Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Hier wordt een procedure gepresenteerd om myosine 5a uit te drukken en te zuiveren, gevolgd door een bespreking van de karakterisering ervan, met behulp van zowel ensemble- als single molecule in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays, en hoe deze methoden kunnen worden aangepast voor de karakterisering van niet-amuskel myosine 2b.

Abstract

Myosine-eiwitten binden en interageren met filamenteuze actine (F-actine) en worden aangetroffen in organismen in de fylogenetische boom. Hun structuur en enzymatische eigenschappen zijn aangepast voor de specifieke functie die ze in cellen uitvoeren. Myosine 5a loopt processief op F-actine om melanosomen en blaasjes in cellen te transporteren. Omgekeerd werkt niet-amuscle myosine 2b als een bipolair filament dat ongeveer 30 moleculen bevat. Het beweegt F-actine van tegenovergestelde polariteit naar het midden van de gloeidraad, waar de myosinemoleculen asynchroon werken om actine te binden, een krachtslag te geven en te ontkoppelen voordat de cyclus wordt herhaald. Nonmuscle myosine 2b, samen met zijn andere nonmuscle myosine 2 isovormen, heeft rollen die celadhesie, cytokinese en spanningsonderhoud omvatten. De mechanochemie van myosines kan worden bestudeerd door in vitro motiliteitstesten uit te voeren met behulp van gezuiverde eiwitten. In de gliding actine filament assay, de myosines zijn gebonden aan een microscoop coverslip oppervlak en translocate fluorescerend gelabeld F-actine, die kan worden gevolgd. In de single molecule/ensemble motility assay is F-actine echter gebonden aan een coverslip en wordt de beweging van fluorescerend gelabelde myosinemoleculen op de F-actine waargenomen. In dit rapport wordt de zuivering van recombinant myosine 5a uit Sf9-cellen met behulp van affiniteitschromatografie beschreven. Hierna schetsen we twee fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays: de gliding actine filament assay en de omgekeerde motility assay. Uit deze test kunnen parameters zoals actinetranslocatiesnelheden en looplengtes en snelheden van één molecuul worden geëxtraheerd met behulp van de beeldanalysesoftware. Deze technieken kunnen ook worden toegepast om de beweging van enkelvoudige filamenten van de niet-muscle myosine 2 isovormen te bestuderen, die hierin worden besproken in de context van niet-amuscle myosine 2b. Deze workflow vertegenwoordigt een protocol en een reeks kwantitatieve tools die kunnen worden gebruikt om de enkele molecuul- en ensembledynamiek van niet-muscle myosines te bestuderen.

Introduction

Myosines zijn motoreiwitten die kracht uitoefenen op actinefilamenten met behulp van de energie die wordt afgeleid van adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyse1. Myosines bevatten een hoofd-, nek- en staartdomein. Het hoofddomein bevat het actinebindende gebied en de site van ATP-binding en hydrolyse. De nekdomeinen zijn samengesteld uit IQ-motieven, die zich binden aan lichte ketens, calmodulin of calmodulin-achtige eiwitten2,3. Het staartgebied heeft verschillende functies die specifiek zijn voor elke klasse myosines, waaronder maar niet beperkt tot de verkleining van twee zware ketens, binding van ladingmoleculen en regulering van het myosine via auto-inhibitory interacties met de hoofddomeinen1.

De beweeglijke eigenschappen van myosine variëren sterk tussen klassen. Sommige van deze eigenschappen omvatten de duty ratio (de fractie van de mechanische cyclus van myosine waarin de myosine gebonden is aan actine) en processiviteit (het vermogen van een motor om meerdere stappen op zijn spoor te maken voordat hij wordt losgemaakt)4. De meer dan 40 klassen myosines werden bepaald op basis van sequentieanalyses5,6,7,8. De klasse 2 myosines zijn geclassificeerd als "conventioneel" omdat ze de eerste waren die werden bestudeerd; alle andere klassen myosines worden daarom geclassificeerd als "onconventioneel".

Myosine 5a (M5a) is een klasse 5 myosine en is een processieve motor, wat betekent dat het meerdere stappen langs actine kan nemen voordat het dissocieert. Het heeft een hoge duty ratio , wat aangeeft dat het een groot deel van zijn mechanische cyclus besteedt aan actin9,10,11,12,13,14. Net als andere myosines bevat de zware ketting een N-terminal motordomein dat zowel een actinebinding als een ATP-hydrolyseplaats omvat, gevolgd door een nekgebied dat dient als hefboomarm, met zes IQ-motieven die zich binden aan essentiële lichtketens (ELC) en calmodulin (CaM)15. Het staartgebied bevat α-spiraalvormige coiled-coils, die het molecuul dimmen, gevolgd door een bolvormig staartgebied voor het binden van lading. De kinetiek weerspiegelt zijn betrokkenheid bij het transport van melanosomen in melanocyten en van het endoplasmatisch reticulum in Purkinje neuronen16,17. M5a wordt beschouwd als de prototypische vrachtvervoermotor18.

Klasse 2 myosines, of de conventionele myosines, omvatten de myosines die samentrekking van skelet, hart en gladde spieren aandrijven naast de niet-muscle myosine 2 (NM2) isovormen, NM2a, 2b en 2c19. De NM2-isovormen worden aangetroffen in het cytoplasma van alle cellen en hebben gedeelde rollen in cytokinese, adhesie, weefselmorfogenese en celmigratie19,20,21,22. Dit artikel bespreekt conventionele myosineprotocollen in de context van niet-muscle myosine 2b (NM2b)23. NM2b heeft, in vergelijking met M5a, een lage duty ratio en is enzymatisch langzamer met een Vmax van 0,2 s-123 in vergelijking met M5a's Vmax van ≈18 s-124. Met name afgeknotte NM2b-constructies met twee koppen bewegen niet gemakkelijk procesief op actine; in plaats daarvan resulteert elke ontmoeting met actine in een machtsslag gevolgd door dissociatie van het molecuul25.

NM2b bevat twee myosine zware kettingen, elk met één bolvormig hoofddomein, één hendelarm (met één ELC en één regulerende lichte ketting (RLC)), en een α-spiraalvormige spiraalvormige staaf/staartdomein, ongeveer 1.100 aminozuren lang, dat deze twee zware kettingen verkleint. De enzymatische activiteit en de structurele toestand van NM2b worden gereguleerd door fosforylering van RLC23. Niet-gefosforyleerde NM2b, in aanwezigheid van ATP en fysiologische ionische sterktes (ongeveer 150 mM zout), keurt een compacte conformatie goed waarbij de twee koppen deelnemen aan een asymmetrische interactie en de staart op twee plaatsen terugvouwt over de koppen23. In deze toestand heeft het myosine geen sterke interactie met actine en heeft het een zeer lage enzymatische activiteit. Bij RLC-fosforylering door calmodulin-afhankelijke myosine lichtketenkinase (MLCK) of Rho-geassocieerd eiwitkinase, breidt het molecuul zich uit en associeert het met andere myosines door het staartgebied om bipolaire filamenten te vormen van ongeveer 30 myosinemoleculen23. De bovengenoemde fosforylering van de RLC leidt ook tot een verhoogde actine-geactiveerde ATPase-activiteit van NM2b met ongeveer vier keer26,27,28. Deze bipolaire filamentopstelling, met veel myosinemotoren aan elk uiteinde, is geoptimaliseerd voor rollen in contractie- en spanningsonderhoud, waarbij actinefilamenten met tegengestelde polariteiten ten opzichte van elkaar kunnen worden verplaatst23,29. Het is dan ook aangetoond dat NM2b als een ensemble van motoren fungeert bij interactie met actine. Het grote aantal motoren binnen deze gloeidraad laat NM2b-filamenten in staat om processief te bewegen op actinefilamenten, waardoor in vitro filamentprocesiviteit mogelijk is om29te karakteriseren .

Hoewel er vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van de rol van myosines in de cel, is er een behoefte om hun individuele kenmerken op eiwitniveau te begrijpen. Om actomyosine-interacties op een eenvoudig eiwit-eiwitinteractieniveau te begrijpen, in plaats van in een cel, kunnen we recombinante myosines uitdrukken en zuiveren voor gebruik in in vitro studies. De resultaten van dergelijke studies informeren mechanobiologen vervolgens over de biofysische eigenschappen van specifieke myosines die uiteindelijk complexe cellulaire processen aansturen12,13,14,25,29. Meestal wordt dit bereikt door een affiniteitstag toe te voegen aan een volledige of afgeknotte myosineconstructie en te zuiveren via affiniteitschromatografie29,30,31. Bovendien kan de constructie worden ontworpen om een genetisch encodable fluorofoor of een label voor eiwitetikettering met een synthetische fluorofoor op te nemen. Door zo'n fluorescerend label toe te voegen, kunnen beeldvormingsstudies met één molecuul worden uitgevoerd om myosinemechanica en kinetiek te observeren.

Na zuivering kan de myosine op verschillende manieren worden gekarakteriseerd. ATPase-activiteit kan worden gemeten met colorimetrische methoden, die inzicht geven in het totale energieverbruik en de affiniteit van de motor onder verschillende omstandigheden in werking stellen32. Om meer te weten te komen over de mechanochemie van de beweeglijkheid ervan, zijn verdere experimenten nodig. Dit artikel beschrijft twee in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methoden die kunnen worden gebruikt om de beweeglijke eigenschappen van een gezuiverd myosine-eiwit te karakteriseren.

De eerste van deze methoden is de glijdende actinegloeidraadtest, die kan worden gebruikt om de ensemble-eigenschappen van myosinemotoren kwantitatief te bestuderen, evenals de kwaliteit van een partij gezuiverd eiwit kwalitatief te bestuderen33. Hoewel dit artikel het gebruik van tirf-microscopie (Total Internal Reflection Fluorescence) voor deze test bespreekt, kunnen deze experimenten effectief worden uitgevoerd met behulp van een fluorescentiemicroscoop in het breed veld die is uitgerust met een digitale camera, die vaak in veel laboratoria wordt aangetroffen34. In deze test wordt een verzadigende laag myosinemotoren bevestigd aan een coverslip. Dit kan worden bereikt met behulp van nitrocellulose, antilichamen, membranen, SiO2-gederivatiseerde oppervlakken (zoals trimethylchlorosilane), onder andere29,33,35,36,37,38. Fluorescerend gelabelde actinefilamenten worden door de afdeklipkamer gepasseerd, waarop de actine zich bindt aan de myosine die aan het oppervlak is bevestigd. Na toevoeging van ATP (en kinases in de studie van NM2) wordt de kamer afgebeeld om de translocatie van actinefilamenten door de oppervlaktegebonden myosines te observeren. Tracking software kan worden gebruikt om de snelheid en lengte van elke glijdende actine filament correleren. Analysesoftware kan ook een maat bieden voor het aantal bewegende en stationaire actinefilamenten, wat nuttig kan zijn om de kwaliteit van een bepaald myosinepreparaat te bepalen. Het aandeel vastgelopen filamenten kan ook opzettelijk worden gemoduleerd door oppervlaktegebonden actine aan andere eiwitten en gemeten om de belastingsafhankelijkheid van het myosine39te bepalen . Omdat elk actinefilament kan worden aangedreven door een groot aantal beschikbare motoren, is deze test zeer reproduceerbaar, waarbij de uiteindelijke gemeten snelheid robuust is voor verstoringen zoals veranderingen in de start myosineconcentratie of de aanwezigheid van extra factoren in de oplossing. Dit betekent dat het gemakkelijk kan worden aangepast om myosine-activiteit te bestuderen onder verschillende omstandigheden, zoals gewijzigde fosforylering, temperatuur, ionische sterkte, viscositeit van de oplossing en de effecten van belasting veroorzaakt door oppervlaktetethers. Hoewel factoren zoals sterk bindende myosine "dode hoofden" die niet in staat zijn tot ATP-hydrolyse vastgelopen actinefilamenten kunnen veroorzaken, bestaan er meerdere methoden om dergelijke problemen te verminderen en nauwkeurige metingen mogelijk te maken. De kinetische eigenschappen van myosine variëren sterk tussen de klassen en, afhankelijk van de specifieke myosine die wordt gebruikt, kan de snelheid van actinefilament glijden in deze test variëren van minder dan 20 nm/s (myosine 9)40,41en tot 60.000 nm/s(Characean myosine 11)42.

De tweede test keert de geometrie van de glijdende actinegloeidraadtestom 12. Hier worden de actinefilamenten aan het afdeklipoppervlak bevestigd en wordt de beweging van enkele moleculen van M5a of van individuele bipolaire filamenten van NM2b gevisualiseerd. Deze test kan worden gebruikt om de looplengtes en snelheden van enkele myosinemoleculen of filamenten op actine te kwantificeren. Een coverlip is bedekt met een chemische verbinding die niet-specifieke binding blokkeert en tegelijkertijd het oppervlak functionaliseert, zoals biotine-polyethyleenglycol (biotine-PEG). De toevoeging van gemodificeerde avidinderivaten priemt vervolgens het oppervlak en biotinylated actine wordt door de kamer gepasseerd, wat resulteert in een laag F-actine die stabiel aan de onderkant van de kamer is gebonden. Ten slotte wordt geactiveerd en fluorescerend gelabeld myosine (meestal 1-100 nM) door de kamer gestroomd, die vervolgens wordt afgebeeld om myosinebeweging over de stationaire actinefilamenten te observeren.

Deze modaliteiten vertegenwoordigen snelle en reproduceerbare methoden die kunnen worden gebruikt om de dynamiek van zowel niet-amuskel- als spier myosines te onderzoeken. Dit verslag schetst de procedures om zowel M5a als NM2b te zuiveren en te karakteriseren, die respectievelijk onconventionele en conventionele myosines vertegenwoordigen. Dit wordt gevolgd door een bespreking van enkele myosine-specifieke aanpassingen, die kunnen worden uitgevoerd om een succesvolle vastlegging van beweging in de twee soorten van de test te bereiken.

Expressie en moleculaire biologie
Het cDNA voor het myosine van belang moet worden gekloond op een gemodificeerde pFastBac1-vector die codeert voor een C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK) als M5a-HMM wordt uitdrukt, of een N-terminal FLAG-tag als het molecuul van NM2b23,43,44,45,46wordt uitdrukt . C-terminal FLAG-tags op NM2b resulteert in een verzwakte affiniteit van het eiwit voor de KOLOM FLAG-affiniteit. Daarentegen bindt het N-terminaal MET VLAG gelabelde eiwit zich meestal goed aan de KOLOM FLAG-affiniteit23. Het N-terminaal gelabelde eiwit behoudt enzymatische activiteit, mechanische activiteit en fosforyleringsafhankelijke regulatie23.

In dit artikel werd een afgeknotte muis M5a heavy meromyosine (HMM)-achtige constructie gebruikt met een GFP tussen de FLAG-tag en het C-terminus van de myosine zware ketting. Merk op dat in tegenstelling tot NM2b M5a-HMM met succes kan worden getagd en gezuiverd met N- of C-terminal FLAG-tags en in beide gevallen zal de resulterende constructie actief zijn. De M5a zware keten werd afgekapt op aminozuur 1090 en bevat een drie aminozuur linker (GCG) tussen de GFP en het coiled-coil gebied van de M5a47. Er is geen extra linker toegevoegd tussen de GFP en FLAG-tag. M5a-HMM werd samen met calmodulin uitgedrukt. De volledige menselijke NM2b-constructie werd samen met ELC en RLC tot uitdrukking gebracht. De N-termini van de RLC werd gefuseerd met een GFP via een linker van vijf aminozuren (SGLRS). Direct gekoppeld aan de FLAG-tag was een HaloTag. Tussen de HaloTag en het N-eindpunt van de myosine zware keten was een linker gemaakt van twee aminozuren (AS).

Beide myosinepreparaten werden gezuiverd uit één liter Sf9-celkweek die besmet was met baculovirus met een dichtheid van ongeveer 2 x 106 cellen/ml. De volumes van het baculovirus voor elke subeenheid waren afhankelijk van de veelheid van infectie van het virus, zoals bepaald door de instructies van de fabrikant. In het geval van M5a werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met twee verschillende baculovirussen- één voor calmodulin en één voor M5a zware keten. In het geval van de NM2b werden cellen gelijktijdig geïnfecteerd met drie verschillende virussen- één voor ELC, één voor RLC en één voor NM2b zware keten. Voor laboratoria die werken met een diversiteit aan myosines (of andere multicomplexe eiwitten), is deze aanpak efficiënt omdat het veel combinaties van zware en lichte ketens mogelijk maakt en veelgebruikte lichte ketens zoals calmodulin kunnen worden gecotransfecteerd met veel verschillende myosine zware ketens. Al het celwerk werd voltooid in een bioveiligheidskast met de juiste steriele techniek om besmetting te voorkomen.

Voor de expressie van zowel M5a als NM2b werden de Sf9-cellen die de recombinante myosines produceren 2-3 dagen na infectie verzameld, via centrifugeren, en opgeslagen bij -80 °C. Celkorrels werden verkregen door de met co-geïnfecteerde Sf9-cellen gedurende 30 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C te centrifugeren. Het eiwitzuiveringsproces wordt hieronder beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Eiwitzuivering

  1. Cellyse en eiwitextractie
    1. Bereid een 1,5x extractiebuffer voor op basis van tabel 1. Filtreer en bewaar bij 4 °C.
    2. Begin met het ontdooien van de celkorrels op ijs. Terwijl de pellets ontdooien, vult u 100 ml extractiebuffer aan met 1,2 ml dithiothreitol (DTT), 5 μg/ml leupeptine, 0,5 μM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) en twee proteaseremmertabletten. Blijf op ijs.
    3. Zodra de pellet ontdooid is, voegt u 1 ml van de aangevulde extractiebuffer toe per 10 ml celkweek. Als de celpellets bijvoorbeeld zijn gevormd uit 500 ml celkweek, voegt u vervolgens 50 ml aangevulde extractiebuffer toe aan de pellet.
    4. Soniceer de celkorrels terwijl je ze op ijs houdt. Gebruik voor elke pellet de volgende omstandigheden: 5 s AAN, 5 s UIT, duur van 5 min, vermogen 4-5.
    5. Verzamel al het gehomogeniseerde lysaat in een bekerglas en voeg ATP (0,1 M stamoplossing; pH 7,0) toe, zodat de uiteindelijke concentratie ATP 1 mM is. Roer gedurende 15 minuten in een koude kamer. De ATP scheidt actieve myosine van actine, waardoor het in de volgende centrifugeerstap kan worden gescheiden. Het is daarom essentieel om onmiddellijk door te gaan naar de volgende stap om de kans op ATP-uitputting en rebinding tot actine te minimaliseren.
    6. Centrifugeer de lysaten bij 48.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Terwijl dit gebeurt, begint u met het wassen van 1-5 ml van een 50% drijfmest van Anti-FLAG affiniteitshars (voor een pellet gevormd uit 1 L cellen) met 100 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), volgens de instructies van de fabrikant. Was bijvoorbeeld voor 5 ml hars 10 ml van een 50% drijfmest. In de laatste wasstap, resuspend de hars met 1-5 ml PBS met voldoende volume om een 50% slurry te creëren.
    7. Combineer na lysaatcentrifugatie het supernatant met de gewassen harsmest en schommel zachtjes in de koude kamer gedurende 1-4 uur. Maak tijdens het wachten de in tabel 1 beschreven buffers en houd ze op ijs.
  2. FLAG affiniteit zuiveringsvoorbereiding
    1. Centrifugeer de oplossing in stap 1.7 bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 °C. De hars wordt aan de onderkant van de buis verpakt. Verwijder het supernatant zonder de hars te verstoren.
    2. Resuspendeer de hars in 50 ml buffer A zoals beschreven in tabel 1 en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C bij 500 x g. Verwijder het supernatant zonder de hars te verstoren.
    3. Resuspendeer de hars in 50 ml buffer B zoals beschreven in tabel 1 en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C bij 500 x g. Herhaal deze stap nogmaals en resuspendeer de hars in 20 ml buffer B. Meng vervolgens de hars en de buffer grondig door de buis ongeveer 10 keer voorzichtig met de hand om te keren.
  3. Eiwit elutie en concentratie
    1. Maak 30 ml elutiebuffer zoals beschreven in tabel 1 en laat het afkoelen op ijs.
    2. Zet de elutiekolom in een koude kamer. Giet de harsmest voorzichtig in de kolom. Was de kolom met 1-2 kolomvolumes buffer B terwijl de hars op de bodem zit, zodat de hars niet uitdroogt.
    3. Desinstroom 1 ml van de Elution Buffer door de hars en verzamel de doorstroming in een buis van 1,5 ml. Herhaal dit zodanig dat 12, 1 ml fracties worden verzameld.
    4. Voer op dit punt een ruwe Bradford-test uit op de breuken om kwalitatief te bepalen welke fracties het meest geconcentreerd zijn48. Op één rij van een 96-put plaat, pipet 60 μL 1x Bradford reagens. Meng 20 μL van elke fractie per put als fracties worden verzameld. Een donkerder blauwe kleuring duidt op de meer geconcentreerde fracties.
    5. Verzamel in een buis van 50 ml het resterende eiwit door de resterende ElutionBuffer voorzichtig door de kolom te leiden, om eventuele resterende myosine die aan de hars in de kolomstroom is gebonden, vrij te geven. Deze doorstroming zal in de volgende stap worden geconcentreerd. Zorg ervoor dat de hars vervolgens wordt geregenereerd voor hergebruik en wordt opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Pool de drie meest geconcentreerde fracties en concentreer de doorstroming verder in de 50 ml buis en de resterende 1 ml fracties met behulp van een 100.000 MWCO geconcentreerde buis. Plaats het gepoolde monster op de geconcentreerde buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C op 750 x g en herhaal dit totdat alle geëuteerde eiwitten zijn geconcentreerd tot een eindvolume van ongeveer 0,5-1 ml.
      OPMERKING: Deze poriegrootte maakt het mogelijk om de myosinemoleculen vast te houden, die meerdere keren de moleculaire gewichtsafsnijding hebben. De lichtkettingen blijven gedurende deze tijdskoers nauw verbonden met de motordomeinen, zoals geverifieerd door SDS-PAGE gelelektroforese op het eindproduct uit te voeren.
  4. Dialyse en flash-freezing
    1. Maak 2 L dialysebuffer, zoals beschreven in tabel 1. Plaats het monster in een dialysezak of -kamer en dialyzeer 's nachts in de koude kamer. Merk op dat de samenstelling van de dialysebuffers verschilt voor NM2b en M5a.
      OPMERKING: In het geval van NM2b is het doel van deze dialysestap om myosinefilamenten te vormen in de buffer met lage ionische sterkte. Sedimentatie van deze filamenten zorgt vervolgens voor een extra zuiveringsstap en maakt de concentratie van het monster mogelijk. Er zal dus de volgende dag een zichtbaar wit neerslag in de dialysekamer zijn. Deze filamenten worden verzameld door centrifugeren en gedepolymeriseerd in stap 5.1. In het geval van M5a-HMM zal het eiwit na de nachtelijke dialyse voldoende zuiver zijn voor gebruik in latere testtesten. Verdere zuiveringsstappen zoals gelfiltratie of ionische uitwisselingschromatografie kunnen indien nodig worden uitgevoerd. Voor M5a-herstel na dialyse gaat u naar stap 5.2.
  5. Myosine herstellen na dialyse
    1. Voor NM2b het volledige monster voorzichtig uit de dialysezak of -kamer verwijderen en gedurende 15 minuten bij 49.000 x g bij 49.000 x g centrifugeren om de myosinefilamenten op te halen. Gooi het supernatant weg en voeg stapsgewijs de opslagbuffer toe aan de pellet zoals beschreven in tabel 1 totdat deze is opgelost. Zachte op- en neerpijpen helpt om de pellet te solubiliseren. Normaal gesproken is hiervoor niet meer dan 500 μL per buis nodig. Nadat de pellet volledig is opgelost in de opslagbuffer met hoge ionische sterkte, kan een extra centrifugeerstap (15 minuten bij 49.000 x g)worden uitgevoerd om ongewenste aggregaten indien nodig te verwijderen, omdat de myosine nu onpolymeriseerd is en in het supernatant blijft.
    2. Verzamel voor M5a-HMM zorgvuldig het volledige monster uit de dialysekamer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 49.000 x g bij 49.000 x g indien er ongewenste aggregaten aanwezig zijn. Neem de supernatant.
  6. Concentratiebepaling en flitsbevriezeling
    1. Om de concentratie van het product te bepalen, meet u de absorptie met behulp van een spectrofotometer op golflengten 260, 280, 290 en 320 nm. Bereken de concentratie in mg/ml (cmg/ml) met vergelijking 1, waarbij A 280 de absorptie bij 280 nm vertegenwoordigt en A320 de absorptie bij 320 nm. De resulterende concentratie in mg/ml kan worden omgezet in μM myosinemoleculen met vergelijking 2, waarbij M het molecuulgewicht van het hele eiwit is (inclusief de zware ketens, lichte ketens, fluoroforen en alle tags).
      cmg/ml = (A280 - A320) / ε (1)
      μM moleculen = 1000cmg/ml/M (2)
      OPMERKING: Als een verdunning nodig is, moet dit worden gedaan in een buffer met hoge ionische sterkte. De extinctiecoëfficiënt (ε) kan worden bepaald door de aminozuursequentie van het eiwit te importeren in een programma zoals ExPASy. De typische opbrengst voor de M5a-HMM is ongeveer 0,5-1 ml 1-5 mg/ml eiwit en voor de volledige NM2b is 0,5-1 ml van 0,5-2 mg/ml. De extinctiecoëfficiënt voor de M5a-HMM die in dit artikel werd gebruikt was 0,671. De extinctiecoëfficiënt voor de NM2b die in dit document werd gebruikt, was 0,611.
    2. Bewaar de gezuiverde myosine op een van de twee manieren. Aliquot tussen 10-20 μL in een dunwandige buis, zoals een polymerisatiekettingreactiebuis, en laat de buis in een container met vloeibare stikstof vallen om te knipperen. Als alternatief, direct pipet tussen 20-25 μL myosine in vloeibare stikstof en bewaar de bevroren kralen van eiwitten in steriele cryogene buizen. In beide gevallen kunnen de resulterende buizen worden opgeslagen in -80 °C of vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: Aangezien beide hieronder beschreven motiliteitstesten zeer kleine hoeveelheden eiwit vereisen, is opslag in kleine aliquots, zoals beschreven, economisch.

2. Glijdende actine filament assay

  1. Coverslip voorbereiding
    1. Maak een 1% nitrocellulose oplossing in amylacetaat.
    2. Verkrijg een weefselkweekschaal (150 x 25 mm) en voeg een cirkelvormig filterpapier (diameter 125 mm) toe aan de onderkant van de schaal.
    3. Laad acht 1,5 dikte 22 mm vierkante deksels op een rek en was met ongeveer 2-5 ml 200-proof ethanol gevolgd door 2-5 ml gedestilleerd water (dH2O). Herhaal deze wasstap en eindig met water. Droog vervolgens de afdeklips volledig met behulp van een gefilterde luchtleiding of N2-lijn.
    4. Neem één deklip en pipetteer langzaam 10 μL van de 1% nitrocelluloseoplossing langs één rand van de slip. Smeer het vervolgens in één vloeiende beweging over de rest van de afdeklip met behulp van de zijkant van een gladde pipetpunt van 200 μL. Plaats deze hoeslip op de weefselkweekschaal met de nitrocellulosezijde naar boven. Herhaal dit voor de resterende afdeklips en laat ze drogen tijdens het bereiden van de resterende reagentia en gebruik de afdeklips binnen 24 uur na het coaten.
  2. Kamervoorbereiding
    1. Veeg een microscoopschuif af met een optisch lenspapier om groot vuil te verwijderen. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer 2 cm lang.
    2. Plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif. Zorg ervoor dat de rand van de tape overeenkomt met de rand van de dia. Plaats het tweede stuk tape ongeveer 2 mm onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel en uitgelijnd zijn. Hierdoor ontstaat een debietkamer die ongeveer 10 μL oplossing kan bevatten (zie figuur 1).
    3. Neem een van de met nitrocellulose beklede coverslips uit deel 1. Plak de afdeklip voorzichtig op de tape zodat de met nitrocellulose bedekte zijde direct contact maakt met de tape (zie figuur 1). Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuifband om er zeker van te zijn dat de afdeklip goed aan de schuif is vastgehecht. Snijd de overtollige tape die over de rand van de glijbaan hangt met een scheermesje.
  3. Actin voorbereiding
    1. Maak 20 μM F-actine door bolvormige actine (G-actine) te polymeriseren in polymerisatiebuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) bij 4 °C 's nachts.
    2. Verdun F-actine tot 5 μM in motiliteitsbuffer (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etiket met ten minste 1,2x molaire overmaat aan rhodamine-phalloïdine. Laat (bedekt met aluminiumfolie) minstens 2 uur op ijs staan. Dit kan tot 1-2 maanden worden gebruikt, opgeslagen op ijs.
  4. Uitvoeren van de myosine 5a glijactine filament assay
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de myosine 5a (HMM) zweefvliegtest verstrekt.
    1. Bereid de oplossingen voor myosine 5a beschreven in tabel 2 voor en houd ze op ijs.
    2. Desluid in 10 μL myosine 5a (50-100 nM) door de stromingskamer en wacht 1 min.
    3. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 50 mM MB met 1 mM DTT ("zoutarme buffer"). Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten lopen door de hoek van het papier voorzichtig bij de uitgang van de stromingskamer te plaatsen.
    4. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Debiet in 10 μL van de zwarte actineoplossing (5 μM F-actine, 1 μM calmodulin en 1 mM ATP in 50 mM MB met 1 mM DTT) om "dode koppen" te elimineren, zoals besproken in de sectie Discussie.
      1. Pipetteer de oplossing met een spuit van 1 ml en een naald van 27 G om de actinefilamenten te scheren voordat u de oplossing in de kamer introduceert. Herhaal deze stap nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde keer. Ongeveer 20 pipetevenementen zijn voldoende.
      2. Om de "dead head" spin uit te voeren, voegt u een stoichiometrische hoeveelheid F-actine toe aan myosine in aanwezigheid van 1 mM ATP en 1 mM MgCl2 bij een zoutconcentratie van 500 mM. Vervolgens ultracentrifugeren bij 480.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. De dode myosine zal in de pellet zitten.
    6. Debiet in 50 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT en 1 mM ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten.
    7. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer om de kamer van een ATP uit te putten.
    8. Debiet in 10 μL 20 nM rhodamine actine (Rh-Actin) oplossing met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 minuut om rigor binding van actine filamenten aan de myosine 5a bevestigd aan het oppervlak van de coverslip mogelijk te maken.
    9. Was met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT om Rh-Actin filamenten weg te spoelen die niet aan het oppervlak zijn gebonden. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 30 μL eindbuffer.
    11. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met behulp van een excitatiegolflengte van 561 nm om Rh-Actin te visualiseren. Een geschikte belichtingstijd is 200 ms bij 1,4 mW laservermogen voor een totale acquisitieduur van 0,5-1 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de acquisitiesnelheid op de juiste manier wordt geschaald naar de snelheid van de bewegende filamenten. Een belangrijke overweging voordat u gegevens verzamelt voor gebruik met trackingprogramma's, is de aanschafframesnelheid. Subpixelbewegingen tussen frames zullen resulteren in een overschatting van de snelheid en bewegingen van enkele honderden nanometers zijn nodig om nauwkeurige waarden te verkrijgen. Een optimale acquisitiesnelheid is voorzien van actineglijder voor ten minste één pixelafstand tussen frames. In het geval van de TIRF-microscoop die hier voor de beeldvorming wordt gebruikt, vertaalt deze drempel zich in 130 nm; daarom moet een myosine die naar verwachting 1 μm/s zal afleggen, worden afgebeeld met een snelheid van 5 frames/s (interval van 0,2 s) om 200 nm beweging te bereiken, terwijl een myosine die naar verwachting 10 nm/s zal reizen, 0,05 frames/s (intervallen van 20 s) vereist. Gegevens kunnen daarom in dit stadium indien nodig worden gesampled (zie Discussie voor meer details).
  5. Uitvoeren van de nonmuscle myosine 2b glijactine filament assay
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de volledige niet-puntige myosine 2b glijtest verstrekt. Het nonmuscle myosine 2b glijactine filament assay protocol verschilt bij bepaalde stappen van het myosine 5a protocol. Zorg ervoor dat de juiste buffers worden gebruikt voor elk van deze stappen. De NM2b-test vereist bijvoorbeeld bevestiging van myosine aan de afdeklip in een zoutrijke buffer, terwijl de M5a in hoge of lage zoutbuffers aan de afdeklip kan worden bevestigd. Bovendien gebruikt de M5a gliding actine filament assay een lagere concentratie myosine om de frequentie van actine filamenten die uit elkaar vallen tijdens de acquisitie te verminderen.
    1. Bereid de oplossingen voor NM2b voor zoals beschreven in tabel 2 en houd ze op ijs.
    2. Debiet in 10 μL van de niet-muscle myosine 2b (0,2 μM) in 500 mM Motility Buffer (MB) ("hoge zoutbuffer") en 1 mM dithiothreitol (DTT) door de debietkamer en wacht 1 min.
      OPMERKING: De zoutrijke buffers dissociate myosinefilamenten en maken de bevestiging van enkele myosinemoleculen aan het oppervlak mogelijk, omdat niet-amuskel myosine 2b kan polymeriseren tot filamenten bij ionische concentratie <150 mM.
    3. Stroming in 10 μL van het 1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) in 500 mM MB met 1 mM DTT ("zoutrijke buffer") zoals beschreven in tabel 2. Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    4. Wassen met 10 μL van 500 mM MB met 1 mM DTT zoals beschreven in tabel 2. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Stroom in 10 μL van de zwarte actineoplossing zoals beschreven in tabel 2 om "dode hoofden" te elimineren, zoals verder besproken in de sectie Discussie. De zwarte actineoplossing bevat 5 μM ongelabeld F-actine, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2,1 μM CaM en 1 mM DTT in 50 mM NaCl motiliteitsbuffer om de niet-amuscle myosine 2b op het oppervlak van de kamer te fosforyleren.
      1. Pipetteer de oplossing met een spuit van 1 ml en een naald van 27 G om de actinefilamenten te scheren voordat u de oplossing in de kamer introduceert. Herhaal deze stap nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde keer. Ongeveer 20 pipetteerevenementen zijn voldoende.
    6. Debiet in 50 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT en 1 mM ATP om de kamer van vrije actinefilamenten uit te putten.
    7. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer om de kamer van een ATP uit te putten.
    8. Debiet in 10 μL 20 nM Rh-Actin-oplossing met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 minuut om rigorbinding van actinefilamenten mogelijk te maken aan de niet-muscle myosine 2b die aan het oppervlak van de afdeklip is bevestigd.
    9. Was met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT om Rh-Actin filamenten weg te spoelen die niet aan het oppervlak zijn gebonden. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 30 μL eindbuffer. Voor niet-amuskel myosine 2b glijdende actine filament assay, de Final Buffer omvat ook calmodulin, CaCl2, en myosine lichte keten kinase om volledige fosforylering van de nonmuscle myosine 2b tijdens video imaging. 0,7% methylcellulose kan ook in de Eindbuffer worden opgenomen als actinefilamenten slechts losjes gebonden zijn of niet aan het oppervlak gebonden zijn. Dit wordt verder besproken in de sectie Discussie.
    11. Neem beelden op een fluorescentiemicroscoop op met een excitatiegolflengte van 561 nm. Een geschikte belichtingstijd is 200 ms bij 1,4 mW laservermogen voor een totale acquisitieduur van 0,5 -3 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de acquisitiesnelheid op de juiste manier wordt geschaald naar de snelheid van de bewegende filamenten. Een belangrijke overweging voordat u gegevens verzamelt voor gebruik met trackingprogramma's, is de aanschafframesnelheid. Subpixelbewegingen tussen frames zullen resulteren in een overschatting van de snelheid en bewegingen van enkele honderden nanometers zijn nodig om nauwkeurige waarden te verkrijgen. Een optimale acquisitiesnelheid is voorzien van actineglijder voor ten minste één pixelafstand tussen frames. In het geval van de TIRF-microscoop die hier voor de beeldvorming wordt gebruikt, vertaalt deze drempel zich in 130 nm; daarom moet een myosine die naar verwachting 1 μm/s zal afleggen, worden afgebeeld met een snelheid van 5 frames/s (interval van 0,2 s) om 200 nm beweging te bereiken, terwijl een myosine die naar verwachting 10 nm/s zal reizen, 0,05 frames/s (intervallen van 20 s) vereist. Gegevens kunnen daarom in dit stadium worden gesampled, indien nodig (zie Discussie voor meer details).

3. Tirf-test met één molecuul

  1. Coverslip voorbereiding
    1. Verdeel het bouillonpoeder in 10 mg aliquots (in 1,5 ml tubes) methoxy-Peg-silaan (mPEG) en 10 mg aliquots biotine-Peg-silaan (bPEG). Bewaren bij -20 °C in een afgesloten, vochtvrije container en binnen 6 maanden gebruiken.
    2. Laad acht no. 1,5H (hoge precisie) dikte 22 mm vierkante afdeklips op een rek en was met 2-5 ml 200-proof ethanol gevolgd door 2-5 ml gedestilleerd water. Herhaal deze wasstap en eindig met water. Droog vervolgens de afdeklips volledig met behulp van een luchtleiding of N2 en plasmaschoon met argon gedurende 3 minuten.
    3. Plaats de schone afdeklips op filterpapier (90 mm) in een weefselkweekschaal (100 x 20 mm) en incubeer in een oven van 70 °C terwijl u de volgende stappen uitvoert.
      OPMERKING: De plasmareiniging kan worden vervangen door andere chemische reinigingsmethoden49.
    4. Bereid 80% ethanoloplossing met dH2O en stel de pH in op 2,0 met HCl. Voeg hiervan 1 ml toe aan een 10 mg aliquot mPEG en 1 ml aan een 10 mg aliquot bPEG. Vortex om op te lossen, wat niet meer dan 30 s mag duren.
    5. Neem 100 μL van de bPEG-oplossing en voeg 900 μL 80% ethanol (pH 2,0) toe. Deze oplossing is 1 mg/ml bPEG. Maak vervolgens een oplossing van beide PEGs als volgt, grondig mengend.
      1. 200 μL van 10 mg/ml mPEG (eindconcentratie: 2 mg/ml).
      2. 10 μL van de 1 mg/ml bPEG (eindconcentratie: 10 μg/ml).
      3. 790 μL van de 80% ethanol (pH 2,0) oplossing.
    6. Haal de afdeklipjes uit de oven. Verdeel voorzichtig 100 μL peg-oplossing over het midden van elke afdeklip, zodat alleen het bovenoppervlak nat is. Plaats vervolgens de slips terug in de oven en incubeer gedurende 20 tot 30 minuten.
    7. Wanneer de afdeklips een gatachtig uiterlijk beginnen aan te nemen, met kleine cirkels zichtbaar over het oppervlak, verwijder ze dan uit de oven.
    8. Was elke afdeklip met 100% ethanol, droog met een luchtlijn en zet terug in de oven. Incubeer alleen voor de tijd die nodig is om kamers te maken in stap 2.
  2. Kamervoorbereiding
    1. Reinig een microscoopschuif voor gebruik bij het maken van de kamer. Snijd twee stukken dubbelzijdige tape, ongeveer 2 cm lang.
    2. Plaats een stuk langs het midden van de lange rand van de microscoopschuif. Zorg ervoor dat de rand van de tape overeenkomt met de rand van de dia. Plaats het tweede stuk tape ongeveer 2 mm onder het eerste stuk tape, zodat de twee parallel en uitgelijnd zijn.
    3. Neem een van de gefunctionaliseerde afdeklipjes uit de oven (gemaakt in 3.1). Plak de afdeklip voorzichtig op de tape zodat de met PEG bedekte zijde naar beneden is gecoat en direct contact maakt met de tape, zoals afgebeeld in figuur 1. Druk met behulp van een pipettip voorzichtig op de interface van de schuifband om er zeker van te zijn dat de afdeklip goed aan de schuif is vastgehecht.
    4. Snijd de overtollige tape die over de glijbaan hangt met een scheermesje. Deze kamers kunnen onmiddellijk worden gebruikt of paarsgewijs in een buis van 50 ml worden geplaatst en in een vriezer van -80 °C worden bewaard voor toekomstig gebruik. Het is belangrijk om onmiddellijk op te slaan, anders zal het oppervlak afbreken.
  3. Uitvoeren van de myosine 5a TIRF microscopie test
    1. Bereid de oplossingen voor myosine 5a omgekeerde motiliteitstest zoals beschreven in tabel 3 voor en houd ze op ijs.
    2. Was de kamer met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT.
    3. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    4. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    5. Debiet in 10 μL van de NeutrAvidin-oplossing in 50 mM MB met 1 mM DTT en wacht 1 minuut.
    6. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    7. Debiet in 10 μL biotinylated rhodamine actine (bRh-Actin) met 1 mM DTT in 50 mM MB en wacht 1 min. Gebruik voor deze stap een grote verveende pipettip en vermijd pipetten op en neer om het scheren van de fluorescerende actinefilamenten te minimaliseren om ervoor te zorgen dat lange actinefilamenten aan het oppervlak kunnen worden bevestigd (20-30 μm of langer). Een effectief alternatief is het snijden van de kegel van een standaard pipetpunt (met een opening van ≈1-1,5 mm).
    8. Wassen met 10 μL van 50 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    9. Debiet in 30 μL Final Buffer met 10 nM myosine 5a toegevoegd, laad vervolgens onmiddellijk op de TIRF-microscoop en noteer na het vinden van de optimale focus voor TIRF-beeldvormingsmodaliteit. Blootstellingstijden tussen 100-200 ms zijn geschikt bij 1,4 mW laservermogen voor de actine en GFP-gelabelde myosine. Een geschikte acquisitietijd voor snelheidsanalyse is 3 min.
  4. Uitvoeren van de nonmuscle myosine 2b TIRF microscopie test
    OPMERKING: In deze sectie worden de details van de niet-muscle myosine 2b TIRF-test met behulp van gepolymeriseerde en gefosforyleerde filamenten verstrekt. Gedetailleerd protocol (secties 4.1-4.3) voor het fosforyleren en polymeriseren van de niet-muscle myosine-2b in een buis is opgenomen.
    1. Om de gezuiverde NM2b te fosforyleren, maakt u een kinasemix van 10x met de volgende omstandigheden: 2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK en 0,1 mM ATP. Dit kan op volume gebracht worden met 500 mM MB met 10 mM DTT. Voeg de 10x kinasemix toe aan de myosine in een volumetrische verhouding van 1:10 en laat dit 20-30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Meestal is de myosineconcentratie voor deze stap 1 μM.
    2. Om de gefosforyleerde myosine in filamenten te polymeriseren, verlaagt u de zoutconcentratie van de NM2b tot 150 mM NaCl. Maak hiervoor een 1x motility buffer (1x MB) zonder zout door de 4x MB vier keer in dH2O te verdunnen. Deze 1x MB kan worden gebruikt om de zoutconcentratie te verlagen omdat de NM2b in een zoutbuffer van 500 mM is ingevroren.
    3. Voeg voor elke 3 μL voorraad NM2b 7 μL 1x MB toe om de zoutconcentratie te verlagen tot 150 mM NaCl en incubeer gedurende 20-30 minuten op ijs om NM2b-filamenten te vormen.
      OPMERKING: De volgorde in de punten 4.1-4.3 is niet cruciaal zolang de NM2b is gefosforyleerd en de uiteindelijke zoutconcentratie 150 mM is. Incubatie in de orde van 30 min-1 uur geeft voldoende tijd voor volledige fosforylering en polymerisatie.
    4. Bereid de oplossingen voor nonmuscle myosine 2b omgekeerde motiliteitstest zoals beschreven in tabel 3 voor en houd ze op ijs.
    5. Was de kamer met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT.
    6. Debiet in 10 μL van de 1 mg/ml BSA in 150 mM MB met 1 mM DTT Herhaal deze was nog twee keer en wacht 1 minuut na de derde wasbeurt. Gebruik de hoek van een tissuepapier of filterpapier om de oplossing door het kanaal te laten stromen.
    7. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    8. Debiet in 10 μL van de NeutrAvidin-oplossing in 150 mM MB met 1 mM DTT en wacht 1 minuut.
    9. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    10. Debiet in 10 μL bRh-Actin en wacht 1 min. Gebruik voor deze stap een grote verveende pipettip en vermijd pipetten op en neer om het scheren van de fluorescerende actinefilamenten te minimaliseren, om ervoor te zorgen dat lange actinefilamenten aan het oppervlak kunnen worden bevestigd (20-30 μm of langer). Een effectief alternatief is het snijden van de kegel van een standaard pipetpunt.
    11. Wassen met 10 μL van 150 mM MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    12. Debiet in 10 μL van de niet-muscle myosine 2b-oplossing (ongeveer 30 nM) en wacht 1 min.
    13. Wassen met 10 μL van 150 MB met 1 mM DTT. Herhaal deze was nog twee keer.
    14. Debiet in 30 μL Final Buffer, laad vervolgens onmiddellijk op de TIRF-microscoop en noteer na het vinden van de optimale focus voor TIRF-beeldvormingsmodaliteit. Blootstellingstijden tussen 100-200 ms zijn geschikt bij 1,4 mW laservermogen voor de actine en GFP-gelabelde myosine. Een geschikte acquisitietijd voor snelheidsanalyse is 3 min.

4. Beeldanalyse

  1. Beeldanalyse voor glijdende actine filament assay
    OPMERKING: De afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met behulp vande software en handleidingen die zijn gekoppeld in de lijst met materialen . Het is belangrijk op te merken dat het hier beschreven programma TIFF-stacks vereist voor analyse. Het proces voor het analyseren van de test van de glijactinegloeidraad is als volgt50.
    1. Upload onbewerkte filmstapels naar een opgegeven mapstructuur en voer de bovenste map van de filmmappen in het programma in.
      OPMERKING: Het programma analyseert de bestanden in deze map en submappen en behandelt de mappen op het laagste niveau als replica's. Er worden gemiddelde statistieken voor elke groep replicates geproduceerd. In dit geval werd voor elke myosine één film gebruikt. Bij het karakteriseren van een nieuwe myosine of het onderzoeken van een nieuwe experimentele aandoening, wordt aanbevolen om films te analyseren vanuit drie gezichtsvelden (FOV) per kamer voor een totaal van drie kamers en om deze workflow te herhalen voor drie voorbereidingen van de myosine die wordt onderzocht.
    2. Gebruik het script "stack2tifs" in combinatie met de door de gebruiker ingevoerde framesnelheid om elke TIFF-stack om te zetten in een map met een reeks afzonderlijke TIFF-bestanden en een bijbehorend metagegevensbestand.txt bestand dat de begintijd van elk frame bevat. Voor gegevens die niet in de TIFF-stackindeling zijn, moet eerst een conversie worden toegepast met behulp van software zoals die in de tabel met materialen.
      OPMERKING: Dit script is het onderdeel van het softwarepakket. De informatie van het script is hier te vinden: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Gebruik de parameter -px, de pixelgrootte (in nm) tijdens het verkrijgen. In dit geval is de pixelgrootte 130 nm. Gebruik de parameters -xmax en -ymax voor het schalen van de assen voor de scatterplotuitgangen. Deze komen overeen met de langste geplote filamentlengte en de maximale geplote snelheid (in nm/s).
      OPMERKING: Dit zijn geschatte waarden en kunnen worden ingesteld op waarden die hoger zijn dan verwacht om ervoor te zorgen dat gegevens in het plot worden opgenomen. Na analyse kunnen de onbewerkte gegevens ook worden geëxporteerd voor gebruik in andere statistische of grafische software voor weergave en analyse.
    4. Gebruik de parameter -minv, een minimale snelheidsafsnijdingsparameter, om de filamenten te definiëren die niet bewegen en daarom kunnen worden uitgesloten van de analyse. Voor een langzame myosine zoals NM2b moet deze parameter laag zijn (in dit voorbeeld 5 nm/s) om te voorkomen dat echte glijdende bewegingen worden uitgesneden. Voor een snelle myosine zoals M5a kan deze parameter hoger zijn (in dit voorbeeld 100 nm/s) om een strenger filter toe te passen, met behoud van de werkelijke glijsnelheidsverdeling.
    5. Gebruik de -pt cutoff parameter om vloeiende beweging te identificeren. Voor elk bemonsteringsvenster wordt een waarde berekend die overeenkomt met 100 x standaardafwijking/gemiddelde snelheid van de snelheid. Tracks met hogere waarden dan de cutoff, hebben meer variabele snelheden en zijn uitgesloten van verdere analyse. In dit voorbeeld is een afsluitwaarde van 33 gebruikt. Tracks met hogere waarden hebben meer variabele snelheden en zijn uitgesloten van verdere analyse.
    6. Gebruik -maxd om een maximaal toegestane koppelingsafstand tussen frames in te stellen. Dit is een berekende frame-tot-frame afstand bewogen door het zwaartepunt van de gloeidraad in eenheden van nm. Het kan nuttig zijn voor het uitsluiten van sporadische bewegingen of onjuiste koppeling tussen filamenten. In de voorbeelden hier bleef de parameter achter op de standaardwaarde van 2.000 nm.
  2. Beeldanalyse voor TIRF-microscopietest
    OPMERKING: Het proces voor het analyseren van de TIRF-test met één molecuul op de beeldvormingssoftware die specifiek in de Tabel met materialen is als volgt29.
    1. Klik en sleep de opgenomen microscopievideo naar de werkruimte van de software om deze te openen51. Splits vervolgens de acquisitiekanalen. Klik op Afbeelding > Kleur > Gesplitste kanalen.
      OPMERKING: In het geval van een merkbare faseafwijking tijdens de verwerving, moeten beelden worden gestabiliseerd om de instrumentele drift op het beeldvlak te corrigeren. In dit geval werd geen compensatie voor Z-as drift gebruikt omdat de microscoop die wordt gebruikt om deze gegevens te verkrijgen de Z-focus goed stabiliseert. Als u de afbeelding in het beeldanalyseprogramma wilt stabiliseren, installeert u de juiste stabilisatorplug-in die is gekoppeld aan de lijst met materialen. De afbeeldingsstabilisator neemt vaste posities aan voor de objecten in de afbeelding en gebruikt een voortschrijdend gemiddelde van de vorige frames als referentie. De aanbevolen procedure is daarom om te beginnen met het kanaal met afbeeldingen van gelabeld actine, omdat dit zich in een vaste positie bevindt.
    2. Klik op Plug-insen zoek vervolgens Image Stabilizer; zorg ervoor dat Vertaling is geselecteerd en bewaar de standaardinstellingen. Schakel het selectievakje naast Logboektransformatiecoëfficiënten in. Als u deze logboekstap toepast, kunnen de berekende verschuivingsparameters in de volgende stap op het andere kanaal worden toegepast. Zorg ervoor dat het proces is voltooid.
    3. Open vervolgens het kanaal met het label myosine en pas de stabilisatie toe door te klikken op Plug-ins > Image Stabilizer Log Applier. Als beelden van actine niet tijdens dezelfde verwerving kunnen worden verkregen vanwege een vereiste voor beeldvorming met een hogere snelheid in één kanaal, stabiliseert drift de stapel afbeeldingen door een gebied te selecteren dat statische objecten bevat, zoals een biotinylated fiducial marker of fluoroforen die niet specifiek aan het biotine-PEG-oppervlak zijn gebonden. Dit gebied kan worden bijgesneden van de oorspronkelijke stapel en gestabiliseerd, gevolgd door toepassing van de resulterende verschuivingswaarden op de oorspronkelijke stapel.
      OPMERKING: In de praktijk zal de drift die wordt waargenomen in motiliteitsexperimenten verwaarloosbaar zijn ten opzichte van de beweging van myosines die bij enkele honderden nm/s bewegen, maar voor de langzaamste myosines wordt dit een belangrijke overweging.
    4. Open vervolgens TrackMate, klik op Plug-ins; klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu op Volgen en ten slotte op TrackMate. Op dit punt is de beeldanalyse onderhevig aan optimalisatie op basis van de parameters van de fluorofoor- en testomstandigheden. De ideale startparameters zijn echter als volgt.
      1. Kalibratie-instellingen: bewaar alle standaardwaarden.
      2. Detector: LoG detector.
      3. Geschatte blobdiameter: 0,5-1,0 micron.
      4. Drempel: 25-200. (Dit kan worden bepaald door op Preview te klikken nadat u een nummer hebt gekozen om te zien of de gedetecteerde vlekken overeenkomen met de film en op de juiste manier aan te passen.)
      5. Initiële drempelwaarde: niet ingesteld.
      6. Weergave: HyperStack Displayer.
      7. Filters instellen op vlekken: niet ingesteld.
      8. Tracker: Eenvoudige LAP tracker.
        OPMERKING: Deze zijn afhankelijk van framesnelheid en myosinesnelheid en moeten groot genoeg zijn om volgende posities aan te sluiten, terwijl ongewenste verbindingen tussen verschillende deeltjes worden uitgezien.
      9. Koppeling maximale afstand: 1,0 micron.
      10. Gap-closing max afstand: 1,0 micron.
      11. Gap-closing max frame gap: 1.
      12. Filters instellen op tracks: Track Displacement (>0,39-om alleen spots op te nemen die meer dan 3 pixels bewegen), Spots in tracks (>3-to alleen tracks met ten minste 3 spots bevatten). Andere filters zoals Minimal Velocity kunnen worden geïntroduceerd om plekken uit te sluiten die langdurig blijven staan. De resultaten van het filteren moeten worden gecontroleerd door visuele inspectie van sporen om ervoor te zorgen dat valse sporen (d.w.z. myosinebeweging op de achtergrond die zich niet langs een actinespoor bevindt) worden verwijderd met behoud van de sporen die aan actine zijn gekoppeld.
    5. Zodra het scherm Weergaveopties verschijnt, klikt u op Analyse voor de relevante uitgangen. Sla de drie geproduceerde tabellen op (Trackstatistieken, Koppelingen in Trackstatistieken en Vlekken in Trackstatistieken). De tabel Track Statistics bevat de snelheids- en verplaatsingsgegevens die vervolgens kunnen worden geanalyseerd om bijvoorbeeld een nieuw eiwit of de effecten van een bepaalde experimentele aandoening te karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De zuivering van myosine kan worden geëvalueerd door het verminderen van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide (SDS-PAGE) gel-elektroforese zoals weergegeven in figuur 2. Terwijl dit cijfer de definitieve, post-dialysed myosine vertegenwoordigt, kan SDS-PAGE op aliquots van de verschillende stadia van de zuiveringsprocedure worden uitgevoerd om om het even welke producten te identificeren die aan supernatant verloren gaan. Myosin 5a HMM heeft een band in het 120-130 kDa bereik en de full-length nonmuscle myosine 2b heeft een band in het 200-230 kDa bereik, overeenkomend met zware kettingen29,44. De myosine 5a heeft ook een band in de buurt van de 17 kDa-markering, die calmodulin markeert. De nonmuscle myosine 2b heeft een band van ongeveer 17 kDa, wat de ELC aanduidt. Omdat er een GFP-gelabelde RLC aanwezig is in dit NM2b-preparaat, verschijnt de RLC op ongeveer 47 kDa; een niet-gelabelde RLC zal echter aanwezig zijn op ongeveer 20 kDa als deze niet is getagd met een GFP.

De gliding actine filament assay getoond in Video 1 en Figuur 3 vertegenwoordigt de kenmerken van een ideale en traceerbare film. Deze gliding actine filament assay kenmerkt de soepele beweging van gelabelde actine filamenten. De zwarte actinewas zorgt ervoor dat de dode myosinekoppen uit het meetveld worden verwijderd, wat verder bijdraagt aan de algehele soepele beweging van de actinefilamenten. De fluorescerend gelabelde filamenten zijn kort genoeg dat een enkel filament niet op zichzelf oversteekt, wat beter is voor het trackingprogramma. Actine filamenten die te lang zijn, zullen andere filamenten kruisen, wat problemen kan opleveren voor het glijdende actine filament assay tracking programma. Dit probleem kan worden vermeden door 10-20 keer op en neer te gaan om de actinefilamenten af te scheren voordat u op de afdeklip laadt.

In het geval van NM2b kan het gebruik van methylcellulose de kwaliteit van de opgenomen films aanzienlijk verbeteren, omdat het de diffusie van de actine buiten het beeldoppervlak vermindert. Dit is niet nodig voor M5a omdat de hogere duty ratio zorgt voor een sterkere bevestiging van de actine aan het met myosine bedekte oppervlak. Als methylcellulose wordt gebruikt, is het nodig om de oplossing door de kamer te laten stromen om ervoor te zorgen dat de oplossing doorstroomt. Zoals getoond in Video 2, blijven de actinefilamenten, wanneer alle andere omstandigheden identiek zijn, met uitzondering van de uitsluiting van methylcellulose, niet zo nauw verbonden met het met myosine bedekte oppervlak.

Omgekeerd is het doel van de omgekeerde motiliteitstest in video 3 en figuur 4 het introduceren van oppervlaktegebonden fluorescerende actinefilamenten waarop myosinebeweging kan worden waargenomen. Een belangrijke vereiste van de omgekeerde test is ervoor te zorgen dat de myosinebeweging consistent wordt waargenomen in de FOV, zoals getoond. Het gebruik van een mengsel van DTT, glucose, catalase en glucoseoxidase kan fotobleaching minimaliseren om langere metingen mogelijk te maken52. Bovendien, als het acquisitiepercentage voor de test laag is, kan het sluiten van het verlichtingslicht tussen het verkrijgen van frames helpen bij overmatige fotobleaching. Het sluiten van het excitatielicht kan worden gedaan via een mechanische sluiter of een acousto-optisch afstembaar filter (AOTF).

Figure 1
Figuur 1: Voorbereiding van gefunctionaliseerde stromingscelkamers. (A) Begin met een gereinigde microscoopschuif, twee stukken dubbelzijdige tape gesneden tot ongeveer 2 cm en een gefunctionaliseerde afdeklip. (B) Voeg de tape toe aan het midden van de microscoopschuif. (C) Bevestig de afdeklip aan de tape met de coating (d.w.z. nitrocellulose) naar beneden gericht en druk voorzichtig op de overlappende gebieden met de tape met behulp van een plastic pipetpunt om ervoor te zorgen dat de afdeklip aan de kamer is gehecht. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: SDS polyacrylamide gel elektroforese van uitgedrukt NM2b en M5a-HMM. (A) Een representatieve SDS PAGE gel afbeelding voor een full-length NM2b zware ketting (≈230 kDa) en GFP-RLC (≈47 kDa) en ELC (≈17 kDa). Gelafbeelding gereproduceerd en aangepast van Melli et al. (2018)29. (B) Een representatieve SDS PAGE gel afbeelding voor een M5a-HMM-achtige zware ketting (≈120 kDa) en calmodulin (≈17 kDa). Merk op dat de gel in deze afbeelding geen GFP heeft ingevoegd aan het uiteinde van de C-terminal. Een GFP ingebracht in de myosine zware keten verhoogt het molecuulgewicht met ≈27 kDa. Gel afbeelding gereproduceerd en gewijzigd werd oorspronkelijk gepubliceerd in het Journal of Biological Chemistry44. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Resultaten vande testresultaten van glijdende actinefilamenten verkregen via TIRF-verlichting. (A) Voorbeeldframe uit een film met translocatie van rhodamine-falloidine gelabelde actinefilamenten (in rood) op 0,2 μM NM2b in aanwezigheid van 0,7% methylcellulose bij 30 °C. Schaalbalk = 10 μm. (B) Filamenttracking beelduitvoer van het FASTrack-programma voor NM2b voor dezelfde FOV als weergegeven in (A) Schaalbalk = 10 μm. (C) Representatief histogram van de acto-NM2b glijsnelheid, waaruit blijkt dat dit monster van NM2b een indringende glijsnelheid van 77 ± 15 nm/s kan genereren (gemiddelde ± standaardafwijking; aantal sporen = 5). (D) Voorbeeldframe uit een film met translocatie van rhodamine-falloidine gelabeld actine filamenten (in rood) op 75 nM M5a-HMM. Schaalbalk = 10 μm. (E) Filament tracking image output door het FASTrack programma voor M5a-HMM voor dezelfde FOV als weergegeven in (D) Schaalbalk = 10 μm. (F) Een representatief histogram van de acto-M5a-HMM glijsnelheid, waaruit blijkt dat dit monster van M5a een actine glijsnelheid van 515 ± 165 nm/s kan genereren (gemiddelde ± standaardafwijking). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Omgekeerde testresultaten verkregen via TIRF-verlichting. (A) Een representatieve FOV uit een tweekanaals samengevoegde beeldstapel die de beweging van NM2b-filamenten (groen weergegeven) op biotinylated actinefilamenten met AF647-phalloidine (blauw weergegeven) bij 30 °C weergeeft. Gepolymeriseerde filamenten van recombinant uitgedrukte en gezuiverde NM2b, samen uitgedrukt met ELC en GFP-RLC, worden waargenomen als de groene, langwerpige deeltjes in de FOV. Schaalbalk = 10 μm. (B) Representatief histogram van de snelheid van NM2b-filamenten. De analyse werd uitgevoerd met behulp vande beeldanalysesoftware die wordt beschreven in de tabel met materialen . Enkelvoudige NM2b-filamenten hebben een snelheid van 84 ± 22 nm/s (gemiddelde ± standaardafwijking; aantal deeltjes dat wordt bijgehouden = 133), bij het bewegen langs enkelvoudige actinefilamenten. (C) Voorbeeld kymografie van de NM2b filament beweging langs een enkele actine filament. Merk op dat sommige gebieden van het deeltje een "rotatie" van de NM2b-gloeidraad laten zien, langs de actinegloeidraad, wat hoogstwaarschijnlijk de tijd vertegenwoordigt waarop één kant van de bipolaire NM2b-gloeidraad loskomt van de actinegloeidraad, zoals eerder getoond in Melli et al.29. (D) Een representatieve FOV van de beweging M5a-HMM met één molecuul (groen weergegeven) op biotinylated actinefilamenten met rhodamine-phalloidine (rood weergegeven). Schaalbalk = 10 μm. (E) Representatief histogram van de runlengte van M5a-HMM, geschikt voor één exponentieel. De analyse werd uitgevoerd met behulp vande beeldanalysesoftware die wordt beschreven in de lijst met materialen . De karakteristieke looplengte is 1,3 μm met een betrouwbaarheidsinterval van 95% van 1,23-1,42 μm in dit voorbeeld. (F) Representatief histogram van de snelheid van één molecuul M5a-HMM op enkelvoudige actinefilamenten. De geanalyseerde gegevensuitvoer van beeldanalyse toont een gemiddelde snelheid van 668 ± 258 nm/s (gemiddelde ± standaardafwijking; aantal bijgehouden deeltjes = 684). (G) Voorbeeld kymografie van enkele moleculen van M5a-HMM beweging langs een enkele actine filament. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Video 1: Vergelijking van NM2b en M5a-HMM glijactine filamenttest. De NM2b glijactine filamenttest werd uitgevoerd in aanwezigheid van methylcellulose (links; videopaneel A) en de M5a-HMM bij afwezigheid van methylcellulose (rechts; videopaneel B) bij 30 °C. Merk op dat de tijdstempel sneller vooruitgaat in het NM2b-videopaneel, in vergelijking met het M5a-HMM-videopaneel om de beweging van de rodolinefilamenten met rhodaminelabel (rood) te laten zien die ongeveer hetzelfde is. Dit komt omdat de werkelijke actinetranslocatiesnelheid van NM2b bijna 7 keer langzamer is dan die voor M5a-HMM (respectievelijk 77 nm/s, versus 515 nm/s, geëxtraheerd uit de Gaussiaanse piek die past bij het histogram in figuur 3). Schaalbalk = 10 μm in beide videopanelen. NM2b-gegevens verkregen bij 0,33 frames per seconde met een blootstelling van 200 ms. M5a-HMM-gegevens verkregen bij 5 frames per seconde met 200 ms blootstelling (continu) en vervolgens naar beneden bemonsterd tot 1 frame per seconde. Tijdstempels zijn toegevoegd met behulp van de plug-in die wordt beschreven in de lijst met materialen. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Gliding actine filament assay van NM2b bij afwezigheid van methylcellulose. Wanneer alle andere omstandigheden hetzelfde zijn, behalve de afwezigheid van methylcellulose, plakken de actinefilamenten soms niet goed aan de deklip bedekt met 0,2 μM NM2b, wat leidt tot films van lagere kwaliteit met actinefilamenten die dicht bij het oppervlak van de NM2b-gecoate coverslip "floppen". Schaalbalk = 10 μm. Dit kan worden opgelost door methylcellulose in te voeren om de soepele beweging van de actinefilamenten weer te geven, zoals te zien is in het linker videopaneel van Video 1 (NM2b gliding actine filament assay). Een ander alternatief is om de NM2b-concentratie te verhogen tot ≈ 1 μM. Deze film werd verworven met 0.33 frames per seconde met 200 ms blootstelling. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 3: Vergelijking van NM2b en M5a-HMM omgekeerde motility assay. De NM2b omgekeerde motiliteitstest werd uitgevoerd in aanwezigheid van methylcellulose en opgenomen met een snelheid van 0,33 frames per seconde met behulp van een sluiter (links; videopaneel A), Videopaneel C toont dezelfde FOV als A, maar met deeltjes worden geïdentificeerd en gevolgd met behulp van beeldanalysesoftware. Evenzo werd de omgekeerde motiliteitstest voor M5a-HMM bij afwezigheid van methylcellulose geregistreerd met een snelheid van 5 frames per seconde (rechts; videopaneel B). Videopaneel D toont dezelfde FOV als B, maar met deeltjes geïdentificeerd en gevolgd met behulp van beeldanalysesoftware. Schaalbalken = 10 μm in alle videopanelen. De twee lasers werden heen en weer geschakeld met behulp van één camera voor acquisitie. Klik hier om deze video te downloaden.

Buffernaam Compositie Stap(en) Gebruikt Opmerkingen
M5a Extractie Buffer 0.3 M NaCl 1.1 Blijf op ijs.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mMMgCl
1,5 miljoen EGTA
4,5 mMNaN
NM2b Extractie buffer 0,5 M NaCl 1.1 Blijf op ijs.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mMMgCl
1,5 miljoen EGTA
4,5 mMNaN
Buffer A 0,5 M NaCl 2.2 Blijf op ijs.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
3 mMNaN
1 mM ATP
1 mM DTT
5 mMMgCl
Buffer B 0,5 M NaCl 2.3 Blijf op ijs.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
3 mMNaN
1 mM DTT
Elutiebuffer 0,5 M NaCl 3.1 Blijf op ijs.
0,5 mg/ml FLAG-peptide
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
3 mMNaN
pH 7,2
M5a Dialyse Buffer 500 mM KCl 4.1 Gebruik koude dH2O om op volume te brengen.
10 mMMgCl
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
1 mM DTT
NM2b Dialyse buffer 25 mM NaCl 4.1 Gebruik koude dH2O om op volume te brengen.
10 mMMgCl
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
1 mM DTT
NM2b-opslagbuffer 0,5 M NaCl 5.1 Blijf op ijs.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA
3 mMNaN

Tabel 1: Buffers gebruikt bij eiwitzuivering.

Buffernaam Compositie (M5a) Samenstelling (NM2b) Gebruikte stap(en) (M5a/NM2b) Opmerkingen
4x motility buffer (4x MB) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Vacuümfilter en bewaren in 4°C
20 mMMgCl 20 mMMgCl
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH 7,4 pH 7,4
50 mM zoutmotiliteitsbuffer (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Vacuümfilter en bewaren in 4°C
50 mM KCl 50 mM NaCl
Verhogen naar volume met dH2O Verhogen naar volume met dH2O
500 mM zoutmotiliteitsbuffer (500 mM MB) N.V.T 25% v/v 4X MB Vacuümfilter en bewaren in 4°C
500 mM NaCl
Verhogen naar volume met dH2O
Myosine 0,05-0,1 μM myosine 0,2 μM myosine 4.2/5.2 Blijf op ijs.
1 mM DTT 1 mM DTT
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 500 mM MB
1 mg/ml RunderserumAlbumine (BSA) 1 mg/ml BSA 1 mg/ml BSA 4.3/5.3 Blijf op ijs.
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 500 mM MB
1 mM DTT 1 mM DTT
5 μM Ongelabeld F-actine in 50 mM MB (zwarte actine) 5 μM ongelabeld F-actine 5 μM ongelabeld F-actine 4.5/5.5 Blijf op ijs. Schuif actine door 5-10 keer op en neer te spuiten, of door een spuit te gebruiken.
1 μM calmodulin (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0,2 mM CaCl2
Verdunnen in 50 mM MB 1 μM CaM
1–10 nM myosine lichtkettingkinase (MLCK)
Verdunnen in 50 mM MB
MB met 1 mM DTT en 1 mM ATP 1 mM DTT 1 mM DTT 4.6/5.6 Blijf op ijs.
1 mM ATP 1 mM ATP
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 50 mM MB
MB met DTT 1 mM DTT 1 mM DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 Blijf op ijs.
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 50 mM MB
20 nM Rhodamine-Phalloidin F-actine (Rh-Actin) 20 nM Rhodamine-falloidine F-actine 20 nM Rhodamine-falloidine F-actine 4.8/5.8 Blijf op ijs. Niet vortexen.
1 mM DTT 1 mM DTT
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 50 mM MB
Definitieve buffer 50 mM KCl 0,7% methylcellulose (optioneel) 4.10/5.10 Voeg de glucose, glucoseoxidase en catalase toe vlak voordat u het experiment uitvoert. Blijf op ijs.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM NaCl
5 mMMgCl 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA 5 mMMgCl
1 mM ATP 0,1 miljoen EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM calmodulin 50 mM DTT
2,5 mg/ml glucose 1–10 nM MLCK
100 μg/ml glucoseoxidase 0,2 mM CaCl2
40 μg/ml catalase 1 μM calmodulin
2,5 mg/ml glucose
100 μg/ml glucoseoxidase
40 μg/ml catalase

Tabel 2: Buffers gebruikt bij zweefvliegtest.

Buffernaam Compositie (M5a) Samenstelling (NM2b) Gebruikte stap(en) (M5a/NM2b) Opmerkingen
4x motility buffer (4x MB) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Vacuümfilter en bewaren in 4°C
20 mMMgCl 20 mMMgCl
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH 7,4 pH 7,4
50 mM zout Motility Buffer (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Vacuümfilter en bewaren in 4°C
50 mM KCl 50 mM NaCl
Verhogen naar volume met dH2O Verhogen naar volume met dH2O
150 mM zout Motility Buffer (150 mM MB) 25% v/v 4X MB Vacuümfilter en bewaren in 4°C
150 mM NaCl
Verhogen naar volume met dH2O
Myosine 30 nM myosine Zie "Final Buffer" Recept/4.12 Blijf op ijs.
1 mM DTT
Verdunnen in 150 mM MB
2 mg/ml NeutrAvidin 2 mg/ml NeutrAvidin 2 mg/ml NeutrAvidin 3.5/4.8 Blijf op ijs.
1 mM DTT 1 mM DTT
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 150 mM MB
1 mg/ml runderserumalbumine (BSA) 1 mg/ml BSA 1 mg/ml BSA 3.3/4.6 Blijf op ijs.
1 mM DTT 1 mM DTT
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 150 mM MB
200 nM rhodamine-falloidine biotinylated F-actine (bRh-Actin) 200 nM rhodamine-phalloidine biotinylated F-actine 200 nM rhodamine-phalloidine biotinylated F-actine 3.7/4.10 Vermijd scheren door niet op en neer te vortexen of pipetten. Om te mengen, voorzichtig omkeren.
1 mM DTT 1 mM DTT
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 150 mM MB
MB met DTT 50 mM DTT 50 mM DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 Blijf op ijs.
Verdunnen in 50 mM MB Verdunnen in 150 mM MB
Definitieve buffer 50 mM KCl 0,7% methylcellulose (optioneel) 3.9/4.14 Voeg de glucose, glucoseoxidase en catalase toe vlak voordat u het experiment uitvoert. Blijf op ijs.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM NaCl
5 mMMgCl 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 miljoen EGTA 5 mMMgCl
1 mM ATP 0,1 miljoen EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM calmodulin 50 mM DTT
2,5 mg/ml glucose 1–10 nM MLCK
100 μg/ml glucoseoxidase 0,2 mM CaCl2
40 μg/ml catalase 1 μM calmodulin
10 nM myosine 2,5 mg/ml glucose
100 μg/ml glucoseoxidase
40 μg/ml catalase

Tabel 3: Buffers gebruikt bij TIRF-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier wordt een workflow gepresenteerd voor de zuivering en in vitro karakterisering van myosine 5a en niet-amuscle myosine 2b. Deze reeks experimenten is nuttig voor het kwantificeren van de mechanochemische eigenschappen van gezuiverde myosineconstructies op een snelle en reproduceerbare manier. Hoewel de twee myosines die hier worden getoond slechts twee specifieke voorbeelden zijn van de vele mogelijkheden, kunnen de voorwaarden en technieken, met enige aanpassing, worden toegepast op de meeste myosines en op vele andere motorische eiwitten.

De protocollen die hier worden besproken, zijn onderhevig aan variaties, afhankelijk van de individuele behoeften van het lab en experimenten. Zoals bijvoorbeeld besproken in de sectie Expressie en Moleculaire Biologie, werden de eiwitten die in dit artikel worden gebruikt, gegenereerd door een co-infectie van twee of meer virussen; succesvolle eiwitexpressie kan echter ook worden bereikt met multi-expressievectoren zoals de p-FastBac dual expression vector of het BiGBac expressiesysteem53.

Verschillende factoren kunnen de succesvolle productie van het recombinante eiwit belemmeren. Om eiwitafbraak te voorkomen, is het absoluut noodzakelijk dat elke stap van de eiwitzuivering op de juiste temperatuur wordt voltooid, waarbij alle centrifugeerstappen plaatsvinden bij 4 °C en alle andere stappen op ijs worden uitgevoerd. Overtollige banden kunnen zichtbaar zijn in de gel van het gedialyseerde eiwitproduct. Dit kan wijzen op afbraak of verontreiniging. Latere zuivering via grootte-uitsluiting of ionische-uitwisselingschromatografie kan de zuiverheid van de monsters verbeteren54. In die zin wordt aanbevolen om aliquots te bewaren bij elke stap van het eiwitzuiveringsproces voor het oplossen van problemen, mocht er een lage opbrengst van myosine of vermoedelijke eiwitverontreiniging zijn. Soms kan er onvoldoende binding van het lysaat aan de hars zijn in stap 1.8, wat kan leiden tot het verlies van het myosine aan het supernatant bij daaropvolgende centrifugeren. Dit kan worden opgelost door de duur van de harsbinding tijdens deze stap te variëren, zelfs door het indien nodig 's nachts te laten binden. Langere incubatietijden introduceren een groter risico op eiwitdegradatie als verontreinigings proteasen niet voldoende worden geremd en myosines met proteolytisch gevoelige gebieden nadelig worden beïnvloed. Bovendien kan onjuist wassen van de hars zowel voor als na gebruik leiden tot de elutie van een ongewenst eiwitproduct, dus het is noodzakelijk dat de juiste protocollen worden gevolgd voor en na het gebruik van de FLAG-affiniteitshars. Als de hars onmiddellijk na gebruik wordt gewassen en op de juiste manier wordt bewaard, kan deze tot 20 keer worden hergebruikt.

Het is belangrijk op te merken dat eiwitdegradatie ook optreedt tijdens de expressiefase en verkorting van expressietijden kan voordelig zijn in termen van afbraak, hoewel dit ten koste kan gaan van de totale opbrengst. Het volgen van de hier beschreven procedures om het eiwitmonster in verschillende stadia van het protocol te controleren (d.w.z. voor, tijdens en na de zuivering) zal helpen bij het bepalen van de fasen die nodig zijn voor optimalisatie. Voor myosines die herhaaldelijk weerstand bieden aan succesvolle expressie en zuivering, kunnen veelvoorkomende problemen co-expressie zijn met onvoldoende of ongepaste lichtkettingen en onjuist vouwen tijdens overexpressie. Geschikte lichtketens moeten worden geselecteerd op basis van bekende interacties waar mogelijk en zware keten-tot-lichte keten baculovirusverhoudingen moeten worden getest in kleinschalige experimenten om het optimale te bepalen. Voor myosines die weinig of geen oplosbaar actief product samenvoegen of opleveren, kan co-expressie met chaperonnes helpen bij het succesvol verkrijgen van actief eiwit54,55.

Gezuiverde myosineproducten bevatten onvermijdelijk een kleine populatie beschadigde myosine, aangeduid als "dode hoofden", die op twee manieren kunnen worden aangepakt. Een methode, beschreven in dit protocol, omvat het stromen van ongelabelde, of "zwarte", actine door de kamer in de glijactine filamenttest. Vervolgens zorgt het wassen met ATP ervoor dat functionele myosines zich distantiëren van de zwarte actine, terwijl dode hoofden gebonden blijven aan deze ongelabelde actine vanwege hun onvermogen om ATP te hydrolyseren en vanwege hun hoge affiniteit. Tijdens het uitvoeren van de zwarte actinewas kan een spuit worden gebruikt om de actine effectief te scheren. Extra afschuiven kan worden bereikt door vortexing, op voorwaarde dat eventuele resulterende bellen worden verwijderd door centrifugeren. Een alternatieve methode is om selectief de dode koppen uit het myosinemonster te pelleteren door myosine te mengen met F-actine en Mg-ATP bij hoge zoutconcentraties (0,5 M) en sedimentering in een tafel-top ultracentrifuge. De myosines die atp onder deze omstandigheden kunnen hydrolyseren, blijven niet gebonden aan de actine vanwege hun lage affiniteit voor actine onder deze zoutrijke omstandigheden en worden aangetroffen in het supernatant, terwijl de dode hoofden van myosine gebonden blijven aan de actine in de pellet56. Evenzo kan een sedimentatie met actine en resuspensie van de pellet ook worden gebruikt om myosines te verwijderen die niet in staat zijn om zich te binden aan actine bij afwezigheid van ATP. Merk op dat een klein deel van dit soort dode hoofden minder impact zal hebben op dit soort test. Door een nucleotidevrije sedimentatie en resuspensie te doen, gevolgd door een ATP-gebonden centrifugeren en resuspensie, kunnen myosines die competent zijn voor zowel actinebindende als ATP-afhankelijke afgifte van actine worden geïsoleerd.

Motility assays kunnen ook op verschillende manieren worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, in de glijdende actine filament assay voor de NM2b, wordt de NM2b gefosforyleerd in de kamer via de toevoeging van MLCK, calmodulin, calcium en ATP in de zwarte actinestap, evenals in de Final Buffer. De NM2b kan echter ook in een buis worden gefosforyleerd, voordat de test wordt uitgevoerd. Hierdoor kan het percentage gefosforyleerde NM2b worden gekwantificeerd door een native gel met een ureumbevattende monsterbuffer uit te voeren of massaspectrometrie57,58uit te voeren . Het effect van temperatuur op myosine activiteit kan ook worden onderzocht. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van een objectief verwarmingssysteem op de microscoop of een omgevingsbehuizing, zodat de stroomcel op constante temperatuur wordt gehouden. Ionische kracht is een andere belangrijke overweging. Voor veel myosines zullen actineaffiniteit en enzymatische activiteit worden verhoogd bij een lagere ionische sterkte; voor anderen is een hogere ionische sterkte noodzakelijk59. Naast het verstrekken van waardevolle informatie over het myosinemechanisme, kan het verlagen van de ionische sterkte de beweeglijkheid verbeteren en myosine toegankelijker maken voor onderzoek met veel assays. Sommige motoren daarentegen vertonen elektrostatische tethering-effecten, die de beweeglijkheid bij lagere ionische sterktes zullen vertragen. Ten slotte is het bij het meten van de beweging van NM2b-filamenten cruciaal om de ionische sterkte binnen een smal bereik (150-200 mM ionische sterkte) te behouden, waarbij de in de meeste celtypen aangetroffen sterkte wordt benaderen. Het gebruik van lagere ionische sterktes resulteert in aggregatie van de myosinefilamenten, terwijl de filamenten depolymeriseren bij hogere ionische sterktes.

Met veel myosines, met name die met lage bedrijfsverhoudingen, zouden de voorwaarden van de uiteindelijke buffer die voor M5a wordt gegeven ertoe leiden dat de fluorescerend gelabelde actinefilamenten slechts losjes aan het oppervlak worden gebonden of helemaal worden losgekoppeld. Dit resulteert in grillige bewegingen die de kwantificering bemoeilijken. Beweging van betere kwaliteit kan vaak worden verkregen met methylcellulose (0,7%) in de eindbuffer. Methylcellulose is een viskeuze verdringingsmiddel en dwingt actine filamenten om dicht bij het oppervlak te blijven, zelfs wanneer de dichtheid van aangesloten myosinemotoren schaars is60. Evenzo is geconstateerd dat de opname van methylcellulose in de uiteindelijke buffer van de motiliteitstest van één filament noodzakelijk is om beweging met NM2a te observeren, en hetzelfde fenomeen werd gemeld voor gladde spier myosinefilamenten29,61. Dit verhoogt ook de processiviteit van NM2b filamenten. Een mogelijk ongewenste bijwerking van het gebruik van methylcellulose in deze test is dat de eigenschappen van het verdringingsmiddel de laterale associatie van myosinefilamenten in bundels kunnen bevorderen. Alternatieven voor methylcellulose bij het oplossen van een gebrek aan beweging of los gebonden actinefilamenten in de glijactinefilamenttest zijn het verlagen van de zoutconcentratie in de motiliteitsbuffers of het verhogen van de myosineoppervlakdichtheid. Zoals hierboven vermeld , is aangetoond dat een hoge ionische sterkte in de motiliteitsbuffers het vermogen van sommige myosines om zich te binden aan actin29,34,62verlaagt .

Een andere variant van de gliding actine filament assay is het gebruik van antilichamen om de myosine op de glasafdekkingslip te verankeren. Als er bijvoorbeeld een GFP aanwezig is aan het C-terminale uiteinde van de myosineconstructie, kan een anti-GFP-antilichaam worden gebruikt om het GFP-myosine aan de coverslip36,63,64te bevestigen . Dit kan helpen bij het verkrijgen van succesvolle beweeglijkheid in situaties waarin de geometrie van het systeem anders de translocatie van de handeling kan belemmeren , zoals bij het testen van kunstmatige of korte hefboomarmen54,64. Bovendien kan het effect van belasting op translocatiesnelheden worden onderzocht in de gliding actine filament assay door gebruik te maken van actinebindende eiwitten zoals α-actinine of utrofine39,50,65. Een dergelijke meting kan nuttig zijn om het effect van belasting op een ensemble van myosines te vergelijken met de belastingsafhankelijke kinetiek van een enkele myosine die kan worden gemeten met behulp van een optische vangtest66,67. Dit kan worden bereikt door het toevoegen van toenemende hoeveelheden van een actine-bindend eiwit samen met de myosine in de eerste stap. Het actinebindende eiwit bindt zich aan het oppervlak en oefent een wrijvingsbelasting uit op de actinefilamenten die door myosines worden bewogen, wat resulteert in een gegradeerde snelheid naarmate de concentratie van actinebindend eiwit op het oppervlak wordt verhoogd39.

De single molecule/ensemble motility assay kan ook worden aangepast om het effect van verschillende actinestructuren op myosinebeweging te onderzoeken. In plaats van bijvoorbeeld myosinebeweging bovenop enkelvoudige actinefilamenten te observeren, kunnen fascin- of α-actinine-gemedieerde actinebundels worden bestudeerd als een in vitro reconstitutie van het actinefilamentnetwerk in de cellen68,69. Het effect van actinebindende eiwitten zoals tropomyosine kan ook worden bestudeerd65,70,71,72.

Van belang is de veelzijdigheid bij het kiezen van een label voor de motiliteitstest met één molecuul/ensemble. In dit rapport werd een GFP-label gebruikt op zowel de M5a-HMM als NM2b; er kunnen echter nog veel meer labels worden gebruikt. Voorbeelden zijn HaloTag of SNAP-tag, die genetisch kan worden gesmolten met de myosine en covalent een synthetische kleurstof bindt. Het voordeel van HaloTag-technologie ligt in de veelzijdigheid voor verschillende experimentele aanpassingen, zoals labelen met verschillende kleuren of het toevoegen van een biotine affiniteitstag29,73. Bovendien kan het gebruik van quantum dot-technologie worden gebruikt om de resolutie van fluorescentietracking met één molecuul te verbeteren, wat ook de beperking van de lage helderheid van GFP en de neiging tot fotobleaching74aanpakt. Tags kunnen met succes worden bevestigd aan lichte kettingen en de zware ketting11,75,76.

Voor het bereiken van succes in de tirf-motiliteitstest met één molecuul, is een belangrijke factor het gebruik van een goed geblokkeerd en gefunctionaliseerd oppervlak. Een eenvoudige methode om matige blokkering te bereiken, is het gebruik van biotinylated-BSA gebonden aan een nitrocelluloseoppervlak. Hoewel dit goed genoeg zal werken om veel motoren te karakteriseren, waaronder M5a, is het niveau van niet-specifieke binding op een dergelijk oppervlak onbetaalbaar voor het reproduceren van schone bewegingen met monsters zoals NM2b. Een belangrijke doorbraak in dit verband was de overgang naar PEGylated oppervlakken gedode met biotine-PEG voor functionalisering77. De PEG-oppervlakken bieden een veel superieur niveau van oppervlakteblokkering en een defectvrij PEGylated-oppervlak kan gedurende zeer lange tijd vrij blijven van aspecifieke binding. Het specifieke protocol dat hier wordt beschreven, maakt de productie van biotinylated PEG-oppervlakken binnen enkele uren mogelijk en als ze onmiddellijk worden opgeslagen zoals beschreven, kunnen de oppervlakken enkele weken worden gebruikt met slechts een marginale kwaliteitsdaling.

Een belangrijke overweging voordat u gegevens verzamelt voor tracking, is de aanschafframesnelheid. De verplaatsing tussen de volgende frames moet groot genoeg zijn om oversamplingfouten te voorkomen. Hoge bemonsteringssnelheden zullen overschattingssnelheden opleveren als gevolg van de verdeling van lokalisatiefouten met een klein tijdsinterval en de schijnbare fout van de meting verhogen. In gevallen waarin de onbewerkte gegevens te fijn worden bemonsterd, kunnen de gegevens worden gesampled door elk Nth-frame te nemen om een nieuwe stack te maken en rekening te houden met de wijziging in framesnelheid die resulteert. Subpixelbewegingen tussen frames moeten worden vermeden en bewegingen van enkele honderden nanometers zijn vereist om nauwkeurige waarden te verkrijgen. In alle gevallen waarin een nieuw monster wordt gekarakteriseerd, moeten de resultaten van geautomatiseerde analyse worden vergeleken met een kleine dataset van handmatig bijgehouden filamenten voor consistentie.

Bij het analyseren van gegevens van motiliteitsexperimenten met één molecuul moet voorzichtig worden gekozen welke parameters moeten worden gemeten, hoe gegevens moeten worden gefilterd en hoe gegevens moeten worden aangepast. Zoals hierboven vermeld, kan de bemonsteringsfrequentie een belangrijke factor zijn bij het analyseren van snelheidsgegevens. Voor veel myosines zullen processieve runs kort zijn en goed worden benaderd door een rechte lijn. In dergelijke gevallen kan de begin-eindpuntafstand van het spoor een goede maat zijn voor de looplengte en dit kan worden gedeeld door de duur van het spoor om een goede schatting van de snelheid te geven. In gevallen waarin de sporen erg lang zijn en gebogen paden rond gebogen filamenten volgen, zal dit type analyse onnauwkeurige resultaten opleveren en moet een totale afgelegde afstand worden gebruikt, met behulp van een acquisitiesnelheid die het mogelijk maakt om opeenvolgende lokalisatiepunten voldoende uit elkaar te plaatsen om oversamplingfouten zoals hierboven beschreven te voorkomen, terwijl ze dicht genoeg bij elkaar liggen dat de rechte lijnafstand tussen hen een goede benadering van de curve tussen die punten blijft. Bovendien moeten voor motoreiwitten met lengtes op lange termijn in verhouding tot de lengte van het spoor aanvullende statistieken worden gemaakt, zoals de Kaplan-Meier-schatter bij de berekening van de looplengten78. Hetzelfde geldt voor situaties waarin fotobleaching voldoende waarschijnlijk is voor het einde van een processieve run. Een ander fenomeen dat kan worden waargenomen in fluorescentiestudies met één molecuul is photoblinking, waarbij fluoroforen snel schakelen tussen de aan- en uittoestand en lijken te knipperen. Dit komt meestal niet voor in deze motiliteitsexperimenten; als dit echter gebeurt, kunnen de laserintensiteit en belichtingstijden worden verlaagd, waardoor het effect tot een minimum moet worden beperkt. Verschillende chemicaliën, waaronder β-mercaptoethanol, Trolox, cyclooctateraeen, n-propylgallaat, 4-nitrobenzylalcohol en 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaan kunnen worden gebruikt om dit ook te verminderen79.

Samengevat bevat dit artikel gedetailleerde protocollen die robuust zijn in hun vermogen om mechanochemische eigenschappen te kwantificeren, zoals actinetranslocatiesnelheid, myosinetranslocatiesnelheid en myosine-runlengte. Deze test is reproduceerbaar en kan worden gebruikt om de kwaliteit van het gezuiverde myosine te bepalen, zelfs in situaties waarin de beweeglijke kenmerken niet het specifieke einddoel van de studie zijn. Bovendien kunnen veranderingen zoals pH, temperatuur en chemische regulatoren in deze onderzoeken worden geïntroduceerd om te onderzoeken hoe de mechanochemie van het bestudeerde myosine wordt beïnvloed. Samen kunnen de actine glijdende en omgekeerde motiliteitstesten een beter begrip van myosine-ensemblegedrag en intermoleculaire variaties in moleculaire motormechanica en kinetiek mogelijk maken. De fluorescentiemicroscopie-gebaseerde assays die hier worden beschreven, ondersteunen de benadering van een reductionist voor cytoskeletonderzoek en kunnen een krachtig hulpmiddel zijn om eiwit-eiwitdynamiek in vitro te begrijpen. Samen kunnen gegevens die zijn verzameld uit deze sterk gecontroleerde experimenten worden gebruikt om mechanobiologen te adviseren over belangrijk actomyosinegedrag dat relevant kan zijn op het biologische celniveau en daarbuiten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We danken Dr. Fang Zhang voor technische hulp bij de voorbereiding van de reagentia die worden gebruikt voor het verzamelen van deze gegevens. Dit werk werd ondersteund door de NHLBI/NIH Intramuraal OnderzoekSprogramma fondsen HL001786 aan J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

Biochemie myosine actine filamenten eiwitzuivering fluorescentie microscopie motiliteitstest single molecule assay bipolaire filamenten totale interne reflectie fluorescentie microscopie
Myosine-specifieke aanpassingen van in vitro fluorescentiemicroscopie-gebaseerde motiliteitstesten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter