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Biochemistry

체외 형광 현미경 검사법 기반 운동성 검사의 Myosin 특이적 적응

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.

Abstract

Myosin 단백질 결합 하 고 필라멘트 액 틴 (F-actin)와 상호 작용 하 고 phylogenetic 나무를 통해 유기 체에서 발견 된다. 그들의 구조와 효소 특성은 셀에서 실행하는 특정 기능에 맞게 조정됩니다. Myosin 5a 는 세포에서 멜라노솜과 소포를 수송하기 위해 F-actin을 가공적으로 걷습니다. 반대로, 비근육 미오신 2b는 약 30개의 분자를 포함하는 양극성 필라멘트로 작동합니다. 그것은 근신 분자가 액틴을 결합하고, 파워 스트로크를 부여하고, 주기를 반복하기 전에 해리하기 위해 비동기적으로 작동하는 필라멘트의 중심으로 반대 극성의 F-actin을 이동합니다. 비근육 근신 2b는 다른 비근육 근신 2 동종포형태와 함께 세포 접착, 세포키네시스 및 장력 유지를 포함하는 역할을 합니다. 미신의 메카노케미케는 정제된 단백질을 사용하여 체외 운동성 작용을 수행하여 연구할 수 있습니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서, myosins는 현미경 커버슬립 표면에 묶여 있고 형광으로 표지된 F-actin을 변환합니다, 이는 추적될 수 있습니다. 단일 분자/앙상블 운동성 분석에서, 그러나, F-actin은 F-actin에 형광표지 된 미신 분자의 커버슬립 및 운동에 결합된다. 본 보고서에서, 친화성 크로마토그래피를 이용한 Sf9 세포로부터의 재조합 묘신 5a의 정제가 설명되어 있다. 이 다음, 우리는 두 형광 현미경 기반 분석법을 설명합니다: 글라이딩 액틴 필라멘트 분석및 반전된 운동성 분석. 이러한 분석에서 액틴 전좌 속도 및 단일 분자 실행 길이 및 속도와 같은 매개 변수는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추출될 수 있다. 이러한 기술은 또한 비근육 근신 2 동종의 단일 필라멘트의 움직임을 연구하기 위해 적용될 수 있으며, 비근육 근신 2b의 맥락에서 본원에 논의된다. 이 워크플로우는 비근육 myosins의 단일 분자 및 앙상블 역학을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 및 정량적 도구 집합을 나타냅니다.

Introduction

묘신은 아데노신 삼위산염(ATP) 가수분해1에서유래한 에너지를 이용하여 액틴 필라멘트에 힘을 발휘하는 모터 단백질이다. 미신에는 머리, 목 및 꼬리 도메인이 포함되어 있습니다. 헤드 도메인에는 액틴 결합 영역뿐만 아니라 ATP 바인딩 및 가수 분해 사이트가 포함되어 있습니다. 목 도메인은 광 사슬, 칼모둘린 또는 칼모둘린과 같은 단백질2,3에결합하는 IQ 모티브로 구성됩니다. 상기 tail 영역은 두 개의 무거운 사슬의 이압, 화물 분자의 결합, 헤드 도메인과의 자동 억제 작용을 통한 미신의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 미오신의 각 클래스에 특정한 여러 기능을갖는다.

미오신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다릅니다. 이러한 특성 중 일부는 듀티 비율(myosin이 액틴에 바인딩되는 myosin의 기계적 사이클의 일부)과 처리성(분리 전에 트랙에서 여러 단계를 하는 모터의 능력)을 포함한다.4. 미신의 40개 이상의 클래스는 서열 분석5,6,7,8에기초하여 결정되었다. 2급 묘신은 가장 먼저 연구되었기 때문에 "종래"로 분류됩니다. 따라서 다른 모든 묘신 은 "틀에 얽매이지 않는" 것으로 분류됩니다.

미신 5a (M5a)는 클래스 5 묘신이며, 해리하기 전에 액틴을 따라 여러 단계를 취할 수 있음을 의미 가공 모터입니다. 그것은 높은 관세 비율을가지고, 그것은 액틴9,10,11,12,13,14에바인딩 되는 기계적 사이클의 큰 부분을 보낸다는 것을 나타내는. 다른 묘신과 공통적으로, 헤비 체인은 액틴 결합 및 ATP 가수분해 부위를 모두 포함하는 N 단말 모터 도메인을 포함하고 있으며, 레버 암 역할을 하는 넥 영역이 있으며, 에센셜 라이트 체인(ELC)과 칼모둘린(CaM)15에결합하는 6개의 IQ 모티브가 있습니다. 꼬리 영역에는 분자를 분화하는 α-헬리칼 코일, 결합화물을 위한 구형 꼬리 영역이 포함됩니다. 그것의 운동은 멜라노세포와 Purkinje뉴런16,17의폐래 망상에 있는 멜라노좀의 수송에 그것의 관여를 반영합니다. M5a는 프로토 타입화물 운송 모터(18)로간주됩니다.

클래스 2 묘신, 또는 종래의 묘신은, 비근육 myosin 2 (NM2) 등방형, NM2a, 2b 및 2c19이외에 골격, 심장 및 부드러운 근육의 수축을 전력하는 myosins를 포함한다. NM2 동위원소는 모든 세포의 세포질에서 발견되며 사이토카네시스, 접착, 조직 형태 발생 및 세포 이동19,20,21,22에서공유된 역할을 갖는다. 본 논문은 비근육 미오신 2b(NM2b)23의맥락에서 종래의 묘신 프로토콜에 대해 설명한다. NM2b는 M5a에 비해 낮은 관세율을 가지며 M5a의 V최대 치인 ≈18s-124에비해 V최대 0.2 s-1 -123으로 효소적으로 느립니다. 특히 두 개의 헤드가 있는 잘린 NM2b 구문은 actin에서 쉽게 처리하지 않습니다. 오히려, 액틴과의 각 만남은분자(25)의해리에 이어 파워 스트로크를 초래한다.

NM2b에는 두 개의 미신 중형 체인이 포함되어 있으며, 각 체인은 1개의 구형 헤드 도메인, 1개의 레버 암(1개의 ELC 및 하나의 규제 라이트 체인(RLC)을 포함하며, α 백리향 코일 로드/꼬리 도메인, 약 1,100개의 아미노산이 이 두 개의 무거운 사슬을 이산화합니다. NM2b의 효소 활성 및 구조 상태는 RLC23의인산화에 의해 조절된다. ATP 및 생리이온 강점(약 150mMM염)이 있는 NM2b는 두 머리가 비대칭 상호 작용에 참여하고 꼬리가23개소에서 머리 위로 다시 접는 컴팩트한 변형을 채택한다. 이 상태에서, 미신은 actin과 강하게 상호 작용하지 않으며 매우 낮은 효소 활동을 가지고 있습니다. 칼모둘린의존성 미오신 광사슬 키나아제(MLCK) 또는 로-관련 단백질 키나아제에 의한 RLC 인산화시, 분자는 꼬리 부위를 통해 다른 미오신과 연결하여 약 30개의 근신분자(23)의양극성 필라멘트를 형성한다. 앞서 언급한 RLC의 인산화는 또한 NM2b의 액틴 활성화 ATPase 활성을 약 4배26,27,28로증가시키는 것으로 이어진다. 양극성 필라멘트 배열은 양쪽 끝에 많은 미오신 모터를 특징으로하며, 수축 및 장력 유지 보수의 역할에 최적화되어 있으며, 반대극성을 가진 액틴 필라멘트는 서로 비교하여 움직일 수 있습니다23,29. 이에 따라 NM2b는 액틴과 상호작용할 때 모터의 앙상블 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 필라멘트 내의 많은 수의 모터를 통해 NM2b 필라멘트가 액틴 필라멘트에서 공정하게 움직일 수 있으므로29개의특징을 나타내는 시험관 내 필라멘트 공정성을 가능하게 합니다.

세포에서 미신의 역할을 이해하는 과정에서 진전이 있었지만, 단백질 수준에서 그들의 개별적인 특성을 이해할 필요가 있다. 간단한 단백질 단백질 상호 작용 수준에서 actomyosin 상호 작용을 이해 하려면, 세포의 내부 보다는, 우리는 표현 하 고 체 외 연구에 사용 하기 위해 재조합 myosins를 정화할 수 있습니다. 그러한 연구의 결과는 궁극적으로 복잡한 세포 과정을 구동 특정 myosins의 생물학적 특성에 대해 mechano생물학자에게12,13,14,25,29를알려줍니다. 전형적으로, 이것은 전체 길이 또는 잘린 미오신 구조에 친화성 태그를 추가하고 친화성 크로마토그래피(29,30,31)를통해 정화함으로써 달성된다. 추가적으로, 생성은 합성 불소호로 단백질 라벨링을 위한 유전으로 응응가능한 형광또는 태그를 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한 형광 라벨을 추가함으로써, 단일 분자 이미징 연구는 myosin 역학 및 운동학을 관찰하기 위하여 수행될 수 있습니다.

정제 후, 미신은 여러 가지 방법으로 특징지어질 수 있다. ATPase 활동은 색법 방법으로 측정할 수 있으며, 상이한 조건 하에서 모터의 전반적인 에너지 소비 및 액틴 친화성에 대한 통찰력을제공한다(32). 그것의 운동성의 mechanochemistry에 관하여 배우기 위하여는, 추가 실험이 필요합니다. 이 논문은 정제된 myosin 단백질의 운동특성을 특성화하는 데 사용할 수 있는 두 가지 체외 형광 현미경-현미경 기반 방법을 자세히 설명합니다.

이러한 방법의 첫 번째는 미오신 모터의 앙상블 특성을 정량적으로 연구하고 정제 된 단백질(33)의배치의 품질을 질적으로 연구하는 데 사용할 수있는 글라이딩 액틴 필라멘트 분석입니다. 이 논문은 이 분석법에 대한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경의 사용에 대해 논의하지만, 이러한 실험은 많은 실험실34에서흔하게 발견되는 디지털 카메라를 탑재한 광야 형광 현미경을 사용하여 효과적으로 수행될 수 있다. 이 분석에서, 미오신 모터의 포화 층은 커버 슬립에 부착된다. 이는 니트로셀룰로오스, 항체, 막, SiO 2-유도표면(예: 트리메틸클로로실레인)을 이용하여 달성될 수있으며,그 중 에서도29,33,35,36,37, 38을이용하여 달성할 수 있다. 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 커버슬립 챔버를 통과하며, 이 챔버는 표면에 부착된 미오신에 결합한다. ATP (및 NM2 의 연구에서 키나아제)를 추가하면 챔버는 표면에 묶인 myosins에 의한 액틴 필라멘트의 전좌를 관찰하도록 이미지화됩니다. 추적 소프트웨어를 사용하여 각 글라이딩 액틴 필라멘트의 속도와 길이를 상호 연관시킬 수 있습니다. 분석 소프트웨어는 또한 주어진 미오신 제제의 품질을 결정하는 데 유용 할 수있는 이동 및 고정 액틴 필라멘트의 수를 측정 할 수 있습니다. 정체된 필라멘트의 비율은 또한 의도적으로 다른 단백질에 actin의 표면 테더링에 의해 변조될 수 있고근신(39)의부하 의존성을 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 각 액틴 필라멘트는 다수의 사용 가능한 모터에 의해 추진될 수 있기 때문에, 이 분석법은 매우 재현가능하며, 최종 측정 속도는 시작 묘신 농도의 변경 또는 솔루션에 추가 인자의 존재와 같은 변투로 견고하다. 이는 변성, 온도, 이온 강도, 용액 점도 및 표면 테더에 의해 유도되는 부하의 효과와 같은 상이한 조건하에서 근신 활성을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다는 것을 의미한다. ATP 가수분해가 불가능한 강한 결합미오신 "죽은 머리"와 같은 요인이 지연된 액틴 필라멘트를 유발할 수 있지만, 이러한 문제를 완화하고 정확한 측정을 허용하는 여러 가지 방법이 존재합니다. 미신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다르며, 사용되는 특정 묘신에 따라 이 분석에서 액틴 필라멘트의 글라이딩 속도는 20nm/s(미신 9)40,41,최대 60,000nm/s(샤라산 미신 11)42미만에서 다를 수 있다.

두 번째 분석법은 글라이딩 액틴 필라멘트분석12의형상을 반전시다. 여기서, 액틴 필라멘트는 표지슬립 표면에 부착되어 M5a 또는 NM2b의 개별 양극성 필라멘트의 단일 분자의 움직임이 시각화된다. 이 분석법은 액틴에 대한 단일 미오신 분자 또는 필라멘트의 실행 길이 및 속도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 커버슬립은 비특이적 결합을 차단하고 비오틴 폴리에틸렌 글리콜(biotin-PEG)과 같은 표면을 동시에 기능화하는 화학 화합물로 코팅됩니다. 수정된 아비딘 유도체의 첨가는 표면을 프라이밍하고 생체개화 액틴이 챔버를 통과하여 챔버의 바닥에 안정적으로 결합된 F-actin층을 초래한다. 마지막으로, 활성 및 형광표 미오신(전형적으로 1-100 nM)은 챔버를 통해 흐르고, 그 후 고정액소필라멘트를 통해 미오신 움직임을 관찰하도록 이미지화된다.

이 양식은 비근육과 근육 myosins 둘 다의 역학을 검토하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능한 방법을 나타냅니다. 이 보고서는 M5a와 NM2b를 각각 정화하고 특성화하는 절차를 각각 설명합니다. 다음은 두 가지 유형의 분석에서 모션을 성공적으로 캡처하기 위해 수행 될 수있는 일부 myosin 특정 적응에 대한 논의에 선행됩니다.

발현 및 분자 생물학
관심있는 myosin에 대한 cDNA는 M5a-HMM을 표현하는 경우 C 단말플래그 태그 (DYKDDDDK) 또는 N-단말 플래그 태그NM23,43,44, 44,45, 46, 46의전체 길이 분자를 표현하는 경우 인코딩 수정 된 pFastBac1 벡터에 복제되어야합니다. NM2b의 C-단말 플래그 태그는 플래그 친화성 컬럼에 대한 단백질의 선호도가 약화됩니다. 대조적으로, N 단자 플래그 태그 단백질은 일반적으로 FLAG 선호도열(23)에잘 결합한다. N-말단 태그 단백질은 효소 활성, 기계적 활성 및 인산화 의존성조절(23)을유지한다.

이 논문에서는, 마우스 M5a 무거운 메로미신 (HMM)와 같은 구조가 플래그 태그와 myosin 무거운 사슬의 C-종점 사이에 GFP와 같은 구조를 사용하였다. NM2b와 달리 M5a-HMM은 N 또는 C 단말 FLAG 태그로 태그를 성공적으로 지정하고 정제할 수 있으며 두 경우 모두 결과 구성이 활성화됩니다. M5a 헤비 체인은 아미노산 1090에서 잘렸으며 GFP와 M5a47의코일 코일 영역 사이의 3개의 아미노산 링커(GCG)를 함유하고 있다. GFP와 플래그 태그 사이에 추가 링커가 추가되지 않았습니다. M5a-HMM은 칼모둘린과 공동 표현되었다. 전신 인간 NM2b 구조는 ELC 및 RLC와 공동 표현되었다. RLC의 N-termini는 5개의 아미노산 (SGLRS)의 링커를 통해 GFP와 융합되었다. 플래그 태그에 직접 부착된 것은 할로태그였습니다. HaloTag와 미신 헤비 체인의 N-종자 사이에는 두 개의 아미노산 (AS)으로 만든 링커가 있었습니다.

두 myosin 제제는 약 2 x 106 세포/mL의 밀도로 바쿨로바이러스에 감염된 Sf9 세포 배양의 1리터로부터 정제되었다. 각 하위 단위에 대한 baculovirus의 볼륨은 제조업체의 지침에 의해 결정된 바이러스의 감염의 복합성에 의존합니다. M5a의 경우, 세포는 칼모둘린을 위한 2개의 다른 바쿨로바이러스-1, M5a 무거운 사슬을 위해 1개로 공동 감염되었다. NM2b의 경우, 세포는 ELC에 대한 3개의 다른 바이러스-1, RLC용, NM2b 중형 체인에 대해 하나씩 공동 감염되었다. myosins의 다양성으로 작업 하는 실험실에 대 한 (또는 다른 다 복합 단백질), 이 방법은 무거운 빛 사슬의 많은 조합을 허용 하 고 칼모둘린 등 일반적으로 사용 되는 라이트 체인 많은 다른 myosin 무거운 사슬과 공동 변환될 수 있기 때문에 이 접근 은 효율적입니다. 모든 세포 작업은 오염을 피하기 위해 적절한 멸균 기술을 가진 생물 안전 캐비닛에서 완료되었습니다.

M5a와 NM2b의 발현을 위해, 재조합 묘신을 생산하는 Sf9 세포는 원심분리를 통해 2-3일 후 감염 후, 원심분리를 통해 수집하고-80°C에 저장하였다. 세포 펠릿은 2,800 x g에서 30 분 동안 4 °C에서 공동 감염된 Sf9 세포를 원심분리하여 수득하였다. 단백질 정제 과정은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

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Protocol

1. 단백질 정제

  1. 세포 리시스 및 단백질 추출
    1. 표 1을기반으로 1.5배 추출 버퍼를 준비합니다. 4°C에서 필터를 하고 보관하십시오.
    2. 얼음에 세포 펠릿을 해동 시작합니다. 펠릿이 해동하는 동안 1.2 mM 디티오트리톨(DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 2개의 프로테아제 억제제 정제를 통해 100mL의 추출 버퍼를 보충하십시오. 얼음을 유지합니다.
    3. 펠릿이 해동되면 세포 배양 10mL당 보충 추출 버퍼 1mL을 추가하십시오. 예를 들어, 세포 펠릿이 세포 배양 500mL로부터 형성된 경우, 펠릿에 50mL의 보충 추출 버퍼를 추가한다.
    4. 얼음 위에 보관하면서 세포 펠릿을 초음파 처리합니다. 각 펠릿에 대해 다음 조건을 사용합니다: 5 s ON, 5 s OFF, 5분, 전원 4-5.
    5. 모든 균질화된 용액을 비커로 수집하고 ATP(0.1M 스톡 솔루션; pH 7.0)를 추가하여 ATP의 최종 농도가 1mM입니다. 차가운 방에서 15 분 동안 저어줍니다. ATP는 활성 미오신을 액틴으로부터 분리하여 다음 원심 분리 단계에서 분리할 수 있도록 합니다. 따라서 ATP 고갈 및 액틴 재구속 가능성을 최소화하기 위해 즉시 다음 단계로 진행하는 것이 필수적입니다.
    6. 4°C에서 1h에 대해 48,000 x g의 리자수리슈 원심분리기. 이 발생 하는 동안, 제조 업체의 지침에 따라 100 mL 인산염 완충 식염수 (PBS)와 안티 플래그 친화성 수지 (세포의 1 L에서 형성 된 펠릿)의 50 % 슬러리의 1-5 mL을 세척하기 시작합니다. 예를 들어, 수지 5mL의 경우, 50% 슬러리의 10mL를 세척한다. 마지막 세척 단계에서는 충분한 부피로 PBS의 1-5mL로 수지를 50 % 슬러리를 만듭니다.
    7. lysate 원심분리에 따라, 1-4 h에 대한 차가운 방에 부드럽게 세척 수지 슬러리와 상류체를 결합합니다. 기다리는 동안 표 1에 설명된 버퍼를 만들고 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 플래그 선호도 정화 준비
    1. 원심 분리는 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 1.7 단계에서 용액을 원심 분리합니다. 수지는 튜브 의 바닥에 포장됩니다. 수지의 방해 없이 상퍼를 제거합니다.
    2. 테이블 1및 원심분리기에서 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 상세한 대로 버퍼 A의 50mL에서 수지를 다시 중단합니다. 수지의 방해 없이 상퍼를 제거합니다.
    3. 테이블 1및 원심분리기에서 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 에 자세히 설명된 대로 버퍼 B의 50mL에서 수지를 다시 중단합니다. 이 단계를 다시 한 번 반복하고 버퍼 B의 20mL에서 수지를 다시 일시 중지합니다. 그런 다음, 수지와 버퍼를 손으로 약 10회 부드럽게 반전시킴으로써 철저히 섞는다.
  3. 단백질 용출 및 농도
    1. 표 1에 설명된 대로 30mL의 용출 버퍼를 만들고 얼음위에 식힙니다.
    2. 차가운 방에 용출 열을 설정합니다. 수지 슬러리를 부드럽게 기둥에 붓습니다. 1-2컬럼 볼륨의 버퍼 B로 컬럼을 바닥에 수지 팩으로 세척하여 수지가 건조하지 않도록 합니다.
    3. 수지를 통해 용출 버퍼의 1mL를 플로우하고 1.5mL 튜브에서 유동을 수집합니다. 12, 1 mL 분획이 수집되는 것을 반복합니다.
    4. 이 시점에서, 질적으로 가장 집중 된48분획을 결정하기 위해 분획에 원유 브래드포드 테스트를 수행 . 96웰 플레이트의 한 줄에 파이펫 60 μL 1x 브래드포드 시약. 분획이 수집될 때 각 분획의 20 μL을 잘 섞습니다. 파란색 색상이 어두워진 경우 더 농축된 분획이 더 많이 표시됩니다.
    5. 50mL 튜브에서, 나머지 용출 버퍼를 컬럼을 통해 부드럽게 배관하여 남은 단백질을 수집하여, 열 흐름의 수지에 결합된 남은 미오신을 방출한다. 이 흐름은 다음 단계에 집중됩니다. 그런 다음 수지재생을 재생하여 재사용하고 제조업체의 지침에 따라 저장되는지 확인합니다.
    6. 가장 농축된 3개의 분획을 풀링하고 50mL 튜브의 흐름을 더욱 집중하고 100,000개의 MWCO 농축 튜브를 사용하여 나머지 1mL 분획을 추가로 농축합니다. 풀링된 샘플을 집중 튜브 및 원심분리기에 750 x g에서 4°C에서 15분 동안 적재하고 모든 용출된 단백질이 약 0.5-1mL의 최종 부피에 집중될 때까지 반복한다.
      참고: 이 모공 크기는 분자량 차단의 수배질량이 있는 myosin 분자의 보존을 허용합니다. 라이트 체인은 최종 제품에 SDS-PAGE 젤 전기 포전을 수행하여 검증된 바와 같이, 농도의이 시간 과정 동안 모터 도메인에 단단히 묶여 남아있다.
  4. 투석 및 플래시 동결
    1. 표 1에설명된 대로 투석 버퍼 2L을 만듭니다. 투석 가방이나 챔버에 샘플을 적재하고 차가운 방에서 밤새 투석을 합니다. 투석 버퍼의 조성은 NM2b 및 M5a에 대해 다릅니다.
      참고: NM2b의 경우, 이 투석 단계의 목적은 낮은 이온 강도 버퍼에서 미신 필라멘트를 형성하는 것이다. 이러한 필라멘트의 퇴적물 다음 추가 정화 단계를 제공하고 시료의 농도를 허용합니다. 따라서 다음 날 투석실에 눈에 보이는 흰색 침전제가 있을 것입니다. 이러한 필라멘트는 원심분리에 의해 수집되고 5.1 단계에서 중합화됩니다. M5a-HMM의 경우, 하룻밤 투석 후, 단백질은 후속 저서에서 사용하기에 충분히 순수할 것이다. 필요한 경우 젤 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가 정화 단계를 수행할 수 있습니다. 투석 후 M5a 복구의 경우 5.2 단계로 이동하십시오.
  5. 투석 후 묘신 회복
    1. NM2b의 경우, 투석 백 또는 챔버 및 원심분리기에서 전체 샘플을 4°C에서 49,000 x g에서 15분 동안 조심스럽게 하역하여 묘신 필라멘트를 수집합니다. 상체를 버리고 저장 버퍼를 표 1에 설명한 대로 펠릿에 점진적으로 추가하여 용해될 때까지 합니다. 부드러운 위아래로 파이펫팅은 펠릿을 용해시키는 데 도움이됩니다. 일반적으로 이것은 튜브 당 500 μL 이상을 필요로하지 않습니다. 펠릿이 높은 이온 강도 저장 버퍼에 완전히 용존되도록 한 후, 추가 원심분리 단계(49,000 x g에서15분)는 필요한 경우 원치 않는 골재를 제거하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 뮤신이 이제 중합되지 않고 상내에 남아 있기 때문이다.
    2. M5a-HMM의 경우, 원치 않는 골재가 존재하는 경우 49,000 x g에서 15 분 동안 4 °C에서 투석 챔버 및 원심분리기에서 전체 샘플을 신중하게 수집하십시오. 상수.
  6. 농도 결정 및 플래시 동결
    1. 제품의 농도를 결정하기 위해 파장 260, 280, 290 및 320 nm에서 분광계를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 수학식 1을사용하여 mg/mL(cmg/mL)의농도를 계산하며, 여기서 A280은 280 nm에서 흡수를 나타내고 A320은 320 nm에서 흡수를 나타낸다. mg/mL의 결과 농도는 M이 전체 단백질의 분자량인 방정식 2를가진 미오신 분자의 μM으로 변환될 수 있다(중사슬, 광사슬, 형광및 모든 태그 포함).
      cmg/mL =(A280 - A320)/ ε (1)
      μM 분자 = 1000cmg/mL/M(2)
      참고: 희석이 필요한 경우 높은 이온 강도 버퍼에서 수행해야 합니다. 소멸 계수(ε)는 ExPASy와 같은 프로그램으로 단백질의 아미노산 서열을 수입함으로써 결정될 수 있다. M5a-HMM의 일반적인 수율은 약 0.5-1 mL의 1-5 mg/mL 단백질이며 전체 길이NM2b는 0.5-2 mg/mL의 0.5-1 mL이다. 이 논문에 사용된 M5a-HMM의 소멸 계수는 0.671이었다. 이 백서에 사용된 NM2b의 소멸 계수는 0.611이었다.
    2. 정제된 묘신을 두 가지 방법 중 하나에 보관합니다. 10-20 μL 사이의 Aliquot는 중합 연쇄 반응 튜브와 같은 얇은 벽으로 둘러싸인 튜브로 들어가서 튜브를 플래시 동결을 위해 액체 질소 용기에 떨어뜨립니다. 대안적으로, 미오신의 20-25 μL 사이의 직접 파이펫을 액체 질소로 직접 피펫하고 멸균 극저온 튜브에 단백질의 냉동 구슬을 저장한다. 두 경우 모두, 결과 튜브는 향후 사용을 위해 -80°C 또는 액체 질소에 저장될 수 있다.
      참고: 아래에 설명된 두 운동성 소법은 매우 적은 양의 단백질을 필요로 하기 때문에, 설명된 바와 같이 작은 알리코트의 저장은 경제적입니다.

2. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석

  1. 커버슬립 준비
    1. 아밀 아세테이트에서 1% 니트로셀룰로오스 용액을 만드세요.
    2. 조직 배양 접시(150 x 25mm)를 얻고 접시 바닥에 원형 필터 용지(직경 125mm)를 추가합니다.
    3. 8번 1.5mm 제곱커버를 랙에 적재하고 200mL의 약 2~5mL로 세척한 후 증류수(dH 2O)를2-5mL로 세척한다. 물로 끝나는 이 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 여과 된 에어 라인 또는 N2라인을 사용하여 커버립을 완전히 건조시하십시오.
    4. 슬립의 한 가장자리를 따라 1% 니트로셀룰로오스 용액의 커버슬립 1개를 천천히 피펫 10 μL로 가져가라. 그런 다음 매끄러운 동작으로 부드러운 면 200 μL 파이펫 팁의 측면을 사용하여 커버 슬립의 나머지 부분에 걸쳐 얼룩을 묻습니다. 니트로셀룰로오스 가옆으로 티슈 배양 접시에 이 커버슬립을 놓습니다. 나머지 커버립을 반복하고 남은 시약을 준비하는 동안 건조하게 하고 코팅 후 24시간 이내에 커버립을 사용하십시오.
  2. 챔버 준비
    1. 광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 이물질을 청소합니다. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자른다.
    2. 현미경 슬라이드의 긴 가장자리의 중간을 따라 한 조각을 놓습니다. 테이프의 가장자리가 슬라이드의 가장자리와 정렬되는지 확인합니다. 두 번째 테이프를 첫 번째 테이프 아래에 약 2mm 아래에 두 어두 드시고 정렬합니다. 이렇게 하면 약 10μL의 용액을 보유할 수 있는 유량 챔버가 생성됩니다(그림 1참조).
    3. 1부에서 니트로셀룰로오스 코팅 커버립 중 하나를 가져 가라. 니트로셀룰로오스로 코팅된 측면이 테이프와 직접 접촉하는 등 테이프에 커버슬립을 조심스럽게 붙입니다(그림 1참조). 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버슬립이 슬라이드에 제대로 부착되었는지 확인합니다. 면도날로 슬라이드 가장자리에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다.
  3. 액틴 준비
    1. 중합화 버퍼(50mM KCl, 2mM MgCl2,1mM DTT, 25mM MOPS(pH 7.0)에서 구형 액틴(G-actin)을 중합하여 20μM F-actin을 하룻밤 사이에 4°C에서 만듭니다.
    2. 연골 완충액에서 5 μM에 F-액틴을 희석시 (20mM MOPS, 5 mM MgCl2,0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). 로다민-팔로이드를 1.2배 이상 과량으로 표시하는 라벨. 얼음 위에 2시간 이상 방치(알루미늄 호일로 덮여 있음). 이것은 얼음에 저장, 최대 1-2 개월 동안 사용할 수 있습니다.
  4. 미오신 5a 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 수행
    참고: 이 섹션에서는 미신 5a(HMM) 글라이딩 분석법의 세부 사항이 제공됩니다.
    1. 표 2에 설명된 미신 5a용 액스를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 미신 5a(50-100 nM)의 10μL로 유동 챔버를 통과하고 1분 동안 기다립니다.
    3. 1mM DTT("저염" 버퍼)를 가진 50mM MB에서 1 mg/mL BSA의 10 μL로 플로우합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다.
    4. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 토론 섹션에서 설명한 바와 같이 블랙 액틴 용액 10μL(5μM F-actin, 1 μM calmodulin, 1mM MB 50m MB 1m DTT)의 1mM ATP로 플로우하여 "데드 헤드"를 제거합니다.
      1. 파이펫은 챔버에 용액을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단하는 1 mL 주사기 및 27 G 바늘로 용액을 피펫합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하고 세 번째 후 1 분 동안 기다립니다. 약 20개의 파이펫 팅 이벤트만으로도 충분합니다.
      2. "데드 헤드" 스핀을 수행하려면 500mMMMM의 염 농도에 1mM ATP 및 1 mM MgCl2의 존재시 미오신에 F-액틴의 양을 첨가한다. 그런 다음 4 °C에서 15 분 동안 480,000 x g의 초원심 분리기. 죽은 묘신은 펠릿에있을 것입니다.
    6. 50mM MB50μL로 1mM DTT와 1mM ATP로 플로우하여 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다.
    7. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하여 ATP의 챔버를 고갈시다.
    8. 50mMMB에서 1mM DTT를 함유한 20nM 로다민 액틴(Rh-Actin) 용액의 10μL로 플로우하고, 커버슬립의 표면에 부착된 묘신 5a에 액틴 필라멘트의 엄격함을 허용하기 위해 1분 정도 기다린다.
    9. 1mM DTT로 50mM MB 10μL로 씻어 표면에 얽매이지 않는 Rh-액틴 필라멘트를 씻어내세요. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우합니다.
    11. 561 nm의 흥분 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 Rh-Actin을 시각화합니다. 적절한 노출 시간은 총 0.5-1 분 동안 1.4 mW 레이저 전력에서 200 ms입니다.
      참고: 획득 속도가 움직이는 필라멘트의 속도로 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 추적 프로그램과 함께 사용하기 위한 데이터를 수집하기 전에 중요한 고려 사항은 수집 프레임 속도입니다. 프레임 간의 하위 픽셀 움직임은 속도의 과대 평가될 것이며 정확한 값을 얻기 위해서는 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 최적의 획득 속도는 프레임 사이의 최소 한 픽셀 거리에 대한 액틴 글라이딩을 특징으로 합니다. 여기에서 이미징에 사용되는 TIRF 현미경의 경우, 이 임계값은 130 nm로 변환됩니다. 따라서 1 μm/s를 이동할 것으로 예상되는 묘신은 5프레임/s(0.2s 간격)의 속도로 이미지화되어야 하며, 미신은 10nm/s를 주행할 것으로 예상되는 동안 0.05 프레임/s(20s 간격)를 주행할 것으로 예상됩니다. 따라서 필요한 경우 이 단계에서 데이터를 다운샘플링할 수 있습니다(자세한 내용은 토론 참조).
  5. 비근육 미오신 2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 수행
    참고: 이 섹션에서는 전체 길이의 비근육 미오신 2b 글라이딩 분석법의 세부 사항이 제공됩니다. 비근육 미오신 2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 프로토콜은 특정 단계에서 미오신 5a 프로토콜과 다릅니다. 이러한 각 단계에 대해 올바른 버퍼가 사용되었는지 확인합니다. 예를 들어, NM2b 분석법은 M5a가 높거나 낮은 염완충제의 커버슬립에 부착될 수 있는 반면, 높은 염분 버퍼로 커버슬립에 묘신의 부착이 필요하다. 또한 M5a 글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 미오신의 농도가 낮을수록 인수 중에 분리되는 액틴 필라멘트의 빈도를 완화합니다.
    1. 표 2에 설명된 대로 NM2b용 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
    2. 비근육 미오신 2b(0.2 μM)의 10μL에서 500m 모틸리 버퍼(MB) ("고염" 버퍼) 및 1mM 디티오트레이톨(DTT)의 유동 챔버를 통해 1분 동안 기다린다.
      참고: 높은 염분 완충제는 myosin 필라멘트를 해리하고, 비근육 myosin 2b가 이온 농도 < 150 mMMMMM의 필라멘트로 중합할 수 있기 때문에 표면에 단일 미오신 분자의 부착을 허용한다.
    3. 표 2에설명된 바와 같이 500mMM MB에서 1 mg/mL 소 소 세럼 알부민(BSA)의 10μL로 플로우한다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    4. 표 2에설명된 대로 500mM MB 10μL로 세척하고 1mM DTT로 세척한다. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 토론 섹션에서 추가로 논의된 바와 같이 표 2에 설명된 바와 같이 검정액용액의 10μL로 플로우하면 "죽은 머리"를 제거합니다. 블랙 액틴 용액에는 라벨이 없는 F-actin 5 μM, 1-10 nM MLCK, 1mM ATP, 0.2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1mM DTT가 50mM NaCl 운동 완충제로 포함되어 있어 챔버 표면에 비근육 미오신 2b를 인계한다.
      1. 파이펫은 챔버에 용액을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단하는 1 mL 주사기 및 27 G 바늘로 용액을 피펫합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하고 세 번째 후 1 분 동안 기다립니다. 약 20개의 파이펫팅 이벤트만으로도 충분합니다.
    6. 50mM MB50μL로 1mM DTT와 1mM ATP로 플로우하여 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다.
    7. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하여 ATP의 챔버를 고갈시다.
    8. 50mM MB에서 1mM DTT를 함유한 20nM Rh-Actin 용액의 10μL로 플로우하고 커버슬립표면에 부착된 무근육 미오신 2b에 액틴 필라멘트의 엄격한 결합을 허용하도록 1분 정도 기다린다.
    9. 1mM DTT로 50mM MB 10μL로 씻어 표면에 얽매이지 않는 Rh-액틴 필라멘트를 씻어내세요. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우합니다. 비근육 근막의 경우 2b글라이딩 액틴 필라멘트 분석의 경우, 파이널 버퍼에는 칼모둘린, CaCl2및 미신 광 사슬 키나아제도 포함되어 비디오 이미징 중에 비근육 미소신 2b의 완전한 인산화를 제공한다. 0.7% 메틸셀룰로오스는 액틴 필라멘트가 느슨하게 묶여 있거나 표면에 바인딩되지 않은 경우 최종 버퍼에 포함될 수 있습니다. 이 논의 섹션에서 더 자세히 설명합니다.
    11. 561 nm의 흥분 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록합니다. 적절한 노출 시간은 총 0.5 ~3 분 동안 1.4 mW 레이저 전력에서 200 ms입니다.
      참고: 획득 속도가 움직이는 필라멘트의 속도로 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 추적 프로그램과 함께 사용하기 위한 데이터를 수집하기 전에 중요한 고려 사항은 수집 프레임 속도입니다. 프레임 간의 하위 픽셀 움직임은 속도의 과대 평가될 것이며 정확한 값을 얻기 위해서는 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 최적의 획득 속도는 프레임 사이의 최소 한 픽셀 거리에 대한 액틴 글라이딩을 특징으로 합니다. 여기에서 이미징에 사용되는 TIRF 현미경의 경우, 이 임계값은 130 nm로 변환됩니다. 따라서 1 μm/s를 이동할 것으로 예상되는 묘신은 5프레임/s(0.2s 간격)의 속도로 이미지화되어야 하며, 미신은 10nm/s를 주행할 것으로 예상되는 동안 0.05 프레임/s(20s 간격)를 주행할 것으로 예상됩니다. 따라서 필요한 경우 이 단계에서 데이터를 다운 샘플링할 수 있습니다(자세한 내용은 토론 참조).

3. 단일 분자 TIRF 분석

  1. 커버슬립 준비
    1. 주식 분말을 10 mg 알리쿼트 (1.5 mL 튜브)의 메톡시 페그 실레인 (mPEG) 및 비오틴 - 페그 실레인 (bPEG)의 10 mg 알리쿼트로 나눕니다. 밀봉된 수분이 없는 용기에 -20°C에 보관하고 6개월 이내에 사용하십시오.
    2. 8번 1.5H(고정밀) 두께 22mm 정사각형 커버립을 랙에 적재하고 200mL의 2-5mL로 세척한 다음 증류수 2-5mL로 세척합니다. 물로 끝나는 이 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 에어 라인 또는 N2를 사용하여 커버립을 완전히 건조시키고 아르곤으로 플라즈마 청소를 3 분 동안 건조시십시오.
    3. 다음 단계를 수행하면서 티슈 컬쳐 접시(100 x 20mm)에 필터 용지(90mm)에 깨끗한 커버립을 놓고 70°C 오븐에 인큐베이션을 입력합니다.
      참고 : 플라즈마 청소는 다른 화학 적 세척 방법으로 대체 할 수있다49.
    4. dH2O로 80% 에탄올 용액을 준비하고 HCl을 사용하여 pH를 2.0으로 조정합니다. 이 중 1mL을 mPEG 의 10 mg 알리쿼트및 1mL에 bPEG의 10 mg 알리쿼트에 추가합니다. 30 초 이상 걸리지 않아야하는 용해 소용돌이.
    5. bPEG 용액의 100 μL을 가지고 80 % 에탄올 (pH 2.0)의 900 μL을 추가합니다. 이 솔루션은 1 mg/mL bPEG. 그런 다음, 두 PEG의 용액을 다음과 같이 만들고, 철저하게 혼합한다.
      1. 10 mg / mL mPEG의 200 μL (최종 농도 : 2 mg / mL).
      2. 1 mg / mL bPEG의 10 μL (최종 농도 : 10 μg / mL).
      3. 80% 에탄올(pH 2.0) 용액의 790 μL.
    6. 커버립을 오븐에서 꺼내. PEG 용액의 100 μL을 각 커버슬립의 중앙에 조심스럽게 분배하여 상단 표면만 젖은지 확인합니다. 그런 다음 전표를 오븐에 다시 넣고 20~30분 동안 배양합니다.
    7. 커버립이 구멍이 뚫리기 시작하면 표면에 작은 원이 표시되어 오븐에서 제거합니다.
    8. 각 커버슬립을 100% 에탄올로 씻고, 에어라인으로 건조하고, 오븐에 다시 놓습니다. 2단계에서 챔버를 만드는 데 필요한 시간 동안만 인큐베이션하십시오.
  2. 챔버 준비
    1. 챔버 만들기에 사용하기 위해 현미경 슬라이드를 청소하십시오. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자른다.
    2. 현미경 슬라이드의 긴 가장자리의 중간을 따라 한 조각을 놓습니다. 테이프의 가장자리가 슬라이드의 가장자리와 정렬되는지 확인합니다. 두 번째 테이프를 첫 번째 테이프 아래에 약 2mm 아래에 두 어두 드시고 정렬합니다.
    3. 오븐에서 기능화 된 커버립 중 하나를 가져 가라 (3.1에서 만든). 못으로 코팅 된 측면이 아래로 향하고 도 1에표시된 것처럼 테이프와 직접 접촉하는 것처럼 조심스럽게 표지 슬립을 테이프에 고정합니다. 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버슬립이 슬라이드에 제대로 부착되었는지 확인합니다.
    4. 면도날로 슬라이드 에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다. 이 챔버는 즉시 사용하거나 50mL 튜브에 쌍으로 배치하고 향후 사용을 위해 -80 °C 냉동고에 저장될 수 있습니다. 즉시 보관하거나 표면이 저하되는 것이 중요합니다.
  3. 미오신 5a TIRF 현미경 분석 기
    1. 표 3에 설명된 미신 5a 반전 운동성 분석법을 위한 해결책을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 챔버를 세척하십시오.
    3. 1mM DTT를 가진 50mM MB에서 1 mg/mL BSA의 10 μL에서 유동한다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    4. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 노이트아비딘 용액의 10μL에서 50mM MB로 1mM DTT를 유동하고 1분 정도 기다립니다.
    6. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    7. 50mMMB에서 1mM DTT를 함유한 바이오티니졸루트 로다민 액틴(bRh-Actin)의 10μL에서 유입되어 1분 정도 기다린다. 이 단계를 위해, 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하고 긴 액틴 필라멘트가 표면에 부착 될 수 있도록 형광 액틴 필라멘트의 전단을 최소화하기 위해 위아래로 파이펫팅을 피하십시오 (20-30 μm 이상). 효과적인 대안은 표준 파이펫 팁의 콘을 절단하는 것입니다 (≈1-1.5 mm의 개구부).
    8. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    9. 10 nM 미신 5a를 첨가한 최종 버퍼의 30 μL에서 흐름한 다음 TIRF 이미징 양식에 대한 최적의 초점을 찾은 후 즉시 TIRF 현미경에 로드하고 기록합니다. 100-200 ms 사이의 노출 시간은 액틴 및 GFP 라벨 myosin에 대한 1.4 mW 레이저 전력에서 적절하다. 속도 분석을 위한 적절한 획득 시간은 3분입니다.
  4. 비근육 근시 2b TIRF 현미경 분석 기
    참고: 본 섹션에서는 중합및 인포액필라멘트를 이용한 비근육 미오신 2b TIRF 분석의 세부 사항이 제공됩니다. 관내 비근육 근신-2b를 인광 및 중합에 대한 상세한 프로토콜(섹션 4.1-4.3)이 포함된다.
    1. 정제된 NM2b를 인광하려면 2mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK 및 0.1 mM ATP와 같은 조건으로 10배 키나아제 믹스를 만듭니다. 이는 10mM DTT가 있는 500mM MB의 볼륨으로 가져올 수 있습니다. 1:10의 체적 비율로 미오신에 10x 키나아제 믹스를 추가하고 실온에서 20-30 분 동안 배양 할 수 있습니다. 전형적으로, 이 단계에 대한 미신 농도는 1 μM이다.
    2. 인을 필라멘트로 중합하려면 NM2b의 염농도를 150m M NaCl로 낮춥시다. 이렇게 하려면 dH2O에서 4x MB를 4배 희석하여 소금이 없는 1x 운동완충(1x MB)을 만듭니다. NM2b가 500mM의 염화 완충액으로 동결되었기 때문에 이 1x MB는 염분 농도를 낮추는 데 사용할 수 있다.
    3. 3μL의 재고 NM2b에 대해 1x MB의 7 μL을 추가하여 소금 농도를 150m NaCl로 낮추고 20-30분 동안 얼음에 배양하여 NM2b 필라멘트를 형성합니다.
      참고: NM2b가 인광이 되고 최종 염 농도가 150mM인 한 섹션 4.1-4.3의 순서는 중요하지 않습니다. 30 분-1 h의 순서에 배양은 완전한 인산화 및 중합을위한 충분한 시간을 허용한다.
    4. 표 3에 설명된 비근육 미오신 2b 반전 운동성 분석용 용액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    5. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 챔버를 세척합니다.
    6. 1mM DTT로 1mg/mL BSA의 10μL로 플로우하면 이 세척을 2회 더 반복하고 세 번째 세척 후 1분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    7. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    8. 1mM DTT로 150mM MB의 노이트아비딘 용액의 10μL로 플로우하고 1분 정도 기다립니다.
    9. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. bRh-액틴의 10 μL로 흐르고 1 분 기다립니다. 이 단계를 위해, 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하고 형광 액틴 필라멘트의 전단을 최소화하기 위해 위아래로 파이펫팅을 방지하여 긴 액틴 필라멘트가 표면에 부착 될 수 있는지 확인하십시오 (20-30 μm 이상). 효과적인 대안은 표준 파이펫 팁의 콘을 절단하는 것입니다.
    11. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    12. 비근육 근근 2b 용액(약 30nM)의 10μL로 흐르고 1분 정도 기다립니다.
    13. 1mM DTT로 150MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    14. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우한 다음 TIRF 현미경에 즉시 로드하고 TIRF 이미징 양식에 대한 최적의 초점을 찾은 후 기록합니다. 100-200 ms 사이의 노출 시간은 액틴 및 GFP 라벨 myosin에 대한 1.4 mW 레이저 전력에서 적절하다. 속도 분석을 위한 적절한 획득 시간은 3분입니다.

4. 이미지 분석

  1. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석용 이미지 분석
    참고: 자료 목록에 연결된 소프트웨어 및 매뉴얼을 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로그램에는 분석을 위해 TIFF 스택이 필요합니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 분석 과정은50과같습니다.
    1. 원시 동영상 스택을 지정된 폴더 구조에 업로드하고 동영상 폴더의 가장 많은 디렉터리를 프로그램에 입력합니다.
      참고: 프로그램은 이 디렉터리 및 하위 디렉터리 전체의 파일을 분석하여 가장 낮은 수준의 디렉터리를 복제로 처리합니다. 복제의 각 그룹에 대한 평균 통계가 생성됩니다. 이 경우, 각 묘신에 대해 하나의 영화가 사용되었다. 새로운 묘신을 특성화하거나 새로운 실험 상태를 조사할 때, 총 3개의 챔버에 대해 챔버당 3개의 현장(FOV)에서 영화를 분석하고 조사 중인 묘신의 세 가지 준비를 위해 이 워크플로우를 반복하는 것이 좋습니다.
    2. 스크립트 "stack2tifs"를 사용하여 사용자 입력 된 프레임 속도와 함께 각 TIFF 스택을 일련의 개별 TIFF 파일 및 해당 메타데이터.txt 각 프레임의 시작 시간을 포함하는 폴더로 변환합니다. TIFF 스택 형식이 아닌 데이터의 경우 먼저 재료 표에나열된 소프트웨어와 같은 소프트웨어를 사용하여 변환을 적용해야 합니다.
      참고: 이 스크립트는 소프트웨어 패키지의 일부입니다. 스크립트의 정보는 여기에서 찾을 수 있습니다: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. 획득 하는 동안 픽셀 크기(nm)인 -px 매개 변수를 사용합니다. 이 경우 픽셀 크기는 130nm입니다. 분산 플롯 출력에 대한 축을 배율 조정하기 위해 -xmax 및-ymax 매개 변수를 사용합니다. 이는 가장 긴 플롯된 필라멘트 길이와 최대 플롯 속도(nm/s)에 해당합니다.
      참고: 예상 값이며 데이터가 플롯에 포함되도록 예상보다 높은 값으로 설정할 수 있습니다. 다음 분석을 통해 원시 데이터는 다른 통계 또는 그래프 소프트웨어에서 사용하여 보고 분석을 할 수도 있습니다.
    4. 최소 속도 차단 매개변수인 -minv 매개변수를 사용하여 이동하지 않는 필라멘트를 정의하고 따라서 분석에서 제외할 수 있습니다. NM2b와 같은 느린 myosin의 경우 이 매개 변수는 실제 글라이딩 움직임을 절단하지 않도록 낮음(이 예에서는 5nm/s)이어야 합니다. M5a와 같은 빠른 myosin의 경우 이 매개 변수는 실제 글라이딩 속도 분포를 유지하면서 보다 엄격한 필터를 적용하기 위해 더 높을 수 있습니다(이 예에서 100nm/s).
    5. -pt 컷오프 매개변수를 사용하여 부드러운 움직임을 식별합니다. 각 샘플링 창에 대해 값은 100 x 속도 표준 편차/평균 속도에 해당하는 것으로 계산됩니다. 컷오프보다 값이 높은 트랙은 더 많은 가변 속도를 가지며 추가 분석에서 제외됩니다. 이 예제에서는 33의 컷오프 값이 사용되었습니다. 값이 높은 트랙은 더 많은 가변 속도를 가지며 추가 분석에서 제외됩니다.
    6. -maxd를 사용하여 프레임 간의 최대 허용 연결 거리를 설정합니다. 이것은 nm 단위로 필라멘트의 중심에 의해 이동 계산 된 프레임 - 투 프레임 거리입니다. 산발적인 움직임이나 필라멘트 간의 잘못된 연결을 제외하는 데 유용할 수 있습니다. 여기서 예제에서 매개 변수는 2,000 nm의 기본 값에 남아 있었습니다.
  2. TIRF 현미경 분석법에 대한 이미지 분석
    참고: 구체적으로 나열된 이미징 소프트웨어에 대한 단일 분자 TIRF 분석 분석 프로세스는 재료 테이블 다음과 같습니다.29.
    1. 기록된 현미경 비디오를 소프트웨어의 작업 공간으로 클릭하고 드래그하여51을엽니다. 그런 다음 인수 채널을 분할합니다. 이미지 > 색상 > 분할 채널을클릭합니다.
      참고: 획득 하는 동안 상당한 단계 드리프트의 경우, 이미징 평면에 악기 드리프트를 수정 하기 위해 이미지를 안정화 해야 합니다. 이 경우, Z축 드리프트에 대한 보상은 이 데이터를 얻는 데 사용되는 현미경으로 사용되지 않았으며 Z-focus를 잘 안정화시키는 것이다. 이미지 분석 프로그램의 이미지를 안정화하려면 재료 목록에 연결된 적절한 안정기 플러그인을 설치합니다. 이미지 안정기는 이미지의 오브젝트에 대한 고정 된 위치를 가정하고 이전 프레임의 롤링 평균을 참조로 사용합니다. 따라서 권장 절차는 고정된 위치에 있으므로 레이블이 지정된 actin의 이미지가 포함된 채널로 시작하는 것입니다.
    2. 플러그인을클릭한 다음 이미지 안정기 찾기; 번역을 선택하고 기본 설정을 유지합니다. 로그 변환 계수 옆에 있는 확인란을 선택합니다. 이 로그 단계를 적용하면 계산된 시프트 매개 변수를 다음 단계의 다른 채널에 적용할 수 있습니다. 프로세스가 완료되도록 허용합니다.
    3. 그런 다음, 라벨 이음새가 있는 채널을 열고 이미지 안정기 로그 어플리케이터> 플러그인을 클릭하여 안정화를 적용합니다. 단일 채널에서 더 높은 속도 이미징에 대한 요구 사항으로 인해 동일한 획득 중에 액틴의 이미지를 획득할 수 없는 경우, 드리프트는 바이오틴-PEG 표면에 특이적으로 결합된 바이오티니얼 세피셜 마커 또는 형광과 같은 정적 물체를 포함하는 영역을 선택하여 이미지 스택을 안정화한다. 이 영역은 원래 스택에서 잘라서 안정화한 다음 결과 이동 값을 원래 스택에 적용합니다.
      참고: 실제로, 운동성 실험에서 관찰된 드리프트는 수백 nm/s에서 움직이는 myosins의 움직임에 비해 무시할 수 있지만, 가장 느린 근신의 경우 이것은 중요한 고려 사항이 됩니다.
    4. 그런 다음, 트랙 메이트를 엽니 다, 플러그인을클릭; 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 추적을 클릭하고 마지막으로 TrackMate에서 클릭합니다. 이 시점에서, 이미지 분석은 형광및 분석 조건의 매개 변수에 기초하여 최적화될 수 있다. 그러나 이상적인 시작 매개 변수는 다음과 같습니다.
      1. 교정 설정: 모든 기본 값을 유지합니다.
      2. 검출기: LoG 검출기.
      3. 추정 Blob 직경: 0.5-1.0 미크로른.
      4. 임계값: 25-200. (이 검색된 반점이 동영상과 일치하는지 여부를 확인하기 위해 숫자를 선택한 후 미리 보기를 클릭하고 적절하게 조정하여 결정할 수 있습니다.)
      5. 초기 임계값: 설정되지 않았습니다.
      6. 보기: 하이퍼스택 디스플레이.
      7. 반점에 필터를 설정합니다: 설정되지 않음.
      8. 추적기 : 간단한 LAP 추적기.
        참고: 프레임 속도와 근신 속도에 따라 달라지며 서로 다른 입자 간의 원치 않는 연결을 제외하면서 후속 위치를 연결할 수 있을 만큼 커야 합니다.
      9. 최대 거리 연결: 1.0 미크로른.
      10. 최대 간격: 1.0 미크로른.
      11. 간격 닫기 최대 프레임 간격: 1.
      12. 트랙의 필터 설정: 트랙 변위(>0.39~3픽셀 이상 이동하는 반점만 포함), 트랙의 스팟(>3~3개 이상의 트랙만 포함). 최소 속도와 같은 다른 필터는 장시간 정지된 반점을 제외하기 위해 도입될 수 있습니다. 필터링 결과는 트랙의 육안 검사를 통해 확인하여 액틴트랙과 관련된 트랙을 유지하면서 가짜 트랙(즉, 액틴 트랙을 따라 있지 않은 백그라운드의 myosin 움직임)을 제거해야 합니다.
    5. 디스플레이 옵션 화면이 올라오면 관련 출력에 대한 분석을 클릭합니다. 생성된 세 개의 테이블(트랙 통계, 트랙 통계의 링크 및 트랙 통계의 스팟)을 저장합니다. 트랙 통계 표는 새로운 단백질 또는 특정 실험 조건의 효과를 특성화하기 위하여 그 후에 분석될 수 있는 속도 및 변위 데이터를 포함할 것입니다, 예를 들면.

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Representative Results

미오신의 정제는 도2에 도시된 바와 같이 나트륨 도데딜 황산염-폴리아크라이글라미드(SDS-PAGE) 겔-전기포아를 감소시킴으로써 평가될 수 있다. 이 수치는 최종, 투석 후 myosin을 나타내지만, SDS-PAGE는 상체에 손실된 모든 제품을 식별하기 위해 정화 절차의 다양한 단계에서 알리쿼트에서 수행될 수 있다. 묘신 5a HMM은 120-130 kDa 범위에서 밴드를 가지고 있으며, 전체 길이 무근육 미오신 2b는 200-230 kDa 범위에서 밴드가 있으며, 중형 체인29,44에해당한다. 미신 5a는 또한 칼모둘린을 표시하는 17 kDa 마크 근처에 밴드가 있습니다. 비근육 미오신 2b는 ELC를 나타내는 약 17 kDa의 밴드가 있습니다. GFP 태그RLC는 이 NM2b 준비에 존재하기 때문에 RLC는 약 47 kDa에 나타납니다. 그러나, 표호되지 않은 RLC는 GFP로 태그되지 않으면 약 20 kDa에 존재합니다.

비디오 1 과 그림 3에 표시된 글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 이상적이고 추적 가능한 영화의 특성을 나타냅니다. 이 글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 라벨이 붙은 액틴 필라멘트의 매끄러운 움직임을 특징으로 합니다. 블랙 액틴 워시는 죽은 미오신 헤드가 측정 장에서 제거되어 액틴 필라멘트의 전반적인 매끄러운 움직임에 더욱 기여합니다. 형광으로 표시된 필라멘트는 단일 필라멘트가 자체적으로 교차하지 않을 만큼 짧으며 추적 프로그램에 더 적합합니다. 너무 긴 액틴 필라멘트는 다른 필라멘트를 넘어갈 것이며, 이는 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 추적 프로그램에 어려움을 초래할 수 있습니다. 이 문제는 커버슬립에 로드하기 전에 액틴 필라멘트를 전단하기 위해 10-20번 위아래로 피펫팅하여 피할 수 있습니다.

NM2b의 경우, 메틸셀룰로오스의 사용은 이미징 표면에서 떨어져 액틴의 확산을 감소시키기 때문에 기록된 영화의 품질을 크게 향상시킬 수 있다. M5a의 높은 의무 비율이 미오신 코팅 표면에 액틴을 더 강하게 부착할 수 있기 때문에 이것은 필요하지 않습니다. 메틸셀룰로오스를 사용하는 경우, 용액이 흐르도록 하기 위해 챔버를 통해 용액을 사두는 것이 필요하다. 비디오 2에도시된 바와 같이, 메틸셀룰로오스의 배제를 제외한 다른 모든 조건이 동일할 때, 액틴 필라멘트는 미오신 코팅 표면과 밀접하게 연관되어 있지 않습니다.

반대로, 비디오 3 및 도 4에 도시된 반전된 운동성 분석법의 목표는 미신 의 움직임을 관찰할 수 있는 표면테열형 형광액필라멘트를 소개하는 것이다. 반전된 분석의 중요한 요구 사항은 그림과 같이 FOV 에서 myosin 운동을 일관되게 관찰하는 것입니다. DTT, 포도당, 카탈라제 및 포도당 산화제의 혼합물을 사용하면 더 긴 측정을 허용하도록 광표백을 최소화할 수있습니다(52). 또한 분석의 획득 속도가 낮으면 프레임 획득 사이에 조명 을 차단하는 것은 과도한 광표백에 도움이 될 수 있습니다. 흥분 광의 셔터링은 기계식 셔터 또는 AOTF(aOTF)를 통해 수행할 수 있습니다.

Figure 1
도 1: 기능성 유량 세포 챔버의 준비. (A)청소 현미경 슬라이드, 약 2cm로 절단 된 양면 테이프의 두 조각, 기능적 커버 슬립으로 시작합니다. (B)현미경 슬라이드의 중앙에 테이프를 추가합니다. (C)커버슬립을 테이프에 부착하여 코팅(즉, 니트로셀룰로오스)을 아래로 향하고 있으며, 커버슬립이 챔버에 부착되었는지 확인하기 위해 플라스틱 파이펫 팁을 사용하여 테이프로 겹치는 부위를 부드럽게 누릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 발현 NM2b 및 M5a-HMM의 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기포고증. (A)전신 NM2b 헤비 체인(≈230 kDa)과 GFP-RLC(≈47 kDa) 및 ELC(≈17 kDa)를 위한 대표적인 SDS PAGE 젤 이미지. 겔 이미지 재현 및 멜리 외에서 수정 (2018)29. (B)M5a-HMM과 같은 중형 체인(≈120 kDa) 및 칼모둘린(≈17 kDa)의 대표적인 SDS PAGE 젤 이미지. 이 이미지의 젤에는 C-단말 끝에 삽입된 GFP가 없습니다. 미오신 중형사슬에 삽입된 GFP는 분자량을 ≈27 kDa로 증가시킨다. 젤 이미지 재현 및 수정은 원래 생물 화학 저널(44)에발표되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: TIRF 조명을 통해 획득한 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 결과. (A) 30°C에서 0.7% 메틸셀룰로오스가 있는 상황에서 0.2 μM NM2b에 로다민-팔로이드의 전좌를 보여주는 영화의 예프레임(A) 예프레임. 스케일 바 = 10 μm.(B)필라멘트 추적 이미지 출력은 NM2b용 NM2b에 대한(A)스케일 바 = 10 μm에 도시된 것과 동일합니다.(C)Acto-NM2b 글라이딩 속도의 대표적인 히스토그램, NM2b의 이 샘플이 15nm/s(평균 ± 표준 편차; 트랙 수 = 550)± 77의 액틴 글라이딩 속도를 생성할 수 있음을 보여준다. (D)75 nM M5a-HMM에 로다민-팔로이드 라벨액틴 필라멘트(빨간색)의 전좌를 보여주는 영화의 예 프레임. 스케일 바 = 10 μm.(E) (D)스케일 바 = 10 μm에 표시된 것과동일한 FOV에 대한 M5a-HMM에 대한 FASTrack 프로그램에 의한 필라멘트 추적 이미지 출력.(F)Acto-M5a-HMM 글라이딩 속도의 대표적인 히스토그램으로, 이 M5a 샘플이 515 ± 165 nm/s(± 표준 편차, 트랙 수 = 25098)의 액틴 글라이딩 속도를 생성할 수 있음을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: TIRF 조명을 통해 획득한 반전 분석 결과. (A)30°C에서 AF647-phalloidin(파란색으로 표시)으로 표시된 생체작 액틴 필라멘트에서 NM2b 필라멘트의 움직임을 보여주는 2채널 병합 이미지 스택의 대표적인 FOV. ELC 및 GFP-RLC와 함께 각각 발현되고 정제된 NM2b의 중합화된 필라멘트는 FOV에서 녹색, 길쭉한 입자로 관찰된다. 스케일 바 = 10 μm.(B)NM2b 필라멘트의 속도의 대표적인 히스토그램. 분석은 재료의 표에설명된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 단일 NM2b 필라멘트는 단일 액틴 필라멘트를 따라 이동할 때 84± 22 nm/s(표준 편차 ±, 추적된 입자 수 = 133)의 속도를 갖는다. (C)단일 액틴 필라멘트를 따라 NM2b 필라멘트 모션의 예키모그래프. 입자의 일부 영역은 NM2b 필라멘트의 "회전"을 나타내며, 이는 양극성 NM2b 필라멘트의 한쪽이 액틴 필라멘트에서 분리되는 시간을 가장 잘 나타내며, 이는 멜리 외29에이전에 나타난 바와 같이. (D)로다민-팔로이드(빨간색으로 표시)로 표시된 바이오타이니화 액틴 필라멘트에 대한 단일 분자 운동 M5a-HMM(녹색으로 표시)의 대표적인 FOV. 스케일 바 = 10 μm.(E)M5a-HMM의 실행 길이의 대표적인 히스토그램은 단일 지수에 적합합니다. 분석은 재료 목록에설명된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 특징적인 주행 길이는 1.3 μm이며 이 예에서는 1.23-1.42 μm의 95% 신뢰 구간이 있습니다. (F)단일 액틴 필라멘트에 대한 단일 분자 M5a-HMM 속도의 대표적인 히스토그램. 이미지 분석에서 분석된 데이터 출력은 평균 속도 668± 258 nm/s(표준 편차 ± 평균, 추적된 입자 수 = 684)를 나타낸다. (G)단일 액틴 필라멘트를 따라 M5a-HMM 운동의 단일 분자의 예 키모그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1: NM2b 및 M5a-HMM 글라이딩 액틴 필라멘트 분석의 비교. NM2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 30°C에서 메틸셀룰로오스(오른쪽; 비디오 패널 B)가 없는 메틸셀룰로오스(왼쪽; 비디오 패널 A)와 M5a-HMM의 존재에서 수행되었다. 타임스탬프는 M5a-HMM 비디오 패널과 비교하여 NM2b 비디오 패널에서 더 빠르게 진행되며, 로다민 라벨이 부착된 액틴 필라멘트(red)의 움직임을 거의 동일합니다. 이는 NM2b의 실제 액틴 전좌 속도가 M5a-HMM(77nm/s 대 515 nm/s)보다 7배 더 느리기 때문에, 가우시안 피크에서 추출하여 도 3의히스토그램에 적합하기 때문이다. 두 비디오 패널에서 배율 막대 = 10 μm. NM2b 데이터는 초당 0.33 프레임으로 200ms 노출로 수집되었습니다. M5a-HMM 데이터는 초당 5프레임에서 200ms 노출(연속)으로 획득한 후 초당 1프레임으로 다운 샘플링됩니다. 타임스탬프는 재료 목록에설명된 플러그인을 사용하여 추가되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2: 멜틸셀룰로오스가 없는 NM2b의 글라이딩 액틴 필라멘트 분석. 메틸셀룰로오스의 부재를 제외하고 다른 모든 조건이 동일할 때, 액틴 필라멘트는 때때로 0.2 μM NM2b로 코팅된 커버슬립에 잘 붙어 있지 않아 NM2b 코팅 커버슬립의 표면에 가까운 액틴 필라멘트가 있는 저품질 영화로 이어집니다. 스케일 바 = 10 μm. 이는 비디오 1의 왼쪽 비디오 패널(NM2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석)에 도시된 바와 같이 액틴 필라멘트의 부드러운 움직임을 보여주기 위해 메틸셀룰로오스를 도입하여 해결할 수 있다. 또 다른 대안은 NM2b 농도를 ≈1 μM으로 증가시키는 것입니다. 이 영화는 초당 0.33 프레임으로 200ms 노출로 획득했습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3: NM2b 및 M5a-HMM 반전 운동성 분석의 비교. NM2b 반전 운동성 분석은 메틸셀룰로오스의 존재에서 수행되었고 셔터(왼쪽; 비디오 패널 A)를 사용하여 초당 0.33 프레임의 속도로 기록되었지만, 비디오 패널 C는 A와 동일한 FOV를 나타내지만, 입자가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 식별되고 추적된다. 유사하게, 메틸셀룰로오스가 없는 경우 M5a-HMM에 대한 반전된 운동성 분석이 초당 5프레임(오른쪽; 비디오 패널 B)의 속도로 기록되었다. 비디오 패널 D는 B와 동일한 FOV를 보여 주지만 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 식별되고 추적된 파티클이 있습니다. 스케일 바 = 모든 비디오 패널에서 10 μm. 두 레이저는 수집을 위해 단일 카메라를 사용하여 앞뒤로 전환되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

버퍼 이름 구성 스텝(들) 사용 코멘트
M5a 추출 버퍼 0.3 M NaCl 1.1 얼음을 유지합니다.
15 mM 걸레, pH 7.2
15 mM MgCl2
1.5 mM EGTA
4.5 mM NaN3
NM2b 추출 버퍼 0.5 M NaCl 1.1 얼음을 유지합니다.
15 mM 걸레, pH 7.2
15 mM MgCl2
1.5 mM EGTA
4.5 mM NaN3
버퍼 A 0.5 M NaCl 2.2 얼음을 유지합니다.
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM DTT
5 mM MgCl2
버퍼 B 0.5 M NaCl 2.3 얼음을 유지합니다.
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM DTT
용출 버퍼 0.5 M NaCl 3.1 얼음을 유지합니다.
0.5 mg/mL 플래그 펩타이드
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
pH 7.2
M5a 투석 버퍼 500 mM KCl 4.1 차가운 dH2O를 사용하여 볼륨을 가져옵니다.
10 mM MgCl2
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b 투석 버퍼 25 mM NaCl 4.1 차가운 dH2O를 사용하여 볼륨을 가져옵니다.
10 mM MgCl2
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b 스토리지 버퍼 0.5 M NaCl 5.1 얼음을 유지합니다.
10 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3

표 1: 단백질 정제에 사용되는 버퍼.

버퍼 이름 조성물(M5a) 컴포지션(NM2b) 스텝( s) 사용(M5a/NM2b) 코멘트
4X 운동완충 (4X MB) 80 mM 걸프, pH 7.2 80 mM 걸프, pH 7.2 진공 필터 및 4°C에 보관
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0.4 mM EGTA 0.4 mM EGTA
pH 7.4 pH 7.4
50 mM 염분완완충 (50mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB 진공 필터 및 4°C에 보관
50mM KCl 50 mM NaCl
dH2O로 볼륨으로 올리기 dH2O로 볼륨으로 올리기
500 mM 염분완충 (500mM MB) N/A 25% v/v 4X MB 진공 필터 및 4°C에 보관
500 mM NaCl
dH2O로 볼륨으로 올리기
묘신 0.05-0.1 μM 묘신 0.2 μM 미신 4.2/5.2 얼음을 유지합니다.
1 mM DTT 1 mM DTT
50mM MB로 희석 500mM MB로 희석
1 mg/mL 소 소 세럼 알부민 (BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 4.3/5.3 얼음을 유지합니다.
50mM MB로 희석 500mM MB로 희석
1 mM DTT 1 mM DTT
5 μM 라벨이 없는 F-actin 50 mM MB (블랙 액틴) 5 μM 라벨이 없는 F-액틴 5 μM 라벨이 없는 F-액틴 4.5/5.5 얼음을 유지합니다. 전단은 5-10 회 위아래로 피펫팅하거나 주사기를 사용하여 작동합니다.
1 μM 칼모둘린 (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0.2 mM CaCl2
50mM MB로 희석 1 μM CaM
1-10 nM 미신 광 사슬 키나아제 (MLCK)
50mM MB로 희석
MB와 1mM DTT 및 1 mM ATP 1 mM DTT 1 mM DTT 4.6/5.6 얼음을 유지합니다.
1 mM ATP 1 mM ATP
50mM MB로 희석 50mM MB로 희석
DTT와 MB 1 mM DTT 1 mM DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 얼음을 유지합니다.
50mM MB로 희석 50mM MB로 희석
20 nM 로다민-팔로이드인 F-액틴 (Rh-액틴) 20 nM 로다민-팔로이드인 F-액틴 20 nM 로다민-팔로이드인 F-액틴 4.8/5.8 얼음을 유지합니다. 소용돌이하지 마십시오.
1 mM DTT 1 mM DTT
50mM MB로 희석 50mM MB로 희석
최종 버퍼 50mM KCl 0.7% 메틸셀룰로오스 (선택 사항) 4.10/5.10 실험을 수행하기 직전에 포도당, 포도당 산화제 및 카탈라아아제에 첨가하십시오. 얼음을 유지합니다.
20 mM 걸프, pH 7.2 50 mM NaCl
5 mM MgCl2 20 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0.1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM 칼모둘린 50 mM DTT
2.5 mg/mL 포도당 1-10 nM MLCK
100 μg/mL 포도당 산화제 0.2 mM CaCl2
40 μg/mL 카탈라아제 1 μM 칼모둘린
2.5 mg/mL 포도당
100 μg/mL 포도당 산화제
40 μg/mL 카탈라아제

표 2: 글라이딩 분석에 사용되는 버퍼입니다.

버퍼 이름 조성물(M5a) 컴포지션(NM2b) 스텝( s) 사용(M5a/NM2b) 코멘트
4X 운동완충 (4X MB) 80 mM 걸프, pH 7.2 80 mM 걸프, pH 7.2 진공 필터 및 4°C에 보관
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0.4 mM EGTA 0.4 mM EGTA
pH 7.4 pH 7.4
50mM염 연골 버퍼(50mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB 진공 필터 및 4°C에 보관
50mM KCl 50 mM NaCl
dH2O로 볼륨으로 올리기 dH2O로 볼륨으로 올리기
150 mM 염분완충 (150mM MB) 25% v/v 4X MB 진공 필터 및 4°C에 보관
150 mM NaCl
dH2O로 볼륨으로 올리기
묘신 30 nM 미신 "최종 버퍼" 레시피/4.12 참조 얼음을 유지합니다.
1 mM DTT
150mM MB로 희석
2 mg/mL 노이트르아비딘 2 mg/mL 노이트르아비딘 2 mg/mL 노이트르아비딘 3.5/4.8 얼음을 유지합니다.
1 mM DTT 1 mM DTT
50mM MB로 희석 150mM MB로 희석
1 mg/mL 소 소 세럼 알부민 (BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 3.3/4.6 얼음을 유지합니다.
1 mM DTT 1 mM DTT
50mM MB로 희석 150mM MB로 희석
200 nM 로다민-팔로이드바이오티렌 F-액틴 (bRh-Actin) 200 nM 로다민-팔로이드 바이오타이니얼 F-액틴 200 nM 로다민-팔로이드 바이오타이니얼 F-액틴 3.7/4.10 소용돌이를 피하거나 위아래로 피펫팅하지 않음으로써 전단을 피하십시오. 혼합하려면 부드럽게 반전하십시오.
1 mM DTT 1 mM DTT
50mM MB로 희석 150mM MB로 희석
DTT와 MB 50 mM DTT 50 mM DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 얼음을 유지합니다.
50mM MB로 희석 150mM MB로 희석
최종 버퍼 50mM KCl 0.7% 메틸셀룰로오스 (선택 사항) 3.9/4.14 실험을 수행하기 직전에 포도당, 포도당 산화제 및 카탈라아아제에 첨가하십시오. 얼음을 유지합니다.
20 mM 걸프, pH 7.2 50 mM NaCl
5 mM MgCl2 20 mM 걸프, pH 7.2
0.1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0.1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM 칼모둘린 50 mM DTT
2.5 mg/mL 포도당 1-10 nM MLCK
100 μg/mL 포도당 산화제 0.2 mM CaCl2
40 μg/mL 카탈라아제 1 μM 칼모둘린
10 nM 묘신 2.5 mg/mL 포도당
100 μg/mL 포도당 산화제
40 μg/mL 카탈라아제

표 3: TIRF 분석에서 사용되는 버퍼입니다.

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Discussion

여기에 제시된 미오신 5a 및 비근육 미오신 2b의 정제 및 체외 특성화를 위한 워크플로우가 있습니다. 이 실험 세트는 정제된 myosin 구조의 메카노케미컬 특성을 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 데 유용합니다. 여기에 표시된 두 개의 myosins는 많은 가능성에서 단지 두 가지 특정 예이지만, 조건과 기술은 대부분의 myosins및 다른 많은 모터 단백질에, 일부 재단과 함께 적용 될 수있다.

여기에서 설명하는 프로토콜은 실험실 및 실험의 개별 요구에 따라 변형될 수 있습니다. 예를 들어, 발현 및 분자 생물학 섹션에서 설명한 바와 같이, 이 논문에 사용된 단백질은 두 개 이상의 바이러스의 공동 감염으로부터 생성되었다; 그러나, 성공적인 단백질 발현은 p-FastBac 이중 발현 벡터 또는 BiGBac 발현시스템(53)과같은 다발성 벡터로달성될 수 있다.

몇몇 요인은 재조합 단백질의 성공적인 생산을 방해할 수 있습니다. 단백질 분해를 방지하기 위해 단백질 정화의 모든 단계가 적절한 온도에서 완료되며, 모든 원심 분리 단계는 4°C에서 발생하고 다른 모든 단계는 얼음에서 수행됩니다. 과잉 밴드는 투석 단백질 생성물의 겔에서 명백할 수 있다. 이것은 저하 또는 오염을 나타낼 수 있습니다. 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통한 후속 정제는샘플(54)의순도를 향상시킬 수 있다. 그 효과를 위해, 문제 해결을 위한 단백질 정제 과정의 각 단계에서 알리코트를 저장하는 것이 좋습니다, 미오신또는 의심되는 단백질 오염의 낮은 수율이 있는 경우에. 때로는 1.8 단계에서 수지에 대한 용액의 부적절한 결합이 있을 수 있으며, 이는 후속 원심분리에서 상체에 미오신을 상실시킬 수 있다. 이 문제는 이 단계에서 수지 바인딩 기간을 변경하여 해결될 수 있으며, 필요한 경우 하룻밤 동안 바인딩하도록 남겨두기도 합니다. 더 긴 잠복기는 오염 물질 프로테아제가 충분히 억제되지 않으면 단백질 분해의 더 큰 위험을 소개하고, 프로테오틸리테학적으로 민감한 부위를 가진 myosins는 부정적인 영향을 받을 것입니다. 또한, 사용 전후수지의 부적절한 세척은 원치 않는 단백질 생성물의 용출을 초래할 수 있으므로 FLAG-선호도 수지 사용 전후에 적절한 프로토콜을 따라야 합니다. 사용 직후 수지를 세척하고 적절하게 보관하면 최대 20회 재사용할 수 있습니다.

단백질 분해는 발현 단계에서도 발생하며 발현 시간을 단축하는 것이 총 수율의 희생일 수 있지만 저하 측면에서 유리할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 프로토콜의 다른 단계에서 단백질 샘플을 모니터링하기 위해 여기에 설명된 절차에 따라(즉, 정화 전, 도중 및 정화 후)은 최적화에 필요한 단계를 결정하는 데 도움이 됩니다. 반복적으로 성공적인 표현과 정제에 저항하는 myosins의 경우, 일반적인 문제는 과발현 동안 부적절한 접이식뿐만 아니라 부족하거나 부적절한 광 사슬과 공동 표현 이 될 수 있습니다. 적절한 광 사슬은 가능한 경우 알려진 상호 작용에 따라 선택되어야하며, 경량 체인 바쿨로 바이러스 비율에 대한 무거운 사슬은 최적의 여부를 결정하기 위해 소규모 실험에서 테스트해야합니다. 수용성 활성 제품을 거의 또는 전혀 산출하지 않는 myosins의 경우, 샤페론과의 공동 발현은 활성 단백질54,55를성공적으로 얻는 데 도움이 될 수 있다.

정제 된 myosin 제품은 필연적으로 두 가지 방법으로 해결 될 수있는 "죽은 머리"라고 불리는 손상된 미오신의 작은 인구를 포함합니다. 이 프로토콜에 설명된 한 가지 방법은 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서 챔버를 통해 라벨이 없는 또는 "검은색"을 흐르는 것을 포함합니다. 이후 ATP로 세척하면 기능성 근신이 검은 색 액틴에서 해리되는 원인이 되며, 죽은 머리는 ATP를 가수분해할 수 없기 때문에 라벨이 부착되지 않은 액틴에 묶여 있으며 높은 친화력으로 인해 부착되지 않습니다. 블랙 액틴 워시를 수행하는 동안 주사기를 사용하여 액틴을 효과적으로 전단할 수 있습니다. 결과 기포가 원심분리에 의해 제거되는 경우 추가 전단은 소용돌이에 의해 달성 될 수있다. 대안적 방법은 미오신 시료로부터 죽은 머리를 F-actin 및 Mg-ATP와 혼합하여 높은 염(0.5M) 농도로 혼합하고 테이블 탑 울트라센티어에 침전시키는 것입니다. 이러한 조건하에서 ATP를 가수분해할 수 있는 묘신은 이러한 높은 염조건에서 액틴에 대한 낮은 친화력으로 인해 액틴에 얽매이지 않고 상퍼상에서 발견되는 반면, 미오신 죽은 머리는펠릿(56)의액틴에 묶여 있다. 유사하게, 탄환의 액틴 및 재발을 이용한 퇴적물또한 ATP가 없을 때 작용할 수 없는 미오신을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 죽은 머리의 작은 비율은 이러한 유형의 분석에 미치는 영향이 적습니다. 뉴클레오티드 없는 퇴적및 재발을 수행함으로써 ATP 결합 원심분리 및 재발을 거쳐 액틴 결합 및 액틴에서 ATP 의존방출모두에 유능한 묘신을 분리할 수 있다.

운동성 검사도 여러 가지 방법으로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, NM2b용 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서, NM2b는 MLCK, 칼모둘린, 칼슘 및 ATP를 블랙 액틴 스텝에 첨가하고 최종 버퍼에서 인포로매된다. 그러나, NM2b는 또한 분석행위를 수행하기 전에 튜브에서 인광될 수 있다. 이를 통해, 인광형 NM2b의 백분율은 우레아 함유 시료 버퍼를 가진 네이티브 젤을 실행하거나 질량분광법(57,58)을수행함으로써 정량화될 수 있다. 미오신 활동에 대한 온도의 영향도 조사될 수 있다. 이는 현미경 또는 환경 인클로저에 객관적인 가열 시스템을 사용하여 유동 셀이 일정한 온도에서 유지되도록 함으로써 달성될 수 있다. 이온의 힘은 또 다른 중요한 고려 사항입니다. 많은 myosins에 대 한, 액 틴 친화 와 효소 활동 낮은 이온 강도에서 증가 될 것 이다; 다른 사람에 대 한, 높은 이온 강도 필요59. 미오신 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공하는 것 외에도 이온 강도를 낮추면 운동성을 향상시키고 많은 assays를 사용하여 조사에 myosin에 더 쉽게 접근 할 수 있습니다. 반면, 일부 모터는 정전기 테더링 효과를 나타내며, 이온 강도가 낮아지며 운동성이 느려집니다. 마지막으로, NM2b 필라멘트의 움직임을 알수 때, 대부분의 세포 유형에서 발견되는 것을 근사화하는 좁은 범위(150-200 mM 이온 강도) 내에서 이온 강도를 유지하는 것이 중요합니다. 낮은 이온 강도의 사용은 미오신 필라멘트의 집계를 초래하고 필라멘트는 더 높은 이온 적 강점에서 중합됩니다.

많은 myosins와 함께, 특히 낮은 의무 비율을 가진 사람들, M5a에 대 한 주어진 최종 버퍼의 조건형 표시 된 actin 필라멘트는 느슨하게 표면에 바인딩 되 거나 완전히 해리. 이로 인해 정량화를 복잡하게 만드는 불규칙한 움직임이 발생합니다. 더 나은 품질의 움직임은 종종 최종 버퍼에서 메틸 셀룰로오스 (0.7 %)를 사용하여 얻을 수 있습니다. 메틸셀룰로오스는 점성 밀집제이며 부착된 미오신 모터의 밀도가 희박하더라도 표면에 가깝게 유지하도록 액틴 필라멘트가서있다. 유사하게, 단일 필라멘트 운동성 분석의 최종 완충액에 메틸셀룰로오스를 포함시키는 것이 NM2a와 의 움직임을 관찰할 필요가 있는 것으로 관찰되었으며, 동일한 현상은 부드러운 근육 미신필라멘트(29,61)에대해 보고되었다. 이것은 또한 NM2b 필라멘트의 처리성을 증가시킵니다. 이 분석에서 메틸셀룰로오스를 사용하는 한 가지 잠재적으로 원치 않는 부작용은 혼잡 에이전트 속성이 모신 필라멘트의 측면 연결을 번들로 홍보 할 수 있다는 것입니다. 멜틸셀룰로오스에 대한 대안은 운동성 액틴 필라멘트 분석에서 운동의 부족 또는 느슨하게 바운드된 액틴 필라멘트를 문제 해결하면 운동성 완충제에서 염농도를 낮추거나 근신 표면 밀도를 증가시키는 것이다. 위에서 언급했듯이, 운동성 완충제에서 높은 이온 강도는액틴 29,34,62에결합하는 일부 묘신의 능력을 낮추는 것으로 나타났다.

글라이딩 액틴 필라멘트 분석의 또 다른 변형은 미신을 유리 표지 슬립에 고정시키기 위해 항체를 사용하는 것이다. 예를 들어, GFP가 미오신 구조의 C-말단 끝에 존재하는 경우, 항GFP 항체는 GFP-미신을커버슬립(36,63,64)으로고치기 위해 사용될 수 있다. 이는 시스템의 형상이 인공 또는 짧은 레버암(54, 64)을테스트하는 경우와 같이 actin 전좌를 방해할 수 있는 상황에서 성공적인 운동성을 얻는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 전좌 속도에 대한 부하의 효과는 α 액틴 또는 우트로핀(utrophin39,50,65)과같은 액틴 결합 단백질을 사용하여 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서 조사될 수 있다. 이러한 측정은 광학 트래핑분석66,67을이용하여 측정할 수 있는 단일 묘신의 하중 의존역학과 묘신의앙상블에 대한 하중의 효과를 비교하는 데 유용할 수 있다. 이것은 초기 단계에서 myosin와 더불어 actin 결합 단백질의 증가양을 추가하여 달성될 수 있습니다. 액틴 결합 단백질은 표면에 결합하고 근신에 의해 이동하는 액틴 필라멘트에 마찰 부하를 가해 표면에 액틴 결합 단백질의 농도가 증가함에 따라 속도 저하시39가된다.

단일 분자/앙상블 운동성 분석법은 또한 미오신 운동에 대한 다양한 액틴 구조의 효과를 조사하기 위해 적응될 수 있다. 예를 들어, 단일 액틴 필라멘트, 파신 또는 α 액틴 매개 액틴 번들 위에 미오신 운동을 관찰하는 대신 세포68,69에서발견되는 액틴 필라멘트 네트워크의 체외 재구성으로서 연구될 수 있다. 트로포묘신과 같은 액틴 결합 단백질의 효과도65,70,71,72를연구할 수 있다.

주목할 점은 단일 분자/앙상블 운동성 분석기라벨을 선택하는 데 다재다능함입니다. 이 보고서에서는 M5a-HMM 및 NM2b 모두에서 GFP 라벨이 사용되었습니다. 그러나 다른 많은 레이블을 사용할 수 있습니다. 예로는 모진에 유전적으로 융합되고 합성 염료를 공유하여 결합할 수 있는 HaloTag 또는 SNAP 태그가 있습니다. HaloTag 기술의 장점은 다양한 색상으로 라벨을 붙이거나 비오틴 선호도 태그29,73을추가하는 등 여러 실험적 적응을 위한 다재다능함에 있습니다. 또한, 퀀텀닷 기술의 사용은 단일 분자 형광 추적의 해상도를 개선하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 또한 GFP의 낮은 밝기의 제한과74의광표백 경향을 해결한다. 태그는 라이트 체인뿐만 아니라 무거운 체인(11,75,76)에성공적으로 부착 할 수 있습니다.

단일 분자 TIRF 운동성 분석에서 성공을 달성하기 위해 핵심 요소는 잘 차단되고 기능화된 표면을 사용하는 것입니다. 적당한 차단을 달성하는 간단한 방법은 니트로 셀룰로오스 표면에 바인딩 된 생체 개화 -BSA를 사용하는 것입니다. M5a를 포함한 많은 모터의 특성화에 충분히 적합하지만, 이러한 표면에 비특이적 결합수준은 NM2b와 같은 시료로 깨끗한 움직임을 재현하는 것이 금지됩니다. 이 와 관련하여 중요한 돌파구는 기능화를 위한 비오틴-PEG로 도핑된 PEGylated 표면으로의 전환이었다77. PEG 표면은 표면 차단의 훨씬 우수한 수준을 제공하고 결함이없는 PEGylated 표면은 매우 오랜 기간 동안 비특이적 결합이 없는 상태로 유지될 수 있습니다. 여기에 자세히 설명된 특정 프로토콜은 몇 시간 만에 생체 화PEG 표면의 생산을 허용하고 설명된 대로 즉시 저장되면 표면은 품질이 미미한 감소만으로 몇 주 동안 사용할 수 있습니다.

추적을 위한 데이터를 수집하기 전에 고려해야 할 주요 고려 사항은 수집 프레임 속도입니다. 후속 프레임 간의 이동은 오버샘플링 오류를 방지할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 높은 샘플링 속도는 작은 시간 간격으로 지역화 오차의 분할로 인해 과대 평가 된 속도를 산출하고 측정의 명백한 오차를 증가시게됩니다. 원시 데이터를 너무 미세하게 샘플링하는 경우 모든 Nth 프레임을 사용하여 새 스택을 만들고 결과되는 프레임 속도의 변화를 고려하여 데이터를 다운 샘플링할 수 있습니다. 프레임 사이의 하위 픽셀 이동을 피해야 하며 정확한 값을 얻으려면 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 새 샘플이 특징인 모든 경우 자동화된 분석에 의해 생성된 결과를 일관성을 위해 수동으로 추적된 필라멘트의 작은 데이터 집합과 비교해야 합니다.

단일 분자 운동성 실험에서 데이터를 분석할 때 측정할 매개 변수, 데이터를 필터링하는 방법 및 데이터에 맞는 방법을 선택할 때주의해야 합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 샘플링 속도는 속도 데이터를 분석할 때 중요한 요소가 될 수 있습니다. 많은 myosins에 대 한, 프로세스 실행 짧고 잘 직선에 의해 근사치 될 것입니다. 이러한 경우, 트랙의 종점 거리 시작은 실행 길이의 양호한 측정값을 제공할 수 있으며, 이는 트랙의 지속 시간으로 나누어 속도의 양호한 추정치를 산출할 수 있다. 트랙이 매우 길고 구부러진 필라멘트 주변의 곡선 경로를 따르는 경우, 이러한 유형의 분석은 부정확한 결과를 산출하고 이동한 총 거리를 사용해야 하며, 연속적인 현지화 지점을 사용하여 위에서 설명한 과샘플링 오류를 피하기에 충분히 충분히 간격을 두는 동시에 둘 사이의 직선 거리가 곡선의 양립거리가 양호한 근사치로 유지될 수 있도록 합니다. 또한, 트랙의 길이와 관련하여 장기 길이의 모터 단백질의 경우, 주행길이(78)를계산할 때 카플란-마이어 추정기와 같은 추가 통계를 만들어야 한다. 처리 실행이 끝나기 전에 포토표백이 충분히 발생할 가능성이 있는 상황도 마찬가지입니다. 단일 분자 형광 연구에서 관찰 될 수있는 또 다른 현상은 형광이 켜기와 오프 상태 사이를 빠르게 전환하고 깜박이는 것처럼 보이는 포토 블링입니다. 이것은 전형적으로 이 운동성 실험에서 생기지 않습니다; 그러나, 이 경우, 레이저 강도 및 노출 시간을 감소시킬 수 있는 효과를 최소화 해야 합니다. β-메르카토에탄올, 트로록스, 사이클로옥타테라엔, n-프로필 갈레이트, 4니트로벤질 알코올, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄을 포함한 여러 화학 물질을 이뿐만 아니라79를완화하는 데 사용할 수 있다.

요약하자면, 이 문서에서는 액틴 전좌 속도, 근신 전좌 속도 및 myosin 실행 길이와 같은 메카노케미컬 특성을 정량화하는 능력이 견고한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 소는 재현가능하며, 운동특성이 연구의 특정 최종 목표가 아닌 상황에서도 정제된 묘신의 품질을 결정하는 데 사용될 수 있다. 또한, pH, 온도 및 화학 레귤레이터와 같은 변화는 이러한 분석을 도입하여 연구된 미오신의 메카노화학이 어떻게 영향을 받는지 검토할 수 있다. 함께 종합하면 액틴 글라이딩과 반전된 운동성 분석법은 분자 운동 역학 및 운동학에서 미오신 앙상블 동작및 분자 간 변이를 더 잘 이해할 수 있습니다. 여기에 설명된 형광 현미경 현미경 기지를 둔 assays는 cytoskeletal 연구에 환원주의자의 접근을 지원하고 시험관에서 단백질 단백질 역학을 이해하는 강력한 공구일 수 있습니다. 이 고도로 통제된 실험에서 수집된 데이터는 세포 생물학 수준 및 그 너머에서 관련될 수 있는 주요 actomyosin 행동의 메카노생물학자에게 조언하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 데이터 수집에 사용되는 시약의 준비와 함께 기술 지원을 준 Fang Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NHLBI / NIH 교내 연구 프로그램 기금 HL001786J.R.S.에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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