Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.

Abstract

Белки миозина связываются и взаимодействуют с нитевидным актином (F-актином) и обнаруживаются в организмах по всему филогенетическому дереву. Их структура и ферментативные свойства адаптированы к конкретной функции, которую они выполняют в клетках. Миозин 5а процессивно ходит по F-актину для транспортировки меланосом и везикул в клетках. И наоборот, немуздровой миозин 2b действует как биполярная нить, содержащая примерно 30 молекул. Он перемещает F-актин противоположной полярности к центру нити, где молекулы миозина работают асинхронно, чтобы связать актин, придать силовой удар и диссоциировать перед повторением цикла. Немуздрочный миозин 2b, наряду с другими его немузкулистыми изоформами миозина 2, имеет роли, которые включают клеточную адгезию, цитокинез и поддержание напряжения. Механохимия миозинов может быть изучена путем выполнения анализов подвижности in vitro с использованием очищенных белков. В скользящем актиновом анализе миозины связываются с поверхностью крышки микроскопа и транслокируют флуоресцентно меченый F-актин, который можно отслеживать. Однако в анализе подвижности одной молекулы/ансамбля F-актин связан с покровным листом, и наблюдается движение флуоресцентно меченых молекул миозина на F-актине. В этом отчете описана очистка рекомбинантного миозина 5а из клеток Sf9 с помощью аффинной хроматографии. После этого мы опишем два анализа на основе флуоресцентной микроскопии: анализ скользящей актиновой нити и анализ перевернутой подвижности. Из этих анализов такие параметры, как скорости транслокации актина и длины и скорости пробега одной молекулы, могут быть извлечены с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Эти методы также могут быть применены для изучения движения одиночных нитей немышечные изоформы миозина 2, обсуждаемые в настоящем документе в контексте немузкусного миозина 2b. Этот рабочий процесс представляет собой протокол и набор количественных инструментов, которые могут быть использованы для изучения динамики одной молекулы и ансамбля немуклетковых миозидов.

Introduction

Миозины представляют собой моторные белки, которые оказывают силу на актиновые нити, используя энергию, полученную в результате гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ)1. Миозины содержат область головы, шеи и хвоста. Головной домен содержит актин-связывающую область, а также место связывания и гидролиза АТФ. Шейные домены состоят из мотивов IQ, которые связываются с легкими цепями, кальмодулином или кальмодулиноподобными белками2,3. Хвостовая область имеет несколько функций, специфичных для каждого класса миозинов, включая, но не ограничиваясь, димеризацией двух тяжелых цепей, связыванием молекул груза и регуляцией миозина посредством аутоингибиторных взаимодействий с головными доменами1.

Подвижные свойства миозина сильно различаются между классами. Некоторые из этих свойств включают коэффициент нагрузки (доля механического цикла миозина, в которой миозин связан с актином) и процессучность (способность двигателя делать несколько шагов на своем пути перед отслоением)4. Более 40 классов миозинов были определены на основе последовательности анализов5,6,7,8. Миозины класса 2 классифицируются как «обычные», поскольку они были первыми, которые были изучены; поэтому все другие классы миозинов классифицируются как «нетрадиционные».

Миозин 5а (M5a) является миозином класса 5 и является процессивным двигателем, что означает, что он может делать несколько шагов вдоль актина перед диссоциацией. Он имеет высокий коэффициент полезного действия, что указывает на то, что он проводит большую часть своего механическогоцикла,связанного с актином9,10,11,12,13,14. Как и другие миозины, тяжелая цепь содержит N-концевой двигательный домен, который включает в себя как актин-связывание, так и сайт гидролиза АТФ, за которым следует область шеи, которая служит рычагом-рычагом, с шестью мотивами IQ, которые связываются с основными легкими цепями (ELC) и кальмодулином (CaM)15. Хвостовая область содержит α спиральные спиральные катушки, которые димеризируют молекулу, за которой следует шаровидная хвостовая область для связывания груза. Его кинетика отражает его участие в транспорте меланосом в меланоцитах и эндоплазматического ретикулума в нейронах Пуркинье16,17. М5а считается прототипом грузового транспортногомотора 18.

Миозины класса 2, или обычные миозины, включают миозины, которые обеспечивают сокращение скелетных, сердечных и гладких мышц в дополнение к немуусочковым изоформам миозина 2 (NM2), NM2a, 2b и 2c19. Изоформы NM2 находятся в цитоплазме всех клеток и играют общую роль в цитокинезе, адгезии, тканевом морфогенезе и миграции клеток19,20,21,22. В данной статье обсуждаются обычные протоколы миозина в контексте немузкулового миозина 2b (NM2b)23. NM2b, по сравнению с M5a, имеет низкий коэффициент нагрузки и ферментарно медленнее с Vmax 0,2 с-123 по сравнению с M5a Vmax ≈18 с-124. Примечательно, что усеченные конструкции NM2b с двумя головками не легко перемещаются процессно на актине; скорее, каждая встреча с актином приводит к силовому удару с последующей диссоциацией молекулы25.

NM2b содержит две тяжелые цепи миозина, каждая с одним шаровидным головным доменом, одним рычагом-рычагом (с одним ELC и одной регуляторной легкой цепью (RLC)) и α-спиральным спиральным стержнем / хвостовым стержнем, длиной примерно 1 100 аминокислот, который димеризует эти две тяжелые цепи. Ферментативная активность и структурное состояние NM2b регулируются фосфорилированием RLC23. Нефосфорилированный NM2b, в присутствии АТФ и физиологических ионных сил (приблизительно 150 мМ соли), принимает компактную конформацию, в которой две головки участвуют в асимметричном взаимодействии, а хвостовые складки возвращаются над головами в двух местах23. В этом состоянии миозин не взаимодействует сильно с актином и обладает очень низкой ферментативной активностью. При фосфорилировании RLC кальмодулин-зависимой миозин-цепной киназой (MLCK) или Rho-ассоциированной протеинкиназой молекула расширяется и связывается с другими миозинами через хвостовую область с образованием биполярных нитей примерно из 30 молекул миозина23. Вышеупомянутое фосфорилирование RLC также приводит к повышению актин-активированной АТФазной активности NM2b примерно в четыре разав 26,27,28. Это биполярное расположение нити накала, имеющее множество миозиновых двигателей на каждом конце, оптимизировано для ролей в сжатии и поддержании напряжения, где актиновые нити с противоположными полярностями могут перемещаться относительно друг друга23,29. Соответственно, было показано, что NM2b действует как ансамбль двигателей при взаимодействии с актином. Большое количество двигателей в этой нити накала позволяют нитям NM2b двигаться процессно на актиновых нитях, что делает возможным характеристику процессичности нити in vitro дляхарактеристики 29.

Хотя был достигнут прогресс в понимании роли миозинов в клетке, необходимо понимать их индивидуальные особенности на уровне белка. Чтобы понять взаимодействия актомиозина на простом уровне белково-белкового взаимодействия, а не внутри клетки, мы можем экспрессировать и очищать рекомбинантные миозины для использования в исследованиях in vitro. Результаты таких исследований затем информируют механобиологов о биофизических свойствах специфических миозидов, которые в конечном итоге управляют сложными клеточными процессами12,13,14,25,29. Как правило, это достигается путем добавления метки аффинности к полноразмерной или усеченной конструкции миозина и очистки с помощью аффинной хроматографии29,30,31. Кроме того, конструкция может быть спроектирована так, чтобы включать генетически кодируемый флуорофор или метку для маркировки белка синтетическим флуорофором. Добавляя такую флуоресцентную метку, можно проводить исследования визуализации одной молекулы для наблюдения за механикой миозина и кинетикой.

После очищения миозин можно охарактеризовать несколькими способами. Активность АТФазы может быть измерена колориметрическими методами, обеспечивающими понимание общего энергопотребления и актинового сродства двигателя в различных условиях32. Чтобы узнать о механохимии его подвижности, требуются дальнейшие эксперименты. В этой статье подробно описываются два метода на основе флуоресцентной микроскопии in vitro, которые могут быть использованы для характеристики подвижных свойств очищенного белка миозина.

Первым из этих методов является скользящий актиновый анализ нити, который может быть использован для количественного изучения ансамблевых свойств миозиновых двигателей, а также качественного изучения качества партии очищенного белка33. Хотя в этой статье обсуждается использование микроскопии полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) для этого анализа, эти эксперименты могут быть эффективно выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой, обычно встречающегося во многих лабораториях34. В этом анализе насыщающий слой миозиновых двигателей прикрепляется к покровному слипу. Это может быть достигнуто с использованием нитроцеллюлозы, антител, мембран, SiO2-производныхповерхностей (таких как триметилхлорсилан), среди прочих29,33,35,36,37,38. Флуоресцентно меченые актиновые нити пропускаются через камеру крышки, на которой актин связывается с миозином, прикрепленным к поверхности. При добавлении АТФ (и киназ при исследовании NM2) камера визуалируется для наблюдения за транслокацией актиновых нитей поверхностно связанными миозинами. Программное обеспечение для отслеживания может использоваться для корреляции скорости и длины каждой скользящей актинной нити. Программное обеспечение для анализа может также обеспечить измерение количества как движущихся, так и стационарных актиновых нитей, что может быть полезно для определения качества данного препарата миозина. Пропорция заглохших нитей также может быть намеренно модулирована поверхностным привязыванием актина к другим белкам и измерена для определения зависимости нагрузки миозина39. Поскольку каждая нить актина может приводиться в движение большим количеством доступных двигателей, этот анализ очень воспроизводим, причем конечная измеренная скорость устойчива к возмущениям, таким как изменения в начальной концентрации миозина или присутствие дополнительных факторов в растворе. Это означает, что его можно легко модифицировать для изучения активности миозина в различных условиях, таких как измененное фосфорилирование, температура, ионная прочность, вязкость раствора и эффекты нагрузки, вызванной поверхностными тросами. Хотя такие факторы, как сильно связывающие «мертвые головки» миозина, неспособные к гидролизу АТФ, могут вызвать застойные актиновые нити, существует несколько методов, позволяющих смягчить такие проблемы и обеспечить точные измерения. Кинетические свойства миозина сильно различаются в зависимости от классов и, в зависимости от конкретного используемого миозина, скорость скольжения актиновой нити в этом анализе может варьироваться от менее 20 нм / с (миозин 9)40,41и до 60 000 нм / с(Characean myosin 11)42.

Второй анализ инвертирует геометрию скользящей актиновой нитианализа 12. Здесь актиновые нити прикрепляются к поверхности покрова и визуализируется движение одиночных молекул M5a или отдельных биполярных нитей NM2b. Этот анализ может быть использован для количественной оценки длины пробега и скоростей отдельных молекул миозина или нитей на актине. Покров покрывается химическим соединением, которое блокирует неспецифическое связывание и одновременно функционализирует поверхность, таким как биотин-полиэтиленгликоль (биотин-ПЭГ). Добавление модифицированных производных авидина затем грунтует поверхность, и биотинилированный актин пропускают через камеру, в результате чего слой F-актина стабильно связывается с нижней частью камеры. Наконец, активированный и флуоресцентно меченый миозин (обычно 1-100 нМ) протекает через камеру, которая затем визуализируется для наблюдения за движением миозина над стационарными актиновым нитями.

Эти модальности представляют собой быстрые и воспроизводимые методы, которые могут быть использованы для изучения динамики как немуечных, так и мышечных миозинов. В этом отчете описываются процедуры очистки и характеристики как M5a, так и NM2b, представляющие собой нетрадиционные и обычные миозины, соответственно. За этим следует обсуждение некоторых миозин-специфических адаптаций, которые могут быть выполнены для достижения успешного захвата движения в двух типах анализа.

Экспрессия и молекулярная биология
КДНК для интересующего миозина должна быть клонирована на модифицированный вектор pFastBac1, который кодирует либо C-концевой FLAG-тег (DYKDDDDK), если экспрессирует M5a-HMM, либо N-концевой FLAG-метки, если экспрессирует полноразмерную молекулу NM2b23,43,44,45,46. C-концевые FLAG-метки на NM2b приводят к ослаблению сродства белка к столбику FLAG-аффинности. Напротив, N-терминально помеченный FLAG белок обычно хорошо связывается с колонкой23FLAG-аффинности. N-терминально меченый белок сохраняет ферментативную активность, механическую активность и фосфорилирование-зависимую регуляцию23.

В этой статье использовалась усеченная мышь M5a тяжелая меромиозиновая (HMM)-подобная конструкция с GFP между FLAG-тегом и C-концем тяжелой цепи миозина. Обратите внимание, что в отличие от NM2b, M5a-HMM может быть успешно помечен и очищен с помощью тегов FLAG N- или C-терминала, и в обоих случаях результирующая конструкция будет активной. Тяжелая цепь M5a была усечена при аминокислоте 1090 и содержит три аминокислотных линкера (GCG) между GFP и областью катушки M5a47. Между GFP и FLAG-тегом не было добавлено дополнительного компоновщика. M5a-HMM был совместно экспрессирован с кальмодулином. Полноразмерная человеческая конструкция NM2b была выражена совместно с ELC и RLC. N-термины RLC сплавлены с GFP через линкер из пяти аминокислот (SGLRS). Непосредственно к FLAG-тегу был прикреплен HaloTag. Между HaloTag и N-концем тяжелой цепи миозина находился линкер, состоящий из двух аминокислот (AS).

Оба препарата миозина очищали от одного литра культуры клеток Sf9, инфицированной бакуловирусом, при плотности примерно 2 х 106 клеток/мл. Объемы бакуловируса для каждой субъединицы зависели от множественности инфекции вируса, определенной инструкциями производителя. В случае M5a клетки были совместно инфицированы двумя различными бакуловирусами - один для кальмодулина и один для тяжелой цепи M5a. В случае NM2b клетки были совместно инфицированы тремя различными вирусами - один для ELC, один для RLC и один для тяжелой цепи NM2b. Для лабораторий, работающих с различными миозинами (или другими многокомплексными белками), этот подход эффективен, поскольку он допускает множество комбинаций тяжелых и легких цепей, а обычно используемые легкие цепи, такие как кальмодулин, могут быть совместно трансфекционированы многими различными тяжелыми цепями миозина. Вся клеточная работа была завершена в шкафу биобезопасности с надлежащей стерильной техникой, чтобы избежать загрязнения.

Для экспрессии как M5a, так и NM2b клетки Sf9, продуцирующие рекомбинантные миозины, собирали через 2-3 дня после заражения путем центрифугирования и хранили при -80 °C. Клеточные гранулы получали центрифугированием коинфицированных клеток Sf9 при 4 °C в течение 30 мин при 2,800 х г. Процесс очистки белка подробно описан ниже.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Очистка белка

  1. Лизис клеток и экстракция белка
    1. Подготовьте 1,5-кратный буфер извлечения на основе таблицы 1. Фильтровать и хранить при 4 °C.
    2. Начните размораживать гранулы клеток на льду. Пока гранулы оттаивают, дополняют 100 мл экстракционного буфера 1,2 мМ дитиотрейтола (DTT), 5 мкг/мл лейпептида, 0,5 мкМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и две таблетки ингибитора протеазы. Держитесь на льду.
    3. После того, как гранула разморозится, добавьте 1 мл дополнительного экстракционного буфера на 10 мл клеточной культуры. Например, если гранулы клеток были сформированы из 500 мл клеточной культуры, то добавьте к грануле 50 мл дополненного экстракционного буфера.
    4. Обжаивайте гранулы клеток ультразвуком, сохраняя их на льду. Для каждой гранулы используют следующие условия: 5 с ВКЛ, 5 с ВЫКЛ, продолжительность 5 мин, мощность 4-5.
    5. Соберите весь гомогенизированный лизат в замок и добавьте АТФ (0,1 М раствора; рН 7,0) таким образом, чтобы конечная концентрация АТФ была 1 мМ. Перемешивать в течение 15 мин в холодном помещении. АТФ диссоциирует активный миозин от актина, позволяя отделить его на следующей ступени центрифугирования. Поэтому важно немедленно перейти к следующему шагу, с тем чтобы свести к минимуму возможность истощения АТФ и его повторной привязки к актину.
    6. Центрифугировать лизаты при 48 000 х г в течение 1 ч при 4 °C. Пока это происходит, начните промывку 1-5 мл 50% суспензии аффинной смолы Anti-FLAG (для гранулы, образованной из 1 л клеток) 100 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), в соответствии с инструкциями производителя. Например, для 5 мл смолы промыть 10 мл 50% суспензии. На заключительном этапе промывки повторно суспендировать смолу с 1-5 мл PBS с достаточным объемом для создания 50% суспензии.
    7. После центрифугирования лизатом соедините супернатант с промытой смоляной суспензией и камнем осторожно в холодном помещении в течение 1-4 ч. Во время ожидания сделайте буферы, описанные в таблице 1, и держите их на льду.
  2. Препарат для аффинной очистки FLAG
    1. Центрифугируют раствор на этапе 1,7 при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С. Смола будет упакована в нижней части трубки. Не нарушая смолу, удалите супернатант.
    2. Повторно суспендируют смолу в 50 мл буфера А, как описано в таблице 1, и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Не нарушая смолу, удалите супернатант.
    3. Повторно суспендируют смолу в 50 мл буфера B, как описано в таблице 1, и центрифугу при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Повторите этот шаг еще раз и повторно суспендируете смолу в 20 мл буфера B. Затем тщательно перемешайте смолу и буфер, осторожно перевернутый тюбик вручную примерно 10 раз.
  3. Элюция и концентрация белка
    1. Сделайте 30 мл элюационного буфера, как описано в таблице 1, и дайте ему остыть на льду.
    2. Установите колонну элюдения в холодном помещении. Аккуратно вылейте смоляную суспензию в колонну. Промывайте колонну с 1-2 колонными объемами буфера B, так как смола упаковывается на дно, следя за тем, чтобы смола не высохла.
    3. Продуть 1 мл элюационного буфера через смолу и собрать поток в трубку 1,5 мл. Повторите так, чтобы были собраны фракции 12, 1 мл.
    4. На этом этапе выполните грубый тест Брэдфорда на фракциях, чтобы качественно определить, какие фракции являются наиболее концентрированными48. На одном ряду 96-скважинной пластины пипетка 60 мкл 1x реагент Брэдфорда. По мере сбора фракций смешайте по 20 мкл каждой фракции на скважину. Более темная синяя окраска указывает на более концентрированные фракции.
    5. В пробирке 50 мл соберите оставшийся белок, осторожно пипетируя оставшийся буфер элюирования через столбец, чтобы освободить любой оставшийся миозин, связанный со смолой в проточном потоке колонны. Этот поток будет сконцентрирован на следующем этапе. Убедитесь, что смола затем регенерирована для повторного использования и хранится в соответствии с инструкциями производителя.
    6. Объедините три наиболее концентрированные фракции и дополнительно сконцентрируйте проточная часть в трубе 50 мл, а также оставшиеся фракции 1 мл с помощью концентрируемой трубки MWCO 100 000 MWCO. Загрузите объединенный образец на концентрирующую трубку и центрифугу при 750 х г в течение 15 мин при 4 °C и повторяйте до тех пор, пока весь элюированный белок не будет сконцентрирован до конечного объема приблизительно 0,5-1 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот размер пор позволяет удерживать молекулы миозина, которые имеют массы, в несколько раз превышающие отсечение молекулярной массы. Легкие цепи остаются тесно связанными с двигательными доменами в течение этого времени концентрации, что подтверждается выполнением электрофореза геля SDS-PAGE на конечном продукте.
  4. Диализ и флэш-заморозка
    1. Сделайте 2 л диализного буфера, как описано в таблице 1. Загрузите образец в диализный мешок или камеру и диализуйте на ночь в холодном помещении. Отметим, что состав диализных буферов отличается для NM2b и M5a.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае NM2b целью этого этапа диализа является образование миозиновых нитей в буфере низкой ионной силы. Осаждение этих нитей затем обеспечивает дополнительную ступень очистки и позволяет концентрирование образца. Таким образом, на следующий день в диализной камере будет видимый белый осадок. Эти нити будут собраны путем центрифугирования и деполимеризованы на этапе 5.1. В случае M5a-HMM, после ночного диализа, белок будет достаточно чистым для использования в последующих анализах. При необходимости могут быть выполнены дальнейшие этапы очистки, такие как фильтрация геля или ионная обменная хроматография. Для восстановления M5a после диализа перейдите к шагу 5.2.
  5. Восстановление миозина после диализа
    1. Для NM2b осторожно выгрузите весь образец из диализного мешка или камеры и центрифуги при 4 °C в течение 15 мин при 49 000 х г для сбора миозинов. Отбросьте супернатант и постепенно добавляйте буфер хранения к грануле, как описано в таблице 1, пока она не растворится. Мягкое пипетирование вверх и вниз помогает солюбилизировать гранулу. В норме для этого не требуется более 500 мкл на пробирку. После обеспечения полного растворения гранулы в буфере хранения с высокой ионной прочностью можно выполнить дополнительную ступень центрифугирования (15 мин при 49 000 х г)для удаления нежелательных агрегатов, если это необходимо, поскольку миозин теперь будет неполимеризованным и останется в надподобном веществе.
    2. Для M5a-HMM тщательно соберите весь образец из диализной камеры и центрифуги при 4 °C в течение 15 мин при 49 000 х г в случае наличия нежелательных агрегатов. Возьмем супернатант.
  6. Определение концентрации и мгновенное замораживание
    1. Чтобы определить концентрацию продукта, измерьте поглощение с помощью спектрофотометра на длинах волн 260, 280, 290 и 320 нм. Рассчитайте концентрацию в мг/мл(cмг/мл)с уравнением 1, где A280 представляет поглощение при 280 нм, а A320 представляет поглощение при 320 нм. Результирующая концентрация в мг/мл может быть преобразована в мкМ молекул миозина с уравнением 2,где M — молекулярная масса всего белка (включая тяжелые цепи, легкие цепи, флуорофоры и все метки).
      cмг/мл = (A280 - A320) / ε (1)
      мкМ молекул = 1000смг/мл/М(2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо разбавление, то оно должно быть сделано в буфере высокой ионной силы. Коэффициент вымирания (ε) можно определить, импортив аминокислотную последовательность белка в такую программу, как ExPASy. Типичный выход для M5a-HMM составляет приблизительно 0,5-1 мл белка 1-5 мг/мл, а для полноразмерного NM2b составляет 0,5-1 мл 0,5-2 мг/мл. Коэффициент вымирания для M5a-HMM, использованный в этой статье, составил 0,671. Коэффициент вымирания для NM2b, использованный в данной работе, составил 0,611.
    2. Храните очищенный миозин одним из двух способов. Аликвот между 10-20 мкл в тонкостенный пробирок, такой как трубка полимеризационной цепной реакции, и опускают трубку в контейнер с жидким азотом для мгновенной заморозки. Альтернативно, непосредственно пипетку между 20-25 мкл миозина в жидкий азот и хранят замороженные шарики белка в стерильных криогенных трубках. В любом случае полученные трубки могут храниться при -80 °C или жидком азоте для будущего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку оба анализа подвижности, описанные ниже, требуют очень небольшого количества белка, хранение в небольших аликвотах, как описано, является экономичным.

2. Скользящий актиновая нить

  1. Подготовка обложек
    1. Сделайте 1% раствор нитроцеллюлозы в амилацетате.
    2. Получите чашку для посева тканей (150 х 25 мм) и добавьте на дно блюда круглую фильтровальную бумагу (диаметром 125 мм).
    3. Загрузите восемь крышек No 1,5 толщиной 22 мм на стойку и промыть примерно 2-5 мл 200-стойкого этанола с последующим 2-5 мл дистиллированной воды (dH2O). Повторите этот шаг стирки, заканчивая водой. Затем полностью высушите крышки с помощьюфильтроточной воздушной линии или N 2-линии.
    4. Возьмите один обтекатель и медленно пипетку 10 мкл 1% раствора нитроцеллюлозы вдоль одного края скольжения. Затем одним плавным движением размажьте его по остальной части крышки, используя сторону гладкого наконечника пипетки 200 мкл. Поместите этот покров на блюдо для посева тканей нитроцеллюлозной стороной вверх. Повторите для оставшихся обложек и дайте им высохнуть при приготовлении оставшихся реагентов и используйте обтекаемые листы в течение 24 ч после нанесения покрытия.
  2. Подготовка камеры
    1. Протрите слайд микроскопа бумагой для оптической линзы, чтобы очистить от крупного мусора. Вырежьте два куска двусторонней ленты, примерно 2 см длиной.
    2. Поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпадает с краем слайда. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными и выровненными. Это создает проточные камеры, которые могут вмещать приблизительно 10 мкл раствора (см. Рисунок 1).
    3. Возьмем один из покрытых нитроцеллюлозой покровных листков из Части 1. Осторожно наклейте крышку на ленту так, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно контактировала с лентой (см. Рисунок 1). Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно прилипла к слайду. Отрежьте лишнюю ленту, висящую над краем горки лезвием бритвы.
  3. Препарат актина
    1. Производят 20 мкМ F-актина путем полимеризации глобулярного актина (G-актина) в полимеризационной буфере (50 мМ KCl, 2 мМ MgCl2,1 мМ DTT, 25 мМ MOPS (рН 7,0)) при 4 °C в течение ночи.
    2. Разбавляют F-актин до 5 мкМ в буфере подвижности (20 мМ МОПС, 5 мММгCl2,0,1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ (рН 7,4)). Этикетка с не менее чем 1,2-кратным молярным избытком родамина-фаллоидина. Оставьте (покрытое алюминиевой фольгой) не менее 2 ч на льду. Его можно использовать до 1-2 месяцев, хранить на льду.
  4. Выполнение анализа скользящей актиновой нити миозина 5а
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробные сведения о скользящем анализе миозина 5а (HMM).
    1. Подготовьте растворы для миозина 5а, описанные в таблице 2, и держите их на льду.
    2. Протоите в 10 мкл миозина 5а (50-100 нМ) через прототочную камеру и подождите 1 мин.
    3. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT (буфер с низким содержанием соли). Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал, аккуратно поместив угол бумаги на выход из блок-камеры.
    4. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Поток в 10 мкл раствора черного актина (5 мкМ F-актина, 1 мкМ кальмодулина и 1 мМ АТФ в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT) для устранения «мертвых головок», как обсуждалось в разделе «Обсуждение».
      1. Пипетку раствора со шприцем 1 мл и иглой 27 г для сдвига актиновой нити перед введением раствора в камеру. Повторите этот шаг еще два раза и подождите 1 минуту после третьего раза. Достаточно примерно 20 событий пипетирования.
      2. Для выполнения вращения «мертвой головы» добавляют стехиометрическое количество F-актина к миозину в присутствии 1 мМ АТФ и 1 мМMgCl2 при концентрации соли 500 мМ. Затем ультрацентрифугу при 480 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Мертвый миозин будет в грануле.
    6. Поток в 50 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей.
    7. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы истощить камеру любого АТФ.
    8. Продуть в 10 мкл раствора родамина актина (Rh-Actin) 20 нМ, содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ МБ, и подождать 1 мин, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с миозином 5а, прикрепленным к поверхности покровного листа.
    9. Промывайте 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT для смывания rh-актиновых нитей, не связанных с поверхностью. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Расход в 30 мкл конечного буфера.
    11. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп, используя длину волны возбуждения 561 нм для визуализации Rh-актина. Соответствующее время экспозиции составляет 200 мс при мощности лазера 1,4 мВт при общей продолжительности захвата 0,5-1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скорость захвата масштабируется соответствующим образом в соответствии со скоростью движущихся нитей. Важным соображением перед сбором данных для использования с программами отслеживания является частота кадров сбора. Субпиксельные движения между кадрами приведут к завышенности скорости, а для получения точных значений потребуются движения в несколько сотен нанометров. Оптимальная скорость захвата обеспечивает актин-скольжение на расстоянии не менее одного пикселя между кадрами. В случае микроскопа TIRF, используемого для визуализации здесь, этот порог переводится в 130 нм; поэтому миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 1 мкм/с, должен быть визуален со скоростью 5 кадров/с (интервал 0,2 с) для достижения 200 нм движения, в то время как миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 10 нм/с, требует 0,05 кадра/с (интервал 20 с). Поэтому при необходимости данные могут быть понижены на этом этапе (см. Обсуждение для получения более подробной информации).
  5. Выполнение анализа скользящей актиновой нити на миозин 2b скольжения миозина
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе приведены подробности полноразмерного немышечно-скользящего анализа миозина 2b. Протокол анализа скользящего актина с немышечной миозиновой нитью 2b отличается от протокола миозина 5а на определенных этапах. Убедитесь, что для каждого из этих шагов используются правильные буферы. Например, анализ NM2b требует прикрепления миозина к крышке в буфере с высоким содержанием соли, в то время как M5a может быть присоединен к крышке в буферах с высоким или низким содержанием соли. Кроме того, скользящий анализ актиновой нити M5a использует более низкую концентрацию миозина для смягчения частоты разрушения актиновых нитей во время приобретения.
    1. Подготовьте растворы для NM2b, как описано в таблице 2, и держите их на льду.
    2. Протойте в 10 мкл немышечного миозина 2b (0,2 мкМ) в буфере подвижности (МБ) 500 мМ (буфер с высоким содержанием соли) и 1 мМ дитиотрейтола (DTT) через проточную камеру и подождите 1 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы с высоким содержанием соли диссоциируют нити миозина и позволяют прикреплять одиночные молекулы миозина к поверхности, поскольку немузкусный миозин 2b может полимеризоваться в нити при ионной концентрации <150 мМ.
    3. Расход в 10 мкл 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 500 мМ МБ с 1 мМ DTT (буфер с высоким содержанием соли), как описано в таблице 2. Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    4. Промывка с 10 мкл 500 мМ МБ с 1 мМ DTT, как описано в таблице 2. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Поток в 10 мкл раствора черного актина, как описано в таблице 2, для устранения «мертвых головок», как обсуждается далее в разделе «Обсуждение». Раствор черного актина содержит 5 мкМ немаркированного F-актина, 1-10 нМ MLCK, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ CaCl2,1 мкМ CaM и 1 мМ DTT в буфере подвижности NaCl 50 мМ для фосфорилировать немуускуловый миозин 2b на поверхности камеры.
      1. Пипетку раствора со шприцем 1 мл и иглой 27 г для сдвига актиновой нити перед введением раствора в камеру. Повторите этот шаг еще два раза и подождите 1 минуту после третьего раза. Приблизительно достаточно 20 событий пипетирования.
    6. Поток в 50 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей.
    7. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту промывку еще два раза, чтобы истощить камеру любого АТФ.
    8. Продуть в 10 мкл раствора rh-актина 20 нМ, содержащего 1 мМ ДТТ в 50 мМ МБ, и подождать 1 мин, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с немуусковым миозином 2b, прикрепленным к поверхности покровного листа.
    9. Промывайте 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT для смывания rh-актиновых нитей, не связанных с поверхностью. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Расход в 30 мкл конечного буфера. Для анализа скользящей актиновой нити на основе немузклового миозина 2b конечный буфер также включает кальмодулин, CaCl2и миозиновую легкоцепочечной киназу для обеспечения полного фосфорилирования немуускового миозина 2b во время видеоизображения. 0,7% метилцеллюлозы также может быть включено в конечный буфер, если актиновые нити только слабо связаны или не связаны с поверхностью. Этот вопрос обсуждается далее в разделе Обсуждение.
    11. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп с использованием длины волны возбуждения 561 нм. Соответствующее время экспозиции составляет 200 мс при мощности лазера 1,4 мВт при общей продолжительности захвата 0,5 -3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скорость захвата масштабируется соответствующим образом в соответствии со скоростью движущихся нитей. Важным соображением перед сбором данных для использования с программами отслеживания является частота кадров сбора. Субпиксельные движения между кадрами приведут к завышенности скорости, а для получения точных значений потребуются движения в несколько сотен нанометров. Оптимальная скорость захвата обеспечивает актин-скольжение на расстоянии не менее одного пикселя между кадрами. В случае микроскопа TIRF, используемого для визуализации здесь, этот порог переводится в 130 нм; поэтому миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 1 мкм/с, должен быть визуален со скоростью 5 кадров/с (интервал 0,2 с) для достижения 200 нм движения, в то время как миозин, который, как ожидается, будет двигаться со скоростью 10 нм/с, требует 0,05 кадра/с (интервал 20 с). Поэтому при необходимости данные могут быть понижены на этом этапе (см. Обсуждение для получения более подробной информации).

3. Одномолекулярный анализ TIRF

  1. Подготовка обложек
    1. Разделите запас порошка на 10 мг аликвот (в пробирках по 1,5 мл) метокси-пег-силана (mPEG) и 10 мг аликвот биотин-пег-силана (bPEG). Хранить при -20 °C в герметичном, неувлажняемом контейнере и использовать в течение 6 месяцев.
    2. Загрузите восемь No 1,5Н (высокоточных) толщиной 22 мм квадратных крышек на стойку и промывайте 2-5 мл 200-стойкого этанола с последующим 2-5 мл дистиллированной воды. Повторите этот шаг стирки, заканчивая водой. Затем полностью высушите крышки с помощью воздушной линии илиN2 и плазменно очистите аргоном в течение 3 мин.
    3. Поместите чистые крышки на фильтровальную бумагу (90 мм) в чашку для культивации тканей (100 x 20 мм) и высиживайте в духовке с 70 °C, выполняя следующие шаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная очистка может быть заменена другими методами химической очистки49.
    4. Приготовьте 80% раствор этанола с dH2O и отрегулируйте рН до 2,0 с помощью HCl. Добавьте 1 мл этого к 10 мг аликвоты mPEG и 1 мл к 10 мг аликвоты bPEG. Вихрь растворяется, что не должно занимать более 30 с.
    5. Взять 100 мкл раствора BPEG и добавить 900 мкл 80% этанола (рН 2,0). Этот раствор составляет 1 мг/мл bPEG. Затем внесите раствор обоих ПЭГ следующим образом, тщательно перемешав.
      1. 200 мкл 10 мг/мл mPEG (конечная концентрация: 2 мг/мл).
      2. 10 мкл 1 мг/мл бПЕГ (конечная концентрация: 10 мкг/мл).
      3. 790 мкл 80% раствора этанола (рН 2,0).
    6. Доберите крышки из духовки. Осторожно распределите 100 мкл раствора ПЭГ по центру каждого облицовки, следя за тем, чтобы только верхняя поверхность была влажной. Затем поместите слипы обратно в духовку и высиживайте в течение 20-30 минут.
    7. Когда покровные листы начнут принимать дырявый вид, с небольшими кругами, видимыми по всей поверхности, снимите их из духовки.
    8. Вымойте каждую крышку 100% этанолом, высушите воздушной линией и поместите обратно в духовку. Инкубировать только в течение времени, необходимого для создания камер на этапе 2.
  2. Подготовка камеры
    1. Очистите слайд микроскопа для использования в камере. Вырежьте два куска двусторонней ленты, примерно 2 см длиной.
    2. Поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа. Убедитесь, что край ленты совпадает с краем слайда. Поместите второй кусок ленты примерно на 2 мм ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными и выровненными.
    3. Возьмите одну из функционализированных обложек из духовки (созданную в 3.1). Осторожно наклейте крышку на ленту так, чтобы сторона, покрытая ПЭГ, была лицевой стороной вниз и непосредственно контактировала с лентой, как показано на рисунке 1. Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно прилипла к слайду.
    4. Отрежьте лишнюю ленту, висящую над горкой, лезвием бритвы. Эти камеры могут быть использованы немедленно или помещены попарно в трубку 50 мл и храниться в морозильной камере при -80 °C для будущего использования. Важно хранить сразу, иначе поверхность разлагается.
  3. Выполнение микроскопии миозина 5a TIRF
    1. Готовят растворы для анализа миозина 5а с перевернутой моторизостью, описанного в таблице 3, и держат их на льду.
    2. Промывайте камеру с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT.
    3. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза и подождите 1 минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    4. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    5. Продуть в 10 мкл раствора НейтрАвидина в 50 мМ МБ с 1 мМ DTT и подождать 1 мин.
    6. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    7. Протоите в 10 мкл биотинилированного родамин-актина (bRh-Актина), содержащего 1 мМ DTT в 50 мМ МБ и выжидайте 1 мин. На этом этапе используйте большой наконечник пипетки и избегайте пипетки вверх и вниз, чтобы свести к минимуму сдвиг флуоресцентных актиновых нитей, чтобы обеспечить прикрепление длинных актиновых нитей к поверхности (20-30 мкм или дольше). Эффективной альтернативой является резка конуса стандартного наконечника пипетки (с отверстием ≈1-1,5 мм).
    8. Промывка с 10 мкл 50 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    9. Поток в 30 мкл конечного буфера с добавлением 10 нМ миозина 5а, затем немедленно загружается на микроскоп TIRF и записывается после нахождения оптимального фокуса для модальности визуализации TIRF. Время воздействия между 100-200 мс подходит при мощности лазера 1,4 мВт для актина и меченого GFP миозина. Подходящее время сбора для анализа скорости составляет 3 мин.
  4. Выполнение немышечного миозина 2b TIRF микроскопии
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем разделе приведены подробные сведения о немышечном анализе миозина 2b TIRF с использованием полимеризованных и фосфорилированных нитей. Включен подробный протокол (разделы 4.1-4.3) для фосфорилирования и полимеризации немуускового миозина-2b в пробирке.
    1. Чтобы фосфорилировать очищенный NM2b, внесите 10-кратную киназную смесь со следующими условиями: 2 мМCaCl2,1 мкМ CaM, 1-10 нМ MLCK и 0,1 мМ АТФ. Это может быть доведено до объема с 500 мМ МБ с 10 мМ DTT. Добавьте 10-кратную киназную смесь к миозину в объемном соотношении 1:10 и дайте ему инкубировать в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Как правило, концентрация миозина для этой ступени составляет 1 мкМ.
    2. Для полимеризации фосфорилированного миозина в нити снижают концентрацию соли NM2b до 150 мМ NaCl. Для этого сделайте 1-кратный буфер подвижности (1 МБ) без соли, разбавлив 4 МБ четыре раза в dH2O. Этот 1x MB может быть использован для снижения концентрации соли, потому что NM2b был заморожен в соляном буфере 500 мМ.
    3. На каждые 3 мкл запаса NM2b добавляют 7 мкл 1x MB для снижения концентрации соли до 150 мМ NaCl и инкубируют на льду в течение 20-30 мин с образованием нитей NM2b.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок, приведенный в разделах 4.1-4.3, не имеет решающего значения, если NM2b фосфорилирован и конечная концентрация соли составляет 150 мМ. Инкубация порядка 30 мин-1 ч дает достаточно времени для полного фосфорилирования и полимеризации.
    4. Готовят растворы для немуускового анализа миозина 2b с перевернутой моторизостью, описанного в таблице 3, и держат их на льду.
    5. Промывайте камеру с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT.
    6. Расход в 10 мкл из 1 мг/мл BSA в 150 мМ МБ с 1 мМ DTT Повторите эту промывку еще два раза и подождите 1 мин после третьей промывки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал.
    7. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    8. Продуть в 10 мкл раствора НейтрАвидина в 150 мМ МБ с 1 мМ DTT и подождать 1 мин.
    9. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    10. Протоите в 10 мкл bRh-актина и подождите 1 мин. На этом этапе используйте наконечник пипетки с большим растонием и избегайте пипетки вверх и вниз, чтобы свести к минимуму сдвиг флуоресцентных актиновых нитей, чтобы обеспечить прикрепление длинных актиновых нитей к поверхности (20-30 мкм или дольше). Эффективной альтернативой является вырезание конуса стандартного наконечника пипетки.
    11. Промывка с 10 мкл 150 мМ МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    12. Протоите в 10 мкл немышечные растворы миозина 2b (приблизительно 30 нМ) и подождите 1 мин.
    13. Промывка с 10 мкл 150 МБ с 1 мМ DTT. Повторите эту стирку еще два раза.
    14. Протейте в 30 мкл конечного буфера, затем немедленно загрузите его на микроскоп TIRF и запишите после нахождения оптимального фокуса для метода визуализации TIRF. Время воздействия между 100-200 мс подходит при мощности лазера 1,4 мВт для актина и меченого GFP миозина. Подходящее время сбора для анализа скорости составляет 3 мин.

4. Анализ изображений

  1. Анализ изображений для анализа скользящей актиновой нити
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения и руководств, связанных с Перечнем материалов. Важно отметить, что описанная здесь программа требует TIFF-стеков для анализа. Процесс анализа скользящей актиновой нити накаливания выглядит следующим образом50.
    1. Загрузите необработанные стеки фильмов в указанную структуру папок и введите в программу самый верхний каталог папок фильмов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа анализирует файлы в этом каталоге и подкаталогах, рассматривая каталоги самого низкого уровня как реплики. Будут подготовлены средние статистические данные по каждой группе реплик. В этом случае для каждого миозина использовался один фильм. При характеристике нового миозина или исследовании нового экспериментального состояния рекомендуется анализировать фильмы из трех полей зрения (FOV) на камеру в общей сложности три камеры и повторять этот рабочий процесс для трех препаратов исследуемого миозина.
    2. Используйте скрипт "stack2tifs" в сочетании с введенной пользователем частотой кадров для преобразования каждого стека TIFF в папку, содержащую серию отдельных файлов TIFF и соответствующий файл метаданных.txt содержащий время начала каждого кадра. Для данных, не в формате стека TIFF, преобразование должно быть сначала применено с использованием программного обеспечения, такого как перечисленные в Таблице материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт является частью программного пакета. Информацию о скрипте можно найти здесь: «https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs»
    3. Используйте параметр -px, который представляет собой размер пикселя (в нм) во время получения. В этом случае размер пикселя составляет 130 нм. Параметры -xmax и -ymax используются для масштабирования осей выходов точечной диаграммы. Они соответствуют самой длинной построенной длине нити накаливания и максимальной построенной скорости (в нм/с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это оценочные значения, которые могут быть установлены на более высокие, чем ожидалось, значения, чтобы обеспечить содержание данных на графике. После анализа необработанные данные также могут быть экспортированы для использования в другом статистическом или графическом программном обеспечении для просмотра и анализа.
    4. Используйте параметр -minv, который является параметром минимальной скорости отсечения, для определения нитей, которые не движутся, и поэтому могут быть исключены из анализа. Для медленного миозина, такого как NM2b, этот параметр должен быть низким (в данном примере 5 нм/с), чтобы избежать вырезания истинных скользящих движений. Для быстрого миозина, такого как M5a, этот параметр может быть выше (в данном примере 100 нм/с), чтобы применить более строгий фильтр, сохраняя при этом истинное распределение скорости скольжения.
    5. Используйте параметр отсечения -pt для определения плавного движения. Для каждого окна выборки вычисляется значение, эквивалентное 100 x стандартному отклонению скорости/средней скорости. Треки с более высокими значениями, чем отсечки, имеют больше переменных скоростей и исключаются из дальнейшего анализа. В этом примере использовалось значение отсечения, равное 33. Треки с более высокими значениями имеют больше переменных скоростей и исключены из дальнейшего анализа.
    6. Используйте -maxd для установки максимально допустимого расстояния связи между кадрами. Это рассчитанное расстояние между кадрами, перемещаемое центроидом нити накала в единицах нм. Это может быть полезно для исключения спорадических движений или неправильной связи между нитями. В приведенных здесь примерах параметр был оставлен со значением по умолчанию 2 000 нм.
  2. Анализ изображений для микроскопического анализа TIRF
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа анализа одной молекулы TIRF на программном обеспечении для визуализации, специально указанном в Таблица материалов выглядит следующим образом:29.
    1. Щелкните и перетащите записанное видео микроскопии в рабочее пространство программного обеспечения, чтобы открыть его51. Затем разделите каналы сбора. Нажмите на Изображение > Цвет > Разделенные каналы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае заметного дрейфа стадии во время съемки изображения должны быть стабилизированы для коррекции инструментального дрейфа на плоскости изображения. При этом компенсация дрейфа оси Z не использовалась, так как микроскоп, используемый для получения этих данных, хорошо стабилизирует Z-фокус. Чтобы стабилизировать изображение в программе анализа изображений, установите соответствующий плагин стабилизатора, который связан со списком материалов. Стабилизатор изображения принимает фиксированные положения для объектов на изображении и использует скользящее среднее предыдущих кадров в качестве эталона. Поэтому рекомендуется начинать с канала, содержащего изображения меченого актина, поскольку он находится в фиксированном положении.
    2. Нажмите на Плагины,затем найдите Стабилизатор изображения; Убедитесь, что выбран параметр «Трансляция» и сохраняют параметры по умолчанию. Установите флажок Коэффициенты преобразования журналов. Применение этого шага Log позволяет применить вычисляемые параметры сдвига к другому каналу на следующем шаге. Обеспечьте завершение процесса.
    3. Затем откройте канал с меткой миозина и примените стабилизацию, нажав на Плагины > Image Stabilizer Log Applyr. Если изображения актина не могут быть получены во время одного и того же сбора из-за требования к более высокой скорости визуализации в одном канале, дрейф стабилизирует стек изображений, выбрав область, содержащую статические объекты, такие как биотинилированный фидуциальный маркер или флуорофоры, не связанные конкретно с поверхностью биотин-ПЭГ. Эта область может быть обрезана из исходного стека и стабилизирована с последующим применением результирующих значений сдвига к исходному стеку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На практике дрейф, наблюдаемый в экспериментах по мотористи, будет незначительным по сравнению с движением миозинов, которые движутся со скоростью несколько сотен нм / с, но для самых медленных миозинов это становится важным соображением.
    4. Затем откройте TrackMate, нажмите на Плагины; затем, в его выпадающем меню нажмите на Отслеживание и, наконец, на TrackMate. На этом этапе анализ изображения подлежит оптимизации на основе параметров флуорофора и условий анализа. Однако идеальные стартовые параметры заключаются в следующем.
      1. Настройки калибровки: сохраните все значения по умолчанию.
      2. Детектор: Детектор LoG.
      3. Расчетный диаметр капли: 0,5-1,0 мкм.
      4. Порог: 25-200. (Это можно определить, щелкнув «Предварительный просмотр» после выбора номера, чтобы увидеть, соответствуют ли обнаруженные пятна фильму, и соответствующим образом настроить его.)
      5. Начальное пороговое значение: не установлено.
      6. Вид: Дисплей HyperStack.
      7. Установка фильтров на пятнах: не установлена.
      8. Трекер: Простой ТРЕКЕР LAP.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Они зависят от частоты кадров и скорости миозина и должны быть достаточно большими, чтобы соединить последующие положения, исключая нежелательные соединения между различными частицами.
      9. Максимальное расстояние связи: 1,0 микрон.
      10. Максимальное расстояние закрытия зазора: 1,0 мкм.
      11. Максимальный зазор при закрытии кадра: 1.
      12. Установка фильтров на треках: Смещение трека (>0,39 - для включения только пятен, движущихся более чем на 3 пикселя), Пятна в треках (>3 - для включения только треков с не менее чем 3 пятнами). Другие фильтры, такие как Minimal Velocity, могут быть введены для исключения пятен, которые останавливаются в течение длительных периодов времени. Результаты фильтрации должны быть проверены визуальным осмотром следов, чтобы гарантировать, что ложные следы (т. Е. Движение миозина в фоновом режиме, которое не находится вдоль актинового трека) удаляются при сохранении дорожек, связанных с актином.
    5. Как только появится экран Параметры отображения, нажмите «Анализ» для соответствующих выходных данных. Сохраните три созданные таблицы (Статистика треков, Ссылки в статистике треков и Места в статистике треков). Таблица Track Statistics будет содержать данные о скорости и смещении, которые затем могут быть впоследствии проанализированы для характеристики нового белка или эффектов определенного экспериментального условия, например.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Очистку миозина можно оценить, выполнив восстанавливающий додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE) гель-электрофорез, как показано на рисунке 2. Хотя этот рисунок представляет собой окончательный, постдиализированный миозин, SDS-PAGE может быть выполнен на аликвотах из различных этапов процедуры очистки для идентификации любых продуктов, потерянных для супернатанта. Миозин 5а HMM имеет полосу в диапазоне 120-130 кДа, а полноразмерный немуклиновый миозин 2b имеет полосу в диапазоне 200-230 кДа, соответствующую тяжелым цепям29,44. Миозин 5а также имеет полосу около отметки 17 кДа, отмечая кальмодулин. Немуускул миозин 2b имеет полосу примерно в 17 кДа, обозначающую ELC. Поскольку В этом препарате NM2b присутствует RLC, помеченный GFP, RLC отображается примерно на 47 кДа; однако немаркированный RLC будет присутствовать примерно на 20 кДа, если он не помечен GFP.

Анализ скользящей актиновой нити, показанный на видео 1 и рисунке 3, представляет характеристики идеального и отслеживаемого фильма. Этот скользящий анализ актиновой нити обеспечивает плавное движение меченых актиновых нитей. Промывка черного актина гарантирует, что мертвые головки миозина удаляются из поля измерения, что дополнительно способствует общему плавному движению актиновых нитей. Флуоресцентно меченые нити достаточно короткие, чтобы одна нить не пересекалась сама по себе, что более оптимально для программы слежения. Слишком длинные актиновые нити будут пересекаться с другими нитями, что может представлять трудности для программы отслеживания скользящей актиновой нити. Этой проблемы можно избежать, пипетки вверх и вниз 10-20 раз, чтобы срежуть актиновые нити перед загрузкой на крышку.

В случае NM2b использование метилцеллюлозы может значительно улучшить качество записанных фильмов, поскольку оно уменьшает диффузию актина от поверхности изображения. Это не является необходимым для M5a, потому что его более высокое коэффициент прочности позволяет более сильно прикрепить актин к поверхности, покрытой миозином. Если используется метилцеллюлоза, необходимо провести раствор через камеру, чтобы обеспечить прохождение раствора. Как показано на видео 2,когда все другие условия идентичны, за исключением исключения метилцеллюлозы, актиновые нити не остаются так тесно связанными с поверхностью, покрытой миозином.

И наоборот, целью анализа инвертированной подвижности, показанного в Видео 3 и на рисунке 4, является введение флуоресцентных актиновых нитей с поверхностным привязным механизмом, на которых можно наблюдать движение миозина. Важным требованием инвертированного анализа является обеспечение того, чтобы движение миозина постоянно наблюдалось через FOV, как показано на рисунке. Использование смеси DTT, глюкозы, каталазы и глюкозооксидазы может свести к минимуму фотоотбеливание, чтобы обеспечить более длительные измерения52. Кроме того, если скорость сбора для анализа низкая, отключение света освещения между приобретающими кадрами может помочь при чрезмерном фотоотбеливание. Опалубка света возбуждения может быть выполнена с помощью механического затвора или акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF).

Figure 1
Рисунок 1:Подготовка функционализированных камер проточных ячеек. (A) Начните с очищенного слайда микроскопа, двух кусков двусторонней ленты, разрезанных примерно до 2 см, и функционализированного покрова. (B) Добавьте ленту к центру слайда микроскопа. (C)Прикрепите крышку к ленте с покрытием (т.е. нитроцеллюлозой), обращенным вниз, и осторожно надавите лентой на перекрывающиеся области с помощью пластикового наконечника пипетки, чтобы убедиться, что крышка прилипла к камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Электрофорез полиакриламидного геля SDS экспрессированного NM2b и M5a-HMM. (A)Репрезентативное изображение геля SDS PAGE для полноразмерной тяжелой цепи NM2b (≈230 кДа) и GFP-RLC (≈47 кДа) и ELC (≈17 кДа). Изображение геля воспроизведено и изменено из Melli et al. (2018)29. (B) Репрезентативное изображение геля SDS PAGE для тяжелой цепи M5a-HMM (≈120 кДа) и кальмодулина (≈17 кДа). Обратите внимание, что гель на этом изображении не имеет GFP, вставленного на конец C-терминала. GFP, вставленный в тяжелую цепь миозина, увеличивает молекулярную массу на ≈27 кДа. Изображение геля, воспроизведенное и измененное, было первоначально опубликовано в Journal of Biological Chemistry44. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Результаты анализа скользящей актиновой нити, полученные с помощью подсветки TIRF. (A)Пример кадра из фильма, показывающего транслокацию родамино-фаллоидиновых меченых актиновых нитей (красным цветом) на 0,2 мкМ NM2b в присутствии 0,7% метилцеллюлозы при 30 °C. Шкала бара = 10 мкм. (B) Вывод изображения отслеживания нити накаливания из программы FASTrack для NM2b для того же FOV, как показано в (A) Шкала бара = 10 мкм. (C) Репрезентативная гистограмма скорости скольжения acto-NM2b, показывающая, что этот образец NM2b может генерировать скорость скольжения актина 77 ± 15 нм / с (среднее ± стандартное отклонение; количество дорожек = 550). (D) Пример кадра из фильма, показывающего транслокацию родамин-фаллоидиновых меченых актиновых нитей (красным цветом) на 75 нМ M5a-HMM. Шкала бара = 10 мкм.(E)Вывод изображения отслеживания нити накала программой FASTrack для M5a-HMM для того же FOV, как показано в (D) Шкала бар = 10 мкм. (F) Репрезентативная гистограмма скорости скольжения акто-M5a-HMM, показывающая, что этот образец M5a может генерировать скорость скольжения актина 515 ± 165 нм / с (среднее ± стандартное отклонение; количество дорожек = 25098). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Результаты инвертированного анализа, полученные с помощью подсветки TIRF. (A) Репрезентативный FOV из двухканального объединенного стека изображений, показывающий движение нитей NM2b (отображаемых зеленым цветом) на биотинилированных актиновых нитях, помеченных AF647-фаллоидином (показан синим цветом) при 30 °C. Полимеризованные нити рекомбинантно экспрессированных и очищенных NM2b, совместно экспрессируемых с ELC и GFP-RLC, наблюдаются как зеленые, удлиненные частицы в FOV. Шкала бар = 10 мкм. (B) Репрезентативная гистограмма скорости нитей NM2b. Анализ проводился с использованием программного обеспечения для анализа изображений, описанного в Таблице материалов. Одиночные нити НМ2b имеют скорость 84 ± 22 нм/с (среднее ± стандартное отклонение; количество отслеживаемых частиц = 133), при движении по одиночным актиновых нитям. (C)Пример кимографа движения нити накаливания NM2b вдоль одной актинной нити накала. Обратите внимание, что некоторые области частицы показывают «вращение» нити NM2b вдоль актиновой нити, что, скорее всего, представляет собой время, когда одна сторона биполярной нити NM2b отслается от актиновой нити, как показано ранее в Melli et al.29. (D)Репрезентативный FOV движения одной молекулы M5a-HMM (отображается зеленым цветом) на биотинилированных актиновых нитях, меченных родамином-фаллоидином (отображается красным цветом). Шкала бара = 10 мкм. (E) Репрезентативная гистограмма длины пробега M5a-HMM, уместилась к одной экспоненциальной. Анализ проводился с использованием программного обеспечения для анализа изображений, описанного в Перечне материалов. Характерная длина пробега составляет 1,3 мкм с 95% доверительным интервалом 1,23-1,42 мкм в этом примере. (F) Репрезентативная гистограмма скорости одной молекулы M5a-HMM на одиночных актиновых нитях. Анализируемые данные анализа изображений показывают среднюю скорость 668 ± 258 нм/с (среднее ± стандартное отклонение; количество отслеживаемых частиц = 684). (G) Пример кимографа движения одиночных молекул M5a-HMM вдоль одной актинной нити. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Сравнение анализа скользящей нити NM2b и M5a-HMM. Анализ скользящей актиновой нити NM2b проводили в присутствии метилцеллюлозы (слева; видеопанель А) и M5a-HMM в отсутствие метилцеллюлозы (справа; видеопанель В) при 30 °C. Обратите внимание, что метка времени на видеопанели NM2b продвигается быстрее по сравнению с видеопанели M5a-HMM, чтобы показать движение актиновых нитей с маркировкой родамина (красного цвета), которое примерно одинаково. Это связано с тем, что фактическая скорость транслокации актина NM2b близка к 7 раз медленнее, чем у M5a-HMM (77 нм/с, по сравнению с 515 нм/с, соответственно, извлеченными из пика Гаусса, подгоняемого к гистограмме на рисунке 3). Шкала = 10 мкм в обеих видеопанелюх. Данные NM2b получены со скоростью 0,33 кадра в секунду при экспозиции 200 мс. Данные M5a-HMM, полученные со скоростью 5 кадров в секунду с экспозицией 200 мс (непрерывные), а затем пониженные до 1 кадра в секунду. Временные метки были добавлены с помощью плагина, описанного в Списке материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Скользящий актиновый анализ NM2b в отсутствие метилцеллюлозы. Когда все остальные условия одинаковы, за исключением отсутствия метилцеллюлозы, актиновые нити иногда не прилипают хорошо к крышке, покрытой 0,2 мкМ NM2b, что приводит к более низкому качеству фильмов с актиновым нитями, «плюхающимися» близко к поверхности покрытого NM2b крышки. Шкала шкалы = 10 мкм. Это может быть решено путем введения метилцеллюлозы, чтобы показать плавное движение актиновых нитей, как показано на левой видеопанели Video 1 (NM2b скользящий анализ актиновой нити). Другой альтернативой является увеличение концентрации NM2b до ≈1 мкМ. Этот фильм был получен со скоростью 0,33 кадра в секунду с экспозицией 200 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Сравнение анализа инвертированной подвижности NM2b и M5a-HMM. Анализ nm2b с перевернутой подвижностью проводили в присутствии метилцеллюлозы и записывали со скоростью 0,33 кадра в секунду с использованием затвора (слева; видеопанель А), видеопанель С показывает тот же FOV, что и А, но с частицами, идентифицированными и отслеживаемыми с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Аналогично, инвертированный анализ подвижности для M5a-HMM в отсутствие метилцеллюлозы регистрировался со скоростью 5 кадров в секунду (справа; видеопанель B). Видеопанелека D показывает тот же FOV, что и B, но с частицами, идентифицированными и отслеживаемыми с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Шкала = 10 мкм во всех видеопанелюх. Два лазера были переключались вперед и назад с использованием одной камеры для приобретения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Имя буфера Состав Используемый шаг(и) Комментарии
Буфер извлечения M5a 0,3 м НаКл 1.1 Держитесь на льду.
15 мМ МОПС, рН 7,2
15 мМ MgCl2
1,5 мМ EGTA
4,5 мМ NaN3
Буфер извлечения NM2b 0,5 м NaCl 1.1 Держитесь на льду.
15 мМ МОПС, рН 7,2
15 мМ MgCl2
1,5 мМ EGTA
4,5 мМ NaN3
Буфер A 0,5 м NaCl 2.2 Держитесь на льду.
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
3 мМ НаН3
1 мМ АТФ
1 мМ DTT
5 мМ MgCl2
Буфер B 0,5 м NaCl 2.3 Держитесь на льду.
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
3 мМ НаН3
1 мМ DTT
Буфер элюции 0,5 м NaCl 3.1 Держитесь на льду.
0,5 мг/мл пептида FLAG
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
3 мМ НаН3
рН 7,2
Буфер диализа M5a 500 мМ KCl 4.1 Используйте холодный dH2O для увеличения громкости.
10 мМ MgCl2
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
1 мМ DTT
БУФЕР ДИАЛИЗА NM2b 25 мМ NaCl 4.1 Используйте холодный dH2O для увеличения громкости.
10 мМ MgCl2
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
1 мМ DTT
Буфер хранения NM2b 0,5 м NaCl 5.1 Держитесь на льду.
10 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA
3 мМ НаН3

Таблица 1: Буферы, используемые при очистке белка.

Имя буфера Состав (M5a) Состав (НМ2б) Используемый шаг (ступени) (M5a/NM2b) Комментарии
4X буфер подвижности (4X МБ) 80 мМ МОПС, рН 7,2 80 мМ МОПС, рН 7,2 Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
20 мМ МгCl2 20 мМ МгCl2
0,4 мМ ЭГТА 0,4 мМ ЭГТА
рН 7,4 рН 7,4
50 мМ Буфер подвижности соли (50 мМ МБ) 25% v/v 4X МБ 25% v/v 4X МБ Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
50 мМ KCl 50 мМ NaCl
Увеличение громкости с помощью dH2O Увеличение громкости с помощью dH2O
Буфер подвижности соли 500 мМ (500 мМ МБ) Н/Д 25% v/v 4X МБ Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
500 мМ NaCl
Увеличение громкости с помощью dH2O
Миозин 0,05-0,1 мкМ миозина 0,2 мкМ миозина 4.2/5.2 Держитесь на льду.
1 мМ DTT 1 мМ DTT
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 500 мМБАЙТ
1 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) 1 мг/мл BSA 1 мг/мл BSA 4.3/5.3 Держитесь на льду.
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 500 мМБАЙТ
1 мМ DTT 1 мМ DTT
5 мкМ немаркированный F-актин в 50 мМ МБ (черный актин) 5 мкМ немаркированного F-актина 5 мкМ немаркированного F-актина 4.5/5.5 Держитесь на льду. Сдвиг актина путем пипетки вверх и вниз 5-10 раз или с помощью шприца.
1 мкМ кальмодулина (CaM) 1 мМ АТФ
1 мМ АТФ 0,2 мМ CaCl2
Разбавление в 50 мМБАЙТ 1 мкМ каМ
1–10 нМ миозин киназы легкой цепи (MLCK)
Разбавление в 50 мМБАЙТ
МБ с 1 мМ DTT и 1 мМ ATP 1 мМ DTT 1 мМ DTT 4.6/5.6 Держитесь на льду.
1 мМ АТФ 1 мМ АТФ
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 50 мМБАЙТ
МБ с DTT 1 мМ DTT 1 мМ DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 Держитесь на льду.
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 50 мМБАЙТ
20 нМ родамин-фаллоидин F-актин (Rh-актин) 20 нМ родамин-фаллоидин F-актин 20 нМ родамин-фаллоидин F-актин 4.8/5.8 Держитесь на льду. Не вихрь.
1 мМ DTT 1 мМ DTT
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 50 мМБАЙТ
Конечный буфер 50 мМ KCl 0,7% метилцеллюлозы (опционально) 4.10/5.10 Добавьте глюкозу, глюкозооксидазу и каталазу непосредственно перед проведением эксперимента. Держитесь на льду.
20 мМ МОПС, рН 7,2 50 мМ NaCl
5 мМ MgCl2 20 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA 5 мМ MgCl2
1 мМ АТФ 0,1 мМ EGTA
50 мМ DTT 1 мМ АТФ
1 мкМ кальмодулина 50 мМ DTT
2,5 мг/мл глюкозы 1–10 нМ МЛКК
100 мкг/мл глюкозооксидазы 0,2 мМ CaCl2
40 мкг/мл каталазы 1 мкМ кальмодулина
2,5 мг/мл глюкозы
100 мкг/мл глюкозооксидазы
40 мкг/мл каталазы

Таблица 2: Буферы, используемые в скользящем анализе.

Имя буфера Состав (M5a) Состав (НМ2б) Используемый шаг (ступени) (M5a/NM2b) Комментарии
4X буфер подвижности (4X МБ) 80 мМ МОПС, рН 7,2 80 мМ МОПС, рН 7,2 Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
20 мМ МгCl2 20 мМ МгCl2
0,4 мМ ЭГТА 0,4 мМ ЭГТА
рН 7,4 рН 7,4
50 мМ соли Подвижный буфер (50 мМ МБ) 25% v/v 4X МБ 25% v/v 4X МБ Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
50 мМ KCl 50 мМ NaCl
Увеличение громкости с помощью dH2O Увеличение громкости с помощью dH2O
150 мМ соли Подвижный буфер (150 мМ МБ) 25% v/v 4X МБ Вакуумный фильтр и хранение при 4°C
150 мМ NaCl
Увеличение громкости с помощью dH2O
Миозин 30 нМ миозина См. Рецепт "Окончательного буфера"/4.12 Держитесь на льду.
1 мМ DTT
Разбавление в 150 мМ МБ
2 мг/мл НейтрАвидина 2 мг/мл НейтрАвидина 2 мг/мл НейтрАвидина 3.5/4.8 Держитесь на льду.
1 мМ DTT 1 мМ DTT
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 150 мМ МБ
1 мг/мл бытового сывороточного альбумина (BSA) 1 мг/мл BSA 1 мг/мл BSA 3.3/4.6 Держитесь на льду.
1 мМ DTT 1 мМ DTT
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 150 мМ МБ
200 нМ родамин-фаллоидин биотинилированный F-актин (bRh-актин) 200 нМ родамин-фаллоидин биотинилированный F-актин 200 нМ родамин-фаллоидин биотинилированный F-актин 3.7/4.10 Избегайте стрижа, не вихря и не пипетки вверх и вниз. Чтобы перемешать, аккуратно инвертировать.
1 мМ DTT 1 мМ DTT
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 150 мМ МБ
МБ с DTT 50 мМ DTT 50 мМ DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 Держитесь на льду.
Разбавление в 50 мМБАЙТ Разбавление в 150 мМ МБ
Конечный буфер 50 мМ KCl 0,7% метилцеллюлозы (опционально) 3.9/4.14 Добавьте глюкозу, глюкозооксидазу и каталазу непосредственно перед проведением эксперимента. Держитесь на льду.
20 мМ МОПС, рН 7,2 50 мМ NaCl
5 мМ MgCl2 20 мМ МОПС, рН 7,2
0,1 мМ EGTA 5 мМ MgCl2
1 мМ АТФ 0,1 мМ EGTA
50 мМ DTT 1 мМ АТФ
1 мкМ кальмодулина 50 мМ DTT
2,5 мг/мл глюкозы 1–10 нМ МЛКК
100 мкг/мл глюкозооксидазы 0,2 мМ CaCl2
40 мкг/мл каталазы 1 мкМ кальмодулина
10 нМ миозина 2,5 мг/мл глюкозы
100 мкг/мл глюкозооксидазы
40 мкг/мл каталазы

Таблица 3: Буферы, используемые при анализе TIRF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь представлен рабочий процесс для очистки и характеристики in vitro миозина 5a и немузмускового миозина 2b. Этот набор экспериментов полезен для количественной оценки механохимических свойств очищенных миозиновых конструкций быстрым и воспроизводимым способом. Хотя два миозина, показанные здесь, являются лишь двумя конкретными примерами из многих возможностей, условия и методы могут быть применены, с некоторым приспособлением, к большинству миозинов и ко многим другим моторным белкам.

Протоколы, обсуждаемые здесь, подвержены изменениям в зависимости от индивидуальных потребностей лаборатории и экспериментов. Например, как обсуждалось в разделе «Экспрессия и молекулярная биология», белки, используемые в этой статье, были получены в результате коинфицированности двух или более вирусов; однако успешная экспрессия белка также может быть достигнута с помощью векторов мультиэкспрессии, таких как вектор двойной экспрессии p-FastBac или система экспрессии BiGBac53.

Несколько факторов могут препятствовать успешному производству рекомбинантного белка. Чтобы предотвратить деградацию белка, крайне важно, чтобы каждый этап очистки белка завершалась при соответствующей температуре, причем все этапы центрифугирования происходили при 4 ° C, а все другие этапы выполнялись на льду. Избыток полос может быть очевиден в гегеле диализованный белковый продукт. Это может свидетельствовать о деградации или загрязнении. Последующая очистка с помощью размерно-исключаемой или ионообмонной хроматографии может повысить чистоту образцов54. С этой целью рекомендуется сохранять аликвоты на каждом этапе процесса очистки белка для устранения неполадок, если есть низкий выход миозина или подозрение на загрязнение белка. Иногда может быть недостаточное связывание лизата со смолой на этапе 1.8, что может привести к потере миозина супернатанту при последующих центрифугациях. Это может быть решено путем изменения продолжительности связывания смолы на этом этапе, даже оставляя ее для связывания на ночь, если это необходимо. Более длительное время инкубации повышает риск деградации белка, если загрязняющие протеазы недостаточно ингибируются, и миозины с протеолитически чувствительными областями будут неблагоприятно затронуты. Кроме того, неправильная промывка смолы как до, так и после использования может привести к элюированию нежелательного белкового продукта, поэтому крайне важно, чтобы до и после использования смолы FLAG-affinity соблюдались соответствующие протоколы. Если смола промыта сразу после использования и хранится соответствующим образом, ее можно повторно использовать до 20 раз.

Важно отметить, что деградация белка также происходит на стадии экспрессии, и сокращение времени экспрессии может быть выгодным с точки зрения деградации, хотя это может быть за счет общего выхода. Следование процедурам, описанным здесь, для мониторинга образца белка на разных этапах протокола (т.е. до, во время и после очистки) поможет определить этапы, необходимые для оптимизации. Для миозинов, которые неоднократно сопротивляются успешной экспрессии и очищению, общими проблемами могут быть соэкспрессия с недостаточными или неподходящими легкими цепями, а также неправильное складывание во время сверхэкспрессии. Соответствующие легкие цепи должны быть выбраны на основе известных взаимодействий, когда это возможно, и отношения между тяжелой цепью и бакуловирусом легкой цепи должны быть проверены в небольших экспериментах для определения оптимального. Для миозинов, которые объединяют или дают мало или вообще не дают растворимого активного продукта, коэкспрессия с шаперонами может помочь в успешном получении активного белка54,55.

Очищенные продукты миозина неизбежно содержат небольшую популяцию поврежденного миозина, называемого «мертвыми головками», с которыми можно бороться двумя способами. Один из методов, описанных в этом протоколе, включает в себя протекание немаркированного или «черного» актина через камеру в анализе скользящей актиновой нити. Последующее промывание АТФ приводит к тому, что функциональные миозины диссоциируют от черного актина, в то время как мертвые головки остаются связанными с этим немаркированным актином из-за их неспособности гидролизовать АТФ и из-за их высокого сродства. При выполнении промывки черным актином шприц можно использовать для эффективного сдвига актина. Дополнительная стрижка может быть выполнена путем вихря, при условии, что любые результирующие пузырьки удаляются центрифугированием. Альтернативный метод заключается в селективном гранулировании мертвых головок из образца миозина путем смешивания миозина с F-актином и Mg-АТФ в концентрациях с высоким содержанием соли (0,5 М) и осаждения в настольной ультрацентрифуге. Миозины, способные гидролизовать АТФ в этих условиях, не остаются связанными с актином из-за их низкого сродства к актину в этих условиях с высоким содержанием соли и обнаруживаются в супернатанте, тогда как мертвые головки миозина остаются связанными с актином в грануле56. Аналогичным образом, осаждение актином и ресуспензия гранулы также могут быть использованы для удаления миозинов, которые не способны связываться с актином в отсутствие АТФ. Обратите внимание, что небольшая часть этого типа мертвых голов будет иметь меньшее влияние на эти типы анализов. Выполняя безнуклеотидное осаждение и повторное суспендирование с последующим центрифугированием и повторной суспензией, связанными с АТФ, можно выделить миозины, которые компетентны как для актин-связывающего, так и для АТФ-зависимого высвобождения из актина.

Анализы подвижности также могут быть изменены несколькими способами. Например, в анализе скользящей актиновой нити для NM2b NM2b фосфорилируется в камере путем добавления MLCK, кальмодулина, кальция и АТФ на ступени черного актина, а также в конечном буфере. Однако NM2b также может быть фосфорилирован в трубке перед выполнением анализа. Таким образом, процент фосфорилированного NM2b может быть количественно определен путем запуска нативного геля с буфером образца, содержащим мочевину, или выполнения масс-спектрометрии57,58. Влияние температуры на активность миозина также может быть исследовано. Это может быть достигнуто путем использования объективной системы нагрева на микроскопе или корпусе окружающей среды, так что проточная ячейка поддерживается при постоянной температуре. Ионная сила является еще одним важным соображением. Для многих миозинов сродство актина и ферментативная активность будут увеличиваться при более низкой ионной силе; для других необходима более высокая ионная сила59. В дополнение к предоставлению ценной информации о механизме миозина, снижение ионной силы может усилить подвижность и сделать миозин более доступным для исследования с помощью многих анализов. Напротив, некоторые двигатели будут демонстрировать эффекты электростатического модема, которые будут замедлять подвижность при более низких ионных силах. Наконец, при анализе движения нитей NM2b крайне важно поддерживать ионную силу в узком диапазоне (ионная сила 150-200 мМ), приближаясь к тем, которые встречаются в большинстве типов клеток. Использование более низких ионных сил приводит к агрегации миозиновых нитей, в то время как нити деполимеризуются при более высоких ионных силах.

Со многими миозинами, особенно с низкими коэффициентами нагрузки, условия конечного буфера, заданного для M5a, приведут к тому, что флуоресцентно меченые актиновые нити будут лишь слабо связаны с поверхностью или вообще диссоциируют. Это приводит к беспорядочные движения, которые усложняют количественную оценку. Лучшее качество движения часто может быть получено с использованием метилцеллюлозы (0,7%) в конечном буфере. Метилцеллюлоза является вязким скученным агентом и заставляет актиновые нити оставаться близко к поверхности, даже когда плотность прикрепленных миозиновых двигателей разрежена60. Аналогичным образом, было замечено, что включение метилцеллюлозы в конечный буфер анализа подвижности одной нити необходимо для наблюдения за движением с NM2a, и то же явление было зарегистрировано для гладкомышечные миозиновыенити 29,61. Это также увеличивает процессичность нитей NM2b. Одним из потенциально нежелательных побочных эффектов использования метилцеллюлозы в этом анализе является то, что свойства краудингового агента могут способствовать боковой ассоциации нитей миозина в пучки. Альтернативами метилцеллюлозе при устранении недостатка движения или слабо связанных актиновых нитей в анализе скользящей актиновой нити являются снижение концентрации соли в буферах подвижности или увеличение поверхностной плотности миозина. Как указывалось выше, было показано, что высокая ионная сила в буферах подвижности снижает способность некоторых миозинов связываться с актинами29,34,62.

Другой вариацией анализа скользящей актиновой нити является использование антител для закрепления миозина на стеклянном покровном листе. Например, если GFP присутствует на С-концевой конце конструкции миозина, анти-GFP антитело может быть использовано для фиксации GFP-миозина к покрову36,63,64. Это может помочь в получении успешной подвижности в ситуациях, когда геометрия системы может в противном случае препятствовать транслокации актина, например, в случае тестирования искусственных или короткихрычагов 54,64. Кроме того, влияние нагрузки на скорости транслокации может быть исследовано в анализе скользящей актиновой нити с использованием актин-связывающих белков, таких как α-актинин или утрофин39,50,65. Такое измерение может быть полезным для сравнения влияния нагрузки на ансамбль миозинов с зависящей от нагрузки кинетикой одного миозина, которая может быть измерена с использованием оптического улавливающего анализа66,67. Это может быть достигнуто путем добавления увеличения количества актин-связывающего белка вместе с миозином на начальном этапе. Актин-связывающий белок связывается с поверхностью и оказывает фрикционную нагрузку на актиновые нити, которые перемещаются миозинами, что приводит к градуированной скорости, поскольку концентрация актин-связывающего белка на поверхности увеличиваетсяна 39.

Анализ подвижности одной молекулы/ансамбля также может быть адаптирован для исследования влияния различных актиновых структур на движение миозина. Например, вместо того, чтобы наблюдать движение миозина поверх одиночных актиновых нитей, фасцин- или α-актинин-опосредованные пучки актина могут быть изучены как восстановление in vitro сети актиновых нитей, обнаруженных в клетках68,69. Влияние актин-связывающих белков, таких как тропомиозин, также может бытьизучено65,70,71,72.

Следует отметить универсальность в выборе метки для анализа подвижности одной молекулы / ансамбля. В настоящем докладе маркировка GFP использовалась как на M5a-HMM, так и на NM2b; однако можно использовать и многие другие метки. Примеры включают HaloTag или SNAP-tag, которые могут быть генетически слиты с миозином и ковалентно связывать синтетический краситель. Преимущество технологии HaloTag заключается в ее универсальности для нескольких экспериментальных адаптаций, таких как маркировка различными цветами или добавление метки сродства биотина29,73. Кроме того, использование технологии квантовых точек может быть использовано для улучшения разрешения флуоресцентного отслеживания одной молекулы, что также решает проблему ограничения низкой яркости GFP и тенденцию к фотоотбеливанию74. Метки могут быть успешно прикреплены к легким цепям, а также к тяжелойцепи 11,75,76.

Для достижения успеха в анализе подвижности одной молекулы TIRF ключевым фактором является использование хорошо заблокированной и функционализированной поверхности. Простым методом достижения умеренной блокировки является использование биотинилированного BSA, связанного с поверхностью нитроцеллюлозы. Хотя это будет работать достаточно хорошо, чтобы охарактеризовать многие двигатели, включая M5a, уровень неспецифического связывания на такой поверхности является непомерно высоким для воспроизведения чистого движения с образцами, такими как NM2b. Ключевым прорывом в этом отношении стал переход на ПЭГилированные поверхности, легированные биотин-ПЭГ для функционализации77. Поверхности ПЭГ обеспечивают гораздо более высокий уровень блокировки поверхности, а бездефектная ПЭГилированная поверхность может оставаться свободной от неспецифического связывания в течение очень длительных периодов времени. Конкретный протокол, подробно описанный здесь, позволяет производить биотинилированные поверхности ПЭГ в течение нескольких часов, и если их сразу же хранить, как описано, поверхности могут использоваться в течение нескольких недель с незначительным снижением качества.

Ключевым соображением перед сбором данных для отслеживания является частота кадров сбора. Перемещение между последующими кадрами должно быть достаточно большим, чтобы избежать ошибок при передискретизации. Высокая частота дискретизации даст завышенные скорости за счет деления ошибок локализации на небольшой временной интервал и увеличит кажущуюся погрешность измерения. В тех случаях, когда необработанные данные слишком тонко отобраны, данные могут быть понижены, взяв каждый N-й кадр для создания нового стека и учитывая изменение частоты кадров, которое в результате этого происходит. Необходимо избегать субпиксельных движений между кадрами, а для получения точных значений требуется движение в несколько сотен нанометров. Во всех случаях, когда характеризуется новый образец, результаты, полученные в результате автоматизированного анализа, должны сравниваться с небольшим набором данных из вручную отслеживаемых нитей для обеспечения согласованности.

При анализе данных экспериментов по подвижности одной молекулы необходимо соблюдать осторожность при выборе параметров для измерения, фильтрации данных и соответствия данных. Как указано выше, частота дискретизации может быть важным фактором при анализе данных о скорости. Для многих миозинов процессные прогоны будут короткими и хорошо приближенными по прямой линии. В таких случаях расстояние от начала до конечной точки трека может обеспечить хорошую меру длины пробега, и это может быть разделено на продолжительность трека, чтобы дать хорошую оценку скорости. В тех случаях, когда дорожки очень длинные и следуют изогнутым путям вокруг изогнутых нитей, этот тип анализа даст неточные результаты, и необходимо использовать общее пройденное расстояние, используя скорость сбора, которая позволяет последовательным точкам локализации быть достаточно хорошо расположенными, чтобы избежать ошибок перевыборки, как описано выше, при этом будучи достаточно близкими друг к другу, чтобы расстояние по прямой линии между ними оставалось хорошим приближением кривой между этими точками. Кроме того, для моторных белков с большой длиной пробега по отношению к длине трека при расчете длины пробега78необходимо сделать дополнительную статистику, такую как оценка Каплана-Мейера. То же самое верно для ситуаций, в которых фотоотбеливание достаточно вероятно произойдет до окончания процессного запуска. Другим явлением, которое можно наблюдать в исследованиях флуоресценции одной молекулы, является фотомигание, при котором флуорофоры быстро переключаются между включенным и выключенным состоянием и, по-видимому, мигают. Обычно это не происходит в этих экспериментах с подвижностью; однако, если это произойдет, интенсивность лазера и время воздействия могут быть уменьшены, что должно свести к минимуму эффект. Несколько химических веществ, включая β-меркаптоэтанол, тролокс, циклооктатераен, н-пропилгаллат, 4-нитробензиловый спирт и 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан, могут быть использованы для смягчения этого, а также79.

Таким образом, в этой статье представлены подробные протоколы, которые являются надежными в своей способности количественно оценивать механохимические свойства, такие как скорость транслокации актина, скорость транслокации миозина и длина пробега миозина. Эти анализы воспроизводимы и могут быть использованы для определения качества очищенного миозина даже в ситуациях, когда подвижные характеристики не являются конкретной конечной целью исследования. Кроме того, такие изменения, как рН, температура и химические регуляторы, могут быть введены в эти анализы, чтобы изучить, как влияет механохимия исследуемого миозина. Взятые вместе, скольжение актина и анализы перевернутой подвижности могут позволить лучше понять поведение ансамбля миозина и межмолекулярные вариации в молекулярной моторной механике и кинетике. Анализы на основе флуоресцентной микроскопии, описанные здесь, поддерживают редукционистский подход к исследованиям цитоскелета и могут быть мощным инструментом для понимания белково-белковой динамики in vitro. Вместе данные, собранные в результате этих высоко контролируемых экспериментов, могут быть использованы для консультирования механобиологов о ключевом поведении актомиозина, которое может быть актуально на биологическом уровне клеток и за его пределами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим д-ра Фан Чжана за техническую помощь в подготовке реагентов, используемых для сбора этих данных. Эта работа была поддержана фондами NHLBI/NIH Intramural Research Program HL001786 для J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

Биохимия выпуск 168 миозин актиновые нити очистка белка флуоресцентная микроскопия анализ подвижности анализ одной молекулы биполярные нити флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения
Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter