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Biochemistry

इन विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित गतिशीलता परख के मायोसिन-विशिष्ट अनुकूलन

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रक्रिया को व्यक्त करने और अपने लक्षण वर्णन की चर्चा के बाद मायोसिन 5a शुद्ध है, दोनों कलाकारों की टुकड़ी और विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित परख में एकल अणु का उपयोग कर, और कैसे इन तरीकों nonmuscle myosin 2b के लक्षण वर्णन के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

Abstract

मायोसिन प्रोटीन फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) के साथ बांधते हैं और बातचीत करते हैं और फिलोजेनेटिक पेड़ के पार जीवों में पाए जाते हैं। उनकी संरचना और एंजाइमेटिक गुणों को उन विशेष कार्य के लिए अनुकूलित किया जाता है जो वे कोशिकाओं में निष्पादित करते हैं। मायोसिन 5ए कोशिकाओं में मेलानोसोम और वेसिकल्स के परिवहन के लिए एफ-ऐक्टिन पर चलता है। इसके विपरीत, नॉनमस्कल मायोसिन 2बी लगभग 30 अणुओं वाले द्विध्रुवी फिलामेंट के रूप में संचालित होता है। यह फिलामेंट के केंद्र की ओर विपरीत ध्रुवता के एफ-ऐक्टिन को स्थानांतरित करता है, जहां मायोसिन अणु ऐक्टिन को बांधने, पावर स्ट्रोक प्रदान करने और चक्र दोहराने से पहले अलग करने के लिए अतुल्यकालिक रूप से काम करते हैं। नॉनमस्कल मायोसिन 2बी, इसके अन्य नॉनमस्कल मायोसिन 2 आइसोफॉर्म के साथ, ऐसी भूमिकाएं हैं जिनमें सेल आसंजन, साइटोकिन्सिस और तनाव रखरखाव शामिल हैं। शुद्ध प्रोटीन का उपयोग करके विट्रो मोटिविटी परखों में प्रदर्शन करके मायोसिन के मशीनीमिस्ट्री का अध्ययन किया जा सकता है। ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में, मायोसिन एक माइक्रोस्कोप कवरलिप सतह से बंधे होते हैं और फ्लोरोसेंट रूप से एफ-ऐक्टिन लेबल होते हैं, जिन्हें ट्रैक किया जा सकता है। एकल अणु/पहनावा गतिशीलता परख में, हालांकि, एफ-ऐक्टिन एक कवरस्लिप से बंधा हुआ है और एफ-ऐक्टिन पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले मायोसिन अणुओं की आवाजाही देखी जाती है । इस रिपोर्ट में, एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके एसएफ 9 कोशिकाओं से रिकॉम्बिनेंट मायोसिन 5ए की शुद्धि रेखांकित की गई है। इसके बाद, हम दो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित परख की रूपरेखा तैयार करते हैं: ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख और उल्टे गतिशीलता परख। इन परखों से, ऐक्टिन ट्रांसलोकेशन वेग और एकल अणु रन लंबाई और वेग जैसे मापदंडों को छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निकाला जा सकता है। इन तकनीकों को गैरमस्कल मायोसिन 2 आइसोफॉर्म के एकल तंतुओं के आंदोलन का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, जो यहां गैरमुस्कल मायोसिन 2बी के संदर्भ में चर्चा की गई थी। यह कार्यप्रवाह एक प्रोटोकॉल और मात्रात्मक उपकरणों का एक सेट का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग गैर-संगीत के एकल अणु और कलाकारों की टुकड़ी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मायोसिन मोटर प्रोटीन हैं जो एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) हाइड्रोलिसिस1से प्राप्त ऊर्जा का उपयोग करके ऐक्टिन फिलामेंट्स पर बल डालते हैं। मायोसिन में सिर, गर्दन और पूंछ डोमेन होते हैं। हेड डोमेन में ऐक्टिन-बाइंडिंग क्षेत्र के साथ-साथ एटीपी बाइंडिंग और हाइड्रोलिसिस की साइट शामिल है। गर्दन डोमेन बुद्धि रूपांकनों से बने होते हैं, जो प्रकाश श्रृंखला, शांत, या शांत-जैसे प्रोटीन2,3से बांधते हैं। पूंछ क्षेत्र में मायोसिन के प्रत्येक वर्ग के लिए विशिष्ट कई कार्य हैं, जिनमें दो भारी श्रृंखलाओं के डामरीकरण, कार्गो अणुओं के बाध्यकारी और सिर डोमेन1के साथ ऑटोइनहिबिटरी इंटरैक्शन के माध्यम से मायोसिन का विनियमन शामिल है।

मायोसिन के मोटिवल गुण वर्गों के बीच बहुत भिन्न होते हैं। इनमें से कुछ गुणों में शुल्क अनुपात (मायोसिन के यांत्रिक चक्र का अंश जिसमें मायोसिन को ऐक्टिन करने के लिए बाध्य किया गया है) और प्रोसेसिविटी (टुकड़ी से पहले अपने ट्रैक पर कई कदम बनाने के लिए मोटर की क्षमता)4शामिल हैं। मायोसिन की 40 से अधिक कक्षाएं अनुक्रम विश्लेषण 5 , 6 ,7,8के आधार पर निर्धारित की गई थीं . कक्षा 2 मायोसिन को "पारंपरिक" के रूप में वर्गीकृत किया गया है क्योंकि वे पहली बार अध्ययन किए गए थे; इसलिए, मायोसिन के अन्य सभी वर्गों को "अपरंपरागत" के रूप में वर्गीकृत किया गया है।

मायोसिन 5a (M5a) एक वर्ग 5 मायोसिन है और एक प्रोसेसिव मोटर है, जिसका अर्थ है कि यह अलग होने से पहले ऐक्टिन के साथ कई कदम उठा सकता है। इसमें उच्च शुल्क अनुपात होता है, जो यह दर्शाता है कि यह अपने यांत्रिक चक्र का एक बड़ा हिस्सा9,10, 11,12,13, 14पर काम करता है। अन्य मायोसिन के साथ आम में, भारी श्रृंखला में एक एन-टर्मिनल मोटर डोमेन होता है जिसमें एक ऐक्टिन-बाइंडिंग और एटीपी हाइड्रोलिसिस साइट दोनों शामिल हैं, जिसके बाद एक गर्दन क्षेत्र है जो लीवर-आर्म के रूप में कार्य करता है, छह बुद्धि रूपांकनों के साथ जो आवश्यक प्रकाश श्रृंखला (ईएलसी) और शांत (सीएएम)15से बांधते हैं। पूंछ क्षेत्र में α-हेलिकल कुंडल-कुंडल होते हैं, जो अणु को मंद करते हैं, जिसके बाद कार्गो को बाध्यकारी बनाने के लिए गोलाकार पूंछ क्षेत्र होता है। इसका काइनेटिक्स मेलानोसाइट्स में मेलानोसोम्स के परिवहन और पुरकिंजे न्यूरॉन्स16,17में एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम के परिवहन में अपनी भागीदारी को दर्शाता है । M5a को प्रोटोटाइप कार्गो परिवहन मोटर18माना जाता है।

कक्षा 2 मायोसिन, या पारंपरिक मायोसिन में मायोसिन शामिल हैं जो नॉनमस्कल मायोसिन 2 (एनएम2) आइसोफॉर्म, एनएम2ए, 2बी और 2सी19के अलावा कंकाल, कार्डियक और चिकनी मांसपेशियों की शक्ति संकुचन है। एनएम 2 आइसोफॉर्म सभी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में पाए जाते हैं और साइटोकिनेसिस, आसंजन, ऊतक मॉर्फोजेनेसिस और सेल माइग्रेशन19,20, 21,22में साझा भूमिकाएं हैं। यह पेपर नॉनमस्कल मायोसिन 2बी (एनएम2बी)23के संदर्भ में पारंपरिक मायोसिन प्रोटोकॉल पर चर्चा करता है। M5a की तुलना में एनएम 2बी में कम शुल्क अनुपात है और यह एम5ए के वीमैक्स की तुलना में 0.2एस-123 के वीमैक्स के साथ ≈18एस-124के साथ एंजाइमेटिक रूप से धीमा है। विशेष रूप से, दो सिर के साथ कटे हुए एनएम 2बी निर्माण आसानी से ऐक्टिन पर प्रक्रियात्मक रूप से आगे नहीं बढ़ते हैं; बल्कि, एक पावर स्ट्रोक में ऐक्टिन परिणामों के साथ प्रत्येक मुठभेड़ अणु25के वियोजन के बाद .

एनएम2बी में दो मायोसिन भारी श्रृंखलाएं होती हैं, जिनमें से प्रत्येक में एक गोलाकार सिर डोमेन, एक लीवर-आर्म (एक ईएलसी और एक नियामक प्रकाश श्रृंखला (आरएलसी) के साथ), और एक α-पेचिक कुंडलित-कुंडल रॉड/पूंछ डोमेन, लगभग 1,100 अमीनो एसिड लंबे होते हैं, जो इन दो भारी श्रृंखलाओं को मंद करते हैं। एनएम2बी की एंजाइमेटिक गतिविधि और संरचनात्मक स्थिति को आरएलसी23के फॉस्फोरिलेशन द्वारा विनियमित किया जाता है। एटीपी और शारीरिक आयनिक ताकत (लगभग 150 एमएम नमक) की उपस्थिति में, अनफॉस्फोरलेटेड एनएम 2बी, एक कॉम्पैक्ट संरचना को अपनाता है जिसमें दो सिर एक असममित बातचीत में भाग लेते हैं और पूंछ दो स्थानों23में सिर पर वापस सिलवटों। इस राज्य में, मायोसिन ऐक्टिन के साथ दृढ़ता से बातचीत नहीं करता है और बहुत कम एंजाइमेटिक गतिविधि है। calmodulin-निर्भर मायोसिन लाइट चेन किनेज़ (एमएलके) या रो-संबद्ध प्रोटीन किनेज़ द्वारा आरएलसी फॉस्फोरिलेशन पर, अणु लगभग 30 मायोसिन अणुओं23के द्विध्रुवी तंतुओं के रूप में पूंछ क्षेत्र के माध्यम से अन्य मायोसिन के साथ फैली हुई है और सहयोगियों । आरएलसी के ऊपर उल्लिखित फॉस्फोरिलेशन से एनएम2बी की ऐक्टिन-एक्टिवेटेड एटीपैस गतिविधि में लगभग चारगुना26, 27,28की वृद्धि होती है। यह द्विध्रुवी फिलामेंट व्यवस्था, जिसमें प्रत्येक छोर पर कई मायोसिन मोटर्स होते हैं, को संकुचन और तनाव रखरखाव में भूमिकाओं के लिए अनुकूलित किया जाता है, जहां विरोध करने वाले ध्रुवों के साथ ऐक्टिन फिलामेंट्स को एक दूसरे के सापेक्ष स्थानांतरित किया जा सकता है23,29। तदनुसार, NM2b को ऐक्टिन के साथ बातचीत करते समय मोटर्स के एक कलाकारों की टुकड़ी के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। इस फिलामेंट के भीतर बड़ी संख्या में मोटर्स एनएम 2बी फिलामेंट्स को ऐक्टिन फिलामेंट्स पर प्रोसेसिंग रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देते हैं, जिससे इन विट्रो फिलामेंट प्रोसेसमेंट संभव होता है29की विशेषता है।

हालांकि कोशिका में मायोसिन की भूमिका को समझने में प्रगति हुई है, लेकिन प्रोटीन स्तर पर उनकी व्यक्तिगत विशेषताओं को समझने की जरूरत है । एक कोशिका के अंदर के बजाय एक साधारण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्तर पर actomyosin इंटरैक्शन को समझने के लिए, हम इन विट्रो अध्ययनों में उपयोग के लिए पुनः संयोजन मायोसिन को व्यक्त और शुद्ध कर सकते हैं। इस तरह के अध्ययनों के परिणाम तब मशीनोबायोलॉजिस्ट को विशिष्ट मायोसिन के जैव भौतिक गुणों के बारे में सूचित करते हैं जो अंततः जटिल सेलुलर प्रक्रियाओंको 12 , 13,14,25,29,29तक चलाते हैं । आमतौर पर, यह एक पूर्ण लंबाई या कटे हुए मायोसिन निर्माण और आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी29,30, 31के माध्यम से शुद्ध करने के लिए एक आत्मीयता टैग जोड़कर पूरा कियाजाताहै। इसके अतिरिक्त, निर्माण को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेबल फ्लोरोफोर या सिंथेटिक फ्लोरोफोर के साथ प्रोटीन लेबलिंग के लिए एक टैग शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। इस तरह के फ्लोरोसेंट लेबल को जोड़कर, मायोसिन यांत्रिकी और काइनेटिक्स का निरीक्षण करने के लिए एकल अणु इमेजिंग अध्ययन किए जा सकते हैं।

शुद्धि के बाद, मायोसिन को कई तरीकों से चिह्नित किया जा सकता है। ATPase गतिविधि को रंगीन तरीकों से मापा जा सकता है, जो विभिन्न परिस्थितियों32के तहत मोटर की समग्र ऊर्जा खपत और ऐक्टिन एफ़िनिटी में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इसकी गतिशीलता के मशीनोनोकेमिस्ट्री के बारे में जानने के लिए आगे के प्रयोगों की जरूरत है । यह पेपर दो इन विट्रो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित तरीकों का विवरण देता है जिसका उपयोग शुद्ध मायोसिन प्रोटीन के मोटिवल गुणों को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है।

इन तरीकों में से पहला ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख है, जिसका उपयोग मायोसिन मोटर्स के कलाकारों की टुकड़ी गुणों का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने के साथ-साथ शुद्ध प्रोटीन33के बैच की गुणवत्ता का गुणात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि यह पेपर इस परख के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी के उपयोग पर चर्चा करता है, इन प्रयोगों को प्रभावी ढंग से डिजिटल कैमरे से लैस एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है, आमतौर पर कई प्रयोगशालाओं34में पाया जाता है। इस परख में मायोसिन मोटर्स की सैचुरिंग लेयर एक कवरस्लिप से जुड़ी होती है। इसे नाइट्रोसेल्यूलोज, एंटीबॉडी, झिल्ली, एसआईओ2-व्युत्पन्न सतहों (जैसे ट्राइमेथिल्च्लोरोसिलीन) का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है, अन्य29,33,35, 35,37,38के बीच। फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए ऐक्टिन फिलामेंट्स को कवरस्लिप चैंबर के माध्यम से पारित किया जाता है, जिस पर ऐक्टिन सतह से जुड़े मायोसिन से बांधता है। एटीपी (और NM2 के अध्ययन में kinases) के अलावा पर, चैंबर सतह से बंधे myosins द्वारा actin तंतु के स्थानांतरण का पालन करने के लिए छवि है । ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रत्येक ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट के वेग और लंबाई को सहसंबंधित करने के लिए किया जा सकता है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर चलती और स्थिर ऐक्टिन फिलामेंट्स दोनों की संख्या का एक उपाय भी प्रदान कर सकता है, जो दिए गए मायोसिन तैयारी की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है। रुके हुए तंतु के अनुपात को जानबूझकर अन्य प्रोटीनों में ऐक्टिन की सतह के तार से भी संग्राहक किया जा सकता है और मायोसिन39की भार निर्भरता निर्धारित करने के लिए मापा जा सकता है । क्योंकि प्रत्येक ऐक्टिन फिलामेंट को बड़ी संख्या में उपलब्ध मोटर्स द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, इस परख बहुत प्रजनन योग्य है, अंतिम मापा वेग शुरुआती मायोसिन एकाग्रता में परिवर्तन या समाधान में अतिरिक्त कारकों की उपस्थिति जैसे क्षोभ के लिए मजबूत है। इसका मतलब यह है कि इसे विभिन्न परिस्थितियों में मायोसिन गतिविधि का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है, जैसे कि बदले हुए फॉस्फोरिलेशन, तापमान, आयनिक ताकत, समाधान चिपचिपाहट, और सतह टेथर्स द्वारा प्रेरित लोड के प्रभाव। हालांकि इस तरह के मजबूत बाध्यकारी मायोसिन "मृत सिर" एटीपी हाइड्रोलिसिस में असमर्थ के रूप में कारकों ठप actin तंतु पैदा कर सकता है, कई तरीकों को ऐसे मुद्दों को कम करने और सटीक माप के लिए अनुमति मौजूद हैं । मायोसिन के गतिज गुण वर्गों में बहुत भिन्न होते हैं और, उपयोग किए गए विशिष्ट मायोसिन के आधार पर, इस परख में ऐक्टिन फिलामेंट ग्लाइडिंग की गति 20 एनएम/एस (मायोसिन 9)40,41,और 60,000 एनएम/एस(चारेरियन मायोसिन 11)42के तहत भिन्न हो सकती है।

दूसरी परख ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख12की ज्यामिति को उलटती है । यहां, ऐक्टिन फिलामेंट्स कवरस्लिप सतह से जुड़े होते हैं और M5a के एकल अणुओं या एनएम 2 बी के व्यक्तिगत द्विध्रुवी तंतुओं के आंदोलन की कल्पना की जाती है। इस परख का उपयोग एकेनोसिन अणुओं या ऐक्टिन पर फिलामेंट्स के रन लंबाई और वेग की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। एक कवरस्लिप को एक रासायनिक यौगिक से लेपित किया जाता है जो गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करता है और साथ ही सतह को कार्यात्मक करता है, जैसे बायोटिन-पॉलीथीन ग्लाइकोल (बायोटिन-खूंटी)। संशोधित एविडिन डेरिवेटिव के अलावा सतह और बायोटिनाइलेटेड ऐक्टिन को कक्ष के माध्यम से पारित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एफ-ऐक्टिन की एक परत कक्ष के नीचे तक बंधी होती है। अंत में, सक्रिय और फ्लोरोसेंटी लेबल मायोसिन (आमतौर पर 1-100 एनएम) कक्ष के माध्यम से प्रवाहित किया जाता है, जिसे तब स्थिर ऐक्टिन फिलामेंट्स पर मायोसिन आंदोलन का निरीक्षण करने के लिए चित्रित किया जाता है।

ये तौर-तरीके तेजी से और प्रजनन योग्य तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं जिन्हें गैरमुस्कल और मांसपेशियों के मायोसिन दोनों की गतिशीलता की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। यह रिपोर्ट क्रमशः अपरंपरागत और पारंपरिक मायोसिन का प्रतिनिधित्व करते हुए M5a और NM2b दोनों को शुद्ध और विशेषता देने की प्रक्रियाओं को रेखांकित करती है । इसके बाद कुछ मायोसिन-विशिष्ट अनुकूलनों की चर्चा की जाती है, जिन्हें दो प्रकार की परख में गति के सफल कैप्चरिंग को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।

अभिव्यक्ति और आणविक जीव विज्ञान
ब्याज की मायोसिन के लिए सीडीएनए को एक संशोधित pFastBac1 वेक्टर पर क्लोन किया जाना चाहिए जो एम 5ए-एचएमएम, या एन-टर्मिनल फ्लैग-टैग व्यक्त करते हुए यदि एनएम23,43,44,45,46की पूर्ण लंबाई अणु व्यक्त करता है तो सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग (DYKDDDDK) के लिए एन्कोड करता है। NM2b पर सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग के परिणामस्वरूप फ्लैग-एफ़िनिटी कॉलम के लिए प्रोटीन की कमजोर आत्मीयता होती है। इसके विपरीत, एन-मरणासन्न ध्वज-टैग प्रोटीन आमतौर पर फ्लैग-एफ़िनिटी कॉलम23से अच्छी तरह से बांधता है । एन-मरणासन्न टैग किए गए प्रोटीन में एंजाइमेटिक गतिविधि, यांत्रिक गतिविधि और फॉस्फोरिलेशन-निर्भर नियमन23बरकरार है ।

इस पेपर में, फ्लैग-टैग और मायोसिन भारी श्रृंखला के सी-टर्मिनस के बीच जीएफपी के साथ एक कटे हुए माउस M5a भारी मेरोमायोसिन (एचएमएम) की तरह निर्माण का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि एनएम 2बी के विपरीत, M5a-HMM को एन-या सी-टर्मिनल फ्लैग टैग के साथ सफलतापूर्वक टैग और शुद्ध किया जा सकता है और दोनों ही मामलों में परिणामस्वरूप निर्माण सक्रिय होगा। M5a भारी श्रृंखला अमीनो एसिड १०९० पर काट दिया गया था और GFP और M5a४७के कुंडल कुंडली क्षेत्र के बीच एक तीन अमीनो एसिड लिंकर (GCG) शामिल हैं । जीएफपी और फ्लैग-टैग के बीच कोई अतिरिक्त लिंकर नहीं जोड़ा गया। M5a-HMM को शांतोडुलिन के साथ सह-व्यक्त किया गया था । पूर्ण लंबाई मानव NM2b निर्माण ईएलसी और आरएलसी के साथ सह व्यक्त किया गया था । आरएलसी की एन-टर्मिनी को पांच अमीनो एसिड (एसजीएलआर) के लिंकर के जरिए जीएफपी से मिलाया गया था । सीधे फ्लैग-टैग से जुड़ा एक हेलोटैग था। हैलोटैग और मायोसिन हैवी चेन के एन-टर्मिनस के बीच दो अमीनो एसिड (एएस) से बना एक लिंकर था।

दोनों मायोसिन तैयारी लगभग 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर बाकुलोवायरस से संक्रमित Sf9 सेल संस्कृति के एक लीटर से शुद्ध थे । प्रत्येक सबयूनिट के लिए बाकुलोवायरस की मात्रा निर्माता के निर्देशों द्वारा निर्धारित संक्रमण की वायरस की बहुलता पर निर्भर थी। M5a के मामले में, कोशिकाओं को दो अलग-अलग बाकुलोवायरस से सह-संक्रमित किया गया था- एक शांत के लिए, और एक M5a भारी श्रृंखला के लिए। एनएम2बी के मामले में, कोशिकाओं को तीन अलग-अलग वायरस से सह-संक्रमित किया गया था- एक ईएलसी के लिए, एक आरएलसी के लिए, और एक एनएम 2बी भारी श्रृंखला के लिए। मायोसिन (या अन्य बहु-जटिल प्रोटीन) की विविधता के साथ काम करने वाली प्रयोगशालाओं के लिए, यह दृष्टिकोण कुशल है क्योंकि यह भारी और हल्की श्रृंखलाओं के कई संयोजनों के लिए अनुमति देता है और आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली हल्की चेन जैसे कि calmodulin कई अलग-अलग मायोसिन भारी श्रृंखलाओं से सह-संक्रमित हो सकते हैं। संदूषण से बचने के लिए उचित बाँझ तकनीक के साथ जैवसेफ्टी कैबिनेट में सभी सेल कार्य पूरा किया गया था।

M5a और NM2b दोनों की अभिव्यक्ति के लिए, रिकॉम्बिनेंट मायोसिन का उत्पादन करने वाली एसएफ 9 कोशिकाओं को अपकेंद्रण के माध्यम से संक्रमण के बाद 2-3 दिन एकत्र किए गए थे, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। सेल छर्रों को सह-संक्रमित Sf9 कोशिकाओं को 2,800 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री करके प्राप्त किया गया था। प्रोटीन शुद्धिकरण प्रक्रिया नीचे विस्तृत है।

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Protocol

1. प्रोटीन शुद्धि

  1. सेल लाइसिस और प्रोटीन निष्कर्षण
    1. टेबल1 के आधार पर 1.5x एक्सट्रैक्लट्रेक्शन बफर तैयार करें। फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. बर्फ पर सेल छर्रों विगलन शुरू करते हैं। जबकि छर्रों विगलन कर रहे हैं, १.२ m m dithiothreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, ०.५ μm फिनाइलमिथाइलसुल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) और दो प्रोटीज अवरोधक गोलियों के साथ निष्कर्षण बफर के पूरक १०० ml । बर्फ पर रखें।
    3. एक बार गोली गल जाने के बाद, सेल संस्कृति के प्रति 10 एमएल पूरक निष्कर्षण बफर के 1 एमएल जोड़ें। उदाहरण के लिए, यदि सेल छर्रों सेल संस्कृति के 500 एमएल से बनते थे, तो गोली में पूरक निष्कर्षण बफर के 50 एमएल जोड़ें।
    4. उन्हें बर्फ पर रखते हुए सेल छर्रों को सोनिकेट करें। प्रत्येक गोली के लिए, निम्नलिखित शर्तों का उपयोग करें: 5 एस ऑन, 5 एस ऑफ, 5 मिनट की अवधि, पावर 4-5।
    5. सभी समरूप lysate को एक बीकर में ले लीजिए और एटीपी (0.1 मीटर स्टॉक समाधान; पीएच 7.0) जोड़ें ताकि एटीपी की अंतिम एकाग्रता 1 mM हो। एक ठंडे कमरे में 15 मिनट के लिए हिलाओ । एटीपी एक्टिविन से एक्टिव मायोसिन को अलग करता है, जिससे इसे निम्नलिखित अपकेंद्रित्र चरण में अलग किया जा सकता है । इसलिए एटीपी की कमी और ऐक्टिन को रिबाइंडिंग की संभावना को कम करने के लिए तुरंत अगले कदम पर आगे बढ़ना जरूरी है ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 48,000 एक्स ग्राम पर lysuge। हालांकि यह हो रहा है, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, 100 एमएल फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ एंटी-फ्लैग एफ़िनिटी राल (कोशिकाओं के 1 एल से गठित गोली के लिए) के 50% घोल के 1-5 एमएल धोना शुरू करें। उदाहरण के लिए, राल के 5 एमएल के लिए, 50% घोल के 10 एमएल धोएं। अंतिम वॉश स्टेप में, 50% घोल बनाने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ पीबीएस के 1-5 एमएल के साथ राल को फिर से खर्च करें।
    7. lysate अपकेंद्रित्र के बाद, 1-4 घंटे के लिए ठंडे कमरे में धुले हुए राल घोल और चट्टान के साथ सुपरनेट को मिलाएं। प्रतीक्षा करते समय, टेबल 1 में वर्णित बफ़र्स बनाएं और उन्हें बर्फ पर रखें।
  2. फ्लैग एफ़िनिटी शुद्धिकरण तैयारी
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर चरण 1.7 में समाधान को सेंट्रलाइज करें। राल ट्यूब के नीचे पैक किया जाएगा। राल को परेशान किए बिना, सुपरनिटेंट को हटा दें।
    2. बफर ए के 50 एमएल में राल को तालिका 1 में विस्तृत और 500 एक्स ग्राम पर 500 एक्स ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फिर से खर्च करें। राल को परेशान किए बिना, सुपरनिटेंट को हटा दें।
    3. बफर बी के 50 एमएल में राल को तालिका 1 में विस्तृत और 500 एक्स ग्राम पर 500 एक्स ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फिर से खर्च करें। इस स्टेप को एक बार और दोहराएं और बफर बी के 20 एमएल में राल को रीसस्ट करें। फिर, राल और बफर को धीरे-धीरे हाथ से लगभग 10 बार उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. प्रोटीन एल्यूशन और एकाग्रता
    1. तालिका 1 में वर्णित एल्यूशन बफर के 30 एमएल बनाएं और इसे बर्फ पर ठंडा होने दें।
    2. एक ठंडे कमरे में एल्यूशन कॉलम सेट करें। धीरे-धीरे राल घोल को कॉलम में डालें। नीचे राल पैक के रूप में बफर बी के 1-2 कॉलम संस्करणों के साथ कॉलम धोएं, यह सुनिश्चित करना है कि राल सूख नहीं है ।
    3. राल के माध्यम से एल्यूशन बफर के 1 एमएल प्रवाह और एक 1.5 एमएल ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। ऐसे दोहराएं कि 12, 1 एमएल अंश एकत्र किए जाते हैं।
    4. इस बिंदु पर, गुणात्मक रूप से यह निर्धारित करने के लिए अंशों पर एक क्रूड ब्रैडफोर्ड परीक्षण करें कि कौन से अंश सबसे अधिक केंद्रित48हैं। एक ९६-अच्छी तरह से थाली की एक पंक्ति पर, पिपेट ६० μL 1x ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक । जैसे ही अंश एकत्र किए जाते हैं, प्रत्येक अंश के 20 माइक्रोल को अच्छी तरह से मिलाएं। एक गहरा नीला रंग और अधिक केंद्रित अंशों को इंगित करता है।
    5. एक 50 एमएल ट्यूब में, कॉलम फ्लोथ्रू में राल से बंधे किसी भी शेष मायोसिन को जारी करने के लिए कॉलम के माध्यम से शेष एल्यूशन बफर को धीरे-धीरे पाइप करके शेष प्रोटीन एकत्र करें। यह प्रवाह के माध्यम से अगले कदम में केंद्रित किया जाएगा । सुनिश्चित करें कि राल को फिर से उपयोग के लिए पुनर्जीवित किया जाता है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार संग्रहीत किया जाता है।
    6. पूल तीन सबसे केंद्रित अंशों और आगे 50 एमएल ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से ध्यान केंद्रित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शेष 1 एमएल अंश एक 100,000 MWCO ध्यान केंद्रित ट्यूब का उपयोग कर. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 750 x ग्राम पर ध्यान केंद्रित ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर पूल किए गए नमूने को लोड करें और तब तक दोहराएं जब तक कि सभी एल्यूटेड प्रोटीन लगभग 0.5-1 मिलील की अंतिम मात्रा में केंद्रित न हो जाए।
      नोट: यह ताकना आकार मायोसिन अणुओं की अवधारण के लिए अनुमति देता है, जिसमें कई बार आणविक वजन कटऑफ होता है। अंतिम उत्पाद पर एसडीएस-पेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का प्रदर्शन करके सत्यापित के रूप में, एकाग्रता के इस समय के दौरान प्रकाश श्रृंखला मोटर डोमेन के लिए कसकर बाध्य रहती है।
  4. डायलिसिस और फ्लैश-फ्रीजिंग
    1. टेबल 1 में वर्णित डायलिसिस बफर के 2एल बनाओ। एक डायलिसिस बैग या कक्ष में नमूना लोड करें और ठंडे कमरे में रात भर डायलिसिस करें। ध्यान दें कि डायलिसिस बफ़र्स की संरचना एनएम 2बी और एम5ए के लिए अलग है।
      नोट: NM2b के मामले में, इस डायलिसिस चरण का उद्देश्य कम आयनिक शक्ति बफर में मायोसिन फिलामेंट्स बनाना है। इन तंतुओं का तलछट तब एक अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम प्रदान करता है और नमूने की एकाग्रता के लिए अनुमति देता है। इसलिए अगले दिन डायलिसिस चैंबर में दिखाई देने वाला सफेद अवासक होगा । इन तंतुओं को अपकेंद्रित्र द्वारा एकत्र किया जाएगा और चरण 5.1 में अवर्णित किया जाएगा। M5a-HMM के मामले में, रात भर डायलिसिस के बाद, प्रोटीन बाद में परख में उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से शुद्ध हो जाएगा । यदि आवश्यक हो तो जेल निस्पंदन या आयनिक एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी जैसे आगे शुद्धिकरण कदम किए जा सकते हैं। डायलिसिस के बाद M5a वसूली के लिए, 5.2 कदम पर जाएं।
  5. डायलिसिस के बाद मायोसिन ठीक
    1. एनएम2बी के लिए, मायोसिन फिलामेंट्स को इकट्ठा करने के लिए डायलिसिस बैग या चैंबर और सेंट्रलाइज से 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सावधानी से उतार दें। सुपरनेट को त्यागें और टेबल 1 में वर्णित पैलेट 1 में वर्णित के रूप में पैलेट में स्टोरेज बफर जोड़ें जब तक कि यह भंग न हो जाए। कोमल ऊपर और नीचे पिपटिंग गोली को घुलनशील करने में मदद करता है। आम तौर पर, इसके लिए प्रति ट्यूब 500 माइक्रोन से अधिक की आवश्यकता नहीं होती है। यह सुनिश्चित करने के बाद कि गोली पूरी तरह से उच्च आयनिक ताकत भंडारण बफर में भंग हो जाती है, यदि आवश्यक हो तो अवांछित समुच्चय को हटाने के लिए एक अतिरिक्त अपकेंद्रित्र चरण (15 मिनट 49,000 x ग्राम)किया जा सकता है, क्योंकि मायोसिन अब अपॉर्माइज्ड हो जाएगा और सुपरनेट में रहेगा।
    2. M5a-HMM के लिए, ध्यान से डायलिसिस चैंबर और अपकेंद्रित्र से 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 49,000 x ग्राम पर किसी भी अवांछित समुच्चय मौजूद हैं। सुपरनिटेस्ट ले लो।
  6. एकाग्रता दृढ़ संकल्प और फ्लैश-फ्रीजिंग
    1. उत्पाद की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, तरंगदैर्ध्य 260, 280, 290, और 320 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषित को मापें। समीकरण 1के साथ एमजी/एमएल(सीएमजी/एमएल)में एकाग्रता की गणना करें, जहां ए 280 280 एनएम पर अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है और ए320 320 एनएम पर अवशोषण का प्रतिनिधित्व करता है। एमजी/एमएल में परिणामी एकाग्रता को समीकरण 2के साथ मायोसिन अणुओं के μM में परिवर्तित किया जा सकता है, जहां एम पूरे प्रोटीन का आणविक वजन (भारी श्रृंखला, हल्की जंजीर, फ्लोरोफोरस और सभी टैग सहित) है।
      cmg/mL =(एक२८०-एक ३२०)/ε(1)
      μM अणुओं = 1000cmg/mL/
      नोट: यदि एक कमजोर पड़ने आवश्यक है, तो यह एक उच्च आयनिक शक्ति बफर में किया जाना चाहिए । विलुप्त होने गुणांक (ε) इस तरह के ExPASy के रूप में एक कार्यक्रम में प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम आयात करके निर्धारित किया जा सकता है । M5a-HMM के लिए विशिष्ट उपज लगभग 0.5-1 मिलीएल 1-5 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन है और पूर्ण लंबाई NM2b के लिए 0.5-1 0.5-2 मिलीग्राम/एमएल की मिली लीटर है । इस पेपर में इस्तेमाल किए जाने वाले एम5ए-एचएमएम के लिए विलुप्त होने का गुणांक ०.६७१ था । इस पेपर में इस्तेमाल किए गए एनएम2बी के लिए विलुप्त होने का गुणांक 0.611 था।
    2. शुद्ध मायोसिन को दो तरीकों में से एक में स्टोर करें। एक पतली दीवारों वाली ट्यूब में 10-20 μL के बीच Aliquot, जैसे कि एक बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया ट्यूब, और फ्लैश-फ्रीजिंग के लिए तरल नाइट्रोजन के कंटेनर में ट्यूब छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, सीधे तरल नाइट्रोजन में मायोसिन के 20-25 माइक्रोन के बीच पिपेट करें और बाँझ क्रायोजेनिक ट्यूबों में प्रोटीन के जमे हुए मोतियों को स्टोर करें। या तो मामले में, परिणामस्वरूप ट्यूबों को भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस या तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: चूंकि नीचे वर्णित दोनों गतिशीलता परख के लिए प्रोटीन की बहुत कम मात्रा की आवश्यकता होती है, छोटे aliquots में भंडारण, जैसा कि वर्णित है, किफायती है।

2. ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख

  1. कवरलिप तैयारी
    1. एमिल एसीटेट में 1% नाइट्रोसेल्यूलोज समाधान बनाएं।
    2. एक ऊतक संस्कृति पकवान (150 x 25 मिमी) प्राप्त करें और पकवान के नीचे एक गोलाकार फ़िल्टर पेपर (125 मिमी व्यास) जोड़ें।
    3. लोड आठ नंबर 1.5 मोटाई 22 मिमी वर्ग कवरलिप एक रैक पर और लगभग 2-5 एमएल के साथ धोने के 200 प्रूफ इथेनॉल के बाद आसुत पानी के 2-5 मिली मील (dH2O) । इस वाशिंग स्टेप को दोहराएं, पानी से समाप्त हो। फिर, फ़िल्टर की गई एयर-लाइन या एन2-लाइनका उपयोग करके कवरस्लिप को पूरी तरह से सुखा लें।
    4. एक कवरस्लिप लें और धीरे-धीरे पर्ची के एक किनारे के साथ 1% नाइट्रोसेल्यूलोस समाधान के 10 माइक्रोल को पिपेट करें। फिर, एक चिकनी गति में, इसे एक चिकनी-तरफा 200 माइक्रोट टिप के पक्ष का उपयोग करके शेष कवरलिप में धुंधला करें। इस कवरलिप को टिशू कल्चर डिश पर नाइट्रोसेल्यूलोस साइड अप के साथ रखें। शेष कवर्लिट्स के लिए दोहराएं और शेष अभिकर् ती तैयार करते समय उन्हें सूखने दें और कोटिंग के बाद 24 घंटे के भीतर कवरस्लिप का उपयोग करें।
  2. चैंबर की तैयारी
    1. बड़े मलबे को साफ करने के लिए ऑप्टिकल लेंस पेपर के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को मिटा दें। दो तरफा टेप के दो टुकड़े काटें, लंबाई में लगभग 2 सेमी।
    2. माइक्रोस्कोप स्लाइड के लंबे किनारे के बीच में एक टुकड़ा रखें। सुनिश्चित करें कि टेप का किनारा स्लाइड के किनारे के साथ संरेखित होता है। टेप के दूसरे टुकड़े को टेप के पहले टुकड़े के नीचे लगभग 2 मिमी रखें जैसे कि दोनों समानांतर और गठबंधन हैं। यह एक प्रवाह कक्ष बनाता है जो लगभग 10 माइक्रोन समाधान पकड़ सकता है (चित्र 1 देखें)।
    3. भाग 1 से नाइट्रोसेल्यूलोस-कोटेड कवर्लिप्स में से एक लें। ध्यान से टेप पर कवर्लिप छड़ी इस तरह है कि नीलोसेलुलोस के साथ लेपित पक्ष टेप के साथ सीधा संपर्क कर रहा है, (चित्रा 1देखें) । एक पिपेट टिप का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड-टेप इंटरफेस पर धीरे-धीरे दबाएं कि कवरस्लिप ने स्लाइड का ठीक से पालन किया है। एक रेजर ब्लेड के साथ स्लाइड के किनारे पर लटक अतिरिक्त टेप काटें।
  3. ऐक्टिन तैयारी
    1. पॉलीमराइजेशन बफर (50 एमएम केसीएल, 2 एमएमएम एमजीसीएल 2, 1 एमएम डीटीटी, 25 एमएम एमयूएचएस (पीएच 7.0)) में पॉलीमराइजिंग गोलाकार ऐक्टिन (जी-ऐक्टिन) द्वारा20माइक्रोनएम एफ-ऐक्टिन बनाएं।
    2. तनु एफ-ऐक्टिन से 5 माइक्रोन में मोटिविटी बफर (20 एमएम एमओपीएस, 5 एमएम एमजीसीएल2,0.1 एमएम ईजीटीए, 1 एमएम डीटीटी (पीएच 7.4))) । रोडामाइन-हल्लोइडिन से कम से कम 1.2x मोलर अतिरिक्त के साथ लेबल करें। बर्फ पर कम से कम 2 घंटे के लिए छोड़ दें (एल्यूमीनियम पन्नी में कवर) । इसका उपयोग बर्फ पर संग्रहीत 1-2 महीने तक किया जा सकता है।
  4. मायोसिन 5a ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख का प्रदर्शन
    नोट: इस खंड में, मायोसिन 5ए (एचएमएम) ग्लाइडिंग परख का विवरण प्रदान किया जाता है।
    1. टेबल 2 में वर्णित मायोसिन 5a के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    2. प्रवाह कक्ष के माध्यम से मायोसिन 5ए (50-100 एनएम) के 10 माइक्रोल में प्रवाह करें और 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    3. 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 10 μL में 50 mM MB में 1 mM DTT ("कम नमक" बफर के साथ प्रवाह) । इस वॉश को दो बार और दोहराएं और तीसरे वॉश के बाद 1 मिनट तक इंतजार करें। प्रवाह कक्ष से बाहर निकलने पर धीरे से कागज के कोने रखकर चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए एक ऊतक कागज या फिल्टर कागज के कोने का उपयोग करें ।
    4. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    5. चर्चा अनुभाग में चर्चा के अनुसार, "मृत सिर" को खत्म करने के लिए ब्लैक ऐक्टिन सॉल्यूशन (5 माइक्रोन एफ-ऐक्टिन, 1 माइक्रोन कैलोडुलिन, और 1 एमएमएम एटीपी में 1 एमएमएम डीटीटी के साथ 50 एमएमएम एमबी में प्रवाहित करें) ।
      1. चैंबर के समाधान को पेश करने से पहले ऐक्टिन फिलामेंट्स को कतरनी के लिए 1 मिलील सिरिंज और 27 जी सुई के साथ समाधान को पिपेट करें। इस स्टेप को दो बार और दोहराएं और तीसरी बार के बाद 1 मिनट तक इंतजार करें। लगभग 20 पाइपिंग घटनाएं पर्याप्त हैं।
      2. "मृत सिर" स्पिन करने के लिए, 500 mm की नमक एकाग्रता पर 1 एमएमएम एटीपी और 1 एमएमएम एमजीसीएल2 की उपस्थिति में मायोसिन में एफ-ऐक्टिन की एक स्टोइकिओमेट्रिक मात्रा जोड़ें। फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 480,000 x g पर अल्ट्रासेंट्राइज। मृत मायोसिन गोली में होगा।
    6. 1 एमएम डीटीटी और 1 एमएम एटीपी के साथ 50 एमएम एमबी के 50 माइक्रोन में फ्लो फ्री ऐक्टिन फिलामेंट्स के चैंबर को खत्म करने के लिए।
    7. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। किसी भी एटीपी के कक्ष को समाप्त करने के लिए इस धोने को दो बार और दोहराएं।
    8. 50 एमएम एमबी में 1 एमएम डीटीटी युक्त 20 एनएम रोडामाइन ऐक्टिन (आरएच-ऐक्टिन) समाधान के 10 माइक्रोन में प्रवाह करें और 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें ताकि कवरस्लिप की सतह से जुड़े मायोसिन 5ए को ऐक्टिन फिलामेंट्स की कठोरता बाध्यकारी की अनुमति दी जा सके।
    9. सतह से बंधे नहीं आरएच-ऐक्टिन फिलामेंट्स को धोने के लिए 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोन के साथ धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    10. अंतिम बफर के 30 μL में प्रवाह ।
    11. आरएच-ऐक्टिन की कल्पना करने के लिए 561 एनएम की उत्तेजन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवियों को रिकॉर्ड करें। एक उपयुक्त एक्सपोजर समय 0.5-1 मिनट की कुल अधिग्रहण अवधि के लिए 1.4 एमडब्ल्यू लेजर पावर पर 200 एमएस है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण की दर चलती तंतुओं की गति के लिए उचित रूप से बढ़ाया गया है। ट्रैकिंग कार्यक्रमों के साथ उपयोग के लिए डेटा एकत्र करने से पहले एक महत्वपूर्ण विचार अधिग्रहण फ्रेम दर है। फ्रेम के बीच सबपिक्सल आंदोलनों के परिणामस्वरूप वेग का एक अति अनुमान होगा, और सटीक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कई सौ नैनोमीटर के आंदोलनों की आवश्यकता होती है। एक इष्टतम अधिग्रहण दर में फ्रेम के बीच कम से कम एक पिक्सेल दूरी के लिए एक्टिन ग्लाइडिंग की सुविधा है। यहां इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के मामले में, यह सीमा 130 एनएम तक अनुवाद करती है; इसलिए, 1 μm/s यात्रा करने की उम्मीद एक मायोसिन को 200 एनएम की गति प्राप्त करने के लिए 5 फ्रेम/एस (0.2 एस अंतराल) की दर से इमेज किया जाना चाहिए, जबकि 10 एनएम/एस यात्रा करने की उम्मीद वाले मायोसिन को 0.05 फ्रेम/एस (20 एस अंतराल) की आवश्यकता होती है। इसलिए यदि आवश्यक हो तो डेटा को इस स्तर पर डाउनसाम्पल किया जा सकता है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)।
  5. नॉनमस्कल मायोसिन 2b ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख का प्रदर्शन
    नोट: इस खंड में, पूर्ण लंबाई नॉनमस्कल मायोसिन 2b ग्लाइडिंग परख का विवरण प्रदान किया जाता है। नॉनमस्कल मायोसिन 2b ग्लाइडिंग ऐक्टिंग फिलामेंट परख प्रोटोकॉल कुछ खास स्टेप्स पर मायोसिन 5ए प्रोटोकॉल से अलग है। सुनिश्चित करें कि इन चरणों में से प्रत्येक के लिए सही बफ़र्स का उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, एनएम 2बी परख के लिए उच्च नमक बफर में कवरस्लिप के लिए मायोसिन के लगाव की आवश्यकता होती है जबकि M5a को उच्च या कम नमक बफ़र्स में कवरस्लिप से जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, M5a ग्लाइडिंग ऐक्टिंग फिलामेंट परख अधिग्रहण के दौरान अलग तोड़ने ऐक्टिन फिलामेंट्स की आवृत्ति को कम करने के लिए मायोसिन की एक कम एकाग्रता का उपयोग करता है।
    1. तालिका 2 में वर्णित एनएम 2बी के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    2. प्रवाह कक्ष के माध्यम से 500 m Motility बफर (एमबी) (उच्च नमक" बफर) और 1 m m dithiothreitol (DTT) में nonmuscle myosin 2b (0.2 μM) के 10μL में प्रवाह और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: उच्च नमक बफ़र्स मायोसिन फिलामेंट्स को अलग करते हैं और सतह पर एकल मायोसिन अणुओं के लगाव के लिए अनुमति देते हैं, क्योंकि नॉनमस्कल मायोसिन 2बी आयनिक एकाग्रता <150 एमएम में फिलामेंट्स में बहुलक हो सकता है।
    3. तालिका 2में वर्णित 1 mm/ml गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में 1 mm DTT ("उच्च नमक" बफर) के साथ 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 10 माइक्रोन में प्रवाह । इस वॉश को दो बार और दोहराएं और तीसरे वॉश के बाद 1 मिनट तक इंतजार करें। चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए एक ऊतक कागज या फिल्टर पेपर के कोने का उपयोग करें।
    4. तालिका 2में वर्णित 1 एमएम डीटीटी के साथ 500 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल के साथ धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    5. "मृत सिर" को खत्म करने के लिए तालिका 2 में वर्णित ब्लैक ऐक्टिन समाधान के 10 μL में प्रवाह, जैसा कि चर्चा अनुभाग में आगे चर्चा की गई है। ब्लैक ऐक्टिन सॉल्यूशन में 5 माइक्रोनएम अवेलेबल एफ-ऐक्टिन, 1-10 एनएम एमसीएल, 1 एमएम एटीपी, 0.2 एमएम सीएसीएल2,1 माइक्रोन कैटम और 1 एमएमएम डीटीटी में 50 एमएम नासीएल मोबिलिटी बफर में नॉनमिस्कल मायोसिन को चैंबर की सतह पर फॉस्फोरिलेट करने के लिए शामिल हैं।
      1. चैंबर के समाधान को पेश करने से पहले ऐक्टिन फिलामेंट्स को कतरनी के लिए 1 मिलील सिरिंज और 27 जी सुई के साथ समाधान को पिपेट करें। इस स्टेप को दो बार और दोहराएं और तीसरी बार के बाद 1 मिनट तक इंतजार करें। लगभग, 20 पाइपिंग घटनाएं पर्याप्त हैं।
    6. 1 एमएम डीटीटी और 1 एमएम एटीपी के साथ 50 एमएम एमबी के 50 माइक्रोन में फ्लो फ्री ऐक्टिन फिलामेंट्स के चैंबर को खत्म करने के लिए।
    7. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। किसी भी एटीपी के कक्ष को समाप्त करने के लिए इस धोने को दो बार और दोहराएं।
    8. 50 एमएम एमबी में 1 एमएम डीटीटी युक्त 20 एनएम आरएच-ऐक्टिन सॉल्यूशन के 10 माइक्रोन में फ्लो करें और कवर्सलिप की सतह से जुड़े नॉनमस्क्ले मायोसिन 2बी को ऐक्टिन फिलामेंट्स की कठोरता बाध्यकारी की अनुमति देने के लिए 1 मिनट का इंतजार करें।
    9. सतह से बंधे नहीं आरएच-ऐक्टिन फिलामेंट्स को धोने के लिए 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोन के साथ धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    10. अंतिम बफर के 30 μL में प्रवाह । नॉनमस्कल मायोसिन 2b ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख के लिए, अंतिम बफर में वीडियो इमेजिंग के दौरान नॉनमस्कल मायोसिन2बीका पूरा फॉस्फोरिलेशन प्रदान करने के लिए कैलोडुलिन, सीएसीएल 2 और मायोसिन लाइट चेन किनेज़ भी शामिल हैं। 0.7% मिथाइलसेलुलोस को अंतिम बफर में भी शामिल किया जा सकता है यदि ऐक्टिन फिलामेंट्स केवल शिथिल रूप से बंधे होते हैं या सतह से बंधे नहीं होते हैं। इस पर चर्चा खंड में आगे चर्चा की जाती है।
    11. 561 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवियों को रिकॉर्ड करें। एक उपयुक्त एक्सपोजर समय 0.5 -3 मिनट की कुल अधिग्रहण अवधि के लिए 1.4 एमडब्ल्यू लेजर पावर पर 200 एमएस है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण की दर चलती तंतुओं की गति के लिए उचित रूप से बढ़ाया गया है। ट्रैकिंग कार्यक्रमों के साथ उपयोग के लिए डेटा एकत्र करने से पहले एक महत्वपूर्ण विचार अधिग्रहण फ्रेम दर है। फ्रेम के बीच सबपिक्सल आंदोलनों के परिणामस्वरूप वेग का एक अति अनुमान होगा, और सटीक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कई सौ नैनोमीटर के आंदोलनों की आवश्यकता होती है। एक इष्टतम अधिग्रहण दर में फ्रेम के बीच कम से कम एक पिक्सेल दूरी के लिए एक्टिन ग्लाइडिंग की सुविधा है। यहां इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के मामले में, यह सीमा 130 एनएम तक अनुवाद करती है; इसलिए, 1 μm/s यात्रा करने की उम्मीद एक मायोसिन को 200 एनएम की गति प्राप्त करने के लिए 5 फ्रेम/एस (0.2 एस अंतराल) की दर से इमेज किया जाना चाहिए, जबकि 10 एनएम/एस यात्रा करने की उम्मीद वाले मायोसिन को 0.05 फ्रेम/एस (20 एस अंतराल) की आवश्यकता होती है। इसलिए यदि आवश्यक हो तो डेटा को इस स्तर पर नीचे-नमूना किया जा सकता है (अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें)।

3. एकल अणु TIRF परख

  1. कवरलिप तैयारी
    1. स्टॉक पाउडर को मेथोक्सी-खूंटी-सिलेन (mPEG) के 10 मिलीग्राम एलिकॉट (1.5 एमएल ट्यूब में) और बायोटिन-खूंटी-सिलेन (बीपीईजी) के 10 मिलीग्राम एलिकोट्स में विभाजित करें। एक सील, नमी मुक्त कंटेनर में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और 6 महीने के भीतर उपयोग करें।
    2. लोड आठ नंबर 1.5H (उच्च परिशुद्धता) मोटाई 22 मिमी वर्ग एक रैक पर कवरलिप और २०० प्रूफ इथेनॉल के 2-5 एमएल के साथ धोने के बाद आसुत पानी के 2-5 एमएल के बाद । इस वाशिंग स्टेप को दोहराएं, पानी से समाप्त हो। फिर, 3 मिनट के लिए आर्गन के साथ एयर-लाइन या एन2 और प्लाज्मा-क्लीन का उपयोग करके कवरस्लिप को पूरी तरह से सुखा लें।
    3. एक ऊतक संस्कृति पकवान (100 x 20 मिमी) में फिल्टर पेपर (90 मिमी) पर साफ कवरस्लिप रखें और निम्नलिखित चरणों को करते समय 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्लाज्मा सफाई अन्य रासायनिक सफाई विधियों49के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    4. डीएच2ओ के साथ 80% इथेनॉल समाधान तैयार करें और एचसीएल का उपयोग करके पीएच को 2.0 में समायोजित करें। 1 मिलीएमएल को 10 मिलीग्राम एलिकोट में mPEG और 1 मिलीएमएल को बीपीईजी के 10 मिलीग्राम एलिकोट में जोड़ें। भंवर भंग करने के लिए, जो 30 s से अधिक नहीं लेना चाहिए।
    5. बीपीईजी समाधान के 100 माइक्रोल लें और 80% इथेनॉल (पीएच 2.0) के 900 माइक्रोल जोड़ें। यह समाधान 1 मिलीग्राम/एमएल बीपीईजी है। इसके बाद दोनों पीईजी का घोल इस प्रकार बनाएं, अच्छी तरह से मिलाएं।
      1. 10 मिलीग्राम/एमएल mPEG (अंतिम एकाग्रता: 2 मिलीग्राम/एमएल) के २०० μL ।
      2. 1 मिलीग्राम/एमएल बीपीईजी (अंतिम एकाग्रता: 10 μg/mL) के 10 μL ।
      3. 80% इथेनॉल (पीएच 2.0) समाधान के 790 माइक्रोन।
    6. कवरस्लिप को ओवन से बाहर निकालें। ध्यान से प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र पर खूंटी समाधान के 100 माइक्रोन बांटना, यह सुनिश्चित करना है कि केवल शीर्ष सतह गीला है। इसके बाद स्लिप को वापस ओवन में रखें और 20 से 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. जब कवर्लिप्स सतह पर स्पष्ट छोटे हलकों के साथ, एक छेद उपस्थिति पर लेना शुरू करते हैं, तो उन्हें ओवन से हटा दें।
    8. प्रत्येक कवरस्लिप को 100% इथेनॉल के साथ धोएं, एक एयर-लाइन के साथ सूखा, और ओवन में वापस रखें। केवल चरण 2 में कक्ष बनाने के लिए आवश्यक समय के लिए इनक्यूबेट।
  2. चैंबर की तैयारी
    1. चैंबर बनाने में उपयोग के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड साफ करें। दो तरफा टेप के दो टुकड़े काटें, लंबाई में लगभग 2 सेमी।
    2. माइक्रोस्कोप स्लाइड के लंबे किनारे के बीच में एक टुकड़ा रखें। सुनिश्चित करें कि टेप का किनारा स्लाइड के किनारे के साथ संरेखित होता है। टेप के दूसरे टुकड़े को टेप के पहले टुकड़े के नीचे लगभग 2 मिमी रखें जैसे कि दोनों समानांतर और गठबंधन हैं।
    3. ओवन से कार्यात्मक कवर्लिप्स में से एक लें (3.1 में बनाया गया)। ध्यान से टेप पर कवर्लिप छड़ी इस तरह है कि खूंटी के साथ लेपित पक्ष नीचे चेहरा है और टेप के साथ सीधा संपर्क कर रही है, के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । एक पिपेट टिप का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड-टेप इंटरफेस पर धीरे-धीरे दबाएं कि कवरस्लिप ने स्लाइड का ठीक से पालन किया है।
    4. एक रेजर ब्लेड के साथ स्लाइड पर लटक अतिरिक्त टेप काटें। इन कक्षों का उपयोग तुरंत किया जा सकता है या जोड़ीवार को 50 एमएल ट्यूब में रखा जा सकता है और भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है। इसे तुरंत स्टोर करना महत्वपूर्ण है या सतह नीचा होगी।
  3. मायोसिन 5a TIRF माइक्रोस्कोपी परख का प्रदर्शन
    1. टेबल 3 में वर्णित मायोसिन 5ए उल्टे गतिशीलता परख के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    2. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से चैंबर धोएं।
    3. 1 एमजी/एमएल बीएसए के 10 μL में 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी में फ्लो। इस वॉश को दो बार और दोहराएं और तीसरे वॉश के बाद 1 मिनट तक इंतजार करें। चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए एक ऊतक कागज या फिल्टर पेपर के कोने का उपयोग करें।
    4. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    5. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी में न्यूट्रल 10 एमएम एमबी में न्यूट्रल करें और 1 मिनट तक इंतजार करें।
    6. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    7. बायोटिनेलेटेड रोडामाइन ऐक्टिन (बीआरएच-ऐक्टिन) के 10 माइक्रोन में फ्लो जिसमें 50 एमएम एमबी में 1 एमएम डीटीटी होता है और 1 मिनट तक इंतजार करना पड़ता है। इस चरण के लिए, एक बड़े-ऊब पिपेट टिप का उपयोग करें और फ्लोरोसेंट ऐक्टिन फिलामेंट्स के कतरन को कम करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग से बचें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लंबे ऐक्टिन फिलामेंट्स सतह (20-30 माइक्रोन या उससे अधिक) से जुड़े हो सकते हैं। एक प्रभावी विकल्प एक मानक पिपेट टिप (≈1-1.5 मिमी) के उद्घाटन के साथ) के शंकु को काट रहा है।
    8. 1 एमएम डीटीटी के साथ 50 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    9. 10 एनएम मायोसिन 5ए के साथ अंतिम बफर के 30 माइक्रोन में प्रवाह करें, फिर तुरंत टीआईआरएफ इमेजिंग मोडलिट्यूल के लिए इष्टतम फोकस खोजने के बाद टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप और रिकॉर्ड पर लोड करें। 100-200 एमएस के बीच एक्सपोजर समय ऐक्टिन और जीएफपी-लेबल मायोसिन के लिए 1.4 एमडब्ल्यू लेजर पावर पर उपयुक्त हैं। वेग विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त अधिग्रहण समय 3 मिनट है।
  4. नॉनमस्कल मायोसिन 2b टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी परख का प्रदर्शन
    नोट: इस खंड में, पॉलीमराइज्ड और फॉस्फोरिलेटेड फिलामेंट्स का उपयोग करके नॉनमस्क्ले मायोसिन 2b टीआईआरएफ परख का विवरण प्रदान किया जाता है। एक ट्यूब में नॉनमस्कल मायोसिन-2बी को फॉस्फोरिलाटिंग और पॉलीमराइज करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल (सेक्शन 4.1-4.3) शामिल है।
    1. शुद्ध एनएम 2बी को फॉस्फोरलेट करने के लिए, निम्नलिखित शर्तों के साथ 10x किनेस मिश्रण बनाएं: 2 mM CaCl2,1 माइक्रोन सीएएम, 1-10 एनएम एमसीएलके, और 0.1 एमएम एटीपी। इसमें 10 एमएम डीटीटी के साथ 500 एमएम एमबी के साथ वॉल्यूम लाया जा सकता है। 1:10 के वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में मायोसिन में 10x किनेज़ मिश्रण जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। आमतौर पर, इस चरण के लिए मायोसिन एकाग्रता 1 माइक्रोन है।
    2. फॉस्फोरिलेटेड मायोसिन को फिलामेंट्स में पॉलीमराइज करने के लिए, एनएम2बी की नमक एकाग्रता को 150 mM NaCl तक कम करें। ऐसा करने के लिए, डीएच 2 ओ में चार बार 4x एमबी को पतला करके नमक नहीं के साथ 1x मोटिविटी बफर(1xएमबी) बनाएं। इस 1x एमबी का उपयोग नमक एकाग्रता को कम करने के लिए किया जा सकता है क्योंकि एनएम2बी 500 mm नमक बफर में जमे हुए थे।
    3. स्टॉक एनएम2बी के हर 3 माइक्रोन के लिए, 1x एमबी के 7 माइक्रोन जोड़ें ताकि नमक एकाग्रता को 150 एमएल NaCl तक कम किया जा सके और एनएम2बी फिलामेंट्स बनाने के लिए 20-30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट किया जा सके।
      नोट: धारा 4.1-4.3 में आदेश महत्वपूर्ण नहीं है जब तक NM2b फॉस्फोरिलेटेड है और अंतिम नमक एकाग्रता 150 mM है। 30 मिनट-1 एच के आदेश पर इनक्यूबेशन पूर्ण फॉस्फोरिलेशन और बहुलीकरण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है।
    4. टेबल 3 में वर्णित नॉनमस्कल मायोसिन 2b उल्टे गतिशीलता परख के लिए समाधान तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    5. 1 एमएम डीटीटी के साथ 150 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से चैंबर धोएं।
    6. 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 10 माइक्रोन में प्रवाह 1 mm DTT के साथ 150 mm MB में इस धोने दो बार और तीसरे धोने के बाद 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । चैनल के माध्यम से समाधान बाती करने के लिए एक ऊतक कागज या फिल्टर पेपर के कोने का उपयोग करें।
    7. 1 एमएम डीटीटी के साथ 150 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    8. 1 mm DTT के साथ 150 mM MB में न्यूट्रिशन डिल्विडिन सॉल्यूशन के 10 माइक्रोल में फ्लो करें और 1 मिनट तक इंतजार करें।
    9. 1 एमएम डीटीटी के साथ 150 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    10. 10 μL में प्रवाह bRh-Actin और 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । इस चरण के लिए, एक बड़े-ऊब पिपेट टिप का उपयोग करें और फ्लोरोसेंट ऐक्टिन फिलामेंट्स के कतरन को कम करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग से बचें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि लंबे ऐक्टिन फिलामेंट्स सतह (20-30 माइक्रोन या उससे अधिक) से जुड़े हो सकते हैं। एक प्रभावी विकल्प एक मानक पिपेट टिप के शंकु को काट रहा है।
    11. 1 एमएम डीटीटी के साथ 150 एमएम एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    12. नॉनमस्कल मायोसिन 2बी समाधान (लगभग 30 एनएम) के 10 माइक्रोन में प्रवाह करें और 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    13. 1 एमएम डीटीटी के साथ 150 एमबी के 10 माइक्रोल से धोएं। इस धो को दो बार और दोहराएं।
    14. अंतिम बफर के 30 μL में प्रवाह, तो तुरंत TIRF माइक्रोस्कोप पर लोड और TIRF इमेजिंग तौर तरीके के लिए इष्टतम ध्यान खोजने के बाद रिकॉर्ड । 100-200 एमएस के बीच एक्सपोजर समय ऐक्टिन और जीएफपी-लेबल मायोसिन के लिए 1.4 एमडब्ल्यू लेजर पावर पर उपयुक्त हैं। वेग विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त अधिग्रहण समय 3 मिनट है।

4. छवि विश्लेषण

  1. ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख के लिए छवि विश्लेषण
    नोट: छवियों सॉफ्टवेयर और सामग्री की सूची में जुड़े मैनुअल का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यहां वर्णित कार्यक्रम के विश्लेषण के लिए झगड़ा-ढेर की आवश्यकता होती है। ग्लाइडिंग ऐक्टिवेशन फिलामेंट परख का विश्लेषण करने की प्रक्रिया इस प्रकार है50.
    1. एक निर्दिष्ट फ़ोल्डर संरचना में कच्चे फिल्म ढेर अपलोड करें और कार्यक्रम में फिल्म फ़ोल्डर्स की शीर्ष सबसे निर्देशिका इनपुट करें।
      नोट: कार्यक्रम इस निर्देशिका और उपनिर्देशिकाओं में फ़ाइलों का विश्लेषण करता है, जो सबसे निचले स्तर की निर्देशिका को प्रतिकृति के रूप में मानते हैं। प्रतिकृति के प्रत्येक समूह के लिए औसत आंकड़े का उत्पादन किया जाएगा । इस मामले में, प्रत्येक मायोसिन के लिए एक ही फिल्म का उपयोग किया गया था। जब एक उपन्यास मायोसिन की विशेषता या एक नई प्रयोगात्मक स्थिति की जांच, यह तीन कक्षों की कुल के लिए प्रति कक्ष तीन क्षेत्र से फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए और मायोसिन की तीन तैयारी के लिए इस कार्यप्रवाह दोहराने की सिफारिश की जा रही है जांच की जा रही है ।
    2. प्रत्येक टिफ स्टैक को एक फ़ोल्डर में बदलने के लिए उपयोगकर्ता-इनपुट फ़्रेम दर के साथ स्क्रिप्ट "स्टैक2टिफ्स" का उपयोग करें जिसमें व्यक्तिगत झगड़ा फ़ाइलों की एक श्रृंखला और एक संबंधित मेटाडेटा.txt प्रत्येक फ्रेम के शुरुआती समय वाली फ़ाइल शामिल है। झगड़ा स्टैक प्रारूप में नहीं डेटा के लिए, एक रूपांतरण पहले सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध उन जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लागू किया जाना चाहिए ।
      नोट: यह स्क्रिप्ट सॉफ्टवेयर पैकेज का हिस्सा है। स्क्रिप्ट की जानकारी यहां पाया जा सकता है: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. अधिग्रहण के दौरान -px पैरामीटर का उपयोग करें, जो पिक्सेल आकार (एनएम में) है। इस मामले में, पिक्सेल का आकार 130 एनएम है। स्कैटर प्लॉट आउटफिट्स के लिए कुल्हाड़ियों को स्केल करने के लिए -xmax और -ymax पैरामीटर का उपयोग करें। ये सबसे लंबे समय तक प्लॉट किए गए फिलामेंट लंबाई और अधिकतम प्लॉट किए गए वेग (एनएम/एस में) के अनुरूप हैं।
      नोट: ये अनुमानित मान हैं और यह सुनिश्चित करने के लिए उच्च-अपेक्षा मानों के लिए सेट किए जा सकते हैं कि डेटा प्लॉट में निहित हो। विश्लेषण के बाद, कच्चे डेटा को देखने और विश्लेषण के लिए अन्य सांख्यिकीय या रेखांकन सॉफ्टवेयर में उपयोग के लिए भी निर्यात किया जा सकता है।
    4. -minv पैरामीटर का उपयोग करें, जो एक न्यूनतम वेग कटऑफ पैरामीटर है, उन फिलामेंट्स को परिभाषित करने के लिए जो आगे नहीं बढ़ रहे हैं, और इसलिए, विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है। एनएम 2बी जैसे धीमे मायोसिन के लिए, यह पैरामीटर कम होना चाहिए (इस उदाहरण में, 5 एनएम/एस) सच्चे ग्लाइडिंग आंदोलनों को काटने से बचने के लिए। M5a जैसे तेज मायोसिन के लिए, यह पैरामीटर सही ग्लाइडिंग गति वितरण को बनाए रखते हुए अधिक कठोर फिल्टर लागू करने के लिए (इस उदाहरण में, 100 एनएम/एस) अधिक हो सकता है।
    5. चिकनी गति की पहचान करने के लिए -pt कटऑफ पैरामीटर का उपयोग करें। प्रत्येक नमूना खिड़की के लिए, एक मूल्य १०० एक्स वेग मानक विचलन/मतलब वेग के बराबर की गणना की है । कटऑफ की तुलना में उच्च मूल्यों वाले ट्रैक, अधिक परिवर्तनीय वेग हैं और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया है। इस उदाहरण में 33 की कटऑफ वैल्यू का इस्तेमाल किया गया। उच्च मूल्यों वाले ट्रैक में अधिक परिवर्तनीय वेग होते हैं और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाता है।
    6. फ्रेम के बीच अधिकतम अनुमेदित लिंकेज दूरी निर्धारित करने के लिए -maxd का उपयोग करें। यह एनएम की इकाइयों में फिलामेंट के केंद्र द्वारा स्थानांतरित एक गणना फ्रेम-टू-फ्रेम दूरी है। यह छिटपुट आंदोलनों या तंतुओं के बीच गलत संबंध को छोड़कर उपयोगी हो सकता है। यहां के उदाहरणों में पैरामीटर को 2,000 एनएम के डिफॉल्ट वैल्यू पर छोड़ दिया गया था।
  2. TIRF माइक्रोस्कोपी परख के लिए छवि विश्लेषण
    नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर एकल अणु TIRF परख का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रिया विशेष रूप से में सूचीबद्ध सामग्री की तालिका इस प्रकार है29.
    1. क्लिक करें और सॉफ्टवेयर के कार्यक्षेत्र के लिए रिकॉर्ड माइक्रोस्कोपी वीडियो खींचें इसे खोलने के लिए५१। फिर, अधिग्रहण चैनलों को विभाजित करें। इमेज > कलर > स्प्लिट चैनल्सपर क्लिक करें ।
      नोट: अधिग्रहण के दौरान प्रशंसनीय चरण बहाव की स्थिति में, छवियों इमेजिंग विमान पर वाद्य बहाव को सही करने के लिए स्थिर किया जाना चाहिए । इस मामले में, जेड-एक्सिस बहाव के लिए कोई मुआवजा इस डेटा को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप के रूप में उपयोग नहीं किया गया था जेड-फोकस अच्छी तरह से स्थिर करता है। छवि विश्लेषण कार्यक्रम पर छवि को स्थिर करने के लिए, उपयुक्त स्टेबलाइजर प्लग-इन स्थापित करें जो सामग्री की सूचीसे जुड़ा हुआ है। छवि स्टेबलाइजर छवि में वस्तुओं के लिए निश्चित स्थिति मानता है और संदर्भ के रूप में पिछले फ्रेम के रोलिंग औसत का उपयोग करता है। इसलिए अनुशंसित प्रक्रिया चैनल के साथ शुरू होनी है जिसमें लेबल किए गए ऐक्टिन की छवियां हैं, क्योंकि यह एक निश्चित स्थिति में है।
    2. प्लगइन्सपर क्लिक करें, फिर इमेज स्टेबलाइजरढूंढें ; यह सुनिश्चित करें कि अनुवाद का चयन किया जाता है और डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखते हैं। लॉग ट्रांसफॉर्मेशन गुणांकके बगल में बॉक्स की जांच करें । इस लॉग चरण को लागू करने से गणना किए गए बदलाव के मापदंडों को अगले चरण में दूसरे चैनल पर लागू करने की अनुमति देता है। प्रक्रिया को पूरा करने के लिए अनुमति दें।
    3. फिर, लेबल वाले मायोसिन के साथ चैनल खोलें और प्लगइन्स > इमेज स्टेबलाइजर लॉग एप्रूडरपर क्लिक करके स्थिरीकरण लागू करें। यदि एक ही चैनल में उच्च दर इमेजिंग के लिए आवश्यकता के कारण एक ही अधिग्रहण के दौरान ऐक्टिन की छवियों का अधिग्रहण नहीं किया जा सकता है, तो बहाव एक ऐसे क्षेत्र का चयन करके छवियों के ढेर को स्थिर करता है जिसमें एक बायोटिनाइलेटेड प्रत्यूषी मार्कर या फ्लोरोफोरस जैसी स्थिर वस्तुएं शामिल हैं, विशेष रूप से बायोटिन-खूंटी सतह पर। इस क्षेत्र को मूल स्टैक से क्रॉप किया जा सकता है और स्थिर किया जा सकता है, जिसके बाद परिणामस्वरूप बदलाव मूल्यों को मूल स्टैक में लागू किया जा सकता है।
      नोट: व्यवहार में, गतिशीलता प्रयोगों में मनाया बहाव myosins जो कई सौ एनएम/s पर कदम की गति के सापेक्ष नगण्य होगा, लेकिन धीमी myosins के लिए यह एक महत्वपूर्ण विचार हो जाता है ।
    4. फिर, ट्रैकमेट खोलें, प्लगइन्सपर क्लिक करें; फिर, इसके ड्रॉपडाउन मेनू में ट्रैकिंग पर क्लिक करें और अंत में TrackMateपर . इस बिंदु पर, छवि विश्लेषण फ्लोरोफोर और परख शर्तों के मापदंडों के आधार पर अनुकूलन के अधीन है। हालांकि, आदर्श शुरुआती पैरामीटर इस प्रकार हैं।
      1. अंशांकन सेटिंग्स: सभी डिफ़ॉल्ट मान रखें।
      2. डिटेक्टर: एलओजी डिटेक्टर।
      3. अनुमानित ब्लॉब व्यास: 0.5-1.0 माइक्रोन।
      4. सीमा: 25-200। (यह देखने के लिए कि पता लगाया स्पॉट फिल्म के लिए मैच और उचित समायोजन करने के लिए एक नंबर चुनने के बाद पूर्वावलोकन पर क्लिक करके निर्धारित किया जा सकता है.)
      5. प्रारंभिक सीमा: सेट नहीं है।
      6. देखें: हाइपरस्टैक डिस्प्लेर।
      7. स्पॉट पर फ़िल्टर सेट करें: सेट नहीं।
      8. ट्रैकर: सरल गोद ट्रैकर।
        नोट: ये फ्रेम दर और मायोसिन वेग पर निर्भर करते हैं और विभिन्न कणों के बीच अवांछित कनेक्शन को छोड़कर बाद की स्थितियों को जोड़ने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए।
      9. अधिकतम दूरी को जोड़ना: 1.0 माइक्रोन।
      10. गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी: 1.0 माइक्रोन।
      11. गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप: 1।
      12. पटरियों पर फ़िल्टर सेट करें: ट्रैक विस्थापन (>0.39-केवल 3 पिक्सल से अधिक चलने वाले स्पॉट), पटरियों में स्पॉट (>3-कम से कम 3 स्थानों के साथ केवल पटरियों को शामिल करने के लिए)। लंबे समय तक स्टाल करने वाले स्थानों को बाहर करने के लिए न्यूनतम वेग जैसे अन्य फ़िल्टर पेश किए जा सकते हैं। फिल्टरिंग के परिणामों को पटरियों के दृश्य निरीक्षण द्वारा जांचा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऐक्टिन से जुड़े पटरियों को बनाए रखते हुए पृष्ठभूमि में नकली पटरियों (यानी, मायोसिन आंदोलन जो एक ऐक्टिन ट्रैक के साथ नहीं है) को हटा दिया जाता है।
    5. एक बार डिस्प्ले ऑप्शन स्क्रीन आने के बाद, संबंधित आउटपुट के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें। उत्पादित तीन तालिकाओं को सहेजें (ट्रैक सांख्यिकी, ट्रैक सांख्यिकी में लिंक, और ट्रैक सांख्यिकी में स्पॉट)। ट्रैक सांख्यिकी तालिका में वेग और विस्थापन डेटा शामिल होंगे जिसे बाद में एक उपन्यास प्रोटीन या एक निश्चित प्रयोगात्मक स्थिति के प्रभावों की विशेषता के लिए विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए।

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Representative Results

मायोसिन के शुद्धिकरण का मूल्यांकन सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट-पॉलीएक्रिलेमाइड (एसडीएस-पेज) जेल-इलेक्ट्रोफोरेसिस को कम करके किया जा सकता है जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है । हालांकि यह आंकड़ा अंतिम, पोस्ट-डायलिज्ड मायोसिन का प्रतिनिधित्व करता है, एसडीएस-पेज को अधिप्रांत से खोए गए किसी भी उत्पाद की पहचान करने के लिए शुद्धिकरण प्रक्रिया के विभिन्न चरणों से अलीकोट पर किया जा सकता है। मायोसिन 5ए एचएमएम में 120-130 केडीए रेंज में एक बैंड है और पूर्ण लंबाई वाले नॉनमस्कल मायोसिन 2बी में 200-230 केडीए रेंज में एक बैंड है, जो भारी चेन29,44के अनुरूप है। मायोसिन 5ए में 17 केडीए मार्क के पास एक बैंड भी है, जो calmodulin को चिह्नित करता है । नॉनमस्कल मायोसिन 2बी में लगभग 17 केडीए पर एक बैंड है, जो ईएलसी को दर्शाता है। क्योंकि इस एनएम 2बी तैयारी में जीएफपी-टैग किए गए आरएलसी मौजूद हैं, इसलिए आरएलसी लगभग 47 केडीए पर दिखाई देती है; हालांकि, एक अवेलेबल आरएलसी लगभग 20 केडीए पर मौजूद होगा यदि जीएफपी के साथ टैग नहीं किया गया है।

वीडियो 1 और चित्रा 3 में दिखाया गया ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख एक आदर्श और ट्रैक करने योग्य फिल्म की विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करता है। इस ग्लाइडिंग ऐक्टिवमेंट परख में लेबल किए गए ऐक्टिन फिलामेंट्स की चिकनी मूवमेंट की सुविधा है । ब्लैक ऐक्टिन वॉश यह सुनिश्चित करता है कि मृत मायोसिन सिर माप क्षेत्र से हटा दिए जाते हैं, और ऐक्टिन फिलामेंट्स के समग्र चिकनी आंदोलन में योगदान देते हैं। फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए फिलामेंट्स काफी कम हैं कि एक भी तंतु खुद पर पार नहीं करता है, जो ट्रैकिंग प्रोग्राम के लिए अधिक इष्टतम है। ऐक्टिन फिलामेंट्स जो बहुत लंबे हैं, अन्य फिलामेंट्स को पार कर जाएंगे, जो ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख ट्रैकिंग प्रोग्राम में कठिनाइयों को पेश कर सकते हैं। इस समस्या को कवरस्लिप पर लोड करने से पहले ऐक्टिन फिलामेंट्स को कतरनी के लिए 10-20 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके टाला जा सकता है।

एनएम2बी के मामले में, मिथाइलसेल्यूलोस का उपयोग रिकॉर्ड की गई फिल्मों की गुणवत्ता में काफी सुधार कर सकता है क्योंकि यह इमेजिंग सतह से दूर ऐक्टिन के प्रसार को कम करता है। यह M5a के लिए आवश्यक नहीं है क्योंकि इसका उच्च शुल्क अनुपात मायोसिन-लेपित सतह के लिए ऐक्टिन के मजबूत लगाव के लिए अनुमति देता है। यदि मिथाइलसेल्यूलोस का उपयोग किया जाता है, तो समाधान को सुनिश्चित करने के लिए कक्ष के माध्यम से समाधान को बात करना आवश्यक है। जैसा कि वीडियो 2में दिखाया गया है, जब मेथाइलसेल्यूलोस के बहिष्कार के अलावा अन्य सभी स्थितियां समान हैं, तो ऐक्टिन फिलामेंट्स मायोसिन-लेपित सतह से निकटता से जुड़े नहीं रहते हैं।

इसके विपरीत, वीडियो 3 और चित्रा 4 में दिखाए गए उल्टे गतिशीलता परख के लिए लक्ष्य सतह-सीमित फ्लोरोसेंट ऐक्टिन फिलामेंट्स को पेश करना है जिस पर मायोसिन आंदोलन देखा जा सकता है। उल्टे परख की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता यह सुनिश्चित करना है कि मायोसिन आंदोलन लगातार एफओवी में मनाया जाता है, जैसा कि दिखाया गया है। डीटीटी, ग्लूकोज, कैटालेस और ग्लूकोज ऑक्सीडेस के मिश्रण का उपयोग लंबे माप52के लिए अनुमति देने के लिए फोटोब्लैचिंग को कम कर सकता है। इसके अलावा, यदि परख के लिए अधिग्रहण की दर कम है, तो फ्रेम प्राप्त करने के बीच रोशनी प्रकाश को बंद करना अत्यधिक फोटोब्लैचिंग में मदद कर सकता है। उत्तेजना प्रकाश का शटरिंग एक यांत्रिक शटर, या एक एसी्टो-ऑप्टिक ट्यूनेबल फिल्टर (एओटीएफ) के माध्यम से किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:कार्यात्मक प्रवाह-सेल कक्षों की तैयारी। (ए)एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ शुरू करें, डबल-तरफा टेप के दो टुकड़े लगभग 2 सेमी तक कट गए, और एक कार्यात्मक कवर्लिपी। (ख)माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में टेप जोड़ें । (ग)टेप को कोटिंग (यानी, नाइट्रोसेल्यूलोस) के साथ कवरस्लिप को नीचे का सामना करना पड़ रहा है और धीरे से टेप के साथ ओवरलैपिंग क्षेत्रों पर एक प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग करके प्रेस करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कवरस्लिप ने चैंबर का पालन किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:व्यक्त एनएम 2बी और एम5ए-एचएमएम के एसडीएस पॉलीएक्रिअलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस। (A)एक प्रतिनिधि एसडीएस पेज जेल छवि एक पूर्ण लंबाई NM2b भारी श्रृंखला (≈230 केडीए) और GFP-RLC (≈47 केडीए) और ईएलसी (≈17 केडीए) के लिए । जेल छवि पुन: पेश और मेल्ली एट अल से संशोधित (२०१८)29। (ख)M5a-HMM की तरह भारी श्रृंखला (≈१२० केडीए) और calmodulin (≈17 केडीए) के लिए एक प्रतिनिधि SDS पेज जेल छवि । ध्यान दें कि इस छवि में जेल में सी-टर्मिनल छोर पर GFP डाला नहीं गया है। मायोसिन हैवी चेन में डाला गया जीएफपी ≈27 केडीए द्वारा आणविक वजन बढ़ाता है। जेल छवि पुन: उत्पन्न और संशोधित मूल रूप से जैविक रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था44. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:ग्लिडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख परिणाम TIRF रोशनी के माध्यम से प्राप्त किए गए।(ए)एक फिल्म से उदाहरण फ्रेम जिसमें रोडामाइन-फॉलोइडिन लेबल वाले ऐक्टिन फिलामेंट्स (लाल रंग में) का स्थानांतरण 0.2 माइक्रोन एनएम एनएम2बी पर 0.7% मिथाइलसेलुलोस की उपस्थिति में 30 डिग्री सेल्सियस पर दिखाया गया है। स्केल बार = 10 माइक्रोन (बी)NM2b के लिए FASTrack कार्यक्रम से एक ही FOV के लिए छवि उत्पादन पर नज़र रखने के रूप में(एक)स्केल बार = 10 माइक्रोन में दिखाया गया है ।(ग)एसीको-एनएम2बी ग्लाइडिंग वेग के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम, यह दिखाते हुए कि एनएम2बी का यह नमूना 77 ± 15 एनएम/एस (मतलब ± मानक विचलन; पटरियों की संख्या = 550) का एक ऐक्टिन ग्लाइडिंग वेग उत्पन्न कर सकता है। (घ)75 एनएम एम5ए-एचएमएम पर रोडामाइन-̈लओडिन लेबल वाली ऐक्टिन फिलामेंट्स (लाल रंग में) के स्थानांतरण को दिखाने वाली फिल्म से उदाहरण फ्रेम। स्केल बार = 10 माइक्रोन(ई)एक ही FOV के लिए M5a-HMM के लिए FASTrack कार्यक्रम द्वारा फिलामेंट ट्रैकिंग छवि उत्पादन के रूप में(डी)स्केल बार = 10 माइक्रोन में दिखाया गया है ।(F)एक्टो-एम5ए-एचएमएम ग्लाइडिंग वेग का एक प्रतिनिधि हिस्टोग्राम, यह दिखाता है कि M5a का यह नमूना 515 ± 165 एनएम/एस (मानक विचलन ± मतलब; पटरियों की संख्या = 25098) का एक ऐक्टिन ग्लाइडिंग वेग उत्पन्न कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:तिरफ रोशनी के माध्यम से प्राप्त उल्टे परख परिणाम। (A)एक दो चैनल विलय छवि ढेर से एक प्रतिनिधि FOV NM2b फिलामेंट्स के आंदोलन को दिखाता है (हरे रंग में प्रदर्शित) बायोटिनाइलेटेड ऐक्टिन फिलामेंट्स पर AF647-फीलॉइडिन (नीले रंग में प्रदर्शित) के साथ लेबल किया गया 30 डिग्री सेल्सियस पर । ELC और GFP-RLC के साथ सह-व्यक्त किए गए पुनः संयोजन के बहुलक तंतुओं को एफओवी में हरे, लम्बी कणों के रूप में मनाया जाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन(बी)NM2b तंतु के वेग के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम। सामग्रीकी तालिका में वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। एकल एनएम2बी फिलामेंट्स में 84 ± 22 एनएम/एस (मानक विचलन ± मतलब; ट्रैक किए गए कणों की संख्या = 133) का वेग होता है, जब एकल ऐक्टिन फिलामेंट्स के साथ आगे बढ़ते हैं। (ग)एक ही ऐक्टिन फिलामेंट के साथ एनएम2बी फिलामेंट मोशन का उदाहरण कायनात । ध्यान दें कि कण के कुछ क्षेत्रों में एनएम 2बी फिलामेंट का "रोटेशन" दिखाई देता है, जो ऐक्टिन फिलामेंट के साथ है, जो सबसे अधिक संभावना उस समय का प्रतिनिधित्व करता है जब बाईपोलर एनएम 2बी फिलामेंट के एक तरफ ऐक्टिन फिलामेंट से टुकड़ी होती है, जैसा कि पहले मेली एट अलअल 29में दिखाया गया है। (घ)रोडामाइन-फालोइडिन (लाल रंग में प्रदर्शित) के साथ लेबल बायोटिनिलेटेड ऐक्टिन फिलामेंट्स पर एकल अणु आंदोलन M5a-HMM (हरे रंग में प्रदर्शित) का एक प्रतिनिधि FOV । स्केल बार = 10 माइक्रोन.(ई)M5a-HMM की रन लंबाई के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम, एक ही घातीय के लिए फिट बैठते हैं । सामग्रीकी सूची में वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। इस उदाहरण में 1.23-1.42 माइक्रोन के 95% आत्मविश्वास अंतराल के साथ विशेषता रन लंबाई 1.3 माइक्रोन है। (च)एकल ऐक्टिन फिलामेंट्स पर एकल अणु एम5ए-एचएमएम वेग का प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । छवि विश्लेषण से डेटा उत्पादन का विश्लेषण ६६८ ± २५८ एनएम/एस (मानक विचलन ± मतलब; ट्रैक किए गए कणों की संख्या = ६८४) का एक मतलब वेग दिखाता है । (जी)एक ही ऐक्टिन फिलामेंट के साथ M5a-HMM गति के एकल अणुओं का उदाहरण कायनाग्राफ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: NM2b और M5a-HMM ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख की तुलना । एनएम2बी ग्लाइडिंग ऐक्टिंग फिलामेंट परख 30 डिग्री सेल्सियस पर मिथाइलसेलुलोस (बाएं; वीडियो पैनल ए) और एम5ए-एचएमएम की अनुपस्थिति में मेथाइलसेल्यूलोस (दाएं; वीडियो पैनल बी) की उपस्थिति में किया गया था । ध्यान दें कि एनएम 2बी वीडियो पैनल में समय स्टांप तेजी से आगे बढ़ता है, M5a-HMM वीडियो पैनल की तुलना में रोडामाइन-लेबल वाले ऐक्टिन फिलामेंट्स (लाल) के आंदोलन को दिखाने के लिए जो लगभग समान है। यह इसलिए है क्योंकि एनएम 2बी का वास्तविक ऐक्टिन ट्रांसलोकेशन वेग एम5ए-एचएमएम (77 एनएम/एस, बनाम 515 एनएम/एस, क्रमशः, गॉसियन पीक फिट से चित्र 3में हिस्टोग्राम तक निकाले गए) के लिए 7 गुना धीमी है। स्केल बार = दोनों वीडियो पैनलों में 10 माइक्रोन। एनएम2बी डेटा 200 एमएस एक्सपोजर के साथ 0.33 फ्रेम प्रति सेकंड पर हासिल किया गया। M5a-HMM डेटा 200 एमएस एक्सपोजर (निरंतर) के साथ प्रति सेकंड 5 फ्रेम पर अधिग्रहीत और बाद में नीचे 1 फ्रेम प्रति सेकंड के लिए नमूना। सामग्रियोंकी सूची में वर्णित प्लगइन का उपयोग करके टाइमस्टैंप जोड़े गए थे । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: मिथाइलसेल्यूलोज की अनुपस्थिति में एनएम 2बी की ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख। जब मेथाइलसेल्यूलोस की अनुपस्थिति को छोड़कर अन्य सभी स्थितियां समान होती हैं, तो ऐक्टिन फिलामेंट्स कभी-कभी 0.2 माइक्रोन एनएम एनएम 2बी के साथ लेपित कवरस्लिप के लिए अच्छी तरह से चिपक नहीं जाते हैं, जिससे एनएम2बी कोटेड कवर्लिक की सतह के करीब ऐक्टिन फिलामेंट्स "फ्लॉपिंग" के साथ कम गुणवत्ता वाली फिल्में होती हैं। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इसे ऐक्टिन फिलामेंट्स की चिकनी गति दिखाने के लिए मिथाइलसेलुलोस शुरू करके हल किया जा सकता है, जैसा कि वीडियो 1 (एनएम2बी ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख) के बाएं वीडियो पैनल में दिखाया गया है। एक अन्य विकल्प NM2b एकाग्रता को ≈1 माइक्रोन में बढ़ाना है। इस फिल्म को २०० एमएस एक्सपोजर के साथ ०.३३ फ्रेम प्रति सेकंड पर हासिल किया गया था । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 3: NM2b और M5a-HMM उल्टे गतिशीलता परख की तुलना । NM2b उल्टे गतिशीलता परख मिथाइलसेल्यूलोस की उपस्थिति में किया गया था और एक शटर (बाएं; वीडियो पैनल ए) के उपयोग के साथ प्रति सेकंड ०.३३ फ्रेम की दर से दर्ज की गई, वीडियो पैनल सी एक के रूप में एक ही FOV से पता चलता है, लेकिन कणों के साथ पहचान और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्रैक कर रहे हैं । इसी तरह, मिथाइलसेल्यूलोस की अनुपस्थिति में M5a-HMM के लिए उल्टे गतिशीलता परख 5 फ्रेम प्रति सेकंड (दाएं; वीडियो पैनल बी) की दर से दर्ज की गई थी । वीडियो पैनल डी बी के रूप में एक ही FOV से पता चलता है, लेकिन पहचान और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ट्रैक कणों के साथ । स्केल बार = सभी वीडियो पैनलों में 10 माइक्रोन। दो लेजर अधिग्रहण के लिए एक ही कैमरे के उपयोग के साथ आगे पीछे टॉगल थे । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

बफर नाम संयोजन चरण (ओं) का उपयोग किया जाता है टिप्पणियाँ
M5a निष्कर्षण बफर 0.3 एम एनएसीएल 1.1 बर्फ पर रखें।
15 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2
15 एमएमएम एमजीसीएल2
1.5 m EGTA
4.5 mM NaN3
एनएम2बी एक्सट्रैक् फिर बफर 0.5 एम एनएसीएल 1.1 बर्फ पर रखें।
15 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2
15 एमएमएम एमजीसीएल2
1.5 m EGTA
4.5 mM NaN3
बफर ए 0.5 एम एनएसीएल 2.2 बर्फ पर रखें।
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
3 एमएमएन3
1 एमएमएम एटीपी
1 एमएमए डीटीटी
5 एमएमएम एमजीसीएल2
बफर बी 0.5 एम एनएसीएल 2.3 बर्फ पर रखें।
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
3 एमएमएन3
1 एमएमए डीटीटी
एल्यूशन बफर 0.5 एम एनएसीएल 3.1 बर्फ पर रखें।
0.5 मिलीग्राम/एमएल फ्लैग पेप्टाइड
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
3 एमएमएन3
पीएच 7.2
M5a डायलिसिस बफर 500 एमएमएल केसीएल 4.1 मात्रा में लाने के लिए कोल्ड डीएच2ओ का उपयोग करें।
10 एमएमएम एमजीसीएल2
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
1 एमएमए डीटीटी
एनएम2बी डायलिसिस बफर 25 एमएमएल एनएसीएल 4.1 मात्रा में लाने के लिए कोल्ड डीएच2ओ का उपयोग करें।
10 एमएमएम एमजीसीएल2
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
1 एमएमए डीटीटी
एनएम2बी स्टोरेज बफर 0.5 एम एनएसीएल 5.1 बर्फ पर रखें।
10 mM MOPS, पीएच 7.2
0.1 m EGTA
3 एमएमएन3

तालिका 1: प्रोटीन शुद्धिकरण में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स।

बफर नाम रचना (M5a) संरचना (एनएम2बी) चरण (एस) प्रयुक्त (M5a/NM2b) टिप्पणियाँ
4X मोटिविटी बफर (4X एमबी) 80 mM MOPS, पीएच 7.2 80 mM MOPS, पीएच 7.2 वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
20 एमएमएम एमजीसीएल2 20 एमएमएम एमजीसीएल2
0.4 m EGTA 0.4 m EGTA
पीएच 7.4 पीएच 7.4
50 mm नमक गतिशीलता बफर (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
50 एमएमएम केसीएल 50 एमएमएम एनएसीएल
डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं
500 mm नमक गतिशीलता बफर (500 mm MB) N/A 25% v/v 4X MB वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
500 एमएमएल एनएसीएल
डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं
मायोसिन 0.05-0.1 माइक्रोनम मायोसिन 0.2 माइक्रोनम मायोसिन 4.2/5.2 बर्फ पर रखें।
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 MM एमबी में तनु 500 MM एमबी में तनु
1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 4.3/5.3 बर्फ पर रखें।
50 MM एमबी में तनु 500 MM एमबी में तनु
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 m MB MB (ब्लैक ऐक्टिन) में 5 माइक्रोन अलेबल एफ-ऐक्टिन 5 माइक्रोन अवेलेबल एफ-ऐक्टिन 5 माइक्रोन अवेलेबल एफ-ऐक्टिन 4.5/5.5 बर्फ पर रखें। कतरनी ऐक्टिन 5-10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके, या सिरिंज का उपयोग करके।
1 माइक्रोन कैलमोडुलिन (सीएएम) 1 एमएमएम एटीपी
1 एमएमएम एटीपी 0.2 एमएमएल सीसीएल2
50 MM एमबी में तनु 1 माइक्रोन कैट
1-10 एनएम मायोसिन लाइट चेन किनेज (एमएलकेके)
50 MM एमबी में तनु
एमबी के साथ 1 एमएम डीटीटी और 1 एमएम एटीपी 1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी 4.6/5.6 बर्फ पर रखें।
1 एमएमएम एटीपी 1 एमएमएम एटीपी
50 MM एमबी में तनु 50 MM एमबी में तनु
डीटीटी के साथ एमबी 1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 बर्फ पर रखें।
50 MM एमबी में तनु 50 MM एमबी में तनु
20 एनएम रोडामाइन-फल्लोइडिन एफ-ऐक्टिन (आरएच-ऐक्टिन) 20 एनएम रोडामाइन-पीएलोडिन एफ-ऐक्टिन 20 एनएम रोडामाइन-पीएलोडिन एफ-ऐक्टिन 4.8/5.8 बर्फ पर रखें। भंवर न करें।
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 MM एमबी में तनु 50 MM एमबी में तनु
अंतिम बफर 50 एमएमएम केसीएल 0.7% मिथाइलसेलुलोस (वैकल्पिक) 4.10/5.10 प्रयोग करने से तुरंत पहले ग्लूकोज, ग्लूकोज ऑक्सीडेस और कैटलाज़ में जोड़ें। बर्फ पर रखें।
20 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2 50 एमएमएम एनएसीएल
5 एमएमएम एमजीसीएल2 20 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2
0.1 m EGTA 5 एमएमएम एमजीसीएल2
1 एमएमएम एटीपी 0.1 m EGTA
50 एमएन डीटीटी 1 एमएमएम एटीपी
1 माइक्रोन कैलमोडुलिन 50 एमएन डीटीटी
2.5 मिलीग्राम प्रति एमएल ग्लूकोज 1-10 एनएम एम सीके
100 माइक्रोग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस 0.2 एमएमएल सीसीएल2
40 μg/एमएल कैटालेज़ 1 माइक्रोन कैलमोडुलिन
2.5 मिलीग्राम प्रति एमएल ग्लूकोज
100 माइक्रोग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस
40 μg/एमएल कैटालेज़

तालिका 2: ग्लाइडिंग परख में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स।

बफर नाम रचना (M5a) संरचना (एनएम2बी) चरण (एस) प्रयुक्त (M5a/NM2b) टिप्पणियाँ
4X मोटिविटी बफर (4X एमबी) 80 mM MOPS, पीएच 7.2 80 mM MOPS, पीएच 7.2 वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
20 एमएमएम एमजीसीएल2 20 एमएमएम एमजीसीएल2
0.4 m EGTA 0.4 m EGTA
पीएच 7.4 पीएच 7.4
50 एमएम नमक मोति बफर (50 एमएम एमबी) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
50 एमएमएम केसीएल 50 एमएमएम एनएसीएल
डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं
150 एमएम नमक मोतिलिटी बफर (150 एमएम एमबी) 25% v/v 4X MB वैक्यूम फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर
150 एमएमएल एनएसीएल
डीएच2ओ के साथ मात्रा तक बढ़ाएं
मायोसिन 30 एनएम मायोसिन देखें "अंतिम बफर" नुस्खा/ बर्फ पर रखें।
1 एमएमए डीटीटी
150 MM एमबी में तनु
2 मिलीग्राम/एमएल न्यूट्राडिन 2 मिलीग्राम/एमएल न्यूट्राडिन 2 मिलीग्राम/एमएल न्यूट्राडिन 3.5/4.8 बर्फ पर रखें।
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 MM एमबी में तनु 150 MM एमबी में तनु
1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 1 मिलीग्राम/एमएल बीएसए 3.3/4.6 बर्फ पर रखें।
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 MM एमबी में तनु 150 MM एमबी में तनु
200 एनएम रोडामाइन-फालॉइडिन बायोटिनिलेटेड एफ-ऐक्टिन (बीआरएच-ऐक्टिन) 200 एनएम रोडामाइन-फलॉइडिन बायोटिनिलेटेड एफ-ऐक्टिन 200 एनएम रोडामाइन-फलॉइडिन बायोटिनिलेटेड एफ-ऐक्टिन 3.7/4.10 ऊपर-नीचे भंवर या पाइपिंग न करके कतरने से बचें। मिश्रण करने के लिए, धीरे उलटा।
1 एमएमए डीटीटी 1 एमएमए डीटीटी
50 MM एमबी में तनु 150 MM एमबी में तनु
डीटीटी के साथ एमबी 50 एमएन डीटीटी 50 एमएन डीटीटी 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 बर्फ पर रखें।
50 MM एमबी में तनु 150 MM एमबी में तनु
अंतिम बफर 50 एमएमएम केसीएल 0.7% मिथाइलसेलुलोस (वैकल्पिक) 3.9/4.14 प्रयोग करने से तुरंत पहले ग्लूकोज, ग्लूकोज ऑक्सीडेस और कैटलाज़ में जोड़ें। बर्फ पर रखें।
20 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2 50 एमएमएम एनएसीएल
5 एमएमएम एमजीसीएल2 20 एमएमएम एमओपी, पीएच 7.2
0.1 m EGTA 5 एमएमएम एमजीसीएल2
1 एमएमएम एटीपी 0.1 m EGTA
50 एमएन डीटीटी 1 एमएमएम एटीपी
1 माइक्रोन कैलमोडुलिन 50 एमएन डीटीटी
2.5 मिलीग्राम प्रति एमएल ग्लूकोज 1-10 एनएम एम सीके
100 माइक्रोग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस 0.2 एमएमएल सीसीएल2
40 μg/एमएल कैटालेज़ 1 माइक्रोन कैलमोडुलिन
10 एनएम मायोसिन 2.5 मिलीग्राम प्रति एमएल ग्लूकोज
100 माइक्रोग्राम/एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेस
40 μg/एमएल कैटालेज़

तालिका 3: TIRF परख में इस्तेमाल बफर।

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Discussion

यहां प्रस्तुत मायोसिन 5ए और नॉनमस्कल मायोसिन 2बी के शुद्धिकरण और इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए एक कार्यप्रवाह है। प्रयोगों का यह सेट शुद्ध मायोसिन निर्माणों के मशीनोकेमिकल गुणों को तेज और प्रजनन तरीके से निर्धारित करने के लिए उपयोगी है। हालांकि यहां दिखाए गए दो मायोसिन कई संभावनाओं में से सिर्फ दो विशिष्ट उदाहरण हैं, शर्तों और तकनीकों को लागू किया जा सकता है, कुछ सिलाई के साथ, अधिकांश मायोसिन और कई अन्य मोटर प्रोटीन के लिए।

यहां चर्चा किए गए प्रोटोकॉल प्रयोगशाला और प्रयोगों की व्यक्तिगत जरूरतों के आधार पर विविधताओं के अधीन हैं। उदाहरण के लिए, जैसा कि अभिव्यक्ति और आणविक जीव विज्ञान अनुभाग में चर्चा की गई है, इस पेपर में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन दो या अधिक वायरस के सह-संक्रमण से उत्पन्न होते थे; हालांकि, सफल प्रोटीन अभिव्यक्ति को मल्टी-एक्सप्रेशन वैक्टर जैसे पी-फास्टबेक ड्यूल एक्सप्रेशन वेक्टर या बिगबेक एक्सप्रेशन सिस्टम53जैसे मल्टी-एक्सप्रेशन वैक्टर के साथ भी हासिल किया जा सकता है।

कई कारक पुनर्संयोजन प्रोटीन के सफल उत्पादन में बाधा डाल सकते हैं। प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए, यह जरूरी है कि प्रोटीन शुद्धिकरण का हर कदम उचित तापमान पर पूरा हो, जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर होने वाले सभी अपकेंद्रित्र कदम और बर्फ पर अन्य सभी कदम किए जा रहे हैं। डायलिज्ड प्रोटीन उत्पाद के जेल में अतिरिक्त बैंड स्पष्ट हो सकते हैं। यह गिरावट या संदूषण का संकेत हो सकता है। आकार-अपवर्जन या आयनिक-विनिमय क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से बाद में शुद्धि नमूनों की शुद्धता को बढ़ा सकती है54. इस आशय के लिए, समस्या निवारण के लिए प्रोटीन शुद्धिकरण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में एलिकोट्स को बचाने की सिफारिश की जाती है, क्या मायोसिन या संदिग्ध प्रोटीन संदूषण की कम उपज होनी चाहिए। कभी-कभी, चरण 1.8 में राल के लिए lysate की अपर्याप्त बाध्यकारी हो सकती है, जिसके परिणामस्वरूप बाद के अपकेंद्री में सुपरनेट को मायोसिन का नुकसान हो सकता है। यह इस चरण के दौरान राल बाध्यकारी की अवधि अलग से हल किया जा सकता है, यहां तक कि यह रातोंरात बांधने के लिए छोड़, यदि आवश्यक हो । लंबे समय तक इनक्यूबेशन प्रोटीन क्षरण का एक बड़ा जोखिम शुरू अगर संदूषक प्रोटीज पर्याप्त रूप से बाधित नहीं कर रहे हैं, और प्रोटियोलिटिकली रूप से संवेदनशील क्षेत्रों के साथ मायोसिन प्रतिकूल रूप से प्रभावित होंगे । इसके अतिरिक्त, उपयोग से पहले और बाद दोनों राल की अनुचित धुलाई के परिणामस्वरूप अवांछित प्रोटीन उत्पाद का उन्मूलन हो सकता है, इसलिए यह जरूरी है कि फ्लैग-एफ़िनिटी राल का उपयोग करने से पहले और बाद में उचित प्रोटोकॉल का पालन किया जाए। यदि उपयोग के तुरंत बाद राल को धोया जाता है और उचित रूप से संग्रहीत किया जाता है, तो इसे 20 बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन क्षरण अभिव्यक्ति चरण के दौरान भी होता है और अभिव्यक्ति के समय को छोटा करना गिरावट के मामले में लाभप्रद हो सकता है, हालांकि यह कुल उपज की कीमत पर हो सकता है। प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में प्रोटीन नमूने की निगरानी के लिए यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं का पालन करें (यानी, पहले, दौरान और शुद्धिकरण के बाद) अनुकूलन के लिए आवश्यक चरणों को निर्धारित करने में मदद करेगा। मायोसिन के लिए जो बार-बार सफल अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण का विरोध करते हैं, आम समस्याओं को अपर्याप्त या अनुचित प्रकाश श्रृंखलाओं के साथ-साथ अतिव्यक्ति के दौरान अनुचित तह के साथ सह-अभिव्यक्ति की जा सकती है। उपयुक्त प्रकाश श्रृंखला ज्ञात बातचीत के आधार पर चयनित किया जाना चाहिए जब संभव है और प्रकाश श्रृंखला baculovirus अनुपात के लिए भारी श्रृंखला इष्टतम निर्धारित करने के लिए छोटे पैमाने पर प्रयोगों में परीक्षण किया जाना चाहिए । मायोसिन के लिए जो कम या कोई घुलनशील सक्रिय उत्पाद नहीं है, चैपरोस के साथ सह-अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक सक्रिय प्रोटीन54,55प्राप्त करने में सहायता कर सकती है।

शुद्ध मायोसिन उत्पादों में अनिवार्य रूप से क्षतिग्रस्त मायोसिन की एक छोटी आबादी होती है, जिसे "मृत सिर" कहा जाता है, जिसे दो तरीकों से संबोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक विधि में ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में चैंबर के माध्यम से अवेलेबल, या "ब्लैक", ऐक्टिन बहना शामिल है। बाद में एटीपी के साथ धोने के कार्यात्मक मायोसिन काले actin से अलग करने के लिए कारण है, जबकि मृत सिर एटीपी हाइड्रोलाइज करने में असमर्थता के कारण इस अवेलेबल actin के लिए बाध्य रहेगा और उनके उच्च आत्मीयता के कारण । ब्लैक ऐक्टिन वॉश को अंजाम देते समय ऐक्टिन को प्रभावी ढंग से कतरनी के लिए सिरिंज का इस्तेमाल किया जा सकता है। अतिरिक्त कतरन को भंवर से पूरा किया जा सकता है, बशर्ते कि किसी भी परिणामी बुलबुले को अपकेंद्रित्र द्वारा हटा दिया जाए। एक वैकल्पिक विधि उच्च नमक (0.5 एम) सांद्रता और टेबल-टॉप अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में तलछट पर एफ-ऐक्टिन और एमजी-एटीपी के साथ मायोसिन मिश्रण करके मायोसिन नमूने से मृत सिर को चुनिंदा रूप से गोली मारना है। इन परिस्थितियों में एटीपी को हाइड्रोलिजिंग करने में सक्षम मायोसिन इन उच्च नमक स्थितियों के तहत ऐक्टिन के लिए अपनी कम आत्मीयता के कारण ऐक्टिन से बंधे नहीं रहते हैं और सुपरनेट में पाए जाते हैं, जबकि मायोसिन मृत सिर गोली56में ऐक्टिन से बंधे रहते हैं। इसी तरह, गोली के ऐक्टिन और रिसोपितेशन के साथ एक तलछट का उपयोग मायोसिन को हटाने के लिए भी किया जा सकता है जो एटीपी के अभाव में ऐक्टिन के लिए बाध्यकारी होने में असमर्थ हैं। ध्यान दें कि मृत सिर के इस प्रकार के एक छोटे से अनुपात परख के इन प्रकार पर एक प्रभाव के कम होगा । एक न्यूक्लियोटाइड-मुक्त तलछट और पुनर्प्रापयन करके इसके बाद एटीपी-बाउंड अपकेंद्री और पुनर्प्रापीकरण, माइकोसिन जो ऐक्टिन-बाइंडिंग और ऐक्टिन से एटीपी-निर्भर रिलीज दोनों के लिए सक्षम हैं, अलग-थलग किया जा सकता है।

गतिशीलता परख को कई तरीकों से भी संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एनएम2बी के लिए ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में, एनएम 2बी को ब्लैक ऐक्टिन स्टेप में एमएलके, कैलमोडुलिन, कैल्शियम और एटीपी के अलावा, साथ ही अंतिम बफर में भी शामिल किया गया है। हालांकि, NM2b भी परख प्रदर्शन करने से पहले, एक ट्यूब में फॉस्फोरिलेटेड किया जा सकता है । ऐसा करके, फॉस्फोरिलेटेड एनएम 2बी के प्रतिशत को यूरिया युक्त नमूना बफर या प्रदर्शन करने वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्री57, 58के साथ एक देशी जेल चलाकर निर्धारित किया जा सकता है। मायोसिन गतिविधि पर तापमान के प्रभाव की भी जांच की जा सकती है। यह माइक्रोस्कोप या एक पर्यावरण बाड़े पर एक उद्देश्य हीटिंग प्रणाली को नियोजित करके पूरा किया जा सकता है, ताकि प्रवाह कोशिका निरंतर तापमान पर बनाए रखा जाता है। आयनिक ताकत एक और महत्वपूर्ण विचार है । कई मायोसिन के लिए, कम आयनिक ताकत पर ऐक्टिन आत्मीयता और एंजाइमेटिक गतिविधि में वृद्धि की जाएगी; दूसरों के लिए, उच्च आयनिक शक्ति आवश्यक है59. मायोसिन तंत्र के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करने के अलावा, आयनिक ताकत को कम करने से गतिशीलता में वृद्धि हो सकती है और मायोसिन कई परखों के साथ जांच के लिए अधिक सुलभ हो सकता है। इसके विपरीत, कुछ मोटर्स इलेक्ट्रोस्टैटिक टेदरिंग प्रभाव प्रदर्शित करेंगे, जो कम आयनिक ताकत पर गतिशीलता को धीमा कर देगा। अंत में, जब एनएम 2बी फिलामेंट्स के आंदोलन को देखते हैं, तो एक संकीर्ण सीमा (150-200 mM आयनिक ताकत) के भीतर आयनिक ताकत को बनाए रखना महत्वपूर्ण है, जो अधिकांश सेल प्रकारों में पाए जाने वाले लोगों को अनुमानित करता है। कम आयनिक शक्तियों के उपयोग के परिणामस्वरूप मायोसिन फिलामेंट्स का एकत्रीकरण होता है, जबकि फिलामेंट्स उच्च आयनिक ताकत पर विकृत हो जाते हैं।

कई मायोसिन के साथ, विशेष रूप से कम शुल्क अनुपात वाले, M5a के लिए दिए गए अंतिम बफर की स्थिति के परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंटी लेबल किए गए ऐक्टिन फिलामेंट्स केवल सतह से बंधे होते हैं या पूरी तरह से अलग हो जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप अनियमित आंदोलन होते हैं जो मात्राकरण को जटिल करते हैं। अंतिम बफर में मिथाइलसेल्यूलोस (0.7%) का उपयोग करके बेहतर गुणवत्ता आंदोलन अक्सर प्राप्त किया जा सकता है। मिथाइलसेल्यूलोस एक चिपचिपा भीड़ एजेंट है और संलग्न मायोसिन मोटर्स का घनत्व विरल60होने पर भी सतह के करीब रहने के लिए बलों ने तंतुओं को मार दिया। इसी प्रकार, यह देखा गया है कि एनएम2ए के साथ आंदोलन का पालन करने के लिए एकल तंतु गतिशीलता परख के अंतिम बफर में मिथाइलसेल्यूलोज का समावेश आवश्यक है, और इसी घटना की सूचना चिकनी मांसपेशी मायोसिन फिलामेंट्स29,61के लिए दी गई थी। इससे एनएम2बी फिलामेंट्स की प्रोसेसिविटी भी बढ़ती है। इस परख में मिथाइलसेल्यूलोस का उपयोग करने का एक संभावित अवांछित दुष्प्रभाव यह है कि भीड़ एजेंट गुण बंडलों में मायोसिन फिलामेंट्स के पार्श्व संघ को बढ़ावा दे सकते हैं। मैथिलेल्यूलोज के विकल्प जब आंदोलन की कमी का निवारण करते हैं या ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में शिथिल रूप से बंधे ऐक्टिन फिलामेंट्स मोटिविटी बफ़र्स में नमक एकाग्रता को कम करना या मायोसिन सतह घनत्व को बढ़ाना है। जैसा कि ऊपर कहा गया है, गतिशीलता बफ़र्स में एक उच्च आयनिक शक्ति को कुछ मायोसिन की क्षमता को कम करने के लिए दिखाया गया है ताकि29,34,62को एक् टिन के लिए बांधा जा सके।

ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख का एक और बदलाव ग्लास कवरलिप पर मायोसिन को एंकर करने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग है। उदाहरण के लिए, यदि मायोसिन निर्माण के सी-टर्मिनल छोर पर जीएफपी मौजूद है, तो जीएफपी-मायोसिन को कवरस्लिप36, 63,64में ठीक करने के लिए एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। यह उन स्थितियों में सफल गतिशीलता प्राप्त करने में सहायता कर सकता है जहां प्रणाली की ज्यामिति अन्यथा ऐक्टिन स्थानांतरण में बाधा डाल सकती है, जैसे कृत्रिम या छोटे लीवर हथियारों के परीक्षण के मामले में54,64। इसके अतिरिक्त, ट्रांसलोकेशन वेग पर लोड के प्रभाव की जांच ग्लाइडिंग ऐक्टिन फिलामेंट परख में α-ऐक्टिनिन या यूट्रोफिन39,50,65जैसे ऐक्टिन-बाइनिंग प्रोटीन को नियोजित करके की जा सकती है। इस तरह के माप एक एकल मायोसिन के लोड-निर्भर गतिज बनाम मायोसिन के एक कलाकारों की टुकड़ी पर लोड के प्रभाव की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकते हैं जिसे ऑप्टिकल ट्रैपिंग परख66, 67का उपयोग करके मापा जा सकता है। यह प्रारंभिक चरण में मायोसिन के साथ एक ऐक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन की बढ़ती मात्रा को जोड़कर पूरा किया जा सकता है। ऐक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन सतह से बांधता है और मायोसिन द्वारा स्थानांतरित किए जा रहे ऐक्टिन फिलामेंट्स पर घर्षण भार डालती है, जिसके परिणामस्वरूप एक वर्गीकृत वेग होता है क्योंकि सतह पर ऐक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन की एकाग्रता39बढ़ जाती है।

मायोसिन आंदोलन पर विभिन्न ऐक्टिन संरचनाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए एकल अणु/पहनावा गतिशीलता परख को भी अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एकल ऐक्टिन फिलामेंट्स, फासिन-या α-ऐक्टिन-मध्यस्थता वाले ऐक्टिन बंडलों के शीर्ष पर मायोसिन आंदोलन को देखने के बजाय कोशिकाओं68, 69में पाए जाने वाले ऐक्टिन फिलामेंट नेटवर्क के इन विट्रो पुनर्गठन के रूप में अध्ययन किया जा सकता है। ट्रोपोमायोसिन जैसे ऐक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के प्रभाव का भी अध्ययन किया जा सकता है65,70,71,72.

नोट के एकल अणु के लिए एक लेबल चुनने में बहुमुखी प्रतिभा है/ इस रिपोर्ट में, M5a-HMM और NM2b दोनों पर एक GFP लेबल का उपयोग किया गया था; हालांकि, कई अन्य लेबल का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरणों में हेलोटैग या स्नैप-टैग शामिल हैं, जिन्हें आनुवंशिक रूप से मायोसिन से जोड़ा जा सकता है और सहसंयोजक रूप से सिंथेटिक डाई को बांध सकता है। हेलोटैग तकनीक का लाभ कई प्रयोगात्मक अनुकूलनों के लिए इसकी बहुमुखी प्रतिभा में निहित है, जैसे कि विभिन्न रंगों के साथ लेबलिंग या बायोटिन एफ़िनिटी टैग29,73जोड़ना। इसके अतिरिक्त, क्वांटम डॉट प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए एकल अणु फ्लोरेसेंस ट्रैकिंग के संकल्प में सुधार करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जो भी GFP कम चमक की सीमा और फोटोब्लैचिंग७४के लिए प्रवृत्ति को संबोधित करता है । टैग को प्रकाश श्रृंखलाओं के साथ - साथ भारीश्रृंखला11, 75,76से सफलतापूर्वक जोड़ा जा सकता है ।

एकल अणु TIRF गतिशीलता परख में सफलता प्राप्त करने के लिए, एक महत्वपूर्ण कारक एक अच्छी तरह से अवरुद्ध और कार्यात्मक सतह का उपयोग कर रहा है । मध्यम अवरुद्ध प्राप्त करने के लिए एक सरल विधि बायोटिनेलेटेड-बीएसए का उपयोग नाइट्रोसेल्यूलोज सतह से बंधे करना है। हालांकि यह M5a सहित कई मोटर्स की विशेषता के लिए काफी काम करेगा, ऐसी सतह पर गैर-विशिष्ट बाध्यकारी का स्तर एनएम 2बी जैसे नमूनों के साथ स्वच्छ आंदोलन को पुन: उत्पन्न करने के लिए निषेधात्मक है। इस संबंध में एक महत्वपूर्ण सफलता कार्यात्मकता77के लिए बायोटिन-खूंटी के साथ पेग्यालेटेड सतहों में संक्रमण था। खूंटी सतहों सतह अवरुद्ध का एक दूर बेहतर स्तर प्रदान करते है और एक दोष मुक्त PEGylated सतह समय की बहुत लंबी अवधि के लिए गैर विशिष्ट बाध्यकारी से मुक्त रह सकते हैं । यहां विस्तृत विशिष्ट प्रोटोकॉल कुछ ही घंटों में बायोटिनाइलेटेड खूंटी सतहों के उत्पादन की अनुमति देता है और यदि तुरंत वर्णित के रूप में संग्रहीत किया जाता है, तो सतहों का उपयोग गुणवत्ता में केवल मामूली गिरावट के साथ कई हफ्तों तक किया जा सकता है।

ट्रैकिंग के लिए डेटा एकत्र करने से पहले एक महत्वपूर्ण विचार अधिग्रहण फ्रेम दर है। बाद के फ्रेम के बीच आंदोलन काफी बड़ा होना चाहिए ताकि ओवरसैंपलिंग त्रुटियों से बचा जा सके। उच्च नमूना दरों में एक छोटे से समय अंतराल द्वारा स्थानीयकरण त्रुटियों के विभाजन के कारण अधिक अनुमानित वेग निकलेगा और माप की स्पष्ट त्रुटि में वृद्धि होगी। ऐसे मामलों में जहां कच्चे डेटा का बहुत बारीक नमूना लिया जाता है, डेटा को एक नया स्टैक बनाने और फ्रेम दर में बदलाव पर विचार करने के लिए हर Nth फ्रेम लेने के द्वारा नीचे-नमूना किया जा सकता है। फ्रेम के बीच सबपिक्सेल आंदोलनों से बचा जाना चाहिए और सटीक मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कई सौ नैनोमीटर के आंदोलनों की आवश्यकता होती है। उन सभी मामलों में जहां एक नए नमूने की विशेषता है, स्वचालित विश्लेषण द्वारा उत्पन्न परिणामों की तुलना स्थिरता के लिए मैन्युअल रूप से ट्रैक किए गए तंतुओं के एक छोटे डेटासेट से की जानी चाहिए।

एकल अणु गतिशीलता प्रयोगों से डेटा का विश्लेषण करते समय, यह चुनते समय देखभाल की जानी चाहिए कि कौन से पैरामीटर मापने के लिए, डेटा को कैसे फ़िल्टर करें, और डेटा को कैसे फिट करें। जैसा कि ऊपर कहा गया है, वेग डेटा का विश्लेषण करते समय नमूना दर एक महत्वपूर्ण कारक हो सकती है। कई मायोसिन के लिए, प्रोसेसिव रन एक सीधी रेखा से कम और अच्छी तरह से अनुमानित होंगे। ऐसे मामलों में, ट्रैक की अंतिम दूरी को समाप्त करने की शुरुआत रन लंबाई का एक अच्छा उपाय प्रदान कर सकती है और इसे वेग का अच्छा अनुमान लगाने के लिए ट्रैक की अवधि से विभाजित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां पटरियां बहुत लंबी होती हैं और तुला तंतुओं के आसपास घुमावदार रास्तों का पालन करती हैं, इस प्रकार के विश्लेषण से गलत परिणाम प्राप्त होंगे और कुल दूरी की यात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए, एक अधिग्रहण दर का उपयोग करके, जो लगातार स्थानीयकरण बिंदुओं के लिए पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से ऊपर वर्णित त्रुटियों से बचने के लिए पर्याप्त रूप से दूरी पर होने की अनुमति देता है, जबकि एक साथ काफी करीब है कि उन दोनों बिंदुओं के बीच वक्र की सीधी रेखा की दूरी बनी हुई है। इसके अलावा, ट्रैक की लंबाई के संबंध में लंबे समय तक चलने वाली लंबाई वाले मोटर प्रोटीन के लिए, रन लंबाई78की गणना करते समय कयोजना-मेयर अनुमानक जैसे अतिरिक्त आंकड़े बनाए जाने चाहिए। उन स्थितियों के लिए भी यही सच है जिनमें एक प्रक्रियात्मक रन के अंत से पहले फोटोब्लीचिंग होने की पर्याप्त संभावना है। एक अन्य घटना जो एकल अणु फ्लोरेसेंस अध्ययनों में देखी जा सकती है वह फोटोलिंकिंग है, जिसमें फ्लोरोफोरस तेजी से राज्य के बीच स्विच करते हैं और पलक झपकते दिखाई देते हैं। यह आमतौर पर इन गतिशीलता प्रयोगों में नहीं होता है; हालांकि, अगर ऐसा होता है, तो लेजर तीव्रता और एक्सपोजर समय को कम किया जा सकता है जो प्रभाव को कम करना चाहिए। β-मर्केप्टोथेन, ट्रॉलॉक्स, साइक्लोक्टेरीन, एन-प्रोपिल गैलेट, 4-नाइट्रोबेनिजिल अल्कोहल, और 1,4-डायज़ेबिसाइक्लो [2.2.2] ऑक्टेन सहित कई रसायनों का उपयोग इसेकमकरने के लिए किया जा सकता है।

संक्षेप में, यह लेख विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो मशीनीन ट्रांसलोकेशन वेग, मायोसिन ट्रांसलोकेशन वेग और मायोसिन रन लंबाई जैसे मशीनोकेमिकल गुणों को निर्धारित करने की उनकी क्षमता में मजबूत हैं। ये परख प्रजनन योग्य हैं और इसका उपयोग उन स्थितियों में भी शुद्ध मायोसिन की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जहां मोती विशेषताएं अध्ययन का विशिष्ट अंतिम लक्ष्य नहीं हैं। इसके अलावा, पीएच, तापमान और रासायनिक नियामकों जैसे परिवर्तनों को इन परख में पेश किया जा सकता है ताकि यह जांच की जा सके कि अध्ययन किए गए मायोसिन की मशीनी कैसे प्रभावित होती है। एक साथ लिया, ऐक्टिन ग्लाइडिंग और उल्टे गतिशीलता परख मायोसिन पहनावा व्यवहार और आणविक मोटर यांत्रिकी और काइनेटिक्स में अंतरमॉलिकुलर विविधताओं की बेहतर समझ के लिए अनुमति दे सकते हैं। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी आधारित परख यहां वर्णित साइटोस्केलेल अनुसंधान के लिए एक न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण का समर्थन करती है और विट्रो में प्रोटीन-प्रोटीन गतिशीलता को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। साथ में, इन अत्यधिक नियंत्रित प्रयोगों से एकत्र किए गए डेटा का उपयोग प्रमुख एक्टोमायोसिन व्यवहार के मशीनोबायोलॉजिस्ट को सलाह देने के लिए किया जा सकता है जो सेल जैविक स्तर पर और उससे आगे प्रासंगिक हो सकते हैं।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम इस डेटा को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले रिएजेंट्स को तैयार करने के साथ तकनीकी सहायता के लिए डॉ फेंग झांग को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनएचएलबीआई/एनआईएच इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम फंड्स एचएल001786 ने जेआर एस को सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

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