentrifugerør. Hold på is til blandet med celler.
- Oppsett av kapillærtransfeksjonssystemet
MERK: Elektroporering av primære humane RPE-celler har blitt utført via et kapillært transfeksjonssystem ved bruk av 10 μL-settet i henhold til produsentens protokoll. Systemet består av transfeksjonsanordningen, transfeksjonspipetten og pipettestasjonen. Settet inneholder 10 μL transfeksjonsspisser, bufferrør, elektrolytisk buffer E (buffer E) og resuspenderingsbuffer R (buffer R).- Koble pipettestasjonen til transfeksjonsenheten.
- Fyll et bufferrør med 3 ml buffer E og sett det inn i pipettestasjonen til en klikkelyd høres.
MERK: Forsikre deg om at sideelektroden til bufferrøret er koblet til sidekulestemplet på pipettestasjonen. - For elektroporering av primære humane RPE-celler, sett følgende pulsforhold på transfeksjonsanordningen: 1,100 V (pulsspenning), 20 ms (pulsbredde), to pulser (pulsnummer).
- Fremstilling av de kultiverte primære humane RPE-cellene
- Dokumentere form og morfologi av de primære RPE-cellekulturene via fasekontrastmikroskopi. Ta mikrografer med lav forstørrelse for å demonstrere veksten av RPE-cellene til et sammenflytende og integrert monolag, samt mikrografer med høyere forstørrelse for å påpeke den typiske brosteinsmorfologien til RPE-cellene.
- Aspirer cellekulturmediet og vask cellene to ganger med 1 ml bufret fosfatsaltvann (PBS, pH 7,4).
- Trypsiniser primære humane RPE-celler med 0,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2 i 7-15 minutter (maksimum). Kontroller celleløsningen mikroskopisk.
- Stopp trypsinisering med 1 ml DMEM / F12 supplert med FBS. Ta en 20 μL aliquot for celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuge RPE-cellesuspensjonen ved 106 x g i 10 minutter.
- Bland 20 μL aliquot med 20 μL trypan blå løsning. Pipette 10 μL i hver halvdel av hemocytometeret og telle cellene under et fasekontrastmikroskop.
- Etter sentrifugering, resuspend RPE-cellepelleten i 1 ml PBS.
- Ta 10.000-100.000 RPE-celler per transfeksjonsreaksjon og sentrifuger dem ved 106 x g i 10 minutter.
MERK: Ved siden av transfeksjonsreaksjonene med elektrisk feltapplikasjon og tilsetning av plasmid-DNA, inkluderer hver tilnærming også to forskjellige kontrollkulturer: (1) uten elektrisk feltapplikasjon og uten plasmid-DNA; (2) med elektrisk feltapplikasjon, men uten plasmid-DNA. - Resuspend cellepelleten i 11 μL buffer R og kombiner den med 2 μL av SB100X transposase / PEDF transposon plasmidblanding (se trinn 2.1.4).
MERK: Etter resuspendering i buffer R må cellene behandles innen 15 minutter for å unngå reduksjon i cellens levedyktighet og transfeksjonseffektivitet. - Sett hodet på transfeksjonspipetten inn i 10 μL transfeksjonsspissen til klemmen helt plukker opp monteringsstammen til stempelet. Trekk opp celle-/plasmidoppløsningen i transfeksjonsspissen.
MERK: Unngå generering av luftbobler og deres aspirasjon inn i transfeksjonsspissen. - Gi 1 ml DMEM / F12 supplert med FBS, men uten Pen / Strep og uten AmphoB, i det nødvendige antall brønner på en 24-brønns cellekulturplate.
- Elektroporering prosess
- Sett transfeksjonspipetten inn i bufferrøret som er plassert i pipettestasjonen (se trinn 2.2.2) til en klikklyd høres.
MERK: Forsikre deg om at metallhodet til transfeksjonspipetten er koblet til kulestemplet inne i pipettestasjonen og til bufferrøret. - Trykk på Start på berøringsskjermen til transfeksjonsenheten. Før påføring av den elektriske pulsen, kontrollerer enheten automatisk om bufferrøret og transfeksjonspipetten er riktig satt inn. Etter levering av de elektriske pulsene vises Komplett på berøringsskjermen.
- Fjern transfeksjonspipetten forsiktig fra pipettestasjonen og slipp umiddelbart de elektroporerte cellene fra 10 μL-transfeksjonsspissen ved å pipettere celle-/plasmidoppløsningen inn i de forberedte brønnene på cellekulturplaten (se trinn 2.3.10).
- Oppretthold transfiserte RPE-cellekulturer ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2. Tilsett Pen/Strep og AmphoB med første mediumbytte 3 dager etter elektroporering.
- Sett transfeksjonspipetten inn i bufferrøret som er plassert i pipettestasjonen (se trinn 2.2.2) til en klikklyd høres.
3. Analyser av transfiserte primære humane RPE-celler
- Forberedelse av prøver
- Etter en dyrkingstid på 3 uker, inkuberer til slutt RPE-cellekulturene i et definert volum på 1,0 ml DMEM / F12 supplert med FBS, Pen / Strep og AmphoB i en definert tid på 24 timer.
- Ta supernatantene i cellekulturen og oppbevar dem ved -20 °C til videre nærtidsbehandling eller ved -80 °C for termisk ustabile prøver og langtidslagring.
- Trypsiniserer transfiserte RPE-cellekulturer med 0,5 ml 0,05 % trypsin-EDTA ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2 i 10 minutter.
- Stopp trypsinisering med 1 ml DMEM / F12 supplert med FBS. Ta små aliquots for celletelling ved hjelp av et hemocytometer (se trinn 2.3.5). Sentrifuge RPE-cellesuspensjonene ved 106 x g i 10 minutter.
- Oppbevar RPE-cellepellets ved -80 ° C til videre behandling.
- Evaluering av PEDF-sekresjon ved western blotting
MERK: For en kvalitativ vurdering analyseres cellekultursupernatanter (se trinn 3.1.2) via natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og påfølgende vestlig blotting. Avhengig av PEDF transposon plasmid DNA brukt, må supernatantene behandles annerledes.- Rensing av His-merkede PEDF-fusjonsproteiner fra cellekultur-supernatanter
- Ta 30 μL nikkel-nitrilotrieddiksyre (Ni-NTA) oppslemming per prøve ved hjelp av en skråskåret spiss og pellet Ni-NTA-harpiksen ved sentrifugering (2,660 x g i 30 s).
- Resuspend Ni-NTA-harpiksen forsiktig med 200 μL 1x inkubasjonsbuffer (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0) og pellet den ved sentrifugering (2,660 x g i 30 s).
- Gjenta forrige trinn.
- Resuspender Ni-NTA-harpiksen forsiktig med 40 μL 4x inkubasjonsbuffer (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8,0) per prøve.
- Bland 900 μL cellekultursupernatant med 260 μL 4x inkubasjonsbuffer og 55 μL forbehandlet Ni-NTA-oppslemming (se trinn 3.2.1.4).
- Inkuber blandingen på en gyngende shaker ved romtemperatur i 60 minutter.
- Pellet Ni-NTA-harpiksen ved sentrifugering (2660 x g for 60 s).
- Resuspender Ni-NTA-harpiksen forsiktig med 175 μL 1x inkubasjonsbuffer og pelletsharpiks ved sentrifugering (2,660 x g for 60 s).
- Gjenta forrige trinn.
- Resuspender Ni-NTA-harpiksen forsiktig med 30 μL elueringsbuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0) og inkuber blandingen på en gyngende shaker ved romtemperatur i 20 minutter.
- Pellet Ni-NTA-harpiksen ved sentrifugering (2,660 x g for 30 s).
- Ta supernatanten forsiktig og bland den med 2x SDS-prøvebuffer47.
- Varm blandingen ved 95 °C i 5 minutter og separer de Ni-NTA-rensede proteinene på en 10% SDS-polyakrylamidgel.
- Utfør western blotting ved hjelp av anti-Penta-Hans antistoffer (mus monoklonal, 1:500) og pepperrot peroksidase (HRP)-konjugerte anti-mus antistoffer (kanin polyklonal, 1:1,000) som tidligere beskrevet36,37.
- Direkte analyse av ikke-merkede PEDF-proteiner
- Ta 15 μL cellekultur supernatant og bland den med 2x SDS prøvebuffer47.
- Varm blandingen ved 95 °C i 5 minutter og separer proteinene på en 10% SDS-polyakrylamidgel.
- Utføre western blotting ved hjelp av anti-human PEDF antistoffer (kanin polyklonal, 1:4,000) og HRP-konjugerte anti-kanin antistoffer (geit polyklonal, 1:2,000) som tidligere beskrevet38.
- Kvantifisering av PEDF-sekresjon av ELISA
- Analyser supernatanter for cellekultur (se trinn 3.1.2) ved hjelp av et humant PEDF ELISA-sett i henhold til produsentens protokoll.
- Relatere mengden utskilt PEDF til tiden og cellenummeret som er bestemt for hver transfeksjonsreaksjon (se trinn 3.1.4).
- Analyse av PEDF-genuttrykk i transfiserte RPE-celler
- Isoler totalt RNA fra RPE-cellepellets (se trinn 3.1.5) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens protokoll.
- Kvantifiser RNA-innhold ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer.
- Utfør revers transkripsjon på 0,1 μg RNA ved hjelp av et revers transkripsjonssystem i henhold til produsentens protokoll.
- Utfør sanntids qPCR som tidligere beskrevet38.
- Analyse av transgene innsettingssteder i transfiserte RPE-celler
- Isoler genomisk DNA fra RPE-cellepellets (se trinn 3.1.5) ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens protokoll.
- Kvantifiser DNA-innhold ved hjelp av et mikrovolumspektrofotometer.
- Generer innsettingsstedsbiblioteker ved hjelp av et beregningsassistert hemi-spesifikt PCR-skjema som tidligere beskrevet38.
- Utfør beregningsanalyse som tidligere beskrevet38.
- Rensing av His-merkede PEDF-fusjonsproteiner fra cellekultur-supernatanter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrking og elektroporering av primære humane RPE-celler
Vi har vist at såing av et tilstrekkelig antall primære RPE-celler av animalsk opprinnelse muliggjør dyrking og vekst til et integrert monolag av pigmenterte, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til å danne tette kryss, å utvise fagocytisk aktivitet og å uttrykke spesifikke markørgener in vitro48 gjenspeiler betydelige oppgaver i retinalpigmentepitelet in vivo. Kultiverte primære RPE-celler isolert fra menneskelige donorøyne viste også den typiske brosteinsmorfologien, uavhengig av donorens alder (65,3 ± 9,94 a, min: 49 a, maks: 83 a, n = 12), isolasjonstiden etter døden (37,3 ± 17,0 timer, min: 16 timer, maks: 68 timer, n = 12) og dyrkingstiden (27,6 ± 14,1 d, min: 13 d, maks: 61 d, n = 12) (figur 2, venstre panel). Anvendelsen av kortsiktige elektriske pulser på primære humane RPE-celler ved bruk av kapillærtransfeksjonssystemet påvirket ikke epitelmorfologien negativt (figur 2, høyre panel). Testing av ulike elektriske parametere viste at to pulser med en pulsspenning på 1,200 V og en pulsbredde på 20 ms ga god og stabil transfeksjonseffektivitet og det høyeste antallet levedyktige RPE-celler (upubliserte data).
SB100X-mediert innsetting av PEDF-genet i dyrkede primære humane RPE-celler
Vi har testet plasmid DNA-forhold mellom SB100X-til-PEDF transposon fra 250 ng (0,08 pmol) SB100X transposase pluss 250 ng (0,052 pmol) PEDF transposon til 12,2 ng (0,0039 pmol) SB100X transposase pluss 487,8 ng (0,1 pmol) PEDF transposon. Denne tilnærmingen identifiserte de to kombinasjonene 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposase pluss 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF transposon og 23,8 ng (0,0076 pmol) pluss 476,2 ng (0,099 pmol) som de som oppnådde best transposisjonseffektivitet37. I kultiverte primære humane RPE-celler tillot levering av PEDF-transgenet ved bruk av SB100X transposon-systemet et kontinuerlig økt PEDF-genuttrykk og PEDF-proteinsekresjon. For His-tagged rekombinant PEDF viste western blot-analyse av cellekulturmedier fra transfekterte primære humane RPE-celler PEDF-sekresjon i konstante nivåer uten transgen silencing i mer enn 500 dager (figur 3A). For ikke-merket PEDF ble sekresjon i transfiserte primære humane RPE-celler også vist å være signifikant økt sammenlignet med ikke-transfekterte celler38. En representativ western blot-analyse av cellekulturmedier fra serielt utførte transfeksjoner indikerte tydelig den universelt høyere PEDF-sekresjonshastigheten 21 dager etter transfeksjon (figur 3B), og i en forfulgt kultur ble langtidsforhøyet PEDF-sekresjon påvist i minst 165 dager (figur 3C). ELISA-basert kvantifisering viste en 20 ganger økning av total PEDF-sekresjon i transfiserte primære humane RPE-celler sammenlignet med respektive ikke-transfiserte kontrollceller (figur 3D). Denne økningen ble også bekreftet på genuttrykksnivå, hvor det totale PEDF-uttrykket ble hevet mer enn 30 ganger (figur 3E).
Figur 1: Arbeidsflyt for elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler ved hjelp av SB100X transposon-systemet. Skjemaet beskriver det kronologiske løpet av (A) isoleringen av primære humane RPE-celler og deres påfølgende dyrking til et konfluent monolag, (B) enkelttrinnene i elektroporeringsprosessen, inkludert rensing av SB100X-transposasen og PEDF-transposonplasmid-DNA, fremstillingen av SB100X-transposase / PEDF transposon plasmidblanding, oppsett av kapillærtransfeksjonssystemet, fremstilling av dyrkede primære humane RPE-celler, elektroporering, såing og dyrking av transfiserte RPE-celler, samt (C) analysene av de transfekterte primære humane RPE-cellene, som omfatter fremstilling av cellekulturens supernatanter og transfiserte celleprøver, evaluering og kvantifisering av PEDF-sekresjon, og analyse av PEDF-genuttrykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fasekontrastmikrografer av RPE-celler isolert fra forskjellige donorøyne. Kulturer av primære humane RPE-celler, forskjellig i donoralder, isolasjonstid etter død og dyrkingstid før deres anvendelse for elektroporering (venstre panel), samt kulturer av transfiserte primære humane RPE-celler, utsatt for de elektriske parametrene 1,100 V (pulsspenning), 20 ms (pulsbredde) og 2 pulser (antall pulser) ved bruk av kapillærtransfeksjonssystemet (høyre panel ), utstilt et konfluent integrert monolag av pigmenterte celler i et brosteinslignende mønster (skala barer: 500 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PEDF-sekresjon og PEDF-genuttrykk etter SB100X-mediert transfeksjon av primære humane RPE-celler. (A-C) Immunblotbaserte analyser av PEDF-sekresjonsstabilitet i dyrkede primære humane RPE-celler transfisert med en blanding av 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposase plasmid pluss 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF transposon plasmid ved bruk av kapillærtransfeksjonssystemet. (A) RPE-celler fra en 26 år gammel donor (kvinne, isolasjonstid etter død: 26 timer, dyrkingstid før elektroporering: 14 dager) ble transfisert og opprettholdt i kultur i mer enn 500 dager. Hans merkede rekombinante PEDF (~ 48 kDa) ble renset fra cellekulturmedier på forskjellige tidspunkter og evaluert ved vestlig blotting ved hjelp av anti-Penta-Him-antistoffer. (B) For ikke-merket rekombinant PEDF ble RPE-celler fra en 53 år gammel donor (kvinnelig, post mortem isolasjonstid: 28 timer, dyrkingstid før transfeksjon: 19 dager) elektroporert uten plasmid-DNA (kontrollkulturer #1 og #2) eller med tilsetning av plasmid-DNA (PEDF-transfiserte cellekulturer #3 til #7) og opprettholdt i kultur i 21 dager. Cellekultur-supernatanter ble ikke renset, men analysert direkte ved immunblotting ved bruk av anti-PEDF-antistoffer. Western blot-analyse av cellelysater viste nivået av intracellulær PEDF i kontroller (kulturer #1 og #2) og transfiserte celler (kulturer #3 og #4). Lasting av lignende proteinmengder ble indikert med lik tetthet av GAPDH-proteinbånd (~ 36 kDa). (C) For analyse av langvarig PEDF-sekresjon ble RPE-celler fra en 63 år gammel donor (mannlig, post-mortem-isolasjonstid: 26 timer, dyrkingstid før transfeksjon: 15 dager) elektroporert uten plasmid-DNA (kontrollkulturer #1 og #2) eller med plasmid-DNA (PEDF-transfisert cellekultur #3) og opprettholdt i kultur i minst 165 dager. Cellekulturmedier ble ikke renset, men analysert direkte ved immunoblotting ved hjelp av anti-PEDF-antistoffer. (D) ELISA-basert kvantifisering av total PEDF-sekresjon i transfiserte primære humane RPE-celler (to prøver) og ikke-transfiserte kontrollceller (fire prøver). Sekresjon av de transfiserte cellene ble sammenlignet med sekresjonen av de ikke-transfiserte cellene (*p = 0,0264, uparret t-test med Welchs korreksjon). (E) Endogent og totalt (endogent pluss rekombinant) PEDF-genuttrykk i transfekterte primære humane RPE-celler var relatert til uttrykket i ikke-transfekterte kontrollceller, hvis uttrykk ble satt til 1 (stiplet linje). Data presenteres som et boks-og-whisker-plott (whiskers: min til max). Totalt PEDF-genuttrykk ble sammenlignet med endogent PEDF-genuttrykk (ikke signifikant, uparret t-test med Welchs korreksjon). Resultatene for den ikke-merkede rekombinante PEDF (B-E) representerer to enheter av hele datasettet av primære RPE-celler fra opptil 27 givere transfisert med et SB100X-til-PEDF transposonforhold på 29,4 ng (0,0094 pmol) pluss 470,6 ng (0,098 pmol), som ble beskrevet av Thumann et al. 2017 38. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vårt prosjekt tar vi sikte på ikke-viral produksjon av genmodifiserte primære humane RPE-celler som kontinuerlig overuttrykker og utskiller en effektiv faktor for å bruke de transfiserte cellene som langsiktig terapeutisk for etablering og vedlikehold av et beskyttende miljø. Vi har etablert introduksjonen av genet som koder for PEDF, et allestedsnærværende uttrykt multifunksjonelt protein med antiangiogene og nevrobeskyttende funksjoner. Protokollen beskrevet her kan brukes til stabilt og reproduserbart transfekt primære humane RPE-celler ved hjelp av SB100X transposon-systemet. DNA-levering og innføring i RPE-cellene utføres med et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem, som bruker spesifikke spisser som elektroporeringskammer i stedet for kyvetter.
Anrikningen av primære RPE-kulturer bestående av morfologisk godt differensierte celler som skal brukes til påfølgende transfeksjoner, påvirkes av flere faktorer relatert til den menneskelige giveren (alder og generell helsestatus) samt mottak av øynene (post mortem tid for celleisolasjon). Nyisolerte og seedede primære RPE-celler trenger minst 2 uker for å utvikle et monolag av sekskantede celler. Som en generell regel viste cellekulturer som trengte mer tid for å nå sammenløp før transfeksjon også en redusert etterlevelse og spredning etter transfeksjon. Celletilslutning og spredning hindres også av fri pigmentdeponering fra RPE-celler som er skadet under celleisolasjon eller transfeksjonsprosessen.
SB transposon-systemet er et mye brukt genetisk verktøy som muliggjør effektiv og sikker levering av terapeutisk relevante nukleotidsekvenser i ulike typer celler som senere kan brukes i genbaserte celleterapier. Spesielt kombinerer den forbedrede varianten SB100X fordelene med virale vektorer og ikke-viralt plasmid-DNA. Den integrerende virkemåten sikrer en stabil genomisk integrasjon av ekspresjonskassetten i vertscellens genom og muliggjør et vedvarende uttrykk for genet eller sekvensen av interesse. I motsetning til retrovirale vektorer, som fortrinnsvis integreres i aktive transkripsjonsenheter med høy risiko for potensiell mutagenese og onkogenese27,28, er den SB-baserte integrasjonsprofilen tilfeldig. Dette ble demonstrert i et stort antall studier ved bruk av forskjellige dyrkede og primære pattedyrceller, inkludert humane celler 49,50,51,52, samt for primære rotte- og humane RPE-celler 38,46. Videre gir anvendelse av SB transposon-systemet som plasmid-DNA redusert immunogenitet og letter produksjonsprosessen.
Levering av den genetiske informasjonen til SB100X-transposasen og PEDF-transgenet på separate plasmider er et viktig aspekt, da det muliggjør en presis justering av det optimale SB100X-til-PEDF-transposonforholdet. Som beskrevet tidligere er SB transposon-systemet følsomt for et overskudd av transposaseuttrykk, noe som resulterer i inhibering av transposisjonsaktiviteten53. Vi observerte også denne effekten for ARPE-19-celler, en spontant utviklet cellelinje renset ved selektiv trypsinisering av en primær human RPE-kultur54 og primære RPE-celler. Her resulterte transfeksjon med SB100X-til-PEDF transposonforhold opp til 55,6 ng (0,018 pmol) SB100X transposase pluss 444,4 ng (0,093 pmol) PEDF-transposon i klart reduserte PEDF-sekresjonsrater 37. Det ideelle transposase-til-transposon-forholdet må bestemmes for hvert nykonstruert transposon-plasmid.
Ikke-virale plasmidbaserte vektorer kan overføres via lipo- / polyplexer, nanopartikler, laser, ultralyd eller elektroporering. Vi har allerede vist at lipofeksjonsbasert transfeksjon av primære PE-celler ikke var effektiv og dermed byttet til elektroporeringsbasert genoverføring36. Elektroporering er definert som anvendelse av et kortvarig elektrisk felt til celler, noe som resulterer i en økning av membranens permeabilitet og dannelsen av vandige porer, gjennom hvilke plasmid-DNA kan komme inn i cellen. Generelt fylles en blanding av celler, plasmid-DNA og ledende buffer i et spesifikt elektroporeringskammer mellom to elektroder, som er koblet til elektroporeringsanordningen som genererer de elektriske pulser. I dette såkalte bulkelektroporeringsoppsettet er et konvensjonelt kyvettelektroporeringskammer preget av to parallelle platetypeelektroder, hvis avstand er variabel (0, 1-0, 4 mm), avhengig av celletype og antall celler som brukes per elektroporeringsreaksjon. Til tross for god transfeksjonseffektivitet kan forskjellige bivirkninger påvirke overlevelsen til de transfiserte cellene negativt, for eksempel pH-endringer, varmeutvikling, boblegenerering og turbulent strømning. Kapillærtransfeksjonssystemet demper i det minste de kyvettebaserte bivirkningene ved å ha elektroder med et minimert overflateareal og en maksimert gapstørrelse mellom dem42 , samt ved å bruke spesifikke resuspension og elektrolytiske buffere; Imidlertid er deres sammensetninger ikke avslørt.
Til tross for forbedringene i bulkelektroporeringsoppsettet, som førte til økt celleoverlevelse, er irreversibel skade på en viss prosentandel av celler uunngåelig. Videre er en presis kontroll av mengden plasmid integrert i cellene ikke mulig. Den nyere utviklingen av miniatyriserte elektroporeringssystemer har gitt mulighet for ytterligere forbedringer ved ytterligere å redusere begrensningene forbundet med bulkelektroporering. Disse nye enhetene er basert på mikroelektroder, mikrofluidiske eller nanostrukturer. De tilbyr nye applikasjonsperspektiver innen genterapi, regenerativ medisin og in situ intracellulær undersøkelse (gjennomgått av Chang et al. og Shi et al.) 55,56.
Vi har vist at elektroporering, som opprinnelig ble utført ved hjelp av et kyvettebasert system og deretter etablert ved hjelp av et pipettebasert kapillærsystem, er en egnet og effektiv metode for å transfektere både pigmentepitelcellelinjen ARPE-19 og primære PE-celler 36,37,38,57,58 . Avhengig av celletypen som brukes, er det viktig å definere passende elektroporeringsprotokoller som bruker parametere som muliggjør både god transfeksjonseffektivitet og celleoverlevelse. Utilstrekkelige elektriske felt hindrer cellene i å skade, men resulterer i lav transfeksjonseffektivitet. Med økningen i elektrisk feltstyrke oppnås forbedret transfeksjonseffektivitet. Imidlertid fører forhøyede elektriske parametere også til høyere prosentandel av døde celler på grunn av irreversibel celleskade. For ARPE-19-cellelinjen, ved bruk av kapillærtransfeksjonssystemet, ble elektroporeringsparametere på 1,350 V, 20 ms og 2 pulser vist å resultere i innledende transfeksjonseffektivitet på 100%37. Anvendelsen av disse parametrene for transfeksjon av primære RPE-celler resulterte også i god effektivitet, men også i et lavere antall dyrkede celler etter transfeksjon sammenlignet med elektroporeringsparametere på 1,100 V, 20 ms og 2 pulser (data ikke vist). Derfor ble det besluttet å velge de mildere elektroporeringsparametrene for å forhindre celleskader og akseptere mindre transfekterte celler.
Det overordnede målet med denne tilnærmingen ligger i den kliniske anvendelsen av PEDF-transfiserte celler for behandling av pasienter som lider av neovaskulær AMD. Behandlingen omfatter stabil introduksjon av PEDF-transgenet til autologe pigmentepitelceller ex vivo basert på SB100X transposon-systemet, etterfulgt av transplantasjon av de transfiserte cellene til pasientens subretinale rom. Det er derfor viktig å sikre at de PEDF-transfiserte cellene ikke transdifferensierer og ikke får en fibroblastisk form og vekstadferd. Det er også viktig å bevise at de transfiserte cellene tillater en vedvarende og konsistent sekresjon av PEDF. Videre er det avgjørende å vite den nøyaktige mengden PEDF som utskilles av et bestemt antall celler i en bestemt tidsperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Zoltán Ivics og Zsuzsanna Izsvák er oppfinnere på flere patenter på SB transposon teknologi
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon, tilskuddsavtale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák ble finansiert av Det europeiske forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gjerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for utmerket teknisk støtte, og Aachen Cornea Bank (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for å gi den menneskelige donorøyne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
References
- James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
- Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
- Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
- Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
- Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
- Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
- Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
- Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
- Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
- Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
- Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
- Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
- Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
- Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
- Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
- Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
- Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
- Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
- Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
- Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
- Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
- van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
- Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
- May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
- Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
- Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
- Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
- Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Chang, L., et al.
- Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
