Myosin-spezifische Anpassungen von In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierten Motilitätsassays

Summary

Hier wird ein Verfahren zur Exprimisierung und Reinigung von Myosin 5a vorgestellt, gefolgt von einer Diskussion seiner Charakterisierung, wobei sowohl Ensemble- als auch Einzelmolekül-In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie-basierte Assays verwendet werden, und wie diese Methoden für die Charakterisierung von nichtmuskleärem Myosin 2b modifiziert werden können.

Abstract

Myosinproteine binden und interagieren mit filamentösem Aktin (F-Aktin) und kommen in Organismen im gesamten phylogenetischen Baum vor. Ihre Struktur und enzymatischen Eigenschaften sind an die jeweilige Funktion angepasst, die sie in Zellen ausführen. Myosin 5a geht prozessiv auf F-Aktin, um Melanosomen und Vesikel in Zellen zu transportieren. Umgekehrt fungiert das nichtmusklele Myosin 2b als bipolares Filament mit etwa 30 Molekülen. Es bewegt F-Aktin der entgegengesetzten Polarität in Richtung des Zentrums des Filaments, wo die Myosinmoleküle asynchron arbeiten, um Aktin zu binden, einen Kraftschlag zu verleihen und zu dissoziieren, bevor sie den Zyklus wiederholen. Nichtmuskleles Myosin 2b hat zusammen mit seinen anderen nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen Rollen, die Zelladhäsion, Zytokinese und Spannungserhaltung umfassen. Die Mechanochemie von Myosinen kann durch die Durchführung von In-vitro-Motilitätstests mit gereinigten Proteinen untersucht werden. Beim Gleitaktinfilament-Assay werden die Myosine an eine mikroskopisch kleine Decklip-Oberfläche gebunden und translozieren fluoreszierend markiertes F-Aktin, das verfolgt werden kann. Im Einzelmolekül/Ensemble-Motilitätstest wird F-Aktin jedoch an einen Coverslip gebunden und die Bewegung fluoreszierend markierter Myosinmoleküle auf dem F-Actin beobachtet. In diesem Bericht wird die Aufreinigung von rekombinantem Myosin 5a aus Sf9-Zellen mittels Affinitätschromatographie skizziert. Im Anschluss skizzieren wir zwei fluoreszenzmikroskopiebasierte Assays: den Gleit-Aktin-Filament-Assay und den Inverted Motility Assay. Aus diesen Assays können Parameter wie Aktintranslokationsgeschwindigkeiten und Einzelmoleküllauflängen und -geschwindigkeiten mit der Bildanalysesoftware extrahiert werden. Diese Techniken können auch angewendet werden, um die Bewegung einzelner Filamente der nichtmuskleären Myosin-2-Isoformen zu untersuchen, die hier im Zusammenhang mit nichtmuskleärem Myosin 2b diskutiert werden. Dieser Workflow stellt ein Protokoll und eine Reihe quantitativer Werkzeuge dar, mit denen die Einzelmolekül- und Ensembledynamik von nichtmuskleären Myosinen untersucht werden kann.

Introduction

Myosine sind Motorproteine, die Kraft auf Aktinfilamente ausüben, indem sie die Energie aus der Adenosintriphosphat (ATP)-Hydrolyse^{nutzen 1}. Myosine enthalten eine Kopf-, Hals- und Schwanzdomäne. Die Kopfdomäne enthält die Aktinbindungsregion sowie den Ort der ATP-Bindung und Hydrolyse. Die Halsdomänen setzen sich aus IQ-Motiven zusammen, die an Leichte Ketten, Calmodulin oder Calmodulin-ähnliche Proteine^{binden 2,3}. Die Schwanzregion hat mehrere Funktionen, die für jede Klasse von Myosinen spezifisch sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Dimerisierung von zwei schweren Ketten, die Bindung von Frachtmolekülen und die Regulierung des Myosins durch autoinhibitorische Wechselwirkungen mit den Kopfdomänen¹.

Die beweglichen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen. Einige dieser Eigenschaften umfassen das Tastverhältnis (der Anteil des mechanischen Zyklus von Myosin, in dem das Myosin an Aktin gebunden ist) und die Prozessivität (die Fähigkeit eines Motors, vor dem Ablösen mehrere Schritte auf seiner Spur zu machen)⁴. Die über 40 Klassen von Myosinen wurden anhand von Sequenzanalysen^5,6,7,8bestimmt. Die Myosine der Klasse 2 werden als "konventionell" eingestuft, da sie die ersten waren, die untersucht wurden; alle anderen Klassen von Myosinen werden daher als "unkonventionell" eingestuft.

Myosin 5a (M5a) ist ein Myosin der Klasse 5 und ist ein prozessiver Motor, was bedeutet, dass es mehrere Schritte entlang des Aktins machen kann, bevor es sich dissoziiert. Es hat ein hohes Tastverhältnis, was darauf hindeutet, dass es einen großen Teil seines mechanischen Zyklus an Aktin^9,10,11,^12,13,14gebunden ist . Wie andere Myosine enthält die schwere Kette eine N-terminale Motordomäne, die sowohl eine Aktinbindungs- als auch eine ATP-Hydrolysestelle umfasst, gefolgt von einer Halsregion, die als Hebelarm dient, mit sechs IQ-Motiven, die an essentielle Leichtketten (ELC) und Calmodulin (CaM)^{binden 15}. Der Schwanzbereich enthält α-spiralförmige Coils, die das Molekül dimerisieren, gefolgt von einem kugelförmigen Schwanzbereich zur Bindung von Fracht. Seine Kinetik spiegelt seine Beteiligung am Transport von Melanosomen in Melanozyten und des endoplasmatischen Retikulums in Purkinje-Neuronen^16,17wider. M5a gilt als prototypischer Gütertransportmotor^18.

Klasse-2-Myosine oder die herkömmlichen Myosine umfassen die Myosine, die die Kontraktion der Skelett-, Herz- und glatten Muskulatur zusätzlich zu den nichtmuskleären Myosin-2 (NM2)-Isoformen NM2a, 2b und 2c¹⁹antreiben. Die NM2-Isoformen befinden sich im Zytoplasma aller Zellen und haben eine gemeinsame Rolle bei der Zytokinese, Adhäsion, Gewebemorphogenese und Zellmigration^19,20,21,22. Dieser Artikel diskutiert konventionelle Myosinprotokolle im Kontext von nichtmuskleellem Myosin 2b (NM2b)²³. NM2b hat im Vergleich zu M5a ein niedriges Tastverhältnis und ist enzymatisch langsamer mit einem V_max von 0,2 s^-123 im Vergleich zu M5as V_max von ≈18 s^-124. Bemerkenswerterweise bewegen sich abgeschnittene NM2b-Konstrukte mit zwei Köpfen nicht ohne weiteres prozessiv auf Aktin; Vielmehr führt jede Begegnung mit Aktin zu einem Kraftschlag, gefolgt von einer Dissoziation des^{Moleküls 25.}

NM2b enthält zwei myosinschwere Ketten mit jeweils einer kugelförmigen Kopfdomäne, einem Hebelarm (mit einer ELC und einer regulatorischen Leichtkette (RLC)) und einer α-helikalen Coiled-Coil-Rod/Tail-Domäne, etwa 1.100 Aminosäuren lang, die diese beiden schweren Ketten dimerisiert. Die enzymatische Aktivität und der Strukturzustand von NM2b werden durch Phosphorylierung des RLC²³reguliert. Unphosphoryliertes NM2b nimmt in Gegenwart von ATP und physiologischen Ionenstärken (ca. 150 mM Salz) eine kompakte Konformation an, bei der die beiden Köpfe an einer asymmetrischen Wechselwirkung teilnehmen und der Schwanz an zwei Stellen²³über die Köpfe zurückklappt. In diesem Zustand interagiert das Myosin nicht stark mit Aktin und hat eine sehr geringe enzymatische Aktivität. Bei RLC-Phosphorylierung durch Calmodulin-abhängige Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK) oder Rho-assoziierte Proteinkinase dehnt sich das Molekül aus und assoziiert sich mit anderen Myosinen durch den Schwanzbereich, um bipolare Filamente von etwa 30 Myosinmolekülen zu bilden²³. Die vorgenannte Phosphorylierung des RLC führt auch zu einer erhöhten Aktin-aktivierten ATPase-Aktivität von NM2b um etwa das Vierfache^26,27,28. Diese bipolare Filamentanordnung mit vielen Myosinmotoren an jedem Ende ist für Rollen bei der Kontraktions- und Spannungserhaltung optimiert, bei denen Aktinfilamente mit entgegengesetzten Polaritäten relativ zueinander bewegt werden können^23,29. Dementsprechend hat sich gezeigt, dass NM2b als Einzensemble von Motoren fungiert, wenn es mit Aktin interagiert. Die große Anzahl von Motoren in diesem Filament ermöglicht es NM2b-Filamenten, sich prozessiv auf Aktinfilamenten zu bewegen, wodurch die Prozessivität des In-vitro-Filaments charakterisiert werden^{kann 29}.

Während Fortschritte beim Verständnis der Rolle von Myosinen in der Zelle erzielt wurden, besteht die Notwendigkeit, ihre individuellen Eigenschaften auf Proteinebene zu verstehen. Um Actomyosin-Interaktionen auf einer einfachen Protein-Protein-Interaktionsebene und nicht innerhalb einer Zelle zu verstehen, können wir rekombinante Myosine für die Verwendung in In-vitro-Studien exprimieren und reinigen. Die Ergebnisse solcher Studien informieren Mechanoobiologen dann über die biophysikalischen Eigenschaften spezifischer Myosine, die letztendlich komplexe zelluläre Prozesse antreiben^{12,13,14,25,29}. Typischerweise wird dies erreicht, indem einem Myosinkonstrukt in voller Länge oder einem abgeschnittenen Myosinkonstrukt ein Affinitäts-Tag hinzugefügt und mittels Affinitätschromatographie^29,30,31aufgereinigt wird. Darüber hinaus kann das Konstrukt so konstruiert werden, dass es ein genetisch kodierbares Fluorophor oder ein Tag für die Proteinmarkierung mit einem synthetischen Fluorophor enthält. Durch Hinzufügen einer solchen fluoreszierenden Markierung können Einzelmolekül-Bildgebungsstudien durchgeführt werden, um die Myosinmechanik und -kinetik zu beobachten.

Nach der Reinigung kann das Myosin auf verschiedene Arten charakterisiert werden. Die ATPase-Aktivität kann mit kolorimetrischen Methoden gemessen werden, die Einenschluss über den Gesamtenergieverbrauch und die Aktinaffinität des Motors unter verschiedenen Bedingungen geben³². Um mehr über die Mechanochemie seiner Motilität zu erfahren, sind weitere Experimente erforderlich. Dieser Artikel beschreibt zwei auf In-vitro-Fluoreszenzmikroskopie basierende Methoden, mit denen die beweglichen Eigenschaften eines gereinigten Myosinproteins charakterisiert werden können.

Die erste dieser Methoden ist der Gleit-Aktin-Filament-Assay, mit dem die Ensembleeigenschaften von Myosinmotoren quantitativ untersucht und die Qualität einer Charge gereinigten Proteins qualitativ untersucht werden können³³. Obwohl in diesem Artikel die Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) für diesen Assay diskutiert wird, können diese Experimente effektiv mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, die häufig in vielen Labors zu finden^{ist 34}. Bei diesem Assay wird eine sättigende Schicht von Myosinmotoren an einem Deckslip befestigt. Dies kann mit Nitrocellulose, Antikörpern, Membranen, SiO2-derivatisierten Oberflächen (wie Trimethylchlorsilan), unter anderem²⁹, 33^,35,36,37,38erreicht werden. Fluoreszierend markierte Aktinfilamente werden durch die Decklippenkammer geleitet, auf der das Aktin an das an der Oberfläche befestigte Myosin bindet. Nach Zugabe von ATP (und Kinasen in der Untersuchung von NM2) wird die Kammer abgebildet, um die Translokation von Aktinfilamenten durch die oberflächengebundenen Myosine zu beobachten. Tracking-Software kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit und Länge jedes gleitenden Aktinfilaments zu korrelieren. Analysesoftware kann auch ein Maß für die Anzahl der beweglichen und stationären Aktinfilamente liefern, was nützlich sein kann, um die Qualität eines bestimmten Myosinpräparats zu bestimmen. Der Anteil an festgefahrenen Filamenten kann auch absichtlich durch Oberflächenanbindeung von Aktin an andere Proteine moduliert und gemessen werden, um die Lastabhängigkeit des Myosins zu bestimmen^39. Da jedes Aktinfilament von einer großen Anzahl verfügbarer Motoren angetrieben werden kann, ist dieser Assay sehr reproduzierbar, wobei die endgültige gemessene Geschwindigkeit robust gegenüber Störungen wie Veränderungen der Anfangsmyosinkonzentration oder dem Vorhandensein zusätzlicher Faktoren in der Lösung ist. Dies bedeutet, dass es leicht modifiziert werden kann, um die Myosinaktivität unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen, wie z. B. veränderte Phosphorylierung, Temperatur, Ionenstärke, Lösungsviskosität und die Auswirkungen der durch Oberflächengurte induzierten Belastung. Obwohl Faktoren wie stark bindende Myosin-"Totköpfe", die nicht in der Lage sind, ATP-Hydrolyse zu blockierenden Aktinfilamenten führen können, gibt es mehrere Methoden, um solche Probleme zu mildern und genaue Messungen zu ermöglichen. Die kinetischen Eigenschaften von Myosin variieren stark zwischen den Klassen und abhängig vom verwendeten spezifischen Myosin kann die Geschwindigkeit des Aktinfilamentgleitens in diesem Assay von unter 20 nm / s (Myosin 9)^40,41und bis zu 60.000 nm / s (Characean Myosin 11)⁴²variieren .

Der zweite Assay invertiert die Geometrie des gleitenden Aktinfilament-Assays¹². Hierbei werden die Aktinfilamente an die Deckschichtoberfläche gebunden und die Bewegung einzelner Moleküle von M5a oder einzelner bipolarer Filamente von NM2b visualisiert. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Lauflängen und Geschwindigkeiten einzelner Myosinmoleküle oder Filamente auf Aktin zu quantifizieren. Ein Deckrutsch ist mit einer chemischen Verbindung beschichtet, die unspezifische Bindungen blockiert und gleichzeitig die Oberfläche funktionalisiert, wie z.B. Biotin-Polyethylenglykol (Biotin-PEG). Die Zugabe von modifizierten Avidinderivaten primet dann die Oberfläche und biotinyliertes Aktin wird durch die Kammer geleitet, was zu einer Schicht F-Aktin führt, die stabil an den Boden der Kammer gebunden ist. Schließlich wird aktiviertes und fluoreszierend markiertes Myosin (typischerweise 1-100 nM) durch die Kammer geflossen, das dann abgebildet wird, um die Myosinbewegung über die stationären Aktinfilamente zu beobachten.

Diese Modalitäten stellen schnelle und reproduzierbare Methoden dar, mit denen die Dynamik sowohl von nichtmuskleären als auch von Muskelmoosinen untersucht werden kann. Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zur Reinigung und Charakterisierung von M5a und NM2b, die unkonventionelle bzw. konventionelle Myosine darstellen. Es folgt eine Diskussion einiger myosinspezifischer Anpassungen, die durchgeführt werden können, um eine erfolgreiche Bewegungserfassung in den beiden Arten des Assays zu erreichen.

Expression und Molekularbiologie
Die cDNA für das interessierende Myosin muss auf einen modifizierten pFastBac1-Vektor geklont werden, der entweder für ein C-terminales FLAG-Tag (DYKDDDDK) kodiert, wenn M5a-HMM exprimiert wird, oder für ein N-terminales FLAG-Tag, wenn es das Molekül in voller Länge von NM2b^{23,43,44,45,46}exprimiert. C-terminale FLAG-Tags auf NM2b führen zu einer geschwächten Affinität des Proteins für die FLAG-Affinitätssäule. Im Gegensatz dazu bindet das N-terminale FLAG-markierte Protein normalerweise gut an die FLAG-Affinitätssäule²³. Das N-terminal markierte Protein behält enzymatische Aktivität, mechanische Aktivität und phosphorylierungsabhängige Regulation²³bei.

In dieser Arbeit wurde ein abgeschnittenes Maus-M5a-schweres Meromyosin (HMM)-ähnliches Konstrukt mit einem GFP zwischen dem FLAG-Tag und dem C-Terminus der schweren Myosinkette verwendet. Beachten Sie, dass M5a-HMM im Gegensatz zu NM2b erfolgreich mit N- oder C-Terminal FLAG-Tags markiert und gereinigt werden kann und in beiden Fällen das resultierende Konstrukt aktiv ist. Die M5a-Schwerkette wurde an der Aminosäure 1090 abgeschnitten und enthält einen Drei-Aminosäure-Linker (GCG) zwischen dem GFP und dem Coiled-Coil-Bereich des M5a^47. Zwischen GFP und FLAG-Tag wurde kein zusätzlicher Linker hinzugefügt. M5a-HMM wurde zusammen mit Calmodulin exprimiert. Das menschliche NM2b-Konstrukt in voller Länge wurde zusammen mit ELC und RLC exprimiert. Die N-Termini des RLC wurden über einen Linker aus fünf Aminosäuren (SGLRS) mit einem GFP verschmolzen. Direkt am FLAG-Tag war ein HaloTag angebracht. Zwischen dem HaloTag und dem N-Terminus der Myosin-Schwerkette befand sich ein Linker aus zwei Aminosäuren (AS).

Beide Myosinpräparate wurden aus einem Liter sf9-Zellkultur, die mit Baculovirus infiziert war, mit einer Dichte von etwa 2 x 10⁶ Zellen/ml gereinigt. Die Volumina des Baculovirus für jede Untereinheit hingen von der Vielzahl der Infektionen des Virus ab, die durch die Anweisungen des Herstellers bestimmt wurde. Im Fall von M5a wurden die Zellen mit zwei verschiedenen Baculoviren koinfiziert - eines für Calmodulin und eines für M5a schwere Kette. Im Fall des NM2b wurden die Zellen mit drei verschiedenen Viren koinfiziert - eines für ELC, eines für RLC und eines für NM2b Schwere Kette. Für Labore, die mit einer Vielzahl von Myosinen (oder anderen multikomplexen Proteinen) arbeiten, ist dieser Ansatz effizient, da er viele Kombinationen von schweren und leichten Ketten ermöglicht und häufig verwendete leichte Ketten wie Calmodulin mit vielen verschiedenen schweren Myosinketten kotransfiziert werden können. Alle Zellarbeiten wurden in einer Biosicherheitswerkbank mit geeigneter steriler Technik durchgeführt, um eine Kontamination zu vermeiden.

Für die Expression von M5a und NM2b wurden die Sf9-Zellen, die die rekombinanten Myosine produzieren, 2-3 Tage nach der Infektion durch Zentrifugation gesammelt und bei -80 °C gelagert. Zellpellets wurden durch Zentrifugieren der koinfizierten Sf9-Zellen bei 4 °C für 30 min bei 2.800 x gerhalten. Der Proteinreinigungsprozess wird im Folgenden detailliert beschrieben.

Protocol

1. Proteinreinigung

1. Zelllyse und Proteinextraktion
   1. Bereiten Sie einen 1,5-fachen Extraktionspuffer basierend auf Tabelle 1 vor. Filtern und lagern bei 4 °C.
   2. Beginnen Sie mit dem Auftauen der Zellpellets auf Eis. Während die Pellets auftauen, ergänzen Sie 100 ml Extraktionspuffer mit 1,2 mM Dithiothreitol (DTT), 5 μg/ ml Leupeptin, 0,5 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und zwei Proteaseinhibitortabletten. Bleibe auf Eis.
   3. Sobald das Pellet aufgetaut ist, fügen Sie 1 ml des ergänzten Extraktionspuffers pro 10 ml Zellkultur hinzu. Wenn die Zellpellets beispielsweise aus 500 ml Zellkultur gebildet wurden, fügen Sie dem Pellet 50 ml zusätzlichen Extraktionspuffer hinzu.
   4. Beschallen Sie die Zellpellets, während Sie sie auf Eis halten. Verwenden Sie für jedes Pellet die folgenden Bedingungen: 5 s ON, 5 s OFF, Dauer 5 min, Leistung 4-5.
   5. Sammeln Sie das gesamte homogenisierte Lysat in einem Becherglas und fügen Sie ATP (0,1 M Stammlösung; pH 7,0) hinzu, so dass die Endkonzentration von ATP 1 mM beträgt. 15 min in einem kühlen Raum umrühren. Das ATP dissoziiert aktives Myosin von Aktin, so dass es im folgenden Zentrifugationsschritt getrennt werden kann. Es ist daher wichtig, sofort mit dem nächsten Schritt fortzufahren, um die Möglichkeit einer ATP-Erschöpfung und erneuten Bindung an Aktin zu minimieren.
   6. Zentrifuge die Lysate bei 48.000 x g für 1 h bei 4 °C. Während dies geschieht, beginnen Sie mit dem Waschen von 1-5 ml einer 50% igen Aufschlämmung von Anti-FLAG-Affinitätsharz (für ein Pellet, das aus 1 L Zellen gebildet wird) mit 100 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zum Beispiel für 5 ml Harz, waschen Sie 10 ml einer 50% igen Aufschlämmung. Im letzten Waschschritt wird das Harz mit 1-5 ml PBS mit genügend Volumen wieder aufgebraucht, um eine 50% ige Aufschlämmung zu erzeugen.
   7. Nach der Lysatzentrifugation den Überstand mit der gewaschenen Harzaufschlämmung verrühren und 1-4 h vorsichtig im Kühlraum schaukeln. Machen Sie während des Wartens die in Tabelle 1 beschriebenen Puffer und halten Sie sie auf Eis.
2. FLAG Affinitätsreinigungsvorbereitung
   1. Zentrifugiert die Lösung in Schritt 1.7 bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Das Harz wird am Boden des Rohres verpackt. Ohne das Harz zu stören, entfernen Sie den Überstand.
   2. Das Harz wird in 50 ml Puffer A wie in Tabelle 1 beschrieben wieder aufgebraucht und bei 500 x g zentrifugiert, um 5 min bei 4 °C zu zentrifugieren. Ohne das Harz zu stören, entfernen Sie den Überstand.
   3. Das Harz wird in 50 ml Puffer B wie in Tabelle 1 beschrieben wieder hergestellt und bei 500 x g zentrifugiert, und 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal und enuspendieren Sie das Harz in 20 ml Puffer B. Dann mischen Sie das Harz und den Puffer gründlich, indem Sie das Röhrchen etwa 10 Mal von Hand vorsichtig umkehren.
3. Proteinelution und -konzentration
   1. Machen Sie 30 ml Elution Buffer wie in Tabelle 1 beschrieben und lassen Sie es auf Eis abkühlen.
   2. Stellen Sie die Elutionssäule in einem Kühlraum auf. Gießen Sie die Harzaufschlämmung vorsichtig in die Säule. Waschen Sie die Säule mit 1-2 Säulenvolumina von Puffer B, während das Harz auf der Unterseite verpackt ist, und stellen Sie sicher, dass das Harz nicht austrocknet.
   3. 1 ml des Elution Buffer durch das Harz fließen lassen und den Durchfluss in einem 1,5 mL Rohr sammeln. Wiederholen Sie dies so, dass 12, 1 ml Fraktionen gesammelt werden.
   4. Führen Sie an dieser Stelle einen groben Bradford-Test an den Fraktionen durch, um qualitativ zu bestimmen, welche Fraktionen am stärksten konzentriert sind⁴⁸. Auf einer Reihe einer 96-Well-Platte 60 μL 1x Bradford-Reagenz pipetten. Wenn Fraktionen gesammelt werden, mischen Sie 20 μL jeder Fraktion pro Vertiefung. Eine dunklere blaue Färbung weist auf die konzentrierteren Fraktionen hin.
   5. Sammeln Sie in einem 50-ml-Röhrchen das verbleibende Protein, indem Sie den verbleibenden Elutionspuffer vorsichtig durch die Säule pipettieren, um das verbleibende Myosin freizusetzen, das an das Harz im Säulendurchfluss gebunden ist. Dieser Durchfluss wird im nächsten Schritt konzentriert. Stellen Sie sicher, dass das Harz dann für die Wiederverwendung regeneriert und gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert wird.
   6. Die drei konzentriertesten Fraktionen werden gebündelt und der Durchfluss im 50-ml-Rohr sowie die verbleibenden 1-ml-Fraktionen mit einem 100.000 MWCO-Konzentrationsrohr weiter konzentriert. Laden Sie die gepoolte Probe bei 750 x g für 15 min bei 4 °C auf das konzentrierende Röhrchen und die Zentrifuge und wiederholen Sie, bis das gesamte eluierte Protein auf ein Endvolumen von ca. 0,5-1 ml konzentriert ist.
      HINWEIS: Diese Porengröße ermöglicht die Retention der Myosinmoleküle, die Massen haben, die ein Vielfaches der Molekulargewichtsabschneidung aufweisen. Die Leichtketten bleiben während dieses Konzentrationsverlaufs fest an die motorischen Domänen gebunden, wie durch die Durchführung einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese am Endprodukt nachgewiesen wurde.
4. Dialyse und Schockgefrieren
   1. Machen Sie 2 L Dialysepuffer, wie in Tabelle 1beschrieben. Laden Sie die Probe in einen Dialysebeutel oder eine Kammer und dialysieren Sie sie über Nacht im Kühlraum. Beachten Sie, dass die Zusammensetzung der Dialysepuffer für NM2b und M5a unterschiedlich ist.
      HINWEIS: Im Fall von NM2b besteht der Zweck dieses Dialyseschritts darin, Myosinfilamente im Puffer mit niedriger Ionenstärke zu bilden. Die Sedimentation dieser Filamente sorgt dann für einen zusätzlichen Reinigungsschritt und ermöglicht die Konzentration der Probe. Es wird daher am nächsten Tag einen sichtbaren weißen Niederschlag in der Dialysekammer geben. Diese Filamente werden durch Zentrifugation gesammelt und in Schritt 5.1 depolymerisiert. Im Falle von M5a-HMM ist das Protein nach der Dialyse über Nacht ausreichend rein für die Verwendung in nachfolgenden Assays. Weitere Reinigungsschritte wie Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie können bei Bedarf durchgeführt werden. Für die M5a-Wiederherstellung nach der Dialyse fahren Sie mit Schritt 5.2 fort.
5. Wiederherstellung von Myosin nach der Dialyse
   1. Für NM2b entladen Sie vorsichtig die gesamte Probe aus dem Dialysebeutel oder der Kammer und zentrifugieren Sie bei 4 °C für 15 minuten bei 49.000 x g, um die Myosinfilamente zu sammeln. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie den Speicherpuffer schrittweise dem Pellet hinzu, wie in Tabelle 1 beschrieben, bis es sich aufgelöst hat. Sanftes Auf- und Abpipettieren hilft, das Pellet zu solubilisieren. Normalerweise werden hierfür nicht mehr als 500 μL pro Röhrchen benötigt. Nachdem sichergestellt wurde, dass das Pellet vollständig im speicherpuffer mit hoher Ionenstärke gelöst ist, kann ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt (15 min bei 49.000 x g)durchgeführt werden, um bei Bedarf unerwünschte Aggregate zu entfernen, da das Myosin nun unpolymerisiert wird und im Überstand verbleibt.
   2. Für M5a-HMM sollten Sie die gesamte Probe vorsichtig aus der Dialysekammer und zentrifuge bei 4 °C für 15 min bei 49.000 x g entnehmen, falls unerwünschte Aggregate vorhanden sind. Nehmen Sie den Überstand.
6. Konzentrationsbestimmung und Schockgefrieren
   1. Um die Konzentration des Produkts zu bestimmen, messen Sie die Absorption mit einem Spektralphotometer bei den Wellenlängen 260, 280, 290 und 320 nm. Berechnen Sie die Konzentration in mg/ml (c_mg/ml) mit Gleichung 1, wobei A₂₈₀ die Absorption bei 280 nm und A₃₂₀ die Absorption bei 320 nm darstellt. Die resultierende Konzentration in mg/ml kann mit Gleichung 2in μM von Myosinmolekülen umgewandelt werden, wobei M das Molekulargewicht des gesamten Proteins (einschließlich der schweren Ketten, leichten Ketten, Fluorophore und aller Tags) ist.
      c_mg/ml = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM Moleküle = 1000c_mg/ml/M(2)
      HINWEIS: Wenn eine Verdünnung notwendig ist, muss sie in einem Puffer mit hoher Ionenstärke erfolgen. Der Extinktionskoeffizient (ε) kann bestimmt werden, indem die Aminosäuresequenz des Proteins in ein Programm wie ExPASy importiert wird. Die typische Ausbeute für das M5a-HMM beträgt etwa 0,5-1 ml 1-5 mg/ml Protein und für das NM2b in voller Länge 0,5-1 ml 0,5-2 mg/ml. Der extinktionskoeffizient für das in dieser Arbeit verwendete M5a-HMM betrug 0,671. Der in diesem Artikel verwendete Extinktionskoeffizient für das NM2b betrug 0,611.
   2. Lagern Sie das gereinigte Myosin auf eine der beiden Arten. Aliquot zwischen 10-20 μL in ein dünnwandiges Rohr, z. B. ein Polymerisationskettenreaktionsrohr, und lassen Sie das Rohr zum Schockgefrieren in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff fallen. Alternativ können Sie zwischen 20-25 μL Myosin direkt in flüssigen Stickstoff pipetten und die gefrorenen Proteinperlen in sterilen kryogenen Röhrchen lagern. In beiden Fällen können die resultierenden Röhrchen in -80 °C oder flüssigem Stickstoff für die zukünftige Verwendung gelagert werden.
      HINWEIS: Da beide unten beschriebenen Motilitätstests sehr geringe Mengen an Protein erfordern, ist die Lagerung in kleinen Aliquoten, wie beschrieben, wirtschaftlich.

2. Gleitaktinfilament-Assay

1. Aufbereitung von Abdeckrippen
   1. Machen Sie eine 1% ige Nitrocelluloselösung in Amylacetat.
   2. Erhalten Sie eine Gewebekulturschale (150 x 25 mm) und fügen Sie ein kreisförmiges Filterpapier (125 mm Durchmesser) auf den Boden der Schüssel hinzu.
   3. Acht quadratische Abdecklappen nr. 1,5 mit einer Dicke von 22 mm auf ein Gestell laden und mit ca. 2-5 mL 200-proof Ethanol anschließend mit 2-5 mL destilliertem Wasser (dH_{2 O)}waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und enden Sie mit Wasser. Anschließend trocknen Sie die Abdeckrlips vollständig mit einergefilterten Luftleitung oder N2-Linie.
   4. Nehmen Sie einen Coverlip und pipetetten Sie langsam 10 μL der 1% igen Nitrocelluloselösung entlang einer Kante des Schlupfes. Dann, in einer glatten Bewegung, schmieren Sie es über den Rest des Coverlips mit der Seite einer glatten 200 μL Pipettenspitze. Legen Sie diesen Coverlip mit der Nitrocellulose-Seite nach oben auf die Gewebekulturschale. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Abdecklippen und lassen Sie sie trocknen, während Sie die verbleibenden Reagenzien vorbereiten, und verwenden Sie die Abdecklippen innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung.
2. Kammervorbereitung
   1. Wischen Sie einen Objektträger mit einem optischen Linsenpapier ab, um große Ablagerungen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband, ca. 2 cm lang.
   2. Legen Sie ein Stück entlang der Mitte des langen Randes des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Bandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Band etwa 2 mm unter das erste Stück Band, so dass die beiden parallel und ausgerichtet sind. Dadurch entsteht eine Strömungskammer, die ca. 10 μL Lösung aufnehmen kann (siehe Abbildung 1).
   3. Nehmen Sie einen der nitrocellulosebeschichteten Deckschichten aus Teil 1. Kleben Sie den Deckmantel vorsichtig auf das Klebeband, so dass die mit Nitrocellulose beschichtete Seite direkten Kontakt mit dem Band hat (siehe Abbildung 1). Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Slide-Tape-Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Coverlip ordnungsgemäß auf dem Dia haftet. Schneiden Sie das überschüssige Klebeband, das über dem Rand des Dias hängt, mit einer Rasierklinge ab.
3. Aktin-Zubereitung
   1. 20 μM F-Aktin durch Polymerisation von globulärem Aktin (G-Actin) in Polymerisationspuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl_2,1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) bei 4 °C über Nacht herstellen.
   2. F-Aktin im Motilitätspuffer auf 5 μM verdünnen (20 mM MOPS, 5 mM MgCl_2,0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etikett mit mindestens 1,2-fachem molaren Überschuss an Rhodamin-Phalloidin. (mit Aluminiumfolie bedeckt) mindestens 2 h auf Eis lassen. Diese kann bis zu 1-2 Monate verwendet werden, auf Eis gelagert.
4. Durchführung des Myosin 5a Gleitaktinfilament Assays
   HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des Myosin 5a (HMM) Gleittests bereitgestellt.
   1. Bereiten Sie die in Tabelle 2 beschriebenen Lösungen für Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis.
   2. 10 μL des Myosins 5a (50-100 nM) durch die Strömungskammer strömen und 1 min warten.
   3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT ("low salt" Buffer). Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten, indem Sie die Ecke des Papiers vorsichtig am Ausgang der Durchflusskammer platzieren.
   4. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   5. Durchfluss in 10 μL der schwarzen Aktinlösung (5 μM F-Aktin, 1 μM Calmodulin und 1 mM ATP in 50 mM MB mit 1 mM DTT), um "tote Köpfe" zu eliminieren, wie im Abschnitt Diskussion diskutiert.
      1. Pipetten Sie die Lösung mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie die Lösung in die Kammer einführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male und warten Sie nach dem dritten Mal 1 Minute. Etwa 20 Pipettierereignisse sind ausreichend.
      2. Um den "Dead Head" -Spin durchzuführen, fügen Sie eine stöchiometrische Menge F-Aktin zu Myosin in Gegenwart von 1 mM ATP und 1 mM MgCl₂ bei einer Salzkonzentration von 500 mM hinzu. Dann Ultrazentrifuge bei 480.000 x g für 15 min bei 4 °C. Das tote Myosin befängt sich im Pellet.
   6. Durchfluss in 50 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP, um die Kammer der freien Aktinfilamente zu erschöpfen.
   7. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male, um die Kammer eines ATP zu erschöpfen.
   8. Strömen Sie in 10 μL 20 nM Rhodamin Actin (Rh-Actin) Lösung mit 1 mM DTT in 50 mM MB und warten Sie 1 Minute, um eine rigoore Bindung der Aktinfilamente an das Myosin 5a zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckslips befestigt ist.
   9. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT, um Rh-Actin-Filamente wegzuwaschen, die nicht an die Oberfläche gebunden sind. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   10. Durchfluss in 30 μL Endpuffer.
   11. Nehmen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm auf, um Rh-Actin zu visualisieren. Eine angemessene Belichtungszeit beträgt 200 ms bei 1,4 mW Laserleistung für eine Gesamtaufnahmedauer von 0,5-1 min.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erfassungsrate entsprechend der Geschwindigkeit der sich bewegenden Filamente skaliert wird. Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für die Verwendung mit Tracking-Programmen ist die Erfassungsbildrate. Subpixelbewegungen zwischen Frames führen zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit, und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. Eine optimale Erfassungsrate bietet Aktingleiten für mindestens einen Pixelabstand zwischen den Frames. Im Falle des TIRF-Mikroskops, das hier für die Bildgebung verwendet wird, entspricht dieser Schwellenwert 130 nm; Daher muss ein Myosin, von dem erwartet wird, dass es 1 μm/s zurückliegt, mit einer Rate von 5 Bildern/s (0,2 s Intervall) abgebildet werden, um 200 nm Bewegung zu erreichen, während ein Myosin, das voraussichtlich 10 nm/s zurücklegen wird, 0,05 Bilder/s (20 s Intervalle) benötigt. Daten können daher bei Bedarf in diesem Stadium heruntergerechnet werden (siehe Diskussion für weitere Details).
5. Durchführung des nichtmuskleären Myosin-2b-Gleitaktin-Filament-Assays
   HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des nichtmuskleären Myosin-2b-Gleitassays in voller Länge bereitgestellt. Das nichtmuskleäre Myosin 2b Gliding Actin Filament Assay Protokoll unterscheidet sich in bestimmten Schritten vom Myosin 5a Protokoll. Stellen Sie sicher, dass für jeden dieser Schritte die richtigen Puffer verwendet werden. Zum Beispiel erfordert der NM2b-Assay die Befestigung von Myosin an den Coverslip in einem hohen Salzpuffer, während der M5a in hohen oder niedrigen Salzpuffern am Coverslip befestigt werden kann. Darüber hinaus verwendet der M5a-Gleit-Aktin-Filament-Assay eine niedrigere Myosinkonzentration, um die Häufigkeit von Aktinfilamenten zu mildern, die während der Erfassung auseinanderbrechen.
   1. Bereiten Sie die Lösungen für NM2b wie in Tabelle 2 beschrieben vor und halten Sie sie auf Eis.
   2. 10 μL des nichtmuskleären Myosins 2b (0,2 μM) in 500 mM Motility Buffer (MB) ("High Salt" Buffer) und 1 mM Dithiothreitol (DTT) durch die Strömungskammer strömen lassen und 1 min warten.
      HINWEIS: Die hohen Salzpuffer dissoziieren Myosinfilamente und ermöglichen die Anheftung einzelner Myosinmoleküle an die Oberfläche, da nichtmuskeliges Myosin 2b in Ionenkonzentration <150 mM zu Filamenten polymerisieren kann.
   3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml Rinderserumalbumins (BSA) in 500 mM MB mit 1 mM DTT ("High Salt" Buffer) wie in Tabelle 2beschrieben . Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
   4. Waschen mit 10 μL von 500 mM MB mit 1 mM DTT wie in Tabelle 2beschrieben. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   5. Durchfluss in 10 μL der schwarzen Aktinlösung wie in Tabelle 2 beschrieben, um "tote Köpfe" zu eliminieren, wie weiter im Abschnitt Diskussion erläutert. Die schwarze Aktinlösung enthält 5 μM unmarkiertes F-Aktin, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl_2,1 μM CaM und 1 mM DTT in 50 mM NaCl Motilitätspuffer, um das nichtmusklele Myosin 2b auf der Oberfläche der Kammer zu phosphorylatieren.
      1. Pipetten Sie die Lösung mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel, um die Aktinfilamente zu scheren, bevor Sie die Lösung in die Kammer einführen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male und warten Sie nach dem dritten Mal 1 Minute. Ungefähr 20 Pipettierereignisse sind ausreichend.
   6. Durchfluss in 50 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP, um die Kammer der freien Aktinfilamente zu erschöpfen.
   7. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male, um die Kammer eines ATP zu erschöpfen.
   8. Strömen Sie in 10 μL 20 nM Rh-Actin-Lösung mit 1 mM DTT in 50 mM MB und warten Sie 1 Minute, um eine rigoline Bindung der Aktinfilamente an das nichtmuskleäre Myosin 2b zu ermöglichen, das an der Oberfläche des Deckels befestigt ist.
   9. Waschen Sie mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT, um Rh-Actin-Filamente wegzuwaschen, die nicht an die Oberfläche gebunden sind. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   10. Durchfluss in 30 μL Endpuffer. Für den nichtmuskleären Myosin-2b-Gleit-Aktin-Filament-Assay enthält der Final Buffer auch Calmodulin, CaCl₂und Myosin-Leichtkettenkinase, um eine vollständige Phosphorylierung des nichtmuskleären Myosins 2b während der Videobildgebung zu ermöglichen. 0,7% Methylcellulose können auch in den Endpuffer aufgenommen werden, wenn Aktinfilamente nur lose gebunden oder nicht an die Oberfläche gebunden sind. Dies wird im Abschnitt Diskussion weiter erläutert.
   11. Nehmen Sie Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von 561 nm auf. Eine angemessene Belichtungszeit beträgt 200 ms bei 1,4 mW Laserleistung für eine Gesamtaufnahmedauer von 0,5 -3 min.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Erfassungsrate entsprechend der Geschwindigkeit der sich bewegenden Filamente skaliert wird. Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für die Verwendung mit Tracking-Programmen ist die Erfassungsbildrate. Subpixelbewegungen zwischen Frames führen zu einer Überschätzung der Geschwindigkeit, und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. Eine optimale Erfassungsrate bietet Aktingleiten für mindestens einen Pixelabstand zwischen den Frames. Im Falle des TIRF-Mikroskops, das hier für die Bildgebung verwendet wird, entspricht dieser Schwellenwert 130 nm; Daher muss ein Myosin, von dem erwartet wird, dass es 1 μm/s zurückliegt, mit einer Rate von 5 Bildern/s (0,2 s Intervall) abgebildet werden, um 200 nm Bewegung zu erreichen, während ein Myosin, das voraussichtlich 10 nm/s zurücklegen wird, 0,05 Bilder/s (20 s Intervalle) benötigt. Die Daten können daher in dieser Phase bei Bedarf heruntersampelt werden (siehe Diskussion für weitere Details).

3. Einzelmolekül-TIRF-Assay

1. Aufbereitung von Abdeckrippen
   1. Teilen Sie das Stammpulver in 10 mg Aliquoten (in 1,5 ml Röhrchen) Methoxy-Peg-Silan (mPEG) und 10 mg Aliquoten Biotin-Peg-Silan (bPEG). Bei -20 °C in einem verschlossenen, feuchtigkeitsfreien Behälter lagern und innerhalb von 6 Monaten verwenden.
   2. Laden Sie acht 22 mm quadratische Abdecklappen mit einer Dicke von 1,5 H (hochpräzise) auf ein Gestell und waschen Sie sie mit 2-5 ml 200-proof Ethanol, gefolgt von 2-5 ml destilliertem Wasser. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und enden Sie mit Wasser. Anschließend trocknen Sie die Abdeckrlips vollständig mit einer Luftleitung oder N₂ und reinigen Sie sie 3 min lang mit Argon.
   3. Legen Sie die sauberen Abdeckteile auf Filterpapier (90 mm) in eine Gewebekulturschale (100 x 20 mm) und inkubieren Sie sie in einem 70 °C-Ofen, während Sie die folgenden Schritte ausführen.
      HINWEIS: Die Plasmareinigung kann durch andere chemische Reinigungsmethoden ersetzt werden⁴⁹.
   4. Bereiten Sie 80%_igeEthanollösung mit dH 2 O vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 2,0 ein. Fügen Sie 1 ml davon zu einem 10 mg Aliquot mPEG und 1 ml zu einem 10 mg Aliquot bPEG hinzu. Wirbel aufzulösen, was nicht mehr als 30 s dauern sollte.
   5. Nehmen Sie 100 μL der bPEG-Lösung und fügen Sie 900 μL 80% Ethanol (pH 2,0) hinzu. Diese Lösung ist 1 mg / ml bPEG. Machen Sie dann eine Lösung aus beiden PEGs wie folgt, und mischen Sie gründlich.
      1. 200 μL 10 mg/ml mPEG (Endkonzentration: 2 mg/ml).
      2. 10 μL des 1 mg/ml bPEG (Endkonzentration: 10 μg/ml).
      3. 790 μL der 80%igen Ethanollösung (pH 2,0).
   6. Nehmen Sie die Abdecklippen aus dem Ofen. Dosieren Sie vorsichtig 100 μL der PEG-Lösung auf die Mitte jedes Deckstücks, um sicherzustellen, dass nur die obere Oberfläche nass ist. Dann die Slips wieder in den Ofen geben und 20 bis 30 min inkubieren.
   7. Wenn die Decklippen ein löchriges Aussehen annehmen, mit kleinen Kreisen auf der Oberfläche, entfernen Sie sie aus dem Ofen.
   8. Jeden Abdecklappen mit 100% Ethanol waschen, mit einer Luftleitung trocknen und wieder in den Ofen stellen. Inkubieren Sie nur für die Zeit, die zum Erstellen von Kammern in Schritt 2 erforderlich ist.
2. Kammervorbereitung
   1. Reinigen Sie einen Objektträger für die Herstellung der Kammer. Schneiden Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband, ca. 2 cm lang.
   2. Legen Sie ein Stück entlang der Mitte des langen Randes des Objektträgers. Stellen Sie sicher, dass die Kante des Bandes mit der Kante der Folie ausgerichtet ist. Legen Sie das zweite Stück Band etwa 2 mm unter das erste Stück Band, so dass die beiden parallel und ausgerichtet sind.
   3. Nehmen Sie einen der funktionalisierten Abdecklippen aus dem Ofen (erstellt in 3.1). Kleben Sie den Deckblatt vorsichtig auf das Klebeband, sodass die mit PEG beschichtete Seite mit dem Gesicht nach unten ist und direkten Kontakt mit dem Band hat, wie in Abbildung 1dargestellt. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die Slide-Tape-Schnittstelle, um sicherzustellen, dass der Coverlip ordnungsgemäß auf dem Dia haftet.
   4. Schneiden Sie das überschüssige Klebeband, das über dem Schlitten hängt, mit einer Rasierklinge ab. Diese Kammern können sofort verwendet oder paarweise in ein 50-ml-Rohr gelegt und für die zukünftige Verwendung in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert werden. Es ist wichtig, sofort zu lagern, da sich sonst die Oberfläche verschlechtert.
3. Durchführung des Myosin 5a TIRF-Mikroskopie-Assays
   1. Bereiten Sie die in Tabelle 3 beschriebenen Lösungen für den invertierten Motilitätstest von Myosin 5a vor und halten Sie sie auf Eis.
   2. Waschen Sie die Kammer mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT.
   3. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 Minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
   4. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   5. 10 μL der NeutrAvidin-Lösung in 50 mM MB mit 1 mM DTT durchfließen und 1 min warten.
   6. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   7. 10 μL biotinyliertes Rhodamin-Actin (bRh-Actin) mit 1 mM DTT in 50 mM MB strömen und 1 min warten. Verwenden Sie für diesen Schritt eine großgebohrte Pipettenspitze und vermeiden Sie ein Pipettieren nach oben und unten, um das Scheren der fluoreszierenden Aktinfilamente zu minimieren, um sicherzustellen, dass lange Aktinfilamente an der Oberfläche befestigt werden können (20-30 μm oder länger). Eine effektive Alternative ist das Schneiden des Kegels einer Standardpipettenspitze (mit einer Öffnung von ≈1-1,5 mm).
   8. Waschen mit 10 μL von 50 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   9. 30 μL Endpuffer mit 10 nM Myosin 5a durchfließen, dann sofort auf das TIRF-Mikroskop laden und aufnehmen, nachdem der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebungsmodalität gefunden wurde. Belichtungszeiten zwischen 100-200 ms sind bei 1,4 mW Laserleistung für das Aktin und GFP-markierte Myosin angemessen. Eine geeignete Erfassungszeit für die Geschwindigkeitsanalyse beträgt 3 min.
4. Durchführung des nichtmuskulären Myosin-2b-TIRF-Mikroskopie-Assays
   HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Details des nichtmuskleären Myosin-2b-TIRF-Assays unter Verwendung polymerisierter und phosphorylierter Filamente bereitgestellt. Ein detailliertes Protokoll (Abschnitte 4.1-4.3) zur Phosphorylierung und Polymerisation des nichtmuskleären Myosin-2b in einem Röhrchen ist enthalten.
   1. Um das gereinigte NM2b zu phosphorylatieren, machen Sie eine 10-fache Kinasemischung mit den folgenden Bedingungen: 2 mM CaCl_2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK und 0,1 mM ATP. Dieser kann mit 500 mM MB mit 10 mM DTT auf Volumen gebracht werden. Fügen Sie die 10-fache Kinasemischung in einem volumetrischen Verhältnis von 1:10 zum Myosin hinzu und lassen Sie es 20-30 minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Typischerweise beträgt die Myosinkonzentration für diesen Schritt 1 μM.
   2. Um das phosphorylierte Myosin zu Filamenten zu polymerisieren, senken Sie die Salzkonzentration des NM2b auf 150 mM NaCl. Machen Sie dazu einen 1x Motilitätspuffer (1x MB) ohne Salz, indem Sie die 4x MB viermal in dH₂O verdünnen. Diese 1x MB können verwendet werden, um die Salzkonzentration zu senken, da das NM2b in einem 500 mM Salzpuffer eingefroren wurde.
   3. Für jede 3 μL Stamm NM2b 7 μL von 1x MB hinzufügen, um die Salzkonzentration auf 150 mM NaCl zu senken, und 20-30 minuten auf Eis inkubieren, um NM2b-Filamente zu bilden.
      HINWEIS: Die Reihenfolge in den Abschnitten 4.1-4.3 ist nicht entscheidend, solange das NM2b phosphoryliert ist und die endgültige Salzkonzentration 150 mM beträgt. Die Inkubation in der Größenordnung von 30 min-1 h ermöglicht genügend Zeit für eine vollständige Phosphorylierung und Polymerisation.
   4. Bereiten Sie die lösungen für den in Tabelle 3 beschriebenen invertierten Motilitätstest für nichtmuskleles Myosin 2b vor und halten Sie sie auf Eis.
   5. Waschen Sie die Kammer mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT.
   6. Durchfluss in 10 μL des 1 mg/ml BSA in 150 mM MB mit 1 mM DTT Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male und warten Sie 1 minute nach der dritten Wäsche. Verwenden Sie die Ecke eines Seidenpapiers oder Filterpapiers, um die Lösung durch den Kanal zu leiten.
   7. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   8. 10 μL der NeutrAvidin-Lösung in 150 mM MB mit 1 mM DTT durchfließen lassen und 1 min warten.
   9. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   10. 10 μL bRh-Actin einströmen und 1 min warten. Verwenden Sie für diesen Schritt eine großgebohrte Pipettenspitze und vermeiden Sie ein Pipettieren nach oben und unten, um das Scheren der fluoreszierenden Aktinfilamente zu minimieren, um sicherzustellen, dass lange Aktinfilamente an der Oberfläche befestigt werden können (20-30 μm oder länger). Eine effektive Alternative ist das Schneiden des Kegels einer Standardpipettenspitze.
   11. Waschen mit 10 μL von 150 mM MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   12. 10 μL der nichtmuskleären Myosin-2b-Lösung (ca. 30 nM) durchfließen und 1 min warten.
   13. Waschen mit 10 μL von 150 MB mit 1 mM DTT. Wiederholen Sie diese Wäsche noch zwei weitere Male.
   14. 30 μL Endpuffer einfließen lassen, dann sofort auf das TIRF-Mikroskop laden und aufzeichnen, nachdem der optimale Fokus für die TIRF-Bildgebungsmodalität gefunden wurde. Belichtungszeiten zwischen 100-200 ms sind bei 1,4 mW Laserleistung für das Aktin und GFP-markierte Myosin angemessen. Eine geeignete Erfassungszeit für die Geschwindigkeitsanalyse beträgt 3 min.

4. Bildanalyse

1. Bildanalyse für Gleitaktinfilament-Assay
   HINWEIS: Die Bilder können mit der Software und den Handbüchern analysiert werden, die in der Materialliste verlinkt sind. Es ist wichtig zu beachten, dass das hier beschriebene Programm TIFF-Stacks zur Analyse benötigt. Das Verfahren zur Analyse des Gleitaktinfilament-Assays ist wie folgt⁵⁰.
   1. Laden Sie rohe Filmstapel in eine bestimmte Ordnerstruktur hoch und geben Sie das oberste Verzeichnis der Filmordner in das Programm ein.
      HINWEIS: Das Programm analysiert die Dateien in diesem Verzeichnis und den Unterverzeichnissen und behandelt die Verzeichnisse der untersten Ebene als Replikate. Für jede Gruppe von Replikaten werden durchschnittliche Statistiken erstellt. In diesem Fall wurde für jedes Myosin ein einzelner Film verwendet. Bei der Charakterisierung eines neuartigen Myosins oder der Untersuchung einer neuen experimentellen Erkrankung empfiehlt es sich, Filme aus drei Sichtfeldern (FOV) pro Kammer für insgesamt drei Kammern zu analysieren und diesen Workflow für drei Präparate des untersuchten Myosins zu wiederholen.
   2. Verwenden Sie das Skript "stack2tifs" in Verbindung mit der vom Benutzer eingegebenen Bildrate, um jeden TIFF-Stapel in einen Ordner zu konvertieren, der eine Reihe einzelner TIFF-Dateien und eine entsprechende Metadaten.txt Datei enthält, die die Startzeit jedes Frames enthält. Für Daten, die nicht im TIFF-Stack-Format vorliegen, muss zunächst eine Konvertierung mit Software wie der in der Materialtabelle aufgeführten vorgenommenwerden.
      HINWEIS: Dieses Skript ist Teil des Softwarepakets. Die Informationen zum Skript finden Sie hier: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
   3. Verwenden Sie den Parameter -px, d. h. die Pixelgröße (in nm) während der Erfassung. In diesem Fall beträgt die Pixelgröße 130 nm. Verwenden Sie die Parameter -xmax und -ymax, um die Achsen für die Streudiagrammausgaben zu skalieren. Diese entsprechen der längsten geplotteten Filamentlänge und der maximalen geplotteten Geschwindigkeit (in nm/s).
      HINWEIS: Dies sind Schätzwerte und können auf höher als erwartete Werte festgelegt werden, um sicherzustellen, dass Daten im Diagramm enthalten sind. Nach der Analyse können die Rohdaten auch zur Verwendung in anderen Statistik- oder Grafiksoftware zur Anzeige und Analyse exportiert werden.
   4. Verwenden Sie den Parameter -minv, bei dem es sich um einen Parameter mit minimaler Geschwindigkeitsabschaltung handelt, um die Filamente zu definieren, die sich nicht bewegen und daher von der Analyse ausgeschlossen werden können. Für ein langsames Myosin wie NM2b muss dieser Parameter niedrig sein (in diesem Beispiel 5 nm/s), um zu vermeiden, dass echte Gleitbewegungen ausgeschnitten werden. Für ein schnelles Myosin wie M5a kann dieser Parameter höher sein (in diesem Beispiel 100 nm/ s), um einen strengeren Filter anzuwenden, während die wahre Gleitgeschwindigkeitsverteilung erhalten bleibt.
   5. Verwenden Sie den Cutoff-Parameter -pt, um eine reibungslose Bewegung zu identifizieren. Für jedes Stichprobenfenster wird ein Wert berechnet, der 100 x Geschwindigkeit Standardabweichung/Mittlere Geschwindigkeit entspricht. Tracks mit höheren Werten als der Cutoff, haben mehr variable Geschwindigkeiten und sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen. In diesem Beispiel wurde ein Cutoff-Wert von 33 verwendet. Tracks mit höheren Werten haben mehr variable Geschwindigkeiten und sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
   6. Verwenden Sie -maxd, um einen maximal zulässigen Verknüpfungsabstand zwischen Frames festzulegen. Dies ist ein berechneter Frame-to-Frame-Abstand, der vom Mittelpunkt des Filaments in Einheiten von nm bewegt wird. Es kann nützlich sein, um sporadische Bewegungen oder falsche Verbindungen zwischen Filamenten auszuschließen. In den Beispielen hier wurde der Parameter auf dem Standardwert von 2.000 nm belassen.
2. Bildanalyse für TIRF-Mikroskopie-Assay
   HINWEIS: Das Verfahren zur Analyse des Einzelmolekül-TIRF-Assays auf der Bildgebungssoftware, die speziell im Materialtabelle ist wie folgt²⁹.
   1. Klicken Sie auf das aufgezeichnete Mikroskopievideo und ziehen Sie es in den Arbeitsbereich der Software, um es zu öffnen⁵¹. Teilen Sie dann die Erfassungskanäle auf. Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle teilen.
      HINWEIS: Bei einer nennenswerten Stufendrift während der Aufnahme müssen die Bilder stabilisiert werden, um die instrumentelle Drift auf der Abbildungsebene zu korrigieren. In diesem Fall wurde keine Kompensation für die Z-Achsendrift verwendet, da das Mikroskop, mit dem diese Daten erhalten wurden, den Z-Fokus gut stabilisiert. Um das Bild im Bildanalyseprogramm zu stabilisieren, installieren Sie das entsprechende Stabilisator-Plug-In, das in der Materiallisteverlinkt ist. Der Bildstabilisator nimmt feste Positionen für die Objekte im Bild an und verwendet einen gleitenden Durchschnitt der vorherigen Frames als Referenz. Das empfohlene Verfahren ist daher, mit dem Kanal zu beginnen, der Bilder von markiertem Aktin enthält, da sich dieser in einer festen Position befindet.
   2. Klicken Sie auf Plugins, dann finden Sie Image Stabilizer; Stellen Sie sicher, dass Übersetzung ausgewählt ist, und behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Protokolltransformationskoeffizienten. Durch Anwenden dieses Protokollschritts können die berechneten Verschiebungsparameter im nächsten Schritt auf den anderen Kanal angewendet werden. Lassen Sie den Vorgang abschließen.
   3. Öffnen Sie dann den Kanal mit dem beschrifteten Myosin und wenden Sie die Stabilisierung an, indem Sie auf Plugins > Image Stabilizer Log Applierklicken. Wenn Bilder von Aktin während derselben Aufnahme nicht aufgenommen werden können, weil eine höhere Bildgebungsrate in einem einzelnen Kanal erforderlich ist, stabilisieren Drifts den Bildstapel, indem sie einen Bereich auswählen, der statische Objekte wie einen biotinylierten Fiducialmarker oder Fluorophore enthält, die unspezifisch an die Biotin-PEG-Oberfläche gebunden sind. Dieser Bereich kann vom ursprünglichen Stapel abgeschnitten und stabilisiert werden, gefolgt von der Anwendung der resultierenden Verschiebungswerte auf den ursprünglichen Stapel.
      HINWEIS: In der Praxis wird die in Motilitätsexperimenten beobachtete Drift im Verhältnis zur Bewegung von Myosinen, die sich mit mehreren hundert nm / s bewegen, vernachlässigbar sein, aber für die langsamsten Myosine wird dies zu einer wichtigen Überlegung.
   4. Öffnen Sie dann TrackMate, klicken Sie auf Plugins; Klicken Sie dann im Dropdown-Menü auf Tracking und schließlich auf TrackMate. An dieser Stelle wird die Bildanalyse anhand der Parameter des Fluorophors und der Assaybedingungen optimiert. Ideale Startparameter sind jedoch wie folgt.
      1. Kalibrierungseinstellungen: Behalten Sie alle Standardwerte bei.
      2. Detektor: LoG-Detektor.
      3. Geschätzter Blobdurchmesser: 0,5-1,0 Mikron.
      4. Schwellenwert: 25-200. (Dies kann durch Klicken auf Vorschau nach Auswahl einer Zahl bestimmt werden, um zu sehen, ob die erkannten Flecken mit dem Film übereinstimmen und entsprechend angepasst werden.)
      5. Anfänglicher Schwellenwert: nicht festgelegt.
      6. Ansicht: HyperStack Displayer.
      7. Filter auf Spots setzen: nicht gesetzt.
      8. Tracker: Einfacher LAP-Tracker.
         HINWEIS: Diese hängen von der Bildrate und der Myosingeschwindigkeit ab und müssen groß genug sein, um nachfolgende Positionen zu verbinden und gleichzeitig unerwünschte Verbindungen zwischen verschiedenen Partikeln auszuschließen.
      9. Verbindungsentfernung: 1,0 Mikron.
      10. Lückenschließende maximale Entfernung: 1,0 Mikron.
      11. Lückenschließende maximale Rahmenlücke: 1.
      12. Legen Sie Filter für Spuren fest: Spurverschiebung (>0,39, um nur Spots einzuschließen, die sich mehr als 3 Pixel bewegen), Spots in Spuren (>3-nur Spuren mit mindestens 3 Spots einzubeziehen). Andere Filter wie Minimal Velocity können eingeführt werden, um Stellen auszuschließen, die für längere Zeit zum Stillstand kommen. Die Ergebnisse der Filterung müssen durch visuelle Inspektion von Spuren überprüft werden, um sicherzustellen, dass falsche Spuren (d. H. Myosinbewegung im Hintergrund, die sich nicht entlang einer Aktinspur befindet) entfernt werden, während die mit Aktin verbundenen Spuren beibehalten werden.
   5. Sobald der Bildschirm Anzeigeoptionen angezeigt wird, klicken Sie auf Analyse für die entsprechenden Ausgaben. Speichern Sie die drei erstellten Tabellen (Track Statistics, Links in Track Statistics und Spots in Track Statistics). Die Tabelle Track Statistics enthält die Geschwindigkeits- und Verschiebungsdaten, die anschließend analysiert werden können, um beispielsweise ein neuartiges Protein oder die Auswirkungen einer bestimmten experimentellen Bedingung zu charakterisieren.

Representative Results

Die Reinigung von Myosin kann durch die Durchführung der Reduktion der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE)-Gelelektrophorese wie in Abbildung 2gezeigt bewertet werden. Während diese Zahl das letzte, postdialysierte Myosin darstellt, kann SDS-PAGE an Aliquoten aus den verschiedenen Phasen des Reinigungsverfahrens durchgeführt werden, um alle Produkte zu identifizieren, die an den Überstand verloren gehen. Myosin 5a HMM hat ein Band im Bereich von 120-130 kDa und das nicht-muslimische Myosin 2b in voller Länge hat ein Band im Bereich von 200-230 kDa, entsprechend den schweren Ketten^29,44. Das Myosin 5a hat auch ein Band in der Nähe der 17 kDa-Marke, das Calmodulin markiert. Das nichtmuskuläre Myosin 2b hat ein Band von etwa 17 kDa, was den ELC bezeichnet. Da in diesem NM2b-Präparat ein GFP-markierter RLC vorhanden ist, erscheint der RLC bei etwa 47 kDa; Ein unbeschrifteter RLC ist jedoch bei ca. 20 kDa vorhanden, wenn er nicht mit einem GFP gekennzeichnet ist.

Der in Video 1 und Abbildung 3 gezeigte Gleitaktin-Filament-Assay stellt die Eigenschaften eines idealen und verfolgbaren Films dar. Dieser gleitende Aktinfilament-Assay zeichnet sich durch die reibungslose Bewegung von markierten Aktinfilamenten aus. Die schwarze Aktinwäsche sorgt dafür, dass die abgestorbenen Myosinköpfe aus dem Messfeld entfernt werden, was weiter zur insgesamt reibungslosen Bewegung der Aktinfilamente beiträgt. Die fluoreszierend markierten Filamente sind kurz genug, dass sich ein einzelnes Filament nicht auf sich selbst überkreuzt, was für das Tracking-Programm optimaler ist. Zu lange Aktinfilamente kreuzen andere Filamente, was dem Gleit-Actin-Filament-Assay-Tracking-Programm Schwierigkeiten bereiten kann. Dieses Problem kann vermieden werden, indem 10-20 Mal auf und ab pipettiert wird, um die Aktinfilamente vor dem Laden auf den Abdeckr zu scheren.

Im Fall von NM2b kann die Verwendung von Methylcellulose die Qualität der aufgenommenen Filme erheblich verbessern, da sie die Diffusion des Aktins von der Abbildungsoberfläche weg reduziert. Dies ist für M5a nicht notwendig, da sein höheres Tastverhältnis eine stärkere Befestigung des Aktins an der myosinbeschichteten Oberfläche ermöglicht. Wenn Methylcellulose verwendet wird, ist es notwendig, die Lösung durch die Kammer zu leiten, um sicherzustellen, dass die Lösung durchfließt. Wie in Video 2gezeigt, bleiben die Aktinfilamente nicht so eng mit der myosinbeschichteten Oberfläche verbunden, wenn alle anderen Bedingungen mit Ausnahme des Ausschlusses von Methylcellulose identisch sind.

Umgekehrt besteht das Ziel für den in Video 3 und Abbildung 4 gezeigten invertierten Motilitätstest darin, oberflächengebundene fluoreszierende Aktinfilamente einzuführen, an denen Myosinbewegungen beobachtet werden können. Eine wichtige Anforderung des invertierten Assays besteht darin, sicherzustellen, dass die Myosinbewegung im gesamten Sichtfeld konsistent beobachtet wird, wie gezeigt. Die Verwendung einer Mischung aus DTT, Glucose, Katalase und Glucoseoxidase kann das Photobleaching minimieren, um längere Messungen zu ermöglichen⁵². Wenn die Erfassungsrate für den Assay niedrig ist, kann das Ausschalten des Beleuchtungslichts zwischen den Aufnahmebildern bei übermäßigem Photobleaching helfen. Die Schalung des Anregungslichts kann über einen mechanischen Verschluss oder einen akustooptischen Abstimmfilter (AOTF) erfolgen.

Abbildung 1: Herstellung funktionalisierter Durchflusszellenkammern. (A) Beginnen Sie mit einem gereinigten Objektträger, zwei auf etwa 2 cm zugeschnittenen Doppelseitenbandstücken und einem funktionalisierten Abdeckbild. (B) Fügen Sie das Band in die Mitte des Objektträgers des Objektträgers hinzu. (C) Befestigen Sie den Abdecklappen mit der Beschichtung (d. h. Nitrocellulose) nach unten am Band und drücken Sie vorsichtig mit einer Kunststoffpipettenspitze auf die überlappenden Bereiche mit dem Band, um sicherzustellen, dass der Abdeckr an der Kammer haftet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von exprimiertem NM2b und M5a-HMM. (A) Ein repräsentatives SDS PAGE Gelbild für eine schwere NM2b-Kette in voller Länge (≈230 kDa) und GFP-RLC (≈47 kDa) und ELC (≈17 kDa). Gelbild reproduziert und modifiziert von Melli et al. (2018)²⁹. (B) Ein repräsentatives SDS PAGE Gelbild für eine M5a-HMM-ähnliche schwere Kette (≈120 kDa) und Calmodulin (≈17 kDa). Beachten Sie, dass das Gel in diesem Bild keinen GFP in das C-Terminal-Ende eingeführt hat. Ein in die Myosin-Schwerekette eingesetzter GFP erhöht das Molekulargewicht um ≈27 kDa. Das reproduzierte und modifizierte Gelbild wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry⁴⁴veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ergebnisse desGleit-Aktin-Filament-Assays, die über TIRF-Beleuchtung erfasst wurden. (A) Beispielbild aus einem Film, der die Translokation von Rhodamin-Phalloidin-markierten Aktinfilamenten (in rot) auf 0,2 μM NM2b in Gegenwart von 0,7% Methylcellulose bei 30 °C zeigt. Maßstabsleiste = 10 μm. (B) Filament-Tracking-Bildausgabe aus dem FASTrack-Programm für NM2b für das gleiche Sichtfeld wie in (A) Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Repräsentatives Histogramm der Gleitgeschwindigkeit von Acto-NM2b, das zeigt, dass diese Probe von NM2b eine Aktin-Gleitgeschwindigkeit von 77 ± 15 nm/s erzeugen kann (mittlere ± Standardabweichung; Anzahl der Spuren = 550). (D) Beispielbild aus einem Film, der die Translokation von Rhodamin-Phalloidin-markierten Aktinfilamenten (in rot) auf 75 nM M5a-HMM zeigt. Maßstabsleiste = 10 μm. (E) Filament-Tracking-Bildausgabe durch das FASTrack-Programm für M5a-HMM für das gleiche Sichtfeld wie in (D) Maßstabsbalken = 10 μm. (F) Ein repräsentatives Histogramm der Gleitgeschwindigkeit von acto-M5a-HMM, das zeigt, dass diese Probe von M5a eine Aktin-Gleitgeschwindigkeit von 515 ± 165 nm/s erzeugen kann (mittlere ± Standardabweichung; Anzahl der Spuren = 25098). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Invertierte Assay-Ergebnisse, die über TIRF-Beleuchtung erfasst wurden. (A) Ein repräsentatives Sichtfeld aus einem zweikanaligen zusammengeführten Bildstapel, das die Bewegung von NM2b-Filamenten (grün dargestellt) auf biotinylierten Aktinfilamenten zeigt, die mit AF647-Phalloidin (blau markiert) bei 30 °C markiert sind. Polymerisierte Filamente aus rekombinant exprimiertem und gereinigtem NM2b, die mit ELC und GFP-RLC co-exprimiert werden, werden als grüne, längliche Partikel im FOV beobachtet. Skalenbalken = 10 μm. (B) Repräsentatives Histogramm der Geschwindigkeit von NM2b-Filamenten. Die Analyse wurde mit der in der Materialtabelle beschriebenenBildanalysesoftware durchgeführt. Einzelne NM2b-Filamente haben eine Geschwindigkeit von 84 ± 22 nm/s (mittlere ± Standardabweichung; Anzahl der verfolgten Partikel = 133), wenn sie sich entlang einzelner Aktinfilamente bewegen. (C) Beispiel Kymograph der NM2b-Filamentbewegung entlang eines einzelnen Aktinfilaments. Beachten Sie, dass einige der Bereiche des Partikels eine "Rotation" des NM2b-Filaments entlang des Aktinfilaments zeigen, was höchstwahrscheinlich den Zeitpunkt darstellt, zu dem sich eine Seite des bipolaren NM2b-Filaments vom Aktinfilament löst, wie zuvor in Melli et al.²⁹gezeigt. (D) Ein repräsentatives Sichtfeld der Einzelmolekülbewegung M5a-HMM (grün dargestellt) auf biotinylierten Aktinfilamenten, die mit Rhodamin-Phalloidin markiert sind (rot dargestellt). Skalenbalken = 10 μm. (E) Repräsentatives Histogramm der Lauflänge von M5a-HMM, passend zu einem einzelnen Exponential. Die Analyse wurde mit der in der Materialliste beschriebenenBildanalysesoftware durchgeführt. Die charakteristische Lauflänge beträgt 1,3 μm mit einem 95%-Konfidenzintervall von 1,23-1,42 μm in diesem Beispiel. (F) Repräsentatives Histogramm der einzelmolekularen M5a-HMM-Geschwindigkeit auf einzelnen Aktinfilamenten. Die analysierten Daten aus der Bildanalyse zeigen eine mittlere Geschwindigkeit von 668 ± 258 nm/s (mittlere ± Standardabweichung; Anzahl der verfolgten Partikel = 684). (G) Beispiel Kymograph einzelner Moleküle der M5a-HMM-Bewegung entlang eines einzelnen Aktinfilaments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Vergleich von NM2b und M5a-HMM Gleitaktinfilament Assay. Der NM2b-Gleitaktinfilament-Assay wurde in Gegenwart von Methylcellulose (links; Videopanel A) und M5a-HMM in Abwesenheit von Methylcellulose (rechts; Videopanel B) bei 30 °C durchgeführt. Beachten Sie, dass der Zeitstempel im NM2b-Videopanel im Vergleich zum M5a-HMM-Videopanel schneller voranschreitet, um die Bewegung der rhodaminmarkierten Aktinfilamente (rot) anzuzeigen, die ungefähr gleich ist. Dies liegt daran, dass die tatsächliche Aktintranslokationsgeschwindigkeit von NM2b fast 7-mal langsamer ist als die für M5a-HMM (77 nm / s gegenüber 515 nm / s, extrahiert aus dem Gaußschen Peak, der zum Histogramm in Abbildung 3passt). Maßstabsleiste = 10 μm in beiden Videopanels. NM2b-Daten, die mit 0,33 Bildern pro Sekunde bei 200 ms Belichtung erfasst wurden. M5a-HMM-Daten, die mit 5 Bildern pro Sekunde mit 200 ms Belichtung (kontinuierlich) erfasst und anschließend auf 1 Bild pro Sekunde herunterbesamt wurden. Zeitstempel wurden mit dem in der Materialliste beschriebenenPlugin hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Gleitaktinfilament-Assay von NM2b in Abwesenheit von Methylcellulose. Wenn alle anderen Bedingungen mit Ausnahme des Fehlens von Methylcellulose gleich sind, haften die Aktinfilamente manchmal nicht gut an dem mit 0,2 μM NM2b beschichteten Decklip, was zu Filmen von geringerer Qualität mit Aktinfilamenten führt, die nahe an der Oberfläche des NM2b-beschichteten Decklips "floppen". Maßstabsleiste = 10 μm. Dies kann durch Einbringen von Methylcellulose behoben werden, um die glatte Bewegung der Aktinfilamente zu zeigen, wie im linken Videobereich von Video 1 (NM2b gliding actin filament assay) gezeigt. Eine weitere Alternative besteht darin, die NM2b-Konzentration auf ≈1 μM zu erhöhen. Dieser Film wurde mit 0,33 Bildern pro Sekunde bei 200 ms Belichtung aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Vergleich des invertierten Motilitätstests NM2b und M5a-HMM. Der NM2b invertierte Motilitätstest wurde in Gegenwart von Methylcellulose durchgeführt und mit einer Rate von 0,33 Bildern pro Sekunde unter Verwendung eines Verschlusses (links; Videopanel A) aufgezeichnet, Videopanel C zeigt das gleiche Sichtfeld wie A, aber mit Partikeln werden mit Bildanalysesoftware identifiziert und verfolgt. In ähnlicher Weise wurde der invertierte Motilitätstest für M5a-HMM in Abwesenheit von Methylcellulose mit einer Rate von 5 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet (rechts; Videopanel B). Videopanel D zeigt das gleiche Sichtfeld wie B, jedoch mit Partikeln, die mit Bildanalysesoftware identifiziert und verfolgt werden. Maßstabsbalken = 10 μm in allen Videopanels. Die beiden Laser wurden mit einer einzigen Kamera zur Erfassung hin und her geschaltet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Puffername	Zusammensetzung	Verwendete(s) Schritt(e)	Kommentare
M5a Extraktionspuffer	0,3 M NaCl	1.1	Bleibe auf Eis.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
NM2b Extraktionspuffer	0,5 M NaCl	1.1	Bleibe auf Eis.
	15 mM MOPS, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Puffer A	0,5 M NaCl	2.2	Bleibe auf Eis.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM ATP
	1 mM DTT
	5 mM MgCl2
Puffer B	0,5 M NaCl	2.3	Bleibe auf Eis.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
Elutionspuffer	0,5 M NaCl	3.1	Bleibe auf Eis.
	0,5 mg/ml FLAG Peptid
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7,2
M5a Dialysepuffer	500 mM KCl	4.1	Verwenden Sie kalte dH2O, um die Lautstärke zu senken.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
NM2b Dialysepuffer	25 mM NaCl	4.1	Verwenden Sie kalte dH2O, um die Lautstärke zu senken.
	10 mM MgCl2
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
NM2b Speicherpuffer	0,5 M NaCl	5.1	Bleibe auf Eis.
	10 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3

Tabelle 1: Puffer, die bei der Proteinreinigung verwendet werden.

Puffername	Zusammensetzung (M5a)	Zusammensetzung (NM2b)	Verwendete(s) Schritt(e) (M5a/NM2b)	Kommentare
4X Motilitätspuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH-Wert 7,4	pH-Wert 7,4
50 mM Salzmotilitätspuffer (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O	Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O
500 mM Salzmotilitätspuffer (500 mM MB)	Nicht/A	25% v/v 4X MB		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
		500 mM NaCl
		Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O
Myosin	0,05-0,1 μM Myosin	0,2 μM Myosin	4.2/5.2	Bleibe auf Eis.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 500 mM MB
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	1 mg/ml BSA	4.3/5.3	Bleibe auf Eis.
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 500 mM MB
	1 mM DTT	1 mM DTT
5 μM Unmarkiertes F-Aktin in 50 mM MB (schwarzes Aktin)	5 μM unmarkiertes F-Aktin	5 μM unmarkiertes F-Aktin	4.5/5.5	Bleibe auf Eis. Scheren Sie Aktin durch Pipettieren 5-10 Mal auf und ab oder durch Verwenden einer Spritze.
	1 μM Calmodulin (CaM)	1 mM ATP
	1 mM ATP	0,2 mM CaCl2
	Verdünnt in 50 mM MB	1 μM CaM
		1–10 nM Myosin-Leichtkettenkinase (MLCK)
		Verdünnt in 50 mM MB
MB mit 1 mM DTT und 1 mM ATP	1 mM DTT	1 mM DTT	4.6/5.6	Bleibe auf Eis.
	1 mM ATP	1 mM ATP
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 50 mM MB
MB mit DTT	1 mM DTT	1 mM DTT	4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9	Bleibe auf Eis.
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 50 mM MB
20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Actin (Rh-Actin)	20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Aktin	20 nM Rhodamin-Phalloidin F-Aktin	4.8/5.8	Bleibe auf Eis. Keinen Wirbel machen.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 50 mM MB
Letzter Puffer	50 mM KCl	0,7% Methylcellulose (optional)	4.10/5.10	Fügen Sie die Glukose, Glukoseoxidase und Katalase unmittelbar vor der Durchführung des Experiments hinzu. Bleibe auf Eis.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μM Calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/ml Glukose	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml Glucoseoxidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml Katalase	1 μM Calmodulin
		2,5 mg/ml Glukose
		100 μg/ml Glucoseoxidase
		40 μg/ml Katalase

Tabelle 2: Puffer, die bei Gleittests verwendet werden.

Puffername	Zusammensetzung (M5a)	Zusammensetzung (NM2b)	Verwendete(s) Schritt(e) (M5a/NM2b)	Kommentare
4X Motilitätspuffer (4X MB)	80 mM MOPS, pH 7,2	80 mM MOPS, pH 7,2		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH-Wert 7,4	pH-Wert 7,4
50 mM SalzMotilitätspuffer (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O	Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O
150 mM Salzmotilitätspuffer (150 mM MB)		25% v/v 4X MB		Vakuumfilter und Lagerung bei 4°C
		150 mM NaCl
		Erhöhung auf Lautstärke mit dH2O
Myosin		30 nM Myosin	Siehe Rezept "Final Buffer"/4.12	Bleibe auf Eis.
		1 mM DTT
		Verdünnt in 150 mM MB
2 mg/ml NeutrAvidin	2 mg/ml NeutrAvidin	2 mg/ml NeutrAvidin	3.5/4.8	Bleibe auf Eis.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 150 mM MB
1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)	1 mg/ml BSA	1 mg/ml BSA	3.3/4.6	Bleibe auf Eis.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 150 mM MB
200 nM Rhodamin-Phalloidin biotinyliertes F-Actin (bRh-Actin)	200 nM Rhodamin-Phalloidin biotinyliertes F-Aktin	200 nM Rhodamin-Phalloidin biotinyliertes F-Aktin	3.7/4.10	Vermeiden Sie Scheren, indem Sie nicht auf und ab wirbeln oder pipettieren. Zum Mischen vorsichtig umkehren.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 150 mM MB
MB mit DTT	50 mM DTT	50 mM DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13	Bleibe auf Eis.
	Verdünnt in 50 mM MB	Verdünnt in 150 mM MB
Letzter Puffer	50 mM KCl	0,7% Methylcellulose (optional)	3.9/4.14	Fügen Sie die Glukose, Glukoseoxidase und Katalase unmittelbar vor der Durchführung des Experiments hinzu. Bleibe auf Eis.
	20 mM MOPS, pH 7,2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	20 mM MOPS, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM ATP	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	1 mM ATP
	1 μM Calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/ml Glukose	1–10 nM MLCK
	100 μg/ml Glucoseoxidase	0,2 mM CaCl2
	40 μg/ml Katalase	1 μM Calmodulin
	10 nM Myosin	2,5 mg/ml Glukose
		100 μg/ml Glucoseoxidase
		40 μg/ml Katalase

Tabelle 3: Im TIRF-Assay verwendete Puffer.

Discussion

Hier wird ein Workflow zur Aufreinigung und In-vitro-Charakterisierung von Myosin 5a und nichtmuskleärem Myosin 2b vorgestellt. Diese Reihe von Experimenten ist nützlich, um die mechanochemischen Eigenschaften von gereinigten Myosinkonstrukten schnell und reproduzierbar zu quantifizieren. Obwohl die beiden hier gezeigten Myosine nur zwei konkrete Beispiele aus den vielen Möglichkeiten sind, können die Bedingungen und Techniken mit etwas Schneiderei auf die meisten Myosine und auf viele andere Motorproteine angewendet werden.

Die hier besprochenen Protokolle unterliegen Je nach den individuellen Bedürfnissen des Labors und der Experimente Variationen. Wie beispielsweise im Abschnitt Expression und Molekularbiologie erörtert, wurden die in diesem Artikel verwendeten Proteine aus einer Koinfektion von zwei oder mehr Viren erzeugt; eine erfolgreiche Proteinexpression kann aber auch mit Multiexpressionsvektoren wie dem p-FastBac Dual Expression Vector oder dem BiGBac Expression System⁵³erreicht werden.

Mehrere Faktoren können die erfolgreiche Produktion des rekombinanten Proteins behindern. Um den Proteinabbau zu verhindern, ist es unerlässlich, dass jeder Schritt der Proteinreinigung bei der entsprechenden Temperatur abgeschlossen wird, wobei alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C und alle anderen Schritte auf Eis durchgeführt werden. Überschüssige Bänder können im Gel des dialysierten Proteinprodukts sichtbar sein. Dies könnte auf einen Abbau oder eine Kontamination hinweisen. Die anschließende Reinigung durch Größenausschluss oder Ionenaustauschchromatographie kann die Reinheit der Proben erhöhen⁵⁴. Zu diesem Zweck wird empfohlen, bei jedem Schritt des Proteinreinigungsprozesses Aliquoten für die Fehlerbehebung zu speichern, sollte es zu einer geringen Ausbeute an Myosin oder verdacht auf Proteinkontamination kommt. Manchmal kann es in Schritt 1.8 zu einer unzureichenden Bindung des Lysats an das Harz kommen, was bei nachfolgenden Zentrifugationen zum Verlust des Myosins an den Überstand führen kann. Dies kann behoben werden, indem die Dauer der Harzbindung während dieses Schritts variiert wird, wobei sie bei Bedarf sogar über Nacht gebunden wird. Längere Inkubationszeiten führen zu einem höheren Risiko des Proteinabbaus, wenn kontaminantische Proteasen nicht ausreichend gehemmt werden und Myosine mit proteolytisch empfindlichen Regionen beeinträchtigt werden. Darüber hinaus kann unsachgemäßes Waschen des Harzes sowohl vor als auch nach dem Gebrauch zur Elution eines unerwünschten Proteinprodukts führen, so dass es unerlässlich ist, dass die richtigen Protokolle vor und nach der Verwendung des FLAG-affinen Harzes befolgt werden. Wird das Harz unmittelbar nach Gebrauch gewaschen und sachgerecht gelagert, kann es bis zu 20 Mal wiederverwendet werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass der Proteinabbau auch während der Expressionsphase stattfindet und eine Verkürzung der Expressionszeiten in Bezug auf den Abbau vorteilhaft sein kann, obwohl dies auf Kosten der Gesamtausbeute gehen kann. Die Einhaltung der hier beschriebenen Verfahren zur Überwachung der Proteinprobe in verschiedenen Stadien des Protokolls (d. H. Vor, während und nach der Reinigung) hilft, die für die Optimierung erforderlichen Phasen zu bestimmen. Bei Myosinen, die sich wiederholt einer erfolgreichen Expression und Reinigung widersetzen, können häufige Probleme die Koexpression mit unzureichenden oder ungeeigneten Lichterketten sowie eine unsachgemäße Faltung während des Überexpressions sein. Geeignete Leichtketten müssen nach Möglichkeit auf der Grundlage bekannter Wechselwirkungen ausgewählt werden, und das Verhältnis von Schwerketten zu Leichtketten-Baculovirus muss in kleinen Experimenten getestet werden, um das Optimum zu bestimmen. Bei Myosinen, die wenig oder kein lösliches aktives Produkt aggregieren oder liefern, kann die Co-Expression mit Chaperonen bei der erfolgreichen Gewinnung von aktivem Protein^54,55helfen.

Gereinigte Myosinprodukte enthalten unweigerlich eine kleine Population von beschädigtem Myosin, die als "tote Köpfe" bezeichnet werden, die auf zwei Arten angesprochen werden können. Eine Methode, die in diesem Protokoll beschrieben wird, beinhaltet das Fließen von unbeschriftetem oder "schwarzem" Aktin durch die Kammer im Gleit-Aktin-Filament-Assay. Anschließendes Waschen mit ATP führt dazu, dass sich funktionelle Myosine vom schwarzen Aktin dissoziieren, während tote Köpfe aufgrund ihrer Unfähigkeit, ATP zu hydrolysieren, und aufgrund ihrer hohen Affinität an dieses unmarkierte Aktin gebunden bleiben. Während der Durchführung der schwarzen Aktinwäsche kann eine Spritze verwendet werden, um das Aktin effektiv zu scheren. Eine zusätzliche Scherung kann durch Wirbeln erfolgen, vorausgesetzt, dass die entstehenden Blasen durch Zentrifugation entfernt werden. Eine alternative Methode besteht darin, die toten Köpfe aus der Myosinprobe selektiv zu pelletieren, indem Myosin mit F-Aktin und Mg-ATP bei hohen Salzkonzentrationen (0,5 M) gemischt und in einer Tisch-Ultrazentrifuge sedimentiert wird. Die Myosine, die atP unter diesen Bedingungen hydrolysieren können, bleiben aufgrund ihrer geringen Affinität zu Aktin unter diesen hohen Salzbedingungen nicht an das Aktin gebunden und befinden sich im Überstand, während die Myosin-Totköpfe an das Aktin im Pellet⁵⁶gebunden bleiben. In ähnlicher Weise kann eine Sedimentation mit Aktin und Resuspension des Pellets auch verwendet werden, um Myosine zu entfernen, die in Abwesenheit von ATP nicht in der Lage sind, sich an Aktin zu binden. Beachten Sie, dass ein kleiner Teil dieser Art von toten Köpfen weniger Einfluss auf diese Art von Assays hat. Durch eine nukleotidfreie Sedimentation und Resuspension, gefolgt von einer ATP-gebundenen Zentrifugation und Resuspension, können Myosine, die sowohl für die Aktinbindung als auch für die ATP-abhängige Freisetzung aus Aktin geeignet sind, isoliert werden.

Motilitätstests können auch auf verschiedene Arten modifiziert werden. Zum Beispiel wird im Gleitaktinfilament-Assay für das NM2b das NM2b in der Kammer durch Zugabe von MLCK, Calmodulin, Calcium und ATP im schwarzen Aktinschritt sowie im Endpuffer phosphoryliert. Das NM2b kann jedoch auch in einem Röhrchen phosphoryliert werden, bevor der Assay durchgeführt wird. Auf diese Weise kann der Prozentsatz des phosphorylierten NM2b quantifiziert werden, indem ein natives Gel mit einem harnstoffhaltigen Probenpuffer ausgeführt oder eine Massenspektrometrie^57,58ausgeführt wird. Der Einfluss der Temperatur auf die Myosinaktivität kann ebenfalls untersucht werden. Dies kann durch den Einsatz eines Objektivheizsystems am Mikroskop oder eines Umgebungsgehäuses erreicht werden, so dass die Durchflusszelle auf konstanter Temperatur gehalten wird. Die Ionenstärke ist eine weitere wichtige Überlegung. Für viele Myosine werden die Aktinaffinität und die enzymatische Aktivität bei geringerer Ionenstärke erhöht; für andere ist eine höhere Ionenstärke notwendig⁵⁹. Neben der Bereitstellung wertvoller Informationen über den Myosinmechanismus kann die Senkung der Ionenstärke die Motilität verbessern und Myosin für die Untersuchung mit vielen Assays zugänglicher machen. Im Gegensatz dazu zeigen einige Motoren elektrostatische Anbindeeffekte, die die Motilität bei niedrigeren Ionenstärken verlangsamen. Schließlich ist es bei der Untersuchung der Bewegung von NM2b-Filamenten entscheidend, die Ionenstärke in einem engen Bereich (150-200 mM Ionenstärke) zu halten, der sich denen der meisten Zelltypen annähert. Die Verwendung niedrigerer Ionenstärken führt zu einer Aggregation der Myosinfilamente, während die Filamente bei höheren Ionenstärken depolymerisieren.

Bei vielen Myosinen, insbesondere solchen mit niedrigen Tastverhältnissen, würden die für M5a angegebenen Bedingungen des Endpuffers dazu führen, dass die fluoreszierend markierten Aktinfilamente nur lose an die Oberfläche gebunden oder ganz dissoziieren. Dies führt zu unregelmäßigen Bewegungen, die die Quantifizierung erschweren. Eine bessere Bewegungsqualität kann oft mit Methylcellulose (0,7%) im Endpuffer erreicht werden. Methylcellulose ist ein viskoses Überfüllungsmittel und zwingt Aktinfilamente, nahe an der Oberfläche zu bleiben, auch wenn die Dichte der angeschlossenen Myosinmotoren spärlich ist⁶⁰. In ähnlicher Weise wurde beobachtet, dass die Aufnahme von Methylcellulose in den endpuffer des Einzelfilament-Motilitätstests notwendig ist, um die Bewegung mit NM2a zu beobachten, und das gleiche Phänomen wurde für glatte Muskel-Myosin-Filamente^{berichtet 29,61}. Dies erhöht auch die Prozessfähigkeit von NM2b-Filamenten. Eine potenziell unerwünschte Nebenwirkung der Verwendung von Methylcellulose in diesem Assay ist, dass die Eigenschaften des Crowding-Agenten die laterale Assoziation von Myosinfilamenten zu Bündeln fördern können. Alternativen zu Methylcellulose bei der Behebung von Bewegungsmangel oder lose gebundenen Aktinfilamenten im Gleit-Aktin-Filament-Assay sind die Senkung der Salzkonzentration in den Motilitätspuffern oder die Erhöhung der Myosinoberflächendichte. Wie oben erwähnt, wurde gezeigt, dass eine hohe Ionenstärke in den Motilitätspuffern die Fähigkeit einiger Myosine senkt, an Aktin^29,34,62zu binden .

Eine weitere Variante des Gleitaktinfilament-Assays ist die Verwendung von Antikörpern, um das Myosin auf dem Glasdeckel zu verankern. Wenn beispielsweise ein GFP am C-terminalen Ende des Myosinkonstrukts vorhanden ist, kann ein Anti-GFP-Antikörper verwendet werden, um das GFP-Myosin an der^{Abdeckungslip 36,63,64}zu fixieren. Dies kann dazu beitragen, eine erfolgreiche Motilität in Situationen zu erreichen, in denen die Geometrie des Systems andernfalls die Aktintranslokation behindern kann, z. B. bei der Prüfung künstlicher oder kurzer Hebelarme^54,64. Zusätzlich kann der Einfluss der Belastung auf die Translokationsgeschwindigkeiten im gleitenden Aktinfilament-Assay unter Verwendung von Aktin-bindenden Proteinen wie α-Actinin oder Utrophin^39,50,65untersucht werden. Eine solche Messung kann nützlich sein, um die Wirkung der Belastung auf ein Ensemble von Myosinen mit der lastabhängigen Kinetik eines einzelnen Myosins zu vergleichen, die mit einem optischen Fangassay^66,67gemessen werden kann. Dies kann erreicht werden, indem im ersten Schritt zunehmende Mengen eines Aktin-bindenden Proteins zusammen mit dem Myosin hinzugefügt werden. Das Aktin-bindende Protein bindet an die Oberfläche und übt eine Reibungsbelastung auf die Aktinfilamente aus, die von Myosinen bewegt werden, was zu einer abgestuften Geschwindigkeit führt, wenn die Konzentration des Aktin-bindenden Proteins auf der Oberfläche erhöht wird³⁹.

Der Einzelmolekül-/Ensemble-Motilitätstest kann auch angepasst werden, um die Wirkung verschiedener Aktinstrukturen auf die Myosinbewegung zu untersuchen. Anstatt beispielsweise die Myosinbewegung auf einzelnen Aktinfilamenten zu beobachten, können Fascin- oder α-Actinin-vermittelte Aktinbündel als In-vitro-Rekonstitution des Aktinfilamentnetzwerks in zellen^68,69untersucht werden. Die Wirkung von Aktin-bindenden Proteinen wie Tropomyosin kann auch untersucht werden^65,70,71,72.

Bemerkenswert ist die Vielseitigkeit bei der Auswahl eines Labels für den Einzelmolekül-/Ensemble-Motilitätsassay. In diesem Bericht wurde sowohl auf dem M5a-HMM als auch auf dem NM2b ein GFP-Label verwendet; Es können jedoch viele andere Etiketten verwendet werden. Beispiele sind HaloTag oder SNAP-Tag, die genetisch mit dem Myosin verschmolzen werden können und kovalent einen synthetischen Farbstoff binden. Der Vorteil der HaloTag-Technologie liegt in ihrer Vielseitigkeit für mehrere experimentelle Anpassungen, wie z.B. die Kennzeichnung mit verschiedenen Farben oder das Hinzufügen eines Biotin-Affinitäts-Tags^29,73. Darüber hinaus kann die Verwendung der Quantenpunkttechnologie verwendet werden, um die Auflösung der Einzelmolekül-Fluoreszenzverfolgung zu verbessern, was auch die Begrenzung der geringen Helligkeit von GFP und die Tendenz zum Photobleaching⁷⁴anspricht. Tags können erfolgreich an leichten Ketten sowie der schweren Kette^11,75,76befestigt werden.

Um den Erfolg im Einzelmolekül-TIRF-Motilitätstest zu erzielen, ist die Verwendung einer gut blockierten und funktionalisierten Oberfläche ein Schlüsselfaktor. Eine einfache Methode, um eine moderate Blockierung zu erreichen, ist die Verwendung von biotinyliertem BSA, das an eine Nitrocelluloseoberfläche gebunden ist. Obwohl dies gut genug funktioniert, um viele Motoren, einschließlich M5a, zu charakterisieren, ist der Grad der unspezifischen Bindung auf einer solchen Oberfläche für die Reproduktion sauberer Bewegungen mit Proben wie NM2b unerschwinglich. Ein wichtiger Durchbruch in dieser Hinsicht war der Übergang zu PEGylierten Oberflächen, die zur Funktionalisierung mit Biotin-PEG dotiert sind⁷⁷. Die PEG-Oberflächen bieten ein weit überlegenes Maß an Oberflächenblockierung und eine fehlerfreie PEGylatierte Oberfläche kann über sehr lange Zeiträume frei von unspezifischer Bindung bleiben. Das hier beschriebene spezifische Protokoll ermöglicht die Herstellung von biotinylierten PEG-Oberflächen in wenigen Stunden und bei sofortiger Lagerung wie beschrieben können die Oberflächen mehrere Wochen mit nur geringfügigem Qualitätsverlust verwendet werden.

Eine wichtige Überlegung vor dem Sammeln von Daten für das Tracking ist die Erfassungsbildrate. Die Bewegung zwischen nachfolgenden Frames muss groß genug sein, um Überstichprobenfehler zu vermeiden. Hohe Abtastraten führen aufgrund der Aufteilung der Lokalisierungsfehler durch ein kleines Zeitintervall zu überschätzten Geschwindigkeiten und erhöhen den scheinbaren Fehler der Messung. In Fällen, in denen die Rohdaten zu fein abgetastet werden, können die Daten heruntersampelt werden, indem jeder N-ten Frame genommen wird, um einen neuen Stack zu erstellen, und die daraus resultierende Änderung der Bildrate berücksichtigt wird. Subpixelbewegungen zwischen Frames müssen vermieden werden und Bewegungen von mehreren hundert Nanometern sind erforderlich, um genaue Werte zu erhalten. In allen Fällen, in denen eine neue Probe charakterisiert wird, müssen die durch die automatisierte Analyse generierten Ergebnisse aus Konsistenzgründen mit einem kleinen Datensatz manuell verfolgter Filamente verglichen werden.

Bei der Analyse von Daten aus Einzelmolekül-Motilitätsexperimenten muss bei der Auswahl der zu messenden Parameter, der Filterung von Daten und der Anpassung von Daten darauf geachtet werden. Wie oben erwähnt, kann die Abtastrate ein wichtiger Faktor bei der Analyse von Geschwindigkeitsdaten sein. Für viele Myosine sind prozessive Läufe kurz und durch eine gerade Linie gut angenähert. In solchen Fällen kann die Start-Endpunkt-Entfernung der Strecke ein gutes Maß für die Lauflänge liefern, die durch die Dauer der Strecke geteilt werden kann, um eine gute Schätzung der Geschwindigkeit zu erhalten. In Fällen, in denen die Spuren sehr lang sind und gekrümmten Pfaden um gebogene Filamente folgen, liefert diese Art der Analyse ungenaue Ergebnisse und eine zurückgelegte Gesamtstrecke muss verwendet werden, wobei eine Erfassungsrate verwendet werden muss, die es ermöglicht, dass aufeinanderfolgende Lokalisierungspunkte ausreichend gut verteilt sind, um Überstichprobenfehler wie oben beschrieben zu vermeiden, während sie nahe genug beieinander liegen, dass der gerade Linienabstand zwischen ihnen eine gute Annäherung an die Kurve zwischen diesen Punkten bleibt. Darüber hinaus müssen für Motorproteine mit langen Laufzeitlängen im Verhältnis zur Streckenlänge bei der Berechnung der Lauflängen⁷⁸zusätzliche Statistiken wie der Kaplan-Meier-Schätzwert erstellt werden. Gleiches gilt für Situationen, in denen photobleaching vor dem Ende eines Prozesslaufs hinreichend wahrscheinlich ist. Ein weiteres Phänomen, das in Einzelmolekül-Fluoreszenzstudien beobachtet werden kann, ist das Photoblinking, bei dem Fluorophore schnell zwischen dem Ein- und Aus-Zustand wechseln und zu blinzeln scheinen. Dies tritt bei diesen Motilitätsexperimenten typischerweise nicht auf; Wenn dies jedoch der Fall ist, können die Laserintensität und die Belichtungszeiten verringert werden, was den Effekt minimieren sollte. Mehrere Chemikalien, darunter β-Mercaptoethanol, Trolox, Cyclooctateraen, n-Propylgallat, 4-Nitrobenzylalkohol und 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan können verwendet werden, um dies ebenso zu mildern⁷⁹.

Zusammenfassend werden in diesem Artikel detaillierte Protokolle beschrieben, die in ihrer Fähigkeit zur Quantifizierung mechanochemischer Eigenschaften wie Aktintranslokationsgeschwindigkeit, Myosintranslokationsgeschwindigkeit und Myosinlauflänge robust sind. Diese Assays sind reproduzierbar und können verwendet werden, um die Qualität des gereinigten Myosins auch in Situationen zu bestimmen, in denen die beweglichen Eigenschaften nicht das spezifische Endziel der Studie sind. Darüber hinaus können Veränderungen wie pH-Wert, Temperatur und chemische Regulatoren in diese Assays eingeführt werden, um zu untersuchen, wie die Mechanochemie des untersuchten Myosins beeinflusst wird. Zusammengenommen können die Aktin-Gleit- und Inverted-Motility-Assays ein besseres Verständnis des Myosin-Ensemble-Verhaltens und der intermolekularen Variationen in der molekularen Motormechanik und Kinetik ermöglichen. Die hier beschriebenen fluoreszenzmikroskopischen Assays unterstützen den Ansatz eines Reduktionisten in der Zytoskelettforschung und können ein leistungsfähiges Werkzeug sein, um die Protein-Protein-Dynamik in vitro zu verstehen. Zusammen können Daten aus diesen hochkontrollierten Experimenten verwendet werden, um Mechanoobiologen über wichtige Actomyosin-Verhaltensweisen zu informieren, die auf zellbiologischer Ebene und darüber hinaus relevant sein können.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309628
2 M CaCl2 Solution	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solution	VWR	10128-298
27 Gauge Needle	Becton Dickinson	309623
5 M NaCl Solution	KD Medical	RGE-3270
Acetic Acid	ThermoFisher Scientific	984303
Amyl Acetate	Ladd Research Industries	10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinylated G-Actin	Cytoskeleton, Inc.	AB07
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
bPEG-silane	Laysan Bio, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Catalase	Millipore Sigma	C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay	Millipore Sigma	WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets	Millipore Sigma	5056489001	This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C.
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay	VWR International	48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay	Azer Scientific	ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol	Fischer Scientific	A4094
G-actin		PMID: 4254541	G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose	Millipore Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Large-Orifice Pipet Tips	Fischer Scientific	02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Unstained Standard Ladder	ThermoFisher Scientific	LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Methylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Microscope Slides	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silane	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase		PMID: 23148220	FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocellulose	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.
Razor Blades	Office Depot	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay	Corning	353025	Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay	Corning	353003	Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box	Tokai HIT	Custom Thermobox
Microscope Laser Unit	Nikon	LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Model: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)	Qsonica	4418
Standard Incubator	Binder	Model: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (AR package)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	File:TrackMate-manual.pdf
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md