Vi præsenterer oplysninger om laboratorieprocedurer for stoffri in vitro-aktivering (IVA) af æggestokkenes follikler til patienter med svær ovariedysfunktion. Denne metode kan øge antallet af hentes oocytter pr æggestokke hyperstimulation og gavn fertilitet bevarelse for disse patienter.
Æggestokkene funktion gradvist falder under aldring og i nogle patofysilogiske tilstande, herunder karyotype abnormitet, autoimmune sygdomme, kemo-og stråling-behandlinger, samt æggestokkene operationer. Hos ugifte kvinder med svær ovarie dysfunktion, fertilitet bevarelse er vigtig for fremtidige graviditeter. Selv oocyt cryopreservation er en etableret metode til fertilitetsbevarelse, disse patienter kunne kun bevare et begrænset antal oocytter, selv efter æggestokkene hyperstimulation, hvilket fører til gentagne stimuleringer for at sikre tilstrækkelig oocytter til at garantere fremtidige graviditet. For at løse dette problem har vi for nylig udviklet en lægemiddelfri in vitro-aktiveringsprocedure (IVA), som gør det muligt for os at stimulere tidlige stadier af æggestokkenes follikler til at udvikle sig til den præantrale follikelfase. Disse præantral follikler kan reagere på den unikke protokol af gonadotropin stimulation, hvilket resulterer i øget antal hentede oocytter pr æggestokkene stimulation for kryopræservering. Den stoffri IVA bestod af den kirurgiske tilgang og æggestokkene stimulation. Vi fjernede en del af cortex fra en eller begge æggestokke fra patienter under laparoskopisk kirurgi. Æggestokkene kortikale væv blev skåret i små terninger for at forstyrre Hippo signalering vej og stimulere udviklingen af tidlige stadier follikler. Disse terninger blev podet ortotropisk i de resterende æggestokke samt under serosa af begge æggeledere. Vi har allerede offentliggjort den kirurgiske procedure for den stoffri IVA og protokollen for efterfølgende ovariestimulering, men heri præsenterer vi detaljerne i laboratoriemetoder, der kræves til lægemiddelfri IVA.
Æggestokkene funktion falder gradvist under aldring og nogle patofysilogiske tilstande, herunder karyotype abnormitet, autoimmune sygdomme, kemo-og stråling-behandlinger, og æggestokkene operationer. Fertilitetsbevarelse er en af de bedste muligheder for ugifte kvinder med svær ovarie dysfunktion for at bevare deres potentiale for fremtidig graviditet. For fertilitetsbevarelse er der i øjeblikket to metoder, der for det meste er tilgængelige inden for onco-fertilitet. Oocyte cryopreservation er en veletableret procedure for fertilitetsbevarelse , og mange vellykkede tilfælde er blevet rapporteret1,2. På den anden side blev der også etableret kryopræservering af æggestokkene til fertilitetsbevarelse hos kræftpatienter, men det er stadig en eksperimentel strategi3,4. I begge metoder er flere antal modne oocytter nødvendige for at graviditeten kan forekomme. Generelt patienter med for tidlig æggestokke utilstrækkelighed (POI), der bliver amenoré før 40 år, og midaldrende kvinder med lav æggestokkene reserve viste dårlig æggestokkene respons (POR) til æggestokkene stimulation for at give modne oocytter5,6,7. Desuden viste unge patienter med et lavt antal antral follikler også POR til æggestokkene stimulation7. Disse patienter har et meget begrænset antal hentes oocytter selv efter korrekt ovarie hyperstimulation, hvilket kræver flere dyre procedurer for at sikre et tilstrækkeligt antal oocytter til graviditet.
Oocyte donation efterfulgt af in vitro befrugtning (IVF) med mands sæd og embryo overførsel (ET) er den eneste mulighed for disse POI og POR patienter, der har svært ved at få deres egne oocytter8,9,10. Oocytdonation kompliceres dog af etiske spørgsmål samt autoimmune og graviditetskomplikationer11,12,13,14. For at løse disse problemer ønskes etablering af infertilitetsbehandling ved hjælp af patienternes egne oocytter. For POI-patienter har vi udviklet in vitro-aktiveringsmetoden (IVA) for at muliggøre vellykket follikelvækst og generering af modne oocytter, der fører en række graviditeter og leverancer15. I IVA, fragmenterede vi æggestokkene cortexes efter fjernelse af æggestokkene under laparoskopisk kirurgi og dyrkede dem i to dage for at aktivere follikler ved Akt-stimulerende medicin og derefter udføre heterotopisk podning tilbage i kunstige poser lavet under serosa af æggeledere under anden laparoskopisk kirurgi15. Denne procedure fremmet vækst af ur- og primærsække efter fragmentering af æggestokkene for at fremme Hippo signalering disruption16, efterfulgt af to dages kultur med Akt signalering stimulatorer17.
I modsætning til alvorlige POI tilfælde, POR patienter med nedsat æggestokkene reserve har flere sekundære follikler. Fordi Hippo signalering forstyrrelser alene er effektiv til at fremme sekundære follikel vækst16, vi for nylig demonstreret vellykkede graviditeter og leverancer til POR patienter ved hjælp af narkotika-fri IVA procedure, der involverer kortikale fragmentering og ortopisk podning uden behandling af Akt stimulerende lægemidler. Stoffri IVA stimulerer tidlige stadier af æggestokkene follikler til at udvikle sig til preantral follikel fase efter kun én operation og øget antallet af hentede oocytter til IVF-embryo overførsel15,18. Den stoffri IVA tilgang har flere fordele i forhold til vores oprindelige IVA med 1) undgå potentielle follikel tab under kultur, 2) minimere invasivitet og omkostninger ved den anden operation, 3) involverer kun kortsigtede post-kirurgi sengeleje og 4) potentiale spontan graviditet på grund af ortopisk podning. Vi har for nylig offentliggjort en videoartikel, der viser de kirurgiske procedurer for stoffri IVA19 og detaljerede protokoller for ovariestimulation efter operationen20. Her præsenterer vi detaljer om laboratoriemetoder, der kræves til lægemiddelfri IVA.
I dette manuskript viste vi en detaljeret laboratorieprotokol for stoffri IVA. Den stoffri IVA er en ny tilgang til infertilitet behandling for POR patient med faldende æggestokkene reserve til at fremme sekundære follikler vækst, hvilket resulterer i at give mere modne oocytter efter æggestokkene stimulation og stigende i vellykket graviditet20. Hos 15 POR-patienter med faldende æggestokkereservat opnåede denne tilgang en spontan graviditet, in vitro-befrugtning-embryooverførsel tillod fir…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto og Mayuko Wakatsuki for at støtte den stoffri IVA-procedure og prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) for kritisk læsning og redigering af manuskriptet. Vi takker også Rebecca Truman og Gregory Truman for at have indsat engelsk fortælling. Denne undersøgelse blev støttet af The Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) og Challenging Exploratory Research (18K19624).
4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |