Summary
Aqui, uma implantação ortotópica sinténica seguida de um procedimento de amputação do osteossarcoma com metástase pulmonar espontânea que pode ser usada para investigação pré-inlinética da biologia da metástase e desenvolvimento de novas terapêuticas é descrita.
Abstract
O avanço mais recente no tratamento do osteossarcoma (OS) ocorreu na década de 1980, quando a quimioterapia multi-agente mostrou melhorar a sobrevida geral em comparação apenas com a cirurgia. Para resolver esse problema, o objetivo do estudo é refinar um modelo menos conhecido de OS em ratos com uma abordagem cirúrgica histológica, de imagem, biológica, implantação e amputação abrangente que prolonga a sobrevivência. Utilizamos um imunocompetente, sprague-Dawley (SD), modelo de rato síngênico com linha celular UMR106 OS implantada (originária de um rato SD) com implantes de tumor tibial ortotópico em ratos machos e fêmeas de 3 semanas de idade para modelar o OS pediátrico. Descobrimos que os ratos desenvolvem tumores pulmonares primários e metastáticos reprodutíveis, e que as amputações de membros em 3 semanas após a implantação reduzem significativamente a incidência de metástase pulmonar e previnem mortes inesperadas. Histologicamente, as OSs primárias e metastáticas em ratos eram muito semelhantes aos humanos. Usando métodos imunohistoquímicos, o estudo mostra que os os ratos estão infiltrados com macrófagos e células T. Um levantamento de expressão proteica das células de OS revela que esses tumores expressam cineases familiares ErbB. Uma vez que essas quinases também são altamente expressas na maioria das OSs humanas, este modelo de rato poderia ser usado para testar inibidores da via ErbB para terapia.
Introduction
O osteossarcoma (OS) é o tumor ósseo primário mais comum em crianças, adolescentes e adultos jovens. O avanço mais recente no tratamento da OS ocorreu na década de 1980, quando a quimioterapia multi-agente mostrou-se para melhorar a sobrevida geral em comparação apenas com a cirurgia1. O SISTEMA OPERACIONAL desenvolve-se durante o rápido crescimento ósseo, tipicamente ocorrendo em ossos tubulares longos como fêmur, tíbia e úmero. Caracterizam-se por uma aparência osteolítica, osteoblástica ou mista com notável reação peristeal2. A quimioterapia e a ressecção cirúrgica podem melhorar o resultado para pacientes com sobrevida de 5 anos para 65% dos pacientes2,3. Infelizmente, pacientes com doença metastática de alto grau têm 20% de sobrevida. O OS invade regionalmente e metástase principalmente para os pulmões ou outros ossos e é mais prevalente em machos. A necessidade mais convincente para esses pacientes jovens é uma nova terapia que previne e elimina a viabilidade de metástases distantes.
Foram revisados modelos pré-clínicos de OS4,5,6,7 e poucos modelos imunocompetntes disponíveis utilizando amputação de os os ortotópicos. Em 2000, um modelo importante foi desenvolvido utilizando camundongos BALB/c com OS ortotópicos e amputação8. Comparado a este modelo de camundongo, o modelo de rato é baseado em animais geneticamente superados e 10 vezes maiores levando a algumas vantagens. O modelo UMR106 de rato foi desenvolvido a partir de um SO induzido de 32P em um rato Sprague Dawley (SD), que foi derivado em uma linhacelular 9. Em 2001, a implantação ortotópica de UMR106-01 foi descrita pela primeira vez em tíbias implantadas de camundongos atrímicos com desenvolvimento rápido e consistente do tumor primário e características radiológicas, histológicas em comum com o OS em humanos. As metástases pulmonares desenvolveram-se e dependiam da colocação ortotópica de UMR106 no microambiente ósseo10. Em 2009, Yu et al.11 estabeleceram um modelo de rato de fêmur ortotópico reprodutopico usando células UMR106 em ratos maiores do sexo masculino. As implantações tumorais bem sucedidas e a taxa de metástase pulmonar em ratos sem amputação foram semelhantes aos dados aqui apresentados. Neste estudo, foi realizada uma amputação adicional ao modelo de uso de ratos jovens, o que sugere que o tempo de remoção do tumor primário é crucial na modelagem da OS, especialmente relacionada à progressão metastática. Com este refinamento, amputação e imagem in vivo melhoram este modelo para estudos pré-clínicos para avaliação de novos medicamentos para OS.
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Protocol
Todos os procedimentos e experimentos envolvendo ratos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Johns Hopkins.
1. O protocolo de cultura celular DA linha celular OS de rato SD UMR-106
- Células de cultivo em DMEM, suplementadas com 10% (v/v) FBS, penicilina (10 U/mL)-estreptomicina (10 U/mL) a 37 °C na atmosfera umidificada de 5% de CO2. Realizar experimentos usando células com passagens de 2-812.
2. Injeção intratibial de protocolo de células do SISTEMA
NOTA: Ratos SD gestantes com acasalamento do tempo dão à luz na instalação animal e, com 3 semanas de idade, são usadas ninhadas (uma vez que a linha celular UMR 106 é síngênica para ratos SD, não é necessária irradiação).
- Indução
- Coloque o rato em uma câmara de indução de tamanho médio e induza a anestesia com isoflurane de 2%-3%. Monitore o animal continuamente para a profundidade da anestesia por reflexo para beliscar o dedo do dedo do sol, a taxa respiratória e o caráter.
- Insira o nariz no nariz. Proteja com fita adesiva, se necessário.
- Remova o cabelo da perna direita até o ventral e o abdômen inferior dorsal com cortadores ou use agente depilatório. Coloque o rato em uma posição supina.
- Esfregue a área cirúrgica asepticamente usando 70% de etanol e diluir acetato de clorexidina ou diluir betadina. Comece ao redor da área do joelho e esfregue em um movimento circular tanto proximally quanto distally. Repita este passo três vezes. Nenhuma cortina é usada para implantação de tumor.
- Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos do rato para evitar a dessecação da córnea causada pela anestesia. Coloque o rato em uma almofada de aquecimento de ajuste de fogo baixo. Certifique-se de que o rato tenha temperatura corporal normal (37 °C) e taxa respiratória normal.
- Cirurgia
- Ligue isoflurane a ~1,5%-2% (para manutenção). Certifique-se de que o animal está em um plano adequado de anestesia por falta de um reflexo de dedo do dedo do dedo do dedo. Caso não, aumente o percentual de isoflurane para 2,5%.
- Marque uma agulha estéril (aproximadamente 22 G) a 10 mm da ponta para orientação de profundidade para inserir.
- Insira a agulha 10 mm para baixo na diáfise da tíbia, entrando no joelho dobrado no meio do planalto tibial, estendendo a agulha através da metafise na difise usando um movimento leve como uma broca para fazer uma abertura. Remova a agulha.
- Carregue a suspensão da célula na seringa Hamilton diretamente antes da injeção na tíbia. Para isso, misture suavemente as células antes de desenhar em seringa, pois a gravidade faz com que as células se instalem no fundo do tubo.
NOTA: As células podem ser armazenadas em um tubo de 1,5 a 2 mL (à temperatura ambiente) antes de desenhar na seringa Hamilton (100 μL) após uma mistura cuidadosa. As células podem ser mantidas à temperatura ambiente por 2-3 h durante o procedimento de implantação. Verifique sempre a viabilidade celular das células no tubo antes e depois da sessão de implantação. A exclusão azul trypan é o método mais fácil para avaliação da viabilidade celular. - Uma vez que o osso é atravessado com a primeira agulha, insira uma segunda agulha (agulha de diâmetro menor também marcada a 10 mm) agulha presa à seringa Hamilton de 100 μL carregada com células. Certifique-se de inserir a agulha até a marca de 10 mm no mesmo orifício que se estende até a diafísica.
- Descarreza suavemente 20 μL de 75.000 células de SO suspensas em PBS na diáfise e cavidade da medula.
NOTA: A agulha não deve oscilar no osso e deve se sentir segura. Se a agulha se move facilmente, o córtex pode ter sido atravessado na diáfise. Repita a inserção novamente para obter uma colocação mais firme antes da injeção de células. - Remova a agulha Hamilton do osso.
NOTA: Se uma pequena gota de forma sanguínea, aplique pressão leve. Se a gota de fluido claro se formar no local da punção, a agulha pode não ter sido estendida o suficiente no osso e a suspensão da célula tumoral pode ter vazado de volta através do buraco. Registo nas notas, mas geralmente, a implantação do tumor será bem sucedida. Com experiência, o procedimento de implantação do tumor deve levar 5 minutos por rato. Com a experiência, a implantação tumoral das células no osso ficará mais fácil. A injeção acidental de células no músculo ao redor do osso pode não levar ao microambiente tumoral necessário para a metástase pulmonar.
- Recuperação
- Certifique-se de que o rato é normoérmico. Coloque o rato em uma gaiola com uma almofada de aquecimento colocada sob a gaiola para recuperação.
- Depois de totalmente acordado, móvel e respirando bem, injete os ratos com Buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
NOTA: Para ter acesso à Buprenorfina, consulte a instituição para ver as opções de aprovação através da equipe veterinária para fazer o pedido. - Mova os ratos de volta para limpar gaiolas e monitore uma vez por dia, toda semana.
3. Medição e monitoramento
- Meça o tamanho do tumor de 9 a 10 dias após a implantação e, em seguida, a cada 2 dias até 3 semanas após a implantação para estabelecer uma taxa de crescimento. Meça o diâmetro máximo da tíbia usando uma pinça eletrônica ou manual. Armazene os dados em uma planilha com uma fórmula para calcular o volume do tumor. Meça a tíbia contralateral (não implantada) como a linha de base.
NOTA: Os diâmetros de cetamina implantados são usados como substituto para o tamanho do tumor. Os membros traseiros são medidos perpendicularmente ao eixo longo da tíbia no maior diâmetro para duas medidas, ventral/dorsal e mídia/ lateral no membro. O volume estimado do tumor é calculado pela fórmula11: Volume tumoral (mm3) = maior diâmetro (mm) x menor diâmetro (mm)2/2. - Considere os ratos para amputação de sobrevivência ou tratamento quimioterápico quando os tumores se aproximam de 15 mm na maior dimensão ou 3 semanas após a implantação do tumor. O membro contralateral mede cerca de 7-9 mm na maioria dos ratos nesta idade.
4. Administração intravenosa de doxorubicina
- Anestesiar os ratos com 2% de isofurane. Prepare a pele sobre a veia jugular com três lavagens cirúrgicas usando betadina e álcool como descrito13.
- Sob dissecção cuidadosa, visualize a veia jugular direita ou esquerda. Insira a agulha no músculo sobrelado e, em seguida, dirija-se em direção à cabeça do rato para o lúmen da veia jugular, pois é visualizado na veia jugular anterior ao músculo peitoral.
- Quando a agulha é inserida na veia jugular, retire suavemente o sangue da seringa para garantir a inserção adequada. É possível acreditar que a agulha é através da veia, mas a agulha está sob a veia e não no lúmen. Se a veia jugular se tornar muito pequena para injeções quando dissecar sem cortes para expor a veia jugular, use a outra veia jugular para a injeção.
- Injete doxorubicina (2 mg/kg) lentamente mais de 1 min em um volume de 100-150 μL. A solução pode ser visualizada por via intravenosa na veia jugular durante o parto.
- Injete volumes semelhantes de soro fisiológico normal em ratos de controle.
- Retire a agulha e aplique pressão suave na veia com uma gaze estéril.
- Feche a incisão da pele usando 3-4 clipes de ferida. Remova os clipes em 7-10 dias após a injeção.
NOTA: Os ratos não costumam tentar remover clipes de metal, mas mordem e removem suturas. O método de injeção jugular é preferível às injeções de veias traseiras para doxorubicina, uma vez que qualquer droga que vaze fora do vaso causa necrose da cauda que pode exigir amputação da cauda.
5. Protocolo de amputação de membros traseiros
- Indução
- Coloque o rato em uma câmara de indução de tamanho médio e induza a anestesia com isoflurane de 2%-4%. Monitore o rato continuamente para a profundidade da anestesia.
NOTA: A câmara de indução é limpa em um recipiente de carvão e quaisquer outros gases são removidos por uma tabela de baixo-rascunho usada para cirurgia. - Insira o nariz em um nariz. Proteja com fita adesiva, se necessário.
NOTA: Este procedimento é feito em uma tabela de rascunho para ressargar gases voláteis em excesso (ou seja, isoflurane). - Remova o cabelo da perna direita até o ventral e o abdômen inferior dorsal com cortadores ou use agente depilatório. Coloque o rato em uma posição supina.
- Esfregue a área cirúrgica asepticamente usando 70% de etanol e diluir acetato de clorexidina ou diluir betadina. Prepare a pele para cirurgia do meio da panturrilha até a área da pele logo acima da articulação do quadril do abdômen inferior direito. Esfregue a perna proximal e a área distal circunferencialmente. Repita este passo três vezes.
- Aplique o lubrificante dos olhos em ambos os olhos do rato. Certifique-se de que o rato tenha temperatura corporal normal (37 °C) e sinais vitais normais. Monitore e regulamente a temperatura corporal usando uma almofada de aquecimento conectada a um monitor de sonda de temperatura retal.
- Coloque o rato em uma câmara de indução de tamanho médio e induza a anestesia com isoflurane de 2%-4%. Monitore o rato continuamente para a profundidade da anestesia.
- Cirurgia
- Ligue isoflurane a 1,5%-3% (manutenção). Monitore a profundidade anestésico, incluindo reação ao aperto do dedo do sol, taxa respiratória e caráter. Ajuste a taxa de isoflurane conforme necessário para manter um plano apropriado de anestesia.
NOTA: A taxa respiratória enquanto estiver sob anestesia deve ser entre 50-100 respirações por minuto. Respirações profundas e pouco frequentes são uma indicação de que o rato está muito profundamente anestesiado. - Abra pacotes de instrumentos estéreis e cortinas e não luvas estéreis. Tome cuidado para manter a esterilidade durante a duração do procedimento. Os instrumentos cirúrgicos estéreis básicos necessários incluem, suporte de lâmina de bisturi, fórceps, hemostats, porta agulha, tesoura e aplicador de clipe de ferida.
- Puxe a perna do rato através da ventilação da cortina cirúrgica estéril. Certifique-se de que o animal está em um plano adequado de anestesia através de reflexo de dedo do dedo do dedo do sol.
- Usando uma lâmina de bisturi ou uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão circunferencial e cutânea apenas proximal ao sufocamento (articulação do joelho).
- Deglove o membro traseiro usando gaze ou dissecção contundente para expor a artéria femoral e a veia na superfície ventral-medial do membro traseiro.
- Ligate os vasos usando suturas absorvíveis 4-0 ao nível do fêmur médio e transecte distally.
- Fixar a veia distally para reduzir o vazamento durante a dissecção muscular.
NOTA: A musculatura circunferencial será transectada distal ao nível de ligadura do vaso da artéria femoral e músculos elevados do fêmur ao nível da articulação coxofemoral. - Usando dissecção contundente, abduzir a articulação do quadril com rotação lateral para fora.
- Encontre a cabeça do fêmur e desarticula-o do acetábulo. Corte qualquer tecido restante mantendo a perna presa ao corpo.
- Dê um bloco de respingos ao acetábulo e nervo ciático com aproximadamente 6 mg/kg ropivacaína.
- Feche a musculatura sobre o acetábulo usando uma sutura simples interrompida (4-0, sutura absorvível).
NOTA: Podem ser injetados 0,5% adicionais de bupivacaína ou lidocaína (0,15-0,2 mg total) em vários locais ao longo da camada muscular fechada (bloqueio local de infiltração/respingo). - Oponha-se e feche as bordas da pele usando clipes de ferida separados a cada 5-10 mm.
- Ligue isoflurane a 1,5%-3% (manutenção). Monitore a profundidade anestésico, incluindo reação ao aperto do dedo do sol, taxa respiratória e caráter. Ajuste a taxa de isoflurane conforme necessário para manter um plano apropriado de anestesia.
- Recuperação
- Coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa com suporte térmico usando uma almofada de aquecimento colocada sob a gaiola.
NOTA: Para evitar hipertermia, a almofada de aquecimento não deve estar em contato direto com o animal e não deve exceder 40 °C. - Monitore o animal até que ele se recupere completamente e esteja normoérmico (37,5-39 °C).
NOTA: O animal não deve ser deixado desacompanhado até que esteja totalmente consciente e severamente reclinado e se movendo facilmente ao redor da gaiola. - Depois de totalmente acordado, móvel e respirando bem, injete os ratos com Buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
NOTA: Dar Buprenorfina em um rato anestesiado pode prejudicar a recuperação. - Administrar 10 mL de solução de Ringer lactado quente subcutâneamente entre as omoplatas.
- Mova os ratos de volta para a gaiola limpa e reúna-se com conespecíficos.
- Monitore todos os animais duas vezes por dia durante o próximo mês em busca de sinais de dor e angústia, incluindo piloereção, postura curvada ou inapetitosidade ou sinais de infecção no local da incisão, incluindo eritema, descarga purulenta ou deshiscência da ferida.
NOTA: Até o momento não observamos sinais clínicos (como infecções) após a recuperação pós-operatória em nenhum dos animais. Apenas um rato teve uma deshicência com suturas, após a qual clipes de ferida foram usados para fechar feridas sem mais problemas. - Administre buprenorfina ou meloxicam em animais que apresentem sinais clínicos de dor em doses publicadas em consulta com um veterinário de animais de laboratório.
- Administre antibióticos (ou seja, cefalosporina) a animais que apresentem sinais clínicos de dor em doses publicadas em consulta a um veterinário de animais de laboratório.
NOTA: Qualquer animal que apresente sinais prolongados de dor ou angústia que não melhorem com analgésicos ou animais que apresentem sinais de infecção que não respondam a antibióticos precisam ser humanamente eutanizados.
- Coloque o rato em uma gaiola de recuperação limpa com suporte térmico usando uma almofada de aquecimento colocada sob a gaiola.
6. Imagem com raio-X
- Após a implantação do tumor, imagem as tíbias e pulmões não invasivamente para detectar o crescimento do tumor usando raio-X com uma máquina projetada para roedores.
- Anestesiar os ratos como feito anteriormente.
- Tire imagens em 3x de ampliação para 6 s a 25 kV.
- Processe o filme usando o processador de raios-X. As radiografias também podem ser digitalizadas digitalmente.
7. Procedimento de necropsia
- Eutanize os ratos com CO2. Confirme a morte por falta de batimentos cardíacos e imediatamente retire sangue de 3 mL do coração para amostras de soro ou plasma.
- Abra o tórax e o abdômen para exame.
- Isole a traqueia e o cannulate com um cateter (18 G). Para fixar o cateter na traqueia, amarre uma sutura de seda em torno da traqueia com o cateter.
- Conecte o cateter de infusão a uma seringa de 3 ou 5 mL. Infundir formalina ou soro fisiológico para inflar suavemente os lóbulos pulmonares para melhores espécimes de histologia. Na infusão, os pulmões soprarão e permitirão uma melhor visualização de metástases pulmonares.
- Examine, disseca e pese todos os órgãos torácicos e abdominais selecionados (como fígado, rins).
- Fixar os órgãos em formalina para histopatologia ou congelar em gelo seco, 2-metilbutano ou nitrogênio líquido.
- Para avaliação da expressão proteica utilizando mancha ocidental, faça lises de tecidos congelados. Anticorpos que reagem com tecidos de ratos são detalhados13.
8. Imunohistoquímica
- Processe o tecido operacional primário, incorpore-o em parafina e seque-o para coloração imunohistoquímica.
- Recupere o antígeno após a desparafinação usando tampão citrato (pH 6.0). Incubar em 0,3% H2O2 em metanol por 30 min para saciar peroxidase endógena.
- Bloqueie as seções de parafina de 5 μm de espessura usando soro normal.
- Incubar com anticorpos anti-CD68 e CD3 primários (ver tabela) durante a noite a 4 °C.
- Enxágüe as seções em PBS e incuba-as no polímero HRP usando um kit de detecção.
NOTA: A imunostaining foi desenvolvida com diaminobenzidina como cromogeno.
9. Mancha ocidental
- Lyse as células UMR-106 em 200-300 μL de tampão de lise14 para realizar eletroforese de gel padrão e mancha ocidental.
- Use 4% a 12% de géis Bis-Tris.
- Incubar em anticorpo primário anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actin ou anticorpo primário anti-rato β2-AR (ver tabela) e anticorpo secundário ligado à peroxidase de rabanete.
- Adicione o substrato chemiluminescente. Exponha as membranas ao filme de raio-X.
NOTA: os níveis de β-actin são usados como controles de carregamento.
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Representative Results
Ratos de sosseio de ORIGEM imunocompetente são usados para esses estudos de SO, que oferece um modelo animal com um sistema imunológico intacto. Usamos a linha celular UMR106 da ATCC, desenvolvida a partir de células que foram inicialmente isoladas de um SO de um rato SD. Implantamos as células em ratos SD, fornecendo assim um modelo sinténico para as células UMR106 são implantadas na tíbia de ratos SD masculinos e fêmeas de 3 semanas de idade, simulando um modelo de SO pediátrico. Além disso, a implantação ortotópica de células UMR106 diretamente na metafísica/diáfise da tíbia dá um microambiente tumoral relevante.
Ao implantar células tumorais, uma agulha deve ser inserida corretamente através do platô tibial (Figura 1) no ângulo correto (paralelo ao eixo ósseo) estendendo a ponta da agulha aproximadamente 10 mm na cavidade central do osso. Com este procedimento, 95% (52/55) de ratos desenvolveram tumores em tíbias distal ao joelho. Com experiência em injeção tibial, 100% dos ratos desenvolveram tumores. Em um grupo de ratos que não foram amputados, o volume médio de tumores em homens foi de 504 mm3 em 3 semanas e 1195 mm3 em 5 semanas após a implantação. No sexo feminino, os volumes tumorais são médios de 285 mm3 em 3 semanas e 495 mm3 em 5 semanas após a implantação.
Foram comparadas duas coortes de ratos, incluindo aquelas com amputação (23 ratos) (Figura 2) e aquelas sem amputação (29 ratos). Ambas as coortes foram eutanizadas às 7 semanas após a implantação para examinar a metástase tumoral nos pulmões. No grupo de amputação (23/3) os ratos desenvolveram metástases pulmonares. Esses três ratos morreram ou foram eutanásias dentro de 24 horas de cirurgia devido a complicações pós-cirurgia. Dois ratos morreram de anestesia prolongada enquanto o cirurgião estava aprendendo o método. Um rato desenvolveu uma deshiscência e foi eutanizado no dia seguinte. Os pulmões desses três ratos foram avaliados e três pequenas metástases (>1 mm) foram encontradas histologicamente. Os 20 ratos sobreviventes não tinham metástases pulmonares 7 semanas após a implantação. Isso indicou que 3 semanas de amputações pós-implantação são adequadas para diminuir o número de ratos com metástase pulmonar. Em um segundo grupo de 29 ratos que não fizeram o procedimento de amputação, 26/29 ratos apresentaram metástases pulmonares consistentes com os dados publicados anteriormente11. Não vimos nenhum padrão no tamanho ou número de metástases nesses ratos. A maioria dos ratos tem mais de 10 metástases de diâmetro de 2-7 mm grosseiramente visíveis que foram facilmente amostradas durante a necropsia. Ocasionalmente, os ratos tinham metástases ainda maiores de até 10 mm de diâmetro. É importante implantar células UMR106 com um número de passagem baixo, pois os estudos demonstraram que as células com número de passagem 10 ou maior se tornam mais agressivas e metástases já em 2-3 semanas após a implantação. A razão para a natureza não é conhecida, mas a especulação é que as células na cultura poderiam desenvolver mutações que favorecem a metástase.
Além da cirurgia de amputação, outro refinamento dos métodos incluiu a imagem de raio-X para vigilância tumoral ou necropsia. Este método permite que o pesquisador confirme a invasão de tumores ósseos em ratos sob anestesia. O método de radiografia planar também pode ser usado em membros recentemente amputados ou membros fixos formalina. O método é rápido (5 min por rato) e barato ($2-5/rato) em comparação com tomografia computadorizada (TC). Para o monitoramento in vivo, requer que os ratos sejam anestesiados durante a imagem. A Figura 3 demonstra a morfologia detalhada vista por imagens de raios-X de dois membros previamente amputados. Este método ilumina a natureza osteolítica e osteoblástica desses tumores. Note a interrupção da arquitetura cortical óssea normal da tíbia e da fíbula em ambos os exemplos (setas brancas). A Figura 4 ilustra a morfologia radiográfica dos pulmões com e sem metástases. Imagens por raio-X podem revelar rapidamente ao laboratório, a necessidade de eutanásia para evitar mortes espontâneas desnecessárias.
Tumores primários e metastáticos no pulmão são histologicamente semelhantes ao sistema operacional humano que exibe morfologia tumoral osteolítica e osteoblástica. No SO do rato, a morfologia tumoral osteolítica e osteoblástica é confirmada pela histopatologia do membro amputado na Figura 5 e Figura 6. Observe que o osso cortical está ausente neste exemplo e o osso adjacente também é substituído ou fortificado por novos ossos tecidos (exostoses) que são orientados perpendiculares ao eixo existente do córtex. Ilhas de osteoide imaturo (material extracelular amorfo) são mostradas dentro do exemplo do tumor. Além disso, a morfologia microscópica das metástases pulmonares, algumas com osso mineralizado, e embolia vascular tumoral são mostradas na Figura 7.
Amputação de membros com OS aumenta a sobrevivência em ratos. Ratos podem morrer espontaneamente devido à metástase pulmonar abrigada por mais de 7 semanas após a implantação. O uso da amputação pode permitir uma investigação mais aprofundada da terapia de câncer padrão ou direcionada neste modelo. O alongamento do tempo entre implantação do tumor e amputação aumentará a incidência de metástase.
Doxorubicina é um agente quimioterápico usado para tratar o SISTEMA OPERACIONAL em humanos. Em ratos, a doxorubicina pode ser dada através de injeçõesjugulares 13 ou um cateter15 como descrito aqui. A injeção jugular requer 5-10 minutos por rato, mas garante a entrega da dose na veia exposta. No geral, as injeções jugulares são muito mais reprodutíveis em comparação com as injeções da veia da cauda do rato. Se a doxorubicina vazar para a derme durante as injeções da veia da cauda, a necrose da cauda pode ocorrer e evitar novos tratamentos. Neste estudo, cinco ratos foram tratados com dose de 2 mg/kg de doxorubicina e eutanásia de 48 h pós-injeção para investigar a morte celular nos tumores, como mostrado na Figura 5A,B.
Cinco ratos de controle tratados com soro fisiológico também foram avaliados para selecionar anticorpos que podem ser usados para imunossuar células imunes em OSs de ratos. Aqui, dois anticorpos foram testados para reatividade imunológica. Para estudos de imunohistoquímica, os tumores foram fixados em formalina por 48-72 h e depois movidos para 70% de etanol para reduzir a ligação cruzada proteica que ocorre na formalina. A imunohistoquímica foi realizada para infiltrados de células imunes em tumores primários do SO e imunossuídos para macrófagos (CD68) e células T (CD3). A Figura 8 mostra dois exemplos de imunossítenos de infiltrados de células imunes dentro do microambiente tumoral.
Também foram explorados os potenciais alvos de intervenção terapêutica. Após a amputação de membros com tumores, amostras de os ratos foram congeladas para o futuro isolamento proteico. Neste estudo, descobrimos que as células UMR106 expressam as proteínas da via familiar ErbB. Manchas ocidentais realizadas em lises de proteína celular UMR106 demonstram a expressão de ErbB2, EGFR, ErbB4 e outras proteínas que interagem com essas vias(Figura 9).
Figura 1: Tíbia com agulha de implantação tumoral inserida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Tibia durante procedimento de amputação com a pele removida(A),artéria femoral exposta e veia(B),com músculo elevado do fêmur(C),e em uma cirurgia de 3 semanas após a amputação de rato(D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Radiografia de raio-X das pernas direitas após amputação (ex vivo) de dois ratos com OS. Note a natureza osteolítica e osteoblástica do tumor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens de raio-X dos pulmões de ratos. (A) sem metástases pulmonares. (B) com metástase pulmonar do SO. (C) correlação com patologia bruta de metástases em um pulmão inflado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: (A) Histopatologia da OS com 90% das células mostrando morte celular no tumor da tíbia 48 h após uma dose de 2 mg/kg de doxorubicina. (B) Morte celular tumoral (seta) no sistema operacional primário tibial a 48 h após uma dose de 2mg/kg de doxorubicina. Note que o canto superior direito e esquerdo tem células viáveis. (C) Invasão de OS em osso cortical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: (A) Histopatologia da OS que substituiu as células da medula óssea e se infiltrou nos cortices da tíbia. Observe o novo crescimento ósseo reativo acompanhado, pois está em camadas externas e perpendiculares ao córtex pré-existente. (B) Exame de maior potência das células tumorais do SO adjacentes a uma ilha de osso. (C) Exame de maior potência das células de SO embutidas na matriz extracelular rosa a azul (osteoide). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: (A) Múltiplas metástases pulmonares em rato com implantação tumoral de tíbia. (B) Células do tumor os em uma embolia em um pequeno vaso de ramo da artéria pulmonar adjacente a um brônquio abaixo do vaso. (C) Algumas metástases pulmonares contêm ilhas de osso, enquanto outras metástases são mais celulares. (D) Maior poder das metástases com células do SO misturadas com ilhas de osso mineralizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Imunohistoquímica de (A) Macrófagos imunostaining e (B) imunostaining células T mostrando células CD3 positivas no SO na tíbia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Proteínas da via ErbB expressas em células oss UMR106 de tumores de tíbia. Lisatos de tumores primários foram examinados para expressão proteica da via de transdução de sinal da família ErbB, incluindo ErbB2, EGFR, ErbB4, AKT, ERK1/2, e receptores β2-adrenérgicos com actin como controle de carga. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Ratos com implantes tibiais da OS desenvolvem tumores mensuráveis por 3 semanas após a implantação. Se os membros com tumores forem amputados 3 semanas após a implantação, a incidência de metástase pulmonar é reduzida significativamente. Os OSs são osteolíticos e osteoblásticos. Ratos sem amputação desenvolvem metástases pulmonares de tamanho múltiplo e variado, observadas por radiografia ou necropsia por 7 semanas após a implantação. EGFR, ErbB2 e ErbB4 são expressos em umr106 OS de rato, semelhante ao os humano OS16,17,18. Células CD3 T e macrófagos são facilmente detectados no SO por métodos imunohistoquímicos. As injeções de veia jugular são preferidas para a veia da cauda para o parto de doxorubicina quimioterapia, uma droga dada aos pacientes com OS. O método descrito aqui é uma amputação coxofemoral completa. Este procedimento é um refinamento e pode ser considerado para substituir o tumor removendo o método cirúrgico (osteotomia femoral) onde o osso é cortado deixando um toco para o paciente8. O estudo sugere uma remoção completa do membro para reduzir a probabilidade de dor pós-cirúrgica e complicações.
Há uma série de passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, é importante observar a passagem das células tumorais e usar menor passagem de células para os estudos para manter o modelo consistente do experimento ao experimento. As células de passagem mais antigas se tornam mais agressivas com o tempo na cultura. Em segundo lugar, o uso da agulha de tamanho apropriado e a seringa Hamilton ajudará a injetar corretamente as células na tíbia a um volume muito pequeno de 20 μL, um volume determinado como ótimo e não causou vazamento. Em terceiro lugar, o cirurgião precisa inicialmente praticar a desarticulação ao fazer necropsias em ratos idosos semelhantes para aprender a mecânica do procedimento. Em quarto lugar, para o sucesso da amputação, manter a termoregulação e limitar o tempo de cirurgia. Um cirurgião experiente pode completar a amputação em 15 minutos.
Observou-se que amplantação de células na tíbia melhorou muito quando uma agulha maior foi usada para fazer a abertura inicial seguida pela inserção de uma agulha de seringa hamilton menor. Isso protege a seringa Hamilton de quebra e embotamento ao longo do tempo. Seringas hamilton podem ter volumes tão pequenos quanto 10 μL. As seringas tuberculinas de 1 mL não seriam suficientes para a implantação de 20 μL. A mesma seringa Hamilton foi usada para todos os ratos implantados em um dia, mas foram lavadas entre os procedimentos cirúrgicos de cada rato. Evite autoclavar as seringas hamilton como elas são propensas a quebra. No final do procedimento, lave-o com soro fisiológico (10 vezes) e depois com 100% de etanol (10 vezes) e deixe secar com o êmbolo removido para armazenar.
Suturas de pele e subcutânea foram inicialmente usadas para fechar a incisão, mas um rato foi encontrado com deshiscência no dia seguinte à cirurgia. O uso de clipes de ferida e cola cirúrgica para fechar a incisão melhorou o método. Com este refinamento, nenhum outro rato teve tal complicação pós-cirurgia. A inclusão da radiografia dos pulmões por raio-X refina este modelo para demonstrar metástase pulmonar em ratos permitindo eutanásia oportuna e previne mortes inesperadas. Imagens de raios-X nos permitem determinar a natureza osteolítica e osteoblástica desses OSs ratos, semelhantes aos OSs humanos.
É necessário um nível moderado de perícia cirúrgica para realizar o procedimento de amputação. O passo mais difícil é a dissecação na musculatura para localizar a articulação coxofemoral. Ampliação e boa iluminação são importantes durante esta etapa. A perícia cirúrgica pode ser alcançada com a prática em animais que foram eutanizados. Depois de cerca de 10 ratos, o cirurgião deve estar confiante para amputar um membro com OS de um rato vivo sob anestesia.
Os métodos existentes para remover membros com sarcomas em camundongos e ratos baseiam-se na remoção da tíbia cortando o osso do fêmur e musculatura no meio do eixo e deixando o toco8. Embora isso possa ser útil para algumas investigações, neste estudo, a remoção completa da perna foi tentada. O procedimento foi considerado satisfatório e não ofereceu complicações pós-cirúrgicas. Em ratos com um toco de membro traseiro, poderia haver mais pele pós-cirúrgica, músculo ou dor nervosa. Saindo de um toco, ratos poderiam chegar ao redor e acessar o local da cirurgia. Ratos fazem muito bem pós-amputação e ambulam bem na gaiola com um hindlimb.
As vantagens da amputação completa do membro incluem a remoção do tumor primário antes que ele se torne muito grande e doloroso para o rato. É importante ressaltar que a remoção do tumor primário ajudará a controlar a metástase do tumor primário no pulmão. Ratos com amputação podem ser estudados para testar a eficácia de novas terapêuticas em células tumorais circulantes no sangue ou nas micrometastases em capilares dos pulmões ou outros ossos.
Há uma necessidade substancial de desenvolvimento de novas terapêuticas contra o câncer para os OS e outros sarcomas, especialmente terapêuticas que têm atividade medicamentosa contra a progressão metastática. Em comparação com a nova terapêutica desenvolvida para outros cânceres, a terapêutica para os OS infelizmente não progrediu em muitas décadas. Respondendo a esse problema, uma reunião de líderes e especialistas em OS e metástases se reuniu para desenvolver diretrizes para o melhor desenvolvimento de medicamentos para os SISTEMAS19. De acordo com as sugestões do painel, foram estabelecidos estudos para melhorar o modelo pré-clínico de ratos, um modelo menos conhecido de OS. Em resumo, amputação e imagem refina modelo pré-clínico de ratos para uso adicional pela comunidade de pesquisa de sarcoma. O procedimento de amputação permitirá uma melhor sobrevida do paciente por vários meses, permitindo a avaliação da eficácia de novos tratamentos em micrometastases ou tumores dormentes ou para testar a toxicidade de tratamentos com um modelo com melhor longevidade.
Em resumo, fornecemos a vantagem deste modelo de SO. Ratos de sofrutída imunocompetente SD são usados para fornecer um modelo sinténico com linha celular UMR106 OS implantada isolada de um SO de rato SD. O tumor primário e metastático é histologicamente semelhante ao so em humanos. Ratos machos e fêmeas juvenis são usados para estudos de implantação de tumores UMR106 modelando sarcoma pediátrico. A colocação ortotópica de células implantadas é feita diretamente na tíbia para um microambiente tumoral relevante. O tumor primário se metástase no pulmão e as metástases podem ser monitoradas por imagens in vivo com método de raio-X. O so de rato expressa proteínas em comum com o SO humano, como o ErbB2. Em comparação com o so cão, o modelo de rato permite que um número maior de animais seja usado simultaneamente. Ratos são 10 vezes maiores que camundongos para facilitar injeções tibiais, cirurgia, imagem, coleta de sangue e biópsia. A longevidade dos ratos é mais assegurada com a amputação e este modelo pode combinar terapia neoadjuvante, amputação e terapia adjuvante permitindo uma melhor sobrevida do paciente, permitindo a avaliação da eficácia dos tratamentos em micrometastases ou tumores dormentes. A avaliação da toxicidade fora do alvo também pode ser avaliada neste modelo onde os ratos podem ser tratados com câncer terapêutico, como a doxorubicina e monitorados a longo prazo para toxicidade cardíaca induzida por doxorubicina ou recorrência da OS. Isso permitiria o teste de agentes de proteção cardio em um modelo com os SO.
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Disclosures
Nenhuma divulgação para declarar.
Acknowledgments
Financiamento do NIH através do Instituto Nacional do Câncer, conceder # CA228582. Shun Ishiyama está recebendo uma bolsa da Toray Medical Co., Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKT | Cell Signaling TECHNOLOGY | 4685S | |
| absorbable suture | Ethicon | J214H | |
| β-actin | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-47778 | |
| β2-AR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-569 | replaced by β2-AR (E-3): sc-271322 |
| Bis–Tris gels | Thermo Fisher | NP0321PK2 | |
| Buprenorphine SR Lab | ZooPharm | IZ-70000-201908 | |
| CD3 antibody | Dako | #A0452 | |
| CD68 antibody | eBioscience | #14-0688-82 | |
| Chemiluminescent substrate | cytiva | RPN2232 | |
| CL-Xposure film | Thermo Fisher | 34089 | |
| Complete Anesthesia System | EVETEQUIP | 922120 | |
| diaminobenzidine | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Doxorubicin | Actavis | NDC 45963-733-60 | |
| EGFR antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-03 | replaced by EGFR (A-10): sc-373746 |
| ERBB2 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-284 | replaced by Neu (3B5): sc-33684 |
| ERBB4 antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-283 | replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050 |
| ERK antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-514302 | |
| eye lubricant | PHARMADERM | NDC 0462-0211-38 | |
| Hamilton syringe (100 µL) | Hamilton | Model 1710 SN SYR | |
| horseradish peroxidase-linked secondary antibody | cytiva | NA934 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7401 | |
| HRP polymer detection kit | VECTOR LABORATORIES | MP-7402 | |
| isoflurane | BUTLER SCHEIN | NDC 11695-6776-2 | |
| isoflurane vaporizer | EVETEQUIP | 911103 | |
| UMR-106 cell | ATCC | CRL-1661 | |
| X-ray | Faxitron | UltraFocus | |
| X-ray processor | Hope X-Ray Peoducts Inc | MicroMax X-ray Processor | Hope Processors are not available in USA anymore |
| wound clips | BECTON DICKINSON | 427631 |
References
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