Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Præsenteret her er en procedure for at udtrykke og rense myosin 5a efterfulgt af en diskussion af dens karakterisering, ved hjælp af både ensemble og enkelt molekyle in vitro fluorescens mikroskopi-baserede assays, og hvordan disse metoder kan ændres til karakterisering af nonmuscle myosin 2b.

Abstract

Myosinproteiner binder og interagerer med filamentøs actin (F-actin) og findes i organismer på tværs af det fylogenetiske træ. Deres struktur og enzymatiske egenskaber er tilpasset den særlige funktion, de udfører i celler. Myosin 5a forarbejder går på F-actin at transportere melanosomer og vesikler i celler. Omvendt fungerer nonmuscle myosin 2b som en bipolar filament, der indeholder ca. 30 molekyler. Det bevæger F-actin af modsatte polaritet mod midten af glødetråden, hvor myosin molekyler arbejde asynkront at binde actin, give en magt slagtilfælde, og dissociate før du gentager cyklus. Nonmuscle myosin 2b, sammen med sin anden nonmuscle myosin 2 isoformer, har roller, der omfatter celle vedhæftning, cytokinesis, og spænding vedligeholdelse. Mekanokemi af myosiner kan studeres ved at udføre in vitro motilitetsanalyser ved hjælp af rensede proteiner. I gliding actin filament assay, myosiner er bundet til et mikroskop coverlip overflade og translokere fluorescerende mærket F-actin, som kan spores. I enkelt molekyle / ensemble motilitet assay, dog F-actin er bundet til en coverlip og flytning af fluorescerende mærket myosin molekyler på F-actin observeres. I denne rapport er rensningen af rekombinant myosin 5a fra Sf9-celler ved hjælp af affinitetskromatografi skitseret. Efter dette skitserer vi to fluorescensmikroskopibaserede assays: den glidende actin filament assay og den omvendte motilitetsanalyse. Fra disse analyser kan parametre som actin translokation hastigheder og enkelt molekyle løbelængder og hastigheder udvindes ved hjælp af billedanalyse software. Disse teknikker kan også anvendes til at studere bevægelsen af enkelt filamenter af nonmuscle myosin 2 isoformer, diskuteret heri i forbindelse med nonmuscle myosin 2b. Denne arbejdsgang repræsenterer en protokol og et sæt kvantitative værktøjer, der kan bruges til at studere enkeltmolekyle- og ensembledynamikken i nonmuscle myosiner.

Introduction

Myosiner er motoriske proteiner, der udøver kraft på actin filamenter ved hjælp af energi stammer fra adenosin triphosphat (ATP) hydrolyse1. Myosiner indeholder et hoved-, hals- og haledomæne. Hoveddomænet indeholder det handlingsbindende område samt STEDET for ATP-binding og hydrolyse. Halsdomænerne består af IQ-motiver, der binder sig til lyskæder, calmodulin eller calmodulinlignende proteiner2,3. Halen regionen har flere funktioner, der er specifikke for hver klasse af myosiner, herunder men ikke begrænset til dimerisering af to tunge kæder, binding af lastmolekyler og regulering af myosin via autoinhibitory interaktioner med hoveddomænerne1.

Myosins bevægelige egenskaber varierer meget mellem klasserne. Nogle af disse egenskaber omfatter toldforhold (den brøkdel af myosins mekaniske cyklus, hvor myosinen er bundet til at virke) og processivitet (en motors evne til at foretage flere trin på sit spor før løsrivelse)4. De over 40 klasser af myosiner blev bestemt på grundlag af sekvensanalyser5,6,7,8. Klasse 2 myosiner er klassificeret som "konventionelle", da de var de første til at blive undersøgt; alle andre klasser af myosiner er derfor klassificeret som "ukonventionelle.".

Myosin 5a (M5a) er en klasse 5 myosin og er en procesiv motor, hvilket betyder, at den kan tage flere skridt langs actin før dissociating. Det har et højt toldforhold, hvilket indikerer, at det bruger en stor del af sin mekaniske cyklus bundet til at actin9,10,11,12,13,14. I lighed med andre myosiner indeholder den tunge kæde et N-terminalmotordomæne, der omfatter både et actin-bindings- og et ATP-hydrolysested efterfulgt af en halsregion, der fungerer som løftestangsarm, med seks IQ-motiver, der binder sig til essentielle lyskæder (ELC) og calmodulin (CaM)15. Haleregionen indeholder α-spiralformede oprullede spoler, som dæmper molekylet, efterfulgt af en kugleformet haleregion til binding af last. Dens kinetik afspejler dens involvering i transport af melanosomer i melanocytter og af det endoplasmiske reticulum i Purkinje neuroner16,17. M5a betragtes som den prototypiske lasttransportmotor18.

Klasse 2 myosiner, eller de konventionelle myosiner, omfatter myosiner, at magt sammentrækning af skelet, hjerte, og glat muskel ud over nonmuscle myosin 2 (NM2) isoformer, NM2a, 2b, og 2c19. NM2 isoformer findes i cytoplasma af alle celler og har fælles roller i cytokinesis, vedhæftning, væv morfogenese, og celle migration19,20,21,22. Dette papir diskuterer konventionelle myosin protokoller i forbindelse med nonmuscle myosin 2b (NM2b)23. NM2b, i forhold til M5a, har en lav told ratio og er enzymatisk langsommere med en Vmax på 0,2 s-123 i forhold til M5a's Vmax på ≈18 s-124. Især afkortede NM2b-konstruktioner med to hoveder bevæger sig ikke let processivt på actin; snarere, hvert møde med actin resulterer i en magt slagtilfælde efterfulgt af dissociation afmolekylet 25.

NM2b indeholder to myosin tunge kæder, hver med en kugleformet hoved domæne, en løftestang-arm (med en ELC og en regulerende lyskæde (RLC)), og en α-spiralformede coiled-coil stang / hale domæne, ca 1.100 aminosyrer lang, at dæmper disse to tunge kæder. NM2b's enzymatiske aktivitet og strukturelle tilstand reguleres af fosforylering af RLC23. Unphosphorylated NM2b, i nærværelse af ATP og fysiologiske ioniske styrker (ca. 150 mM salt), vedtager en kompakt kropsbygning, hvori de to hoveder gør deltage i en asymmetrisk interaktion og halen folder tilbage over hovedet to steder23. I denne tilstand interagerer myosin ikke stærkt med actin og har meget lav enzymatisk aktivitet. Ved RLC fosforylering ved calmodulin-afhængige myosin lyskæde kinase (MLCK) eller Rho-associeret protein kinase, molekylet udvider og forbinder med andre myosiner gennem halen regionen til at danne bipolar filamenter af ca 30 myosin molekyler23. Ovennævnte fosforylering af RLC fører også til øget actin-aktiveret ATPase aktivitet NM2b med ca . Denne bipolar glødetråd arrangement, byder på mange myosin motorer i hver ende, er optimeret til roller i sammentrækning og spænding vedligeholdelse, hvor actin filamenter med modsatrettede polariteter kan flyttes i forhold til hinanden23,29. Derfor har NM2b vist sig at fungere som et ensemble af motorer, når de interagerer med actin. Det store antal motorer i denne glødetråd gør det muligt for NM2b filamenter at bevæge sig forarbejdet på actin filamenter, hvilket gør in vitro filament processivitet muligt at karakterisere29.

Mens der er gjort fremskridt med at forstå myosins rolle i cellen, er der behov for at forstå deres individuelle egenskaber på proteinniveau. For at forstå actomyosin interaktioner på et simpelt protein-protein interaktionsniveau, snarere end inde i en celle, kan vi udtrykke og rense rekombinante myosiner til brug i in vitro undersøgelser. Resultaterne af sådanne undersøgelser informerer derefter mekanobiologer om de biofysiske egenskaber ved specifikke myosiner, der i sidste ende driver komplekse cellulære processer12,13,14,25,29. Typisk opnås dette ved at tilføje en affinitet tag til en fuld længde eller afkortet myosin konstruere og rense via affinitet kromatografi29,30,31. Derudover kan konstruktionen konstrueres til at omfatte en genetisk kodbar fluorophore eller et tag til proteinmærkning med en syntetisk fluorophore. Ved at tilføje en sådan fluorescerende etiket, enkelt molekyle billeddannelse undersøgelser kan udføres for at observere myosin mekanik og kinetik.

Efter rensning kan myosinen karakteriseres på flere måder. ATPase aktivitet kan måles ved hjælp af kolorimetriske metoder, der giver indsigt i motorens samlede energiforbrug og handle i affinitet under forskellige forhold32. For at lære om mekanokemien af dens motilitet kræves yderligere eksperimenter. Dette papir beskriver to in vitro fluorescensmikroskopibaserede metoder, der kan bruges til at karakterisere de bevægelige egenskaber ved et renset myosinprotein.

Den første af disse metoder er den glidende actin filament assay, som kan bruges til kvantitativt at studere myosinmotorernes ensembleegenskaber samt kvalitativt studere kvaliteten af et parti renset protein33. Selv om dette papir diskuterer brugen af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi til denne analyse, kan disse eksperimenter effektivt udføres ved hjælp af en wide-field fluorescens mikroskop udstyret med et digitalt kamera, almindeligvis findes i mangelaboratorier 34. I denne analyse er et mætningslag af myosinmotorer fastgjort til en coverlip. Dette kan opnås ved hjælp af nitrocellulose, antistoffer, membraner, SiO2-derivatiserede overflader (såsom trimethylchlorosilane), blandt andet29,33,35,36,37,38. Fluorescerende mærket actin filamenter er passeret gennem coverslip kammer, hvorpå actin binder sig til myosin fastgjort til overfladen. Ved tilsætning af ATP (og kinaser i studiet af NM2) afbildes kammeret for at observere translokationen af actin filamenter ved de overfladebundne myosiner. Sporingssoftware kan bruges til at korrelere hastigheden og længden af hver glidende actin filament. Analysesoftware kan også give et mål for antallet af både bevægelige og stationære aktinfilamenter, hvilket kan være nyttigt at bestemme kvaliteten af en given myosinforberedelse. Andelen af gået i stå filamenter kan også bevidst moduleres ved overflade tøjring af actin til andre proteiner og måles for at bestemme belastningen afhængighed af myosin39. Da hver actin filament kan fremdrives af et stort antal tilgængelige motorer, er denne analyse meget reproducerbar, idet den endelige målte hastighed er robust til forstyrrer såsom ændringer i start myosinkoncentrationen eller tilstedeværelsen af yderligere faktorer i opløsningen. Det betyder, at det let kan ændres for at studere myosinaktivitet under forskellige forhold, såsom ændret fosforylering, temperatur, ionstyrke, opløsningsviskositet og virkningerne af belastning induceret af overfladeliner. Selv om faktorer som stærkt bindende myosin "døde hoveder" ude af stand til ATP hydrolyse kan forårsage gået i stå actin filamenter, flere metoder findes for at afbøde sådanne problemer og give mulighed for nøjagtige målinger. Myosins kinetiske egenskaber varierer meget på tværs af klasser, og afhængigt af den specifikke myosin, der anvendes, kan hastigheden af actin filament glide i denne analyse variere fra under 20 nm / s (myosin 9)40,41og op til 60.000 nm / s(Characean myosin 11)42.

Den anden analyse inverterer geometrien af den glidende actin filament assay12. Her er actin filamenter fastgjort til coverslip overfladen og bevægelsen af enkelte molekyler af M5a eller af individuelle bipolære filamenter af NM2b visualiseres. Denne analyse kan bruges til at kvantificere løbelængder og hastigheder af enkelt myosin molekyler eller filamenter på actin. En coverlip er belagt med en kemisk forbindelse, der blokerer ikke-specifik binding og samtidig funktionaliserer overfladen, såsom biotin-polyethylen glycol (biotin-PEG). Tilsætningen af modificerede avidinderivater derefter primtal overfladen og biotinylerede actin er passeret gennem kammeret, hvilket resulterer i et lag af F-actin stabilt bundet til bunden af kammeret. Endelig er aktiveret og fluorescerende mærket myosin (typisk 1-100 nM) flød gennem kammeret, som derefter afbildes for at observere myosin bevægelse over den stationære actin filamenter.

Disse modaliteter repræsenterer hurtige og reproducerbare metoder, der kan anvendes til at undersøge dynamikken i både nonmuscle og muskel myosiner. Denne rapport skitserer procedurerne for rensning og præget af både M5a og NM2b, der repræsenterer henholdsvis ukonventionelle og konventionelle myosiner. Dette efterfølges af en diskussion af nogle af de myosin-specifikke tilpasninger, som kan udføres for at opnå en vellykket indfangning af bevægelse i de to typer af analysen.

Udtryk og molekylærbiologi
CDNA for myosin af interesse skal klones på en modificeret pFastBac1 vektor, der koder for enten en C-terminal FLAG-tag (DYKDDDDK), hvis der udtrykkes M5a-HMM, eller en N-terminal FLAG-tag, hvis der udtrykkes fuld længde molekyle af NM2b23,43,44,45,46. C-terminal FLAG-tags på NM2b resulterer i en svækket affinitet af proteinet for FLAG-affinitet kolonne. I modsætning hertil binder N-terminalt FLAG-mærket protein normalt godt til FLAG-affinitetskolonnen23. Det N-terminalt mærkede protein bevarer enzymatisk aktivitet, mekanisk aktivitet og fosforyleringsafhængig regel23.

I dette papir, en afkortet mus M5a tunge meromyosin (HMM)-lignende konstruere med en GFP mellem FLAG-tag og C-endestation af myosin tung kæde blev brugt. Bemærk, at I modsætning til NM2b kan M5a-HMM mærkes og renses med enten N- eller C-terminal FLAG-tags, og i begge tilfælde vil den resulterende konstruktion være aktiv. Den tunge M5a-kæde blev afkortet ved aminosyre 1090 og indeholder en tre aminosyreforbindelse (GCG) mellem GFP og spole-spoleregionen I M5a47. Der blev ikke tilføjet yderligere linker mellem GFP- og FLAG-koden. M5a-HMM blev co-udtrykt med calmodulin. Den menneskelige NM2b-konstruktion i fuld længde blev udtrykt i samarbejde med ELC og RLC. N-termini af RLC blev fusioneret med en GFP via en linker af fem aminosyrer (SGLRS). Direkte knyttet til FLAG-tag var en HaloTag. Mellem HaloTag og N-endestation af myosin tunge kæde var en linker lavet af to aminosyrer (AS).

Begge myosinpræparater blev renset fra en liter Sf9 cellekultur inficeret med baculovirus ved en tæthed på ca. 2 x 106 celler / mL. Mængderne af baculovirus for hver underenhed afhang af virusets mangfoldighed af infektion som bestemt af producentens instruktioner. I tilfælde af M5a, celler blev co-inficeret med to forskellige baculovirus-en for calmodulin, og en for M5a tung kæde. I tilfælde af NM2b, celler blev co-inficeret med tre forskellige vira-en for ELC, en for RLC, og en for NM2b tung kæde. For laboratorier, der arbejder med en mangfoldighed af myosiner (eller andre multikomplekse proteiner), er denne tilgang effektiv, da den giver mulighed for mange kombinationer af tunge og lette kæder og almindeligt anvendte lyskæder som calmodulin kan co-transfected med mange forskellige myosin tunge kæder. Alt cellearbejde blev afsluttet i et biosikkerhedsskab med korrekt steril teknik for at undgå forurening.

Til udtryk for både M5a og NM2b blev Sf9-cellerne, der producerer rekombinant myosiner, indsamlet 2-3 dage efter infektion via centrifugering og opbevaret ved -80 °C. Cellepiller blev fremkomet ved at centrifugere de co-inficerede Sf9-celler ved 4 °C i 30 minutter ved 2.800 x g. Proteinrensningsprocessen er beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensning af proteiner

  1. Celle lysis og proteinudvinding
    1. Forbered en 1,5x udpakningsbuffer baseret på tabel 1. Filtreres og opbevares ved 4 °C.
    2. Begynd at optø cellepillerne på is. Pellets optøning, supplerer 100 mL ekstraktionsbuffer med 1,2 mM dithiothreitol (DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0,5 μM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og to proteasehæmmertabletter. Bliv ved med at være på is.
    3. Når pellet er optøet, tilsættes 1 mL af den supplerede ekstraktionsbuffer pr. 10 mL cellekultur. For eksempel, hvis cellepillerne blev dannet af 500 mL cellekultur, skal du tilføje 50 mL suppleret ekstraktionsbuffer til pelleten.
    4. Sonicate cellepiller og samtidig holde dem på is. For hver pellet skal du bruge følgende betingelser: 5 s ON, 5 s OFF, varighed på 5 min, effekt 4-5.
    5. Alle homogeniserede lysater opsamles i et bægerglas og tilsættes ATP (0,1 M bestandsopløsning; pH 7.0), således at den endelige koncentration af ATP er 1 mM. Rør i 15 minutter i et koldt rum. ATP tager afstand fra aktiv myosin fra actin, så det kan adskilles i det følgende centrifugeringstrin. Det er derfor vigtigt at gå videre til næste skridt med det samme for at minimere muligheden for ATP-udtømning og rebinding til actin.
    6. Lysater ved 48.000 x g i 1 time ved 4 °C centrifugeres. Mens dette sker, skal du begynde at vaske 1-5 mL af en 50% gylle af Anti-FLAG affinitet harpiks (for en pellet dannet af 1 L celler) med 100 mL fosfat-buffered saltvand (PBS), ifølge producentens anvisninger. For eksempel, for 5 mL harpiks, vask 10 mL af en 50% gylle. I det sidste vasketrin opsuspendes harpiksen med 1-5 mL PBS med nok volumen til at skabe en 50% gylle.
    7. Efter lysat centrifugering, kombinere supernatant med vasket harpiks gylle og rock forsigtigt i det kolde rum i 1-4 timer. Mens du venter, skal du lave de buffere, der er beskrevet i tabel 1, og holde dem på is.
  2. Præparat til rensning af AFFINITET AF FLAG
    1. Opløsningen centrifugeres i trin 1.7 ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Harpiksen pakkes i bunden af røret. Uden at forstyrre harpiksen skal du fjerne supernatanten.
    2. Harpiksen er blevet genbrugt i 50 mL buffer A som beskrevet i tabel 1 og centrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Uden at forstyrre harpiksen skal du fjerne supernatanten.
    3. Harpiksen er blevet genbrugt i 50 mL buffer B som beskrevet i tabel 1 og centrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 °C. Gentag dette trin igen, og genbrug harpiksen i 20 mL buffer B. Bland derefter harpiksen og bufferen grundigt ved forsigtigt at vende røret i hånden ca. 10 gange.
  3. Proteine udstævning og koncentration
    1. Lav 30 mL Elution Buffer som beskrevet i tabel 1 og lad det køle af på is.
    2. Opsæt elueringskolonnen i et koldt rum. Hæld forsigtigt harpiks gyllen i kolonnen. Kolonnen vaskes med 1-2 kolonnevolumener af buffer B, da harpiksen pakker på bunden, hvilket sikrer, at harpiksen ikke tørrer ud.
    3. Elution Buffers flow 1 mL gennem harpiksen og saml gennemstrømningen i et 1,5 mL rør. Gentag sådan, at der indsamles 12, 1 mL fraktioner.
    4. På dette tidspunkt skal du udføre en rå Bradford-test på fraktionerne for kvalitativt at bestemme, hvilke fraktioner der er de mest koncentrerede48. På en række af en 96-brønds plade, pipette 60 μL 1x Bradford reagens. Efterhånden som fraktioner opsamles, blandes 20 μL af hver fraktion pr. brønd. En mørkere blå farve angiver de mere koncentrerede fraktioner.
    5. I et 50 mL rør opsamles det resterende protein ved forsigtigt at pipette den resterende Elution Buffer gennem kolonnen for at frigøre eventuel resterende myosin bundet til harpiksen i kolonneflowthrough. Denne gennemstrømning vil blive koncentreret i næste trin. Sørg for, at harpiksen derefter regenereres til genbrug og opbevares i overensstemmelse med producentens anvisninger.
    6. Saml de tre mest koncentrerede fraktioner, og koncentrer gennemstrømningen yderligere i 50 mL-røret samt de resterende 1 mL-fraktioner ved hjælp af et 100.000 MWCO-koncentrationsrør. Den samlede prøve fastgøres på koncentratrøret og centrifuge ved 750 x g i 15 minutter ved 4 °C, og gentages, indtil alt elueret protein er koncentreret til et slutvolumen på ca. 0,5-1 mL.
      BEMÆRK: Denne porestørrelse giver mulighed for opbevaring af myosinmolekylerne, som har masser flere gange den molekylære vægtafskæring. Lyskæderne forbliver tæt bundet til motordomænerne i løbet af dette koncentrationsforløb, som verificeret ved at udføre SDS-PAGE gelelektroforese på det endelige produkt.
  4. Dialyse og lynfrysning
    1. Lav 2 L dialysebuffer som beskrevet i tabel 1. Prøven indlæses i en dialysepose eller et kammer, og dialyze natten over i kølerummet. Bemærk, at sammensætningen af dialysebufferne er forskellig for NM2b og M5a.
      BEMÆRK: I tilfælde af NM2b er formålet med dette dialysetrin at danne myosinfilamenter i den lave ioniske styrkebuffer. Sedimentering af disse filamenter giver derefter et ekstra rensningstrin og giver mulighed for koncentration af prøven. Der vil derfor være et synligt hvidt bundfald i dialysekammeret næste dag. Disse filamenter vil blive indsamlet ved centrifugering og depolymeriseret i trin 5.1. I tilfælde af M5a-HMM vil proteinet efter dialyse fra den ene dag til den anden være tilstrækkeligt rent til brug i efterfølgende assays. Yderligere rensningstrin såsom gelfiltrering eller ionisk udvekslingskromatografi kan udføres, hvis det er nødvendigt. For M5a opsving efter dialyse, gå til trin 5,2.
  5. Gendannelse af myosin efter dialyse
    1. For NM2b skal hele prøven forsigtigt aflæses fra dialyseposen eller -kammeret og centrifuge ved 4 °C i 15 minutter ved 49.000 x g for at opsamle myosinfilamenter. Supernatanten kasseres, og lagerbufferen tilsættes gradvist til pellet'en som beskrevet i tabel 1, indtil den er opløst. Skånsom op og ned pipetter hjælper med at opløse pellet. Normalt kræver dette ikke mere end 500 μL pr. rør. Efter at have sikret, at pellet er fuldt opløst i den høje ioniske styrke opbevaring buffer, en ekstra centrifugering skridt (15 min ved 49.000 x g) kan udføres for at fjerne uønskede aggregater, hvis det kræves, da myosin vil nu være upolymeriseret og vil forblive i supernatant.
    2. For M5a-HMM skal hele prøven omhyggeligt udtages fra dialysekammeret og centrifuge ved 4 °C i 15 minutter ved 49.000 x g, hvis der forekom uønskede granulater. Tag supernatanten.
  6. Koncentrationsbestemmelse og lynfrysning
    1. For at bestemme produktets koncentration måles absorbansen ved hjælp af et spektrofotometer ved bølgelængder 260, 280, 290 og 320 nm. Koncentrationen i mg/mL (cmg/mL) med Ligning 1, hvor A280 repræsenterer absorptionen ved 280 nm, og A320 repræsenterer absorptionen ved 320 nm. Den resulterende koncentration i mg/mL kan omdannes til μM myosinmolekyler med Equation 2, hvor M er den molekylære vægt af hele proteinet (herunder de tunge kæder, lyskæder, fluorophorer og alle tags).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      μM molekyler = 1000cmg/mL/M (2)
      BEMÆRK: Hvis en fortynding er nødvendig, skal det gøres i en høj ionisk styrkebuffer. Udryddelseskoefficienten (ε) kan bestemmes ved at importere proteinets aminosyresekvens til et program som ExPASy. Typisk udbytte for M5a-HMM er ca. 0,5-1 mL 1-5 mg/mL protein og for NM2b i fuld længde er 0,5-1 mL på 0,5-2 mg/mL. Udryddelseskoefficienten for M5a-HMM, der blev anvendt i dette papir, var 0,671. Udryddelseskoefficienten for NM2b, der blev brugt i dette papir, var 0,611.
    2. Opbevar den rensede myosin på en af de to måder. Aliquot mellem 10-20 μL i et tyndvægget rør, såsom et polymeriseringskædereaktionsrør, og slip røret i en beholder med flydende nitrogen til flash-frysning. Alternativt kan du pipette mellem 20-25 μL myosin i flydende nitrogen og opbevare de frosne perler af protein i sterile kryogene rør. I begge tilfælde kan de resulterende rør opbevares i -80 °C eller flydende nitrogen til fremtidig brug.
      BEMÆRK: Da begge motilitetsanalyser, der er beskrevet nedenfor, kræver meget små mængder protein, er opbevaring i små aliquots, som beskrevet, økonomisk.

2. Gliding actin glødetråd assay

  1. Tilberedning af coverslip
    1. Lav en 1% nitrocelluloseopløsning i amylacetat.
    2. Få en vævskultur skål (150 x 25 mm) og tilsæt et cirkulært filterpapir (125 mm diameter) til bunden af skålen.
    3. 22 mm kvadratisk overtræk på et stativ, og vask med ca. 2-5 mL 200-bevis ethanol efterfulgt af 2-5 mL destilleret vand (dH2O). Gentag dette vasketrin og med vand. Tør derefter coverlips helt ved hjælp af en filtreret luftlinje eller N2-line.
    4. Tag en coverslip og langsomt pipette 10 μL af 1% nitrocellulose opløsning langs den ene kant af slip. Smør den derefter i en jævn bevægelse over resten af coverlipet ved hjælp af siden af en glatsidet 200 μL pipettespids. Placer denne coverslip på vævskultur parabol med nitrocellulose side op. Gentag for de resterende coverslips og lad dem tørre under forberedelsen af de resterende reagenser og brug coverslips inden for 24 timer efter belægning.
  2. Forberedelse af kammeret
    1. Tør et mikroskop dias med en optisk linse papir til at rense store vragrester. Skær to stykker dobbeltsidet tape, ca. 2 cm i længden.
    2. Placer et stykke langs midten af den lange kant af mikroskopet dias. Sørg for, at kanten af båndet flugter med kanten af diaset. Placer det andet stykke tape ca. 2 mm under det første stykke tape, så de to er parallelle og justerede. Dette skaber et flowkammer, der kan rumme ca. 10 μL opløsning (se figur 1).
    3. Tag en af de nitrocellulosebelagte coverslips fra del 1. Sæt forsigtigt coverlip på båndet, så den side, der er belagt med nitrocellulose, kommer i direkte kontakt med båndet (se figur 1). Ved hjælp af en pipettespids skal du forsigtigt trykke ned på slide-tape-grænsefladen for at sikre, at coverlipet er korrekt klæbet til diaset. Skær det overskydende tape hængende over kanten af rutsjebanen med et barberblad.
  3. Actin forberedelse
    1. Der fremstilles 20 μM F-actin ved polymerisering af kugleformet actin (G-actin) i polymeriseringsbuffer (50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) ved 4 °C natten over.
    2. F-actin fortyndes til 5 μM i motilitetsbuffer (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etiket med mindst 1,2 x molar overskud af rhodamin-falloidin. Lad (dækket af aluminiumsfolie) i mindst 2 timer på is. Dette kan bruges i op til 1-2 måneder, opbevares på is.
  4. Udførelse af myosin 5a glidende actin filament assay
    BEMÆRK: I dette afsnit gives detaljerne i myosin 5a (HMM) glidende assay.
    1. Forbered løsningerne til myosin 5a, der er beskrevet i tabel 2, og hold dem på is.
    2. Flow i 10 μL af myosin 5a (50-100 nM) gennem flowkammeret og vent i 1 min.
    3. Flow i 10 μL af 1 mg/mL BSA i 50 mM MB med 1 mM DTT ("lavt salt" buffer). Gentag denne vask to gange mere og vent i 1 minut efter den tredje vask. Brug hjørnet af et silkepapir eller filtrerpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen ved forsigtigt at placere papirets hjørne ved flowkammerets udgang.
    4. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    5. Flow i 10 μL af den sorte actinopløsning (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin og 1 mM ATP i 50 mM MB med 1 mM DTT) for at eliminere "døde hoveder", som beskrevet i diskussionsafsnittet.
      1. Opløsningen pipetteres med en 1 ml sprøjte og en 27 G nål for at klippe actinfilamenter, før opløsningen introduceres i kammeret. Gentag dette trin to gange mere og vent i 1 minut efter tredje gang. Ca. 20 pipetter er tilstrækkelige.
      2. For at udføre "døde hoved" spin, tilføje en støkiometrisk mængde F-actin til myosin i nærværelse af 1 mM ATP og 1 mM MgCl2 ved en saltkoncentration på 500 mM. Derefter ultracentrifuge ved 480.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Den døde myosin vil være i pillerne.
    6. Flow i 50 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP for at nedbryde kammeret af frie actin filamenter.
    7. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere for at nedbryde kammeret for enhver ATP.
    8. Flow i 10 μL af 20 nM rhodamin actin (Rh-Actin) opløsning, der indeholder 1 mM DTT i 50 mM MB og vente i 1 min at tillade streng binding af actin filamenter til myosin 5a fastgjort til overfladen af dæksletlip.
    9. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT for at vaske Rh-Actin filamenter væk, der ikke er bundet til overfladen. Gentag denne vask to gange mere.
    10. Flow i 30 μL af den endelige buffer.
    11. Optag billeder på et fluorescensmikroskop ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 561 nm for at visualisere Rh-Actin. En passende eksponeringstid er 200 ms ved 1,4 mW lasereffekt i en samlet anskaffelsestid på 0,5-1 min.
      BEMÆRK: Sørg for, at anskaffelseshastigheden skaleres korrekt til hastigheden af de bevægelige filamenter. En vigtig overvejelse, før du indsamler data til brug med sporingsprogrammer, er anskaffelsesrammehastigheden. Subpixel bevægelser mellem rammer vil resultere i en overvurdering af hastigheden, og bevægelser af flere hundrede nanometer er nødvendige for at opnå nøjagtige værdier. En optimal anskaffelseshastighed har actin-gliden i mindst en pixelafstand mellem rammer. I tilfælde af TIRF-mikroskopet, der bruges til billeddannelsen her, svarer denne tærskel til 130 nm; Derfor skal en myosin, der forventes at rejse 1 μm/s, afbildes med en hastighed på 5 billeder/s (0,2 s interval) for at opnå 200 nm bevægelse, mens en myosin forventes at rejse 10 nm/s kræver 0,05 billeder/s (20 s intervaller). Data kan derfor om nødvendigt nedsamples på nuværende tidspunkt (se diskussion for at få flere oplysninger).
  5. Udførelse af nonmuscle myosin 2b glidende actin filament assay
    BEMÆRK: I dette afsnit gives detaljerne i den ikke-rensende myosin 2b glidende analyse i fuld længde. Den nonmuscle myosin 2b glidende actin filament assay protokol er forskellig fra myosin 5a protokollen på visse trin. Kontroller, at de korrekte buffere bruges til hvert af disse trin. For eksempel kræver NM2b-analysen fastgørelse af myosin til coverlip i høj saltbuffer, mens M5a kan fastgøres til coverlipet i høj- eller lavsaltbuffere. Derudover bruger M5a-glidende actin filament assay en lavere koncentration af myosin til at afbøde hyppigheden af actin filamenter, der går i stykker under erhvervelsen.
    1. Forbered løsningerne til NM2b som beskrevet i tabel 2 og hold dem på is.
    2. Der strømmes 10 μL af den ikkemuskle myosin 2b (0,2 μM) i 500 mM Motilitetsbuffer (MB) ("højt salt" buffer) og 1 mM dithiothreitol (DTT) gennem flowkammeret og vent i 1 min.
      BEMÆRK: De høje saltbuffere dissocierer myosinfilamenter og giver mulighed for fastgørelse af enkelte myosinmolekyler til overfladen, da nonmuscle myosin 2b kan polymeriseres til filamenter ved ionisk koncentration <150 mM.
    3. Flow i 10 μL af 1 mg/mL serumalbumin (BSA) i 500 mM MB med 1 mM DTT ("høj saltbuffer" som beskrevet i tabel 2. Gentag denne vask to gange mere og vent i 1 minut efter den tredje vask. Brug hjørnet af et silkepapir eller filtrerpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen.
    4. Vask med 10 μL på 500 mM MB med 1 mM DTT som beskrevet i tabel 2. Gentag denne vask to gange mere.
    5. Flow i 10 μL af den sorte actinopløsning som beskrevet i tabel 2 for at fjerne "døde hoveder", som diskuteret yderligere i diskussionsafsnittet. Den sorte actinopløsning indeholder 5 μM umærket F-actin, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl2, 1 μM CaM og 1 mM DTT i 50 mM NaCl motilitetsbuffer til fosforivning af nonmuscle myosin 2b på overfladen af kammeret.
      1. Opløsningen pipetteres med en 1 ml sprøjte og en 27 G nål for at klippe actinfilamenter, før opløsningen introduceres i kammeret. Gentag dette trin to gange mere og vent i 1 minut efter tredje gang. Ca. 20 pipetter er tilstrækkelige.
    6. Flow i 50 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP for at nedbryde kammeret af frie actin filamenter.
    7. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere for at nedbryde kammeret for enhver ATP.
    8. Flow i 10 μL af 20 nM Rh-Actin opløsning indeholdende 1 mM DTT i 50 mM MB og vente i 1 min at tillade rigor binding af actin filamenter til nonmuscle myosin 2b fastgjort til overfladen af coverlip.
    9. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT for at vaske Rh-Actin filamenter væk, der ikke er bundet til overfladen. Gentag denne vask to gange mere.
    10. Flow i 30 μL af den endelige buffer. For nonmuscle myosin 2b glidende actin filament assay, den endelige Buffer omfatter også calmodulin, CaCl2, og myosin lyskæde kinase at give fuld fosforylering af nonmuscle myosin 2b under video imaging. 0,7% methylcellulose kan også indgå i den endelige buffer, hvis actin filamenter kun er løst bundet eller ikke er bundet til overfladen. Dette behandles yderligere i afsnittet Diskussion.
    11. Optag billeder på et fluorescensmikroskop ved hjælp af en excitationsbølgelængde på 561 nm. En passende eksponeringstid er 200 ms ved 1,4 mW lasereffekt i en samlet anskaffelsestid på 0,5 -3 min.
      BEMÆRK: Sørg for, at anskaffelseshastigheden skaleres korrekt til hastigheden af de bevægelige filamenter. En vigtig overvejelse, før du indsamler data til brug med sporingsprogrammer, er anskaffelsesrammehastigheden. Subpixel bevægelser mellem rammer vil resultere i en overvurdering af hastigheden, og bevægelser af flere hundrede nanometer er nødvendige for at opnå nøjagtige værdier. En optimal anskaffelseshastighed har actin-gliden i mindst en pixelafstand mellem rammer. I tilfælde af TIRF-mikroskopet, der bruges til billeddannelsen her, svarer denne tærskel til 130 nm; Derfor skal en myosin, der forventes at rejse 1 μm/s, afbildes med en hastighed på 5 billeder/s (0,2 s interval) for at opnå 200 nm bevægelse, mens en myosin forventes at rejse 10 nm/s kræver 0,05 billeder/s (20 s intervaller). Data kan derfor nedfreknydes på nuværende tidspunkt, hvis det er nødvendigt (se diskussion for flere detaljer).

3. Enkelt molekyle TIRF analyse

  1. Tilberedning af coverslip
    1. Lagerpulveret opdeles i 10 mg aliquots (i 1,5 mL rør) af methoxy-Peg-silan (mPEG) og 10 mg aliquots af biotin-Peg-silan (bPEG). Opbevares ved -20 °C i en forseglet, fugtfri beholder og anvendes inden for 6 måneder.
    2. 22 mm firkantede overtræksdæksler på et stativ, og vask med 2-5 mL ethanol med 2-5 mL ethanol efterfulgt af 2-5 mL destilleret vand. Gentag dette vasketrin og med vand. Tør derefter coverlips helt ved hjælp af en luft-line eller N2 og plasma-ren med argon i 3 min.
    3. De rene overtrækslips anbringes på filtrerpapir (90 mm) i en vævskulturskål (100 x 20 mm) og inkuberes i en ovn på 70 °C, mens du udfører følgende trin.
      BEMÆRK: Plasmarensningen kan erstattes med andre kemiske rengøringsmetoder49.
    4. Der fremstilles 80% ethanolopløsning med dH2O, og pH-filen justeres til 2,0 ved hjælp af HCl. Der tilsættes 1 ml af dette til en 10 mg aliquot mPEG og 1 ml til en 10 mg aliquot af bPEG. Vortex at opløse, som ikke bør tage mere end 30 s.
    5. Der tages 100 μL bPEG-opløsning og tilsættes 900 μL 80% ethanol (pH 2.0). Denne opløsning er 1 mg/mL bPEG. Derefter lave en løsning af begge PEGs som følger, blande grundigt.
      1. 200 μL på 10 mg/mL mPEG (endelig koncentration: 2 mg/mL).
      2. 10 μL af 1 mg/mL bPEG (endelig koncentration: 10 μg/mL).
      3. 790 μL af 80% ethanolopløsningen (pH 2.0).
    6. Tag dækslet ud af ovnen. Dispenser forsigtigt 100 μL af PEG-opløsningen på midten af hver coverlip, hvilket sikrer, at kun den øverste overflade er våd. Placer derefter gliderne tilbage i ovnen og inkuber i 20 til 30 minutter.
    7. Når coverlips begynder at tage på en holey udseende, med små cirkler synlige på tværs af overfladen, fjerne dem fra ovnen.
    8. Vask hver coverslip med 100% ethanol, tør med en luft-line, og sted tilbage i ovnen. Inkuber kun i den tid, det tager at oprette kamre i trin 2.
  2. Forberedelse af kammeret
    1. Rengør et mikroskop dias til brug i at gøre kammeret. Skær to stykker dobbeltsidet tape, ca. 2 cm i længden.
    2. Placer et stykke langs midten af den lange kant af mikroskopet dias. Sørg for, at kanten af båndet flugter med kanten af diaset. Placer det andet stykke tape ca. 2 mm under det første stykke tape, så de to er parallelle og justerede.
    3. Tag en af de funktionaliserede coverslips fra ovnen (skabt i 3.1). Sæt forsigtigt coverlip'en på båndet, så den side, der er belagt med PEG, vender med forsiden nedad og kommer i direkte kontakt med båndet, som vist i figur 1. Ved hjælp af en pipettespids skal du forsigtigt trykke ned på slide-tape-grænsefladen for at sikre, at coverlipet er korrekt klæbet til diaset.
    4. Skær det overskydende tape hængende over rutsjebanen med et barberblad. Disse kamre kan anvendes med det samme eller placeres parvis i et 50 mL rør og opbevares i en fryser på -80 °C til fremtidig brug. Det er vigtigt at opbevare med det samme, eller overfladen nedbrydes.
  3. Udførelse af myosin 5a TIRF mikroskopi assay
    1. Forbered løsningerne til myosin 5a omvendt motilitetsanalyse, der er beskrevet i tabel 3, og hold dem på is.
    2. Kammeret vaskes med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT.
    3. Flow i 10 μL af 1 mg/mL BSA i 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere og vent i 1 minut efter den tredje vask. Brug hjørnet af et silkepapir eller filtrerpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen.
    4. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    5. Flow i 10 μL af NeutrAvidin opløsningen i 50 mM MB med 1 mM DTT og vent i 1 min.
    6. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    7. Flow i 10 μL biotinyleret rhodamin actin (bRh-Actin), der indeholder 1 mM DTT i 50 mM MB og vent i 1 min. Til dette trin skal du bruge en storboret pipettespids og undgå at pipette op og ned for at minimere klipning af fluorescerende actinfilamenter for at sikre, at lange actin filamenter kan fastgøres til overfladen (20-30 μm eller længere). Et effektivt alternativ er at skære keglen på en standard pipettespids (med en åbning på ≈1-1,5 mm).
    8. Vask med 10 μL på 50 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    9. Flow i 30 μL af Final Buffer med 10 nM myosin 5a tilføjet, derefter straks indlæse på TIRF mikroskop og registrere efter at have fundet den optimale fokus for TIRF billedbehandling modalitet. Eksponeringstider mellem 100-200 ms er passende ved 1,4 mW laserkraft til actin og GFP-mærket myosin. En passende anskaffelsestid for hastighedsanalyse er 3 min.
  4. Udførelse af nonmuscle myosin 2b TIRF mikroskopi assay
    BEMÆRK: I dette afsnit gives detaljerne i nonmuscle myosin 2b TIRF-analysen ved hjælp af polymeriserede og fosforerede filamenter. Detaljeret protokol (punkt 4.1-4.3) til fosforylering og polymerisering af nonmuscle myosin-2b i et rør er inkluderet.
    1. For at fosforrylatere den rensede NM2b, lav en 10x kinase blandes med følgende betingelser: 2 mM CaCl2, 1 μM CaM, 1-10 nM MLCK og 0,1 mM ATP. Dette kan bringes til volumen med 500 mM MB med 10 mM DTT. Tilsæt 10x kinase mix til myosin ved et volumetrisk forhold på 1:10 og lad dette inkubere i 20-30 minutter ved stuetemperatur. Typisk er myosinkoncentrationen for dette trin 1 μM.
    2. For at polymerisere fosforyleret myosin i filamenter, sænke saltkoncentrationen af NM2b til 150 mM NaCl. For at gøre dette skal du lave en 1x motilitetsbuffer (1x MB) uden salt ved at fortynde 4x MB fire gange i dH2O. Denne 1x MB kan bruges til at sænke saltkoncentrationen, fordi NM2b blev frosset i en 500 mM saltbuffer.
    3. For hver 3 μL bestand NM2b tilsættes 7 μL 1x MB for at sænke saltkoncentrationen til 150 mM NaCl og inkuberes på is i 20-30 min for at danne NM2b filamenter.
      BEMÆRK: Rækkefølgen i punkt 4.1-4.3 er ikke afgørende, så længe NM2b er fosforineret, og den endelige saltkoncentration er 150 mM. Inkubation i størrelsesordenen 30 min-1 h giver tilstrækkelig tid til fuldstændig fosforylering og polymerisering.
    4. Forbered løsningerne til nonmuscle myosin 2b omvendt motilitetsanalyse som beskrevet i tabel 3 og hold dem på is.
    5. Kammeret vaskes med 10 μL på 150 mM MB med 1 mM DTT.
    6. Flow i 10 μL af 1 mg/mL BSA i 150 mM MB med 1 mM DTT Gentag denne vask to gange mere og vent i 1 minut efter den tredje vask. Brug hjørnet af et silkepapir eller filtrerpapir til at transportere opløsningen gennem kanalen.
    7. Vask med 10 μL på 150 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    8. Flow i 10 μL af NeutrAvidin opløsningen i 150 mM MB med 1 mM DTT og vent i 1 min.
    9. Vask med 10 μL på 150 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    10. Flow i 10 μL bRh-Actin og vent i 1 min. Til dette trin skal du bruge en storboret pipettespids og undgå at pipette op og ned for at minimere klipning af fluorescerende actin filamenter for at sikre, at lange actin filamenter kan fastgøres til overfladen (20-30 μm eller længere). Et effektivt alternativ er at skære keglen på en standard pipettespids.
    11. Vask med 10 μL på 150 mM MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    12. Der strømmes 10 μL af den ikkemuskle myosin 2b opløsning (ca. 30 nM) og vent i 1 min.
    13. Vask med 10 μL på 150 MB med 1 mM DTT. Gentag denne vask to gange mere.
    14. Flow i 30 μL af Final Buffer, derefter straks indlæse på TIRF mikroskop og registrere efter at have fundet den optimale fokus for TIRF billedbehandling modalitet. Eksponeringstider mellem 100-200 ms er passende ved 1,4 mW laserkraft til actin og GFP-mærket myosin. En passende anskaffelsestid for hastighedsanalyse er 3 min.

4. Billedanalyse

  1. Billedanalyse for gliding actin filament assay
    BEMÆRK: Billederne kan analyseres ved hjælp af den software og manualer, der er knyttet til listen over materialer. Det er vigtigt at bemærke, at det program, der er beskrevet her, kræver TIFF-stakke til analyse. Processen til analyse af glidende actin filament assay er som følger50.
    1. Overfør rå filmstakke til en angivet mappestruktur, og indtast den mest populære mappe i filmmapperne i programmet.
      BEMÆRK: Programmet analyserer filerne i hele denne mappe og undermapper og behandler mapper på laveste niveau som replikeringer. Der udarbejdes gennemsnitlige statistikker for hver gruppe replikater. I dette tilfælde blev der brugt en enkelt film til hver myosin. Når man karakteriserer en ny myosin eller undersøger en ny eksperimentel tilstand, anbefales det at analysere film fra tre synsfelt (FOV) pr. Kammer i i alt tre kamre og gentage denne arbejdsgang for tre forberedelser af myosinen, der undersøges.
    2. Brug scriptet "stack2tifs" sammen med den brugerinputterede billedhastighed til at konvertere hver TIFF-stak til en mappe, der indeholder en række individuelle TIFF-filer og en tilsvarende metadata.txt fil, der indeholder starttidspunktet for hver ramme. Hvis data ikke er i TIFF-stakformat, skal en konvertering først anvendes ved hjælp af software som dem, der er angivet i tabellen over materialer.
      BEMÆRK: Dette script er den del af softwarepakken. Oplysningerne i scriptet kan findes her: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. Brug parameteren -px, som er pixelstørrelsen (i nm) under anskaffelsen. I dette tilfælde er pixelstørrelsen 130 nm. Brug parametrene -xmax og -ymax til skalering af akserne til punktdiagramoutput. Disse svarer til den længste afbildede glødetrådslængde og den maksimale afbildede hastighed (i nm/s).
      BEMÆRK: Disse værdier er anslåede og kan indstilles til værdier, der er højere end forventet, for at sikre, at dataene er indeholdt i området. Efter analyse kan de rå data også eksporteres til brug i anden statistisk eller grafsoftware til visning og analyse.
    4. Brug parameteren -minv, som er en skæringsparameter for minimumshastighed, til at definere de filamenter, der ikke bevæger sig, og kan derfor udelukkes fra analysen. For en langsom myosin som NM2b skal denne parameter være lav (i dette eksempel 5 nm / s) for at undgå at skære ægte glidebevægelser ud. For en hurtig myosin som M5a kan denne parameter være højere (i dette eksempel 100 nm/s) for at anvende et strengere filter, samtidig med at den ægte glidehastighedsfordeling bevares.
    5. Brug cutoff-parameteren -pt til at identificere jævn bevægelse. For hvert prøvetagningsvindue beregnes en værdi svarende til 100 x Hastighedsstandardafvigelse/middelhastighed. Spor med højere værdier end cutoff, har mere variable hastigheder og er udelukket fra yderligere analyse. I dette eksempel blev der anvendt en skæringsværdi på 33. Spor med højere værdier har flere variable hastigheder og er udelukket fra yderligere analyse.
    6. Brug -maxd til at angive en maksimalt tilladt afstand mellem rammer. Dette er en beregnet frame-to-frame afstand flyttet af centroid af glødetråden i enheder af nm. Det kan være nyttigt at udelukke sporadiske bevægelser eller forkert sammenkædning mellem filamenter. I eksemplerne her blev parameteren efterladt på standardværdien på 2.000 nm.
  2. Billedanalyse for TIRF mikroskopianalyse
    BEMÆRK: Processen til analyse af det enkelte molekyle TIRF-analyse på billedbehandlingssoftwaren, der er specifikt Tabel over materialer er som følger29.
    1. Klik på og træk den optagede mikroskopivideo til softwarens arbejdsområde for at åbne den51. Del derefter anskaffelseskanalerne. Klik på Billede > Farve > Opdelte kanaler.
      BEMÆRK: I tilfælde af mærkbar afdrift under erhvervelsen skal billederne stabiliseres for at korrigere instrumental drift på billedplanet. I dette tilfælde blev der ikke anvendt nogen kompensation for Z-aksedrift, da det mikroskop, der blev brugt til at opnå disse data, stabiliserer Z-fokusbrønden. Hvis du vil stabilisere billedet på billedanalyseprogrammet, skal du installere den relevante stabilisator-plug-in, der er knyttet til listen over materialer. Billedstabilisatoren antager faste positioner for objekterne i billedet og bruger et rullende gennemsnit af de tidligere rammer som reference. Den anbefalede procedure er derfor at begynde med den kanal, der indeholder billeder af mærket actin, da dette er i en fast position.
    2. Klik på Plugins, og find derefter Billedstabilisator; sikre, at Oversættelse er valgt, og bevare standardindstillingerne. Markér afkrydsningsfeltet ud for Logfør transformeringskoefficienter. Hvis du anvender dette logtrin, kan de beregnede skiftparametre anvendes på den anden kanal i næste trin. Tillad, at processen fuldføres.
    3. Åbn derefter kanalen med mærket myosin, og anvend stabiliseringen ved at klikke på Plugins > Image Stabilizer Log Applier. Hvis der ikke kan erhverves billeder af actin under den samme erhvervelse på grund af et krav om billeddannelse med højere hastighed i en enkelt kanal, stabiliserer afdrift stakken af billeder ved at vælge et område, der indeholder statiske objekter, såsom en biotinyleret fiducial markør eller fluorophores bundet ikke-specifikt til biotin-PEG-overfladen. Dette område kan beskæres fra den oprindelige stak og stabiliseres, efterfulgt af anvendelse af de resulterende skiftværdier på den oprindelige stak.
      BEMÆRK: I praksis vil den afdrift observeret i motilitet eksperimenter være ubetydelig i forhold til bevægelse af myosiner, der bevæger sig på flere hundrede nm / s, men for de langsomste myosiner dette bliver en vigtig overvejelse.
    4. Åbn derefter TrackMate, klik på Plugins; Derefter skal du klikke på Sporing i rullemenuen og til sidst på TrackMate. På dette tidspunkt er billedanalysen underlagt optimering baseret på parametrene for fluorophore- og analysebetingelserne. Men ideelle startparametre er som følger.
      1. Kalibreringsindstillinger: Bevar alle standardværdierne.
      2. Detektor: LoG-detektor.
      3. Anslået klatdiameter: 0,5-1,0 mikron.
      4. Tærskel: 25-200. (Dette kan bestemmes ved at klikke på Eksempel, når du har valgt et tal for at se, om de fundne pletter stemmer overens med filmen og justeres korrekt).
      5. Indledende tærskelværdi: ikke angivet.
      6. Visning: HyperStack Displayer.
      7. Indstil filtre på pletter: ikke indstillet.
      8. Tracker: Simpel LAP tracker.
        BEMÆRK: Disse afhænger af billedhastighed og myosinhastighed og skal være store nok til at forbinde efterfølgende positioner, mens uønskede forbindelser mellem forskellige partikler udelukkes.
      9. Forbinder max afstand: 1,0 mikron.
      10. Afstandslukkende max afstand: 1,0 mikron.
      11. Mellemrumslukning maks. rammegab: 1.
      12. Indstil filtre på spor: Sporforskydning (>0,39-til kun at omfatte pletter, der bevæger sig mere end 3 pixel), Pletter i spor (>3-til kun at omfatte spor med mindst 3 pletter). Andre filtre såsom Minimal Velocity kan indføres for at udelukke pletter, stall i lange perioder. Resultaterne af filtrering skal kontrolleres ved visuel inspektion af spor for at sikre, at falske spor (dvs. myosinbevægelse i baggrunden, der ikke er langs et actinspor) fjernes, samtidig med at sporene i forbindelse med actin bevares.
    5. Når skærmbilledet Skærmindstillinger vises, skal du klikke på Analyse for at se de relevante output. Gem de tre producerede tabeller (Spor statistik, Links i Spor statistik og Spots i Track Statistics). Track Statistics-tabellen vil indeholde de hastigheds- og forskydningsdata, der derefter kan analyseres for at karakterisere et nyt protein eller virkningerne af en bestemt eksperimentel tilstand, for eksempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rensningen af myosin kan evalueres ved at udføre reducere natrium dodecyl sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) gel-elektrophoresis som vist i figur 2. Mens dette tal repræsenterer den endelige, post-dialyzed myosin, SDS-PAGE kan udføres på aliquots fra de forskellige stadier af rensningsproceduren for at identificere eventuelle produkter tabt til supernatant. Myosin 5a HMM har et band i 120-130 kDa rækkevidde og fuld længde nonmuscle myosin 2b har et band i 200-230 kDa rækkevidde, svarende til tunge kæder29,44. Myosin 5a har også et bånd nær 17 kDa-mærket, der markerer calmodulin. Den nonmuscle myosin 2b har et band på ca 17 kDa, betegner ELC. Da der findes en GFP-mærket RLC i dette NM2b-præparat, vises RLC'en ved ca. 47 kDa. En ikke-mærket RLC vil dog være til stede ved ca. 20 kDa, hvis den ikke er mærket med en GFP.

Den glidende actin filament assay vist i Video 1 og Figur 3 repræsenterer kendetegnene ved en ideel og sporbar film. Denne glidende actin filament assay har den glatte bevægelse af mærkede actin filamenter. Den sorte actin vask sikrer, at de døde myosinhoveder fjernes fra målefeltet, hvilket yderligere bidrager til den samlede glatte bevægelse af actin filamenter. De fluorescerende mærkede filamenter er korte nok til, at en enkelt glødetråd ikke krydser over på sig selv, hvilket er mere optimalt for sporingsprogrammet. Actin filamenter, der er for lange vil krydse over andre filamenter, som kan udgøre vanskeligheder for glidende actin filament assay tracking program. Dette problem kan undgås ved at pipetter op og ned 10-20 gange for at klippe actin filamenter før lastning på coverlip.

I tilfælde af NM2b kan brugen af methylcellulose forbedre kvaliteten af de optagede film betydeligt, da det reducerer udbredelsen af actin væk fra billedfladen. Dette er ikke nødvendigt for M5a, fordi dens højere toldforhold giver mulighed for en stærkere fastgørelse af actin til den myosinbelagte overflade. Hvis der anvendes methylcellulose, er det nødvendigt at transportere opløsningen gennem kammeret for at sikre, at opløsningen strømmer igennem. Som vist i video 2, når alle andre betingelser er identiske bortset fra udelukkelsen af methylcellulose, forbliver actinfilamenter ikke så tæt forbundet med den myosinbelagte overflade.

Omvendt er målet for den inverterede motilitetsanalyse, der er vist i video 3 og figur 4, at indføre overfladebundet fluorescerende aktinfilamenter, hvorpå myosinbevægelse kan observeres. Et vigtigt krav i den omvendte analyse er at sikre, at myosinbevægelsen konsekvent observeres på tværs af FOV, som vist. Brugen af en blanding af DTT, glukose, katalase og glukoseoxidase kan minimere fotobleaching for at give mulighed for længere målinger52. Desuden, hvis erhvervelse sats for analysen er lav, forskalling belysningen lyset ud mellem at erhverve rammer kan hjælpe med overdreven photobleaching. Forskalling af excitation lys kan ske via en mekanisk lukker, eller en acousto-optisk tunable filter (AOTF).

Figure 1
Figur 1:Forberedelse af funktionaliserede flowcellekamre. (A) Begynd med et renset mikroskopdias, to stykker dobbeltsidet tape skåret til ca. 2 cm og en funktionaliseret coverlip. (B) Tilføj båndet til midten af mikroskopet dias. (C) Sæt coverlip på båndet med belægningen (dvs. nitrocellulose) nedad og tryk forsigtigt på de overlappende områder med båndet ved hjælp af en plastpipettespids for at sikre, at dækslet har klæbet til kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SDS polyacrylamidgelelektrophoresis af udtrykt NM2b og M5a-HMM. (A) Et repræsentativt SDS PAGE-gelbillede til en tung kæde i fuld længde (≈230 kDa) og GFP-RLC (≈47 kDa) og ELC (≈17 kDa). Gelbillede gengivet og modificeret fra Melli et al. (2018)29. (B) Et repræsentativt SDS PAGE-gelbillede til en M5a-HMM-lignende tung kæde (≈120 kDa) og calmodulin (≈17 kDa). Bemærk, at gelen i dette billede ikke har indsat en GFP i C-terminalenden. En GFP indsat i myosin tunge kæde øger den molekylære vægt med ≈27 kDa. Gel billede gengivet og modificeret blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry44. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Glidende actinfilamentanalyseresultater opnået via TIRF-belysning. (A) Eksempelramme fra en film, der viser translokation af rhodamin-phalloidin mærket actin filamenter (i rødt) på 0,2 μM NM2b i nærværelse af 0,7% methylcellulose ved 30 °C. Skalalinje = 10 μm. (B) Glødetrådssporingsbilledoutput fra FASTrack-programmet for NM2b for samme FOV som vist i (A) Skalalinje = 10 μm. (C) Repræsentativ histogram for den glidende hastighed acto-NM2b, der viser, at denne prøve af NM2b kan generere en handlingsflyvningshastighed på 77 ± 15 nm/s (middel ± standardafvigelse; antal spor = 550). (D) Eksempel ramme fra en film, der viser translokation af rhodamin-phalloidin mærket actin filamenter (i rødt) på 75 nM M5a-HMM. Skalalinje = 10 μm. (E) Glødetrådssporingsbilledoutput fra FASTrack-programmet for M5a-HMM for samme FOV som vist i (D) Skalalinje = 10 μm. (F) Et repræsentativt histogram over den glidende hastighed acto-M5a-HMM, der viser, at denne prøve af M5a kan generere en handlingsflyvningshastighed på 515 ± 165 nm/s (middel ± standardafvigelse; antal spor = 25098). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Inverterede analyseresultater opnået via TIRF-belysning. (A) En repræsentativ FOV fra en tokanals fusioneret billedstak, der viser bevægelsen af NM2b-filamenter (vist med grønt) på biotinylerede aktinfilamenter mærket med AF647-phalloidin (vist med blåt) ved 30 °C. Polymeriserede filamenter af rekombinant udtrykt og renset NM2b co-udtrykt med ELC og GFP-RLC observeres som de grønne, aflange partikler i FOV. Skalastang = 10 μm. (B) Repræsentativt histogram over NM2b-filamenters hastighed. Analysen blev udført ved hjælp af den billedanalysesoftware, der er beskrevet i tabellen over materialer. Enkelt NM2b filamenter har en hastighed på 84 ± 22 nm/s (middel ± standardafvigelse; antal sporede partikler = 133), når du bevæger dig langs enkeltaktin filamenter. (C) Eksempel kymograph af NM2b glødetråd bevægelse langs en enkelt actin glødetråd. Bemærk, at nogle af partikelregionerne viser en "rotation" af NM2b-glødetråden langs actinfilamentet, som sandsynligvis repræsenterer det tidspunkt, hvor den ene side af den bipolære NM2b filament løsner sig fra actin filamentet, som vist tidligere i Melli et al.29. (D) En repræsentativ FOV for enkeltmolekylebevægelsen M5a-HMM (vises med grønt) på biotinylerede aktinfilamenter mærket med rhodamin-phalloidin (vises med rødt). Skalastang = 10 μm. (E) Repræsentativt histogram med kørelængde på M5a-HMM, der passer til en enkelt eksponentiel. Analysen blev udført ved hjælp af den billedanalysesoftware, der er beskrevet i Listen over materialer. Den karakteristiske kørselslængde er 1,3 μm med et konfidensinterval på 95% på 1,23-1,42 μm i dette eksempel. (F)Repræsentativt histogram af enkeltmolekyle M5a-HMM-hastighed på enkeltaktinfilamenter. Analyseret dataoutput fra billedanalyse viser en middelhastighed på 668 ± 258 nm/s (middel ± standardafvigelse; antal sporede partikler = 684). (G)Eksempel kymograph af enkelt molekyler af M5a-HMM bevægelse langs en enkelt actin filament. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: Sammenligning af NM2b og M5a-HMM glidende actin filament assay. NM2b-glidningsaktinfilamentanalysen blev udført i nærværelse af methylcellulose (venstre; videopanel A) og M5a-HMM uden methylcellulose (højre; videopanel B) ved 30 °C. Bemærk, at tidsstemplet går hurtigere frem i NM2b-videopanelet sammenlignet med M5a-HMM-videopanelet for at vise bevægelsen af de rhodaminmærkede actin-filamenter (rød), der er omtrent det samme. Dette skyldes, at den faktiske actintranslokationshastighed for NM2b er tæt på 7 gange langsommere end for M5a-HMM (henholdsvis 77 nm/s mod 515 nm/s, udvundet fra den gaussiske top egnet til histogrammet i figur 3). Skalabjælke = 10 μm i begge videopaneler. NM2b-data, der er opnået med 0,33 billeder pr. sekund med 200 ms eksponering. M5a-HMM-data, der er indsamlet med 5 billeder i sekundet med 200 ms eksponering (kontinuerlig) og derefter nedprøvet til 1 ramme pr. sekund. Tidsstempler blev tilføjet ved hjælp af den plug-in, der er beskrevet i listen over materialer. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: Gliding actin filament assay af NM2b i mangel af methylcellulose. Når alle andre forhold er de samme, bortset fra fraværet af methylcellulose, klæber actinfilamenter nogle gange ikke godt til coverlip belagt med 0,2 μM NM2b, hvilket fører til film af lavere kvalitet med actin filamenter "flopper" tæt på overfladen af NM2b coatedlip covers. Skalastang = 10 μm. Dette kan løses ved at indføre methylcellulose at vise den glatte bevægelse af actin filamenter, som vist i venstre videopanel af Video 1 (NM2b glidende actin filament assay). Et andet alternativ er at øge NM2b-koncentrationen til ≈1 μM. Denne film blev erhvervet på 0,33 billeder i sekundet med 200 ms eksponering. Klik her for at downloade denne video.

Video 3: Sammenligning af NM2b og M5a-HMM omvendt motilitet assay. NM2b inverteret motilitet assay blev udført i overværelse af methylcellulose og registreres med en hastighed på 0,33 billeder i sekundet med brug af en lukker (venstre; video panel A), Video panel C viser den samme FOV som A, men med partikler er identificeret og spores ved hjælp af billedanalyse software. På samme måde blev den omvendte motilitetsanalyse for M5a-HMM i mangel af methylcellulose optaget med en hastighed på 5 billeder i sekundet (højre; videopanel B). Videopanel D viser den samme FOV som B, men med partikler identificeret og sporet ved hjælp af billedanalyse software. Skalastænger = 10 μm i alle videopaneler. De to lasere blev toggled frem og tilbage med brug af et enkelt kamera til erhvervelse. Klik her for at downloade denne video.

Navn på buffer Sammensætning Anvendte trin Kommentarer
Buffer til udpakning af M5a 0,3 M NaCl 1.1 Bliv ved med at være på is.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mM MgCl2
1,5 mM EGTA
4,5 mM NaN3
NM2b-udpakningsbuffer 0,5 M NaCl 1.1 Bliv ved med at være på is.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mM MgCl2
1,5 mM EGTA
4,5 mM NaN3
Buffer A 0,5 M NaCl 2.2 Bliv ved med at være på is.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM DTT
5 mM MgCl2
Buffer B 0,5 M NaCl 2.3 Bliv ved med at være på is.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM DTT
Elution-buffer 0,5 M NaCl 3.1 Bliv ved med at være på is.
0,5 mg/mL FLAG peptid
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
pH 7,2
M5a Dialysebuffer 500 mM KCl 4.1 Brug kold dH2O til at bringe til volumen.
10 mM MgCl2
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b Dialysebuffer 25 mM NaCl 4.1 Brug kold dH2O til at bringe til volumen.
10 mM MgCl2
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b-lagerbuffer 0,5 M NaCl 5.1 Bliv ved med at være på is.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3

Tabel 1: Buffere, der anvendes til proteinrensning.

Navn på buffer Sammensætning (M5a) Sammensætning (NM2b) Anvendte trin (M5a/NM2b) Kommentarer
4X Motilitetsbuffer (4x MB) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Vakuumfilter og opbevares i 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH-dag 7,4 pH-dag 7,4
50 mM saltmotilitetsbuffer (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Vakuumfilter og opbevares i 4°C
50 mM KCl 50 mM NaCl
Hæv til lydstyrke med dH2O Hæv til lydstyrke med dH2O
500 mM saltmotilitetsbuffer (500 mM MB) NIELSEN 25% v/v 4X MB Vakuumfilter og opbevares i 4°C
500 mM NaCl
Hæv til lydstyrke med dH2O
Myosin 0,05-0,1 μM myosin 0,2 μM myosin 4.2/5.2 Bliv ved med at være på is.
1 mM DTT 1 mM DTT
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 500 mM MB
1 mg/mL Bovin Serum Albumin (BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 4.3/5.3 Bliv ved med at være på is.
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 500 mM MB
1 mM DTT 1 mM DTT
5 μM Umærket F-actin i 50 mM MB (sort actin) 5 μM umærket F-actin 5 μM umærket F-actin 4.5/5.5 Bliv ved med at være på is. Forskydningsakt ved at pipette op og ned 5-10 gange eller ved hjælp af en sprøjte.
1 μM calmodulin (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0,2 mM CaCl2
Fortyndet i 50 mM MB 1 μM CaM
1-10 nM myosin lyskæde kinase (MLCK)
Fortyndet i 50 mM MB
MB med 1 mM DTT og 1 mM ATP 1 mM DTT 1 mM DTT 4.6/5.6 Bliv ved med at være på is.
1 mM ATP 1 mM ATP
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 50 mM MB
MB med DTT 1 mM DTT 1 mM DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 Bliv ved med at være på is.
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 50 mM MB
20 nM Rhodamin-Phalloidin F-actin (Rh-Actin) 20 nM Rhodamin-phalloidin F-actin 20 nM Rhodamin-phalloidin F-actin 4.8/5.8 Bliv ved med at være på is. Må ikke hvirvler.
1 mM DTT 1 mM DTT
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 50 mM MB
Endelig buffer 50 mM KCl 0,7% methylcellulose (valgfrit) 4.10/5.10 Tilsæt glukose, glukoseoxidase og katalase umiddelbart før forsøget udføres. Bliv ved med at være på is.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM NaCl
5 mM MgCl2 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0,1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM calmodulin 50 mM DTT
2,5 mg/mL glukose 1-10 nM MLCK
100 μg/mL glucoseoxidase 0,2 mM CaCl2
40 μg/mL katalase 1 μM calmodulin
2,5 mg/mL glukose
100 μg/mL glucoseoxidase
40 μg/mL katalase

Tabel 2: Buffere, der anvendes i glidende analyse.

Navn på buffer Sammensætning (M5a) Sammensætning (NM2b) Anvendte trin (M5a/NM2b) Kommentarer
4X Motilitetsbuffer (4x MB) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Vakuumfilter og opbevares i 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH-dag 7,4 pH-dag 7,4
50 mM salt motilitetsbuffer (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB Vakuumfilter og opbevares i 4°C
50 mM KCl 50 mM NaCl
Hæv til lydstyrke med dH2O Hæv til lydstyrke med dH2O
150 mM salt Motility Buffer (150 mM MB) 25% v/v 4X MB Vakuumfilter og opbevares i 4°C
150 mM NaCl
Hæv til lydstyrke med dH2O
Myosin 30 nM myosin Se "Final Buffer" Opskrift/4.12 Bliv ved med at være på is.
1 mM DTT
Fortyndet i 150 mM MB
2 mg/mL NeutrAvidin 2 mg/mL NeutrAvidin 2 mg/mL NeutrAvidin 3.5/4.8 Bliv ved med at være på is.
1 mM DTT 1 mM DTT
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 150 mM MB
1 mg/mL bovin serumalbumin (BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 3.3/4.6 Bliv ved med at være på is.
1 mM DTT 1 mM DTT
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 150 mM MB
200 nM rhodamin-falloidin biotinyleret F-actin (bRh-Actin) 200 nM rhodamin-falloidin biotinyleret F-actin 200 nM rhodamin-falloidin biotinyleret F-actin 3.7/4.10 Undgå klipning ved ikke at hvirvle eller pipetter op og ned. For at blande, forsigtigt invertere.
1 mM DTT 1 mM DTT
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 150 mM MB
MB med DTT 50 mM DTT 50 mM DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 Bliv ved med at være på is.
Fortyndet i 50 mM MB Fortyndet i 150 mM MB
Endelig buffer 50 mM KCl 0,7% methylcellulose (valgfrit) 3.9/4.14 Tilsæt glukose, glukoseoxidase og katalase umiddelbart før forsøget udføres. Bliv ved med at være på is.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM NaCl
5 mM MgCl2 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0,1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM calmodulin 50 mM DTT
2,5 mg/mL glukose 1-10 nM MLCK
100 μg/mL glucoseoxidase 0,2 mM CaCl2
40 μg/mL katalase 1 μM calmodulin
10 nM myosin 2,5 mg/mL glukose
100 μg/mL glucoseoxidase
40 μg/mL katalase

Tabel 3: Buffere, der anvendes i TIRF-analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Præsenteret her er en arbejdsgang for rensning og in vitro karakterisering af myosin 5a og nonmuscle myosin 2b. Dette sæt eksperimenter er nyttigt til at kvantificere de mekanokemiske egenskaber af rensede myosinkonstruktioner på en hurtig og reproducerbar måde. Selvom de to myosiner, der vises her, kun er to specifikke eksempler ud af de mange muligheder, kan betingelserne og teknikkerne anvendes med nogle skræddersyning til de fleste myosiner og til mange andre motorproteiner.

De protokoller, der diskuteres her, er underlagt variationer afhængigt af laboratoriets individuelle behov og eksperimenter. For eksempel, som diskuteret i afsnittet Ekspression og molekylærbiologi, blev de proteiner, der blev brugt i dette papir, genereret fra en co-infektion af to eller flere vira; Et vellykket proteinudtryk kan dog også opnås med vektorer med flere udtryk, f.eks.

Flere faktorer kan hæmme en vellykket produktion af det rekombinante protein. For at forhindre proteinforringelse er det bydende nødvendigt, at hvert trin i proteinrensningen gennemføres ved den rette temperatur, idet alle centrifugeringstrin forekommer ved 4 °C, og alle andre trin udføres på is. Overskydende bånd kan være synlige i gelen af det dialyzed proteinprodukt. Dette kan være tegn på nedbrydning eller kontaminering. Efterfølgende rensning via størrelsesudelukkelse eller ionisk udveksling af kromatografi kan øge renheden af prøverne54. Med henblik herpå anbefales det at gemme aliquots på hvert trin i proteinrensningsprocessen til fejlfinding, hvis der er et lavt udbytte af myosin eller mistanke om proteinforurening. Nogle gange kan der være utilstrækkelig binding af lysatet til harpiksen i trin 1.8, hvilket kan resultere i tab af myosin til supernatanten i efterfølgende centrifugeringer. Dette kan løses ved at variere varigheden af harpiksbinding i dette trin, selv om det overlades til at binde natten over, hvis det er nødvendigt. Længere inkubationstider medfører en større risiko for proteinforringelse, hvis forurenende proteaser ikke hæmmes tilstrækkeligt, og myosiner med proteolytisk følsomme områder vil blive påvirket negativt. Derudover kan forkert vask af harpiksen både før og efter brug resultere i eliks af et uønsket proteinprodukt, så det er bydende nødvendigt, at de korrekte protokoller følges før og efter brug af FLAG-affinitetsharpiksen. Hvis harpiksen vaskes umiddelbart efter brug og opbevares korrekt, kan den genbruges op til 20 gange.

Det er vigtigt at bemærke, at proteinforringelse også forekommer i udtryksfasen, og afkortning af ekspressionstiderne kan være fordelagtige med hensyn til nedbrydning, selv om dette kan ske på bekostning af det samlede udbytte. Efter de procedurer, der er skitseret her for at overvåge proteinprøven på forskellige stadier af protokollen (dvs. før, under og efter rensning) vil bidrage til at bestemme de stadier, der er nødvendige for optimering. For myosiner, der gentagne gange modstår vellykket udtryk og rensning, kan almindelige problemer være co-udtryk med utilstrækkelige eller uhensigtsmæssige lyskæder samt forkert foldning under overekspression. Passende lyskæder skal vælges på grundlag af kendte interaktioner, når det er muligt, og tunge baculovirusforhold mellem kæder og lyskæder skal afprøves i små forsøg for at bestemme det optimale. For myosiner, der aggregerer eller giver lidt eller intet opløseligt aktivt produkt, kan co-udtryk med chaperoner hjælpe med at opnå aktivt protein54,55.

Rensede myosinprodukter indeholder uundgåeligt en lille population af beskadiget myosin, benævnt "døde hoveder", som kan løses på to måder. En metode, der er skitseret i denne protokol, indebærer flydende umærket, eller "sort", actin gennem kammeret i glidende actin filament assay. Efterfølgende vask med ATP forårsager funktionelle myosiner til at adskille fra den sorte actin, mens døde hoveder vil forblive bundet til denne umærkede actin på grund af deres manglende evne til at hydrolysere ATP og på grund af deres høje affinitet. Mens du udfører den sorte actin vask, en sprøjte kan bruges til at klippe actin effektivt. Yderligere klipning kan opnås ved hvirvelvridning, forudsat at eventuelle resulterende bobler fjernes ved centrifugering. En alternativ metode er selektivt pellet de døde hoveder fra myosin prøve ved at blande myosin med F-actin og Mg-ATP ved højt salt (0,5 M) koncentrationer og sedimentering i en table-top ultracentrifuge. Myosiner, der er i stand til hydrolysering ATP under disse forhold, forbliver ikke bundet til actin på grund af deres lave affinitet for actin under disse høje saltforhold og findes i supernatanten, mens myosin døde hoveder forbliver bundet til actin i pellet56. Tilsvarende kan en sedimentering med actin og genopvarmning af pellet også bruges til at fjerne myosiner, som ikke er i stand til at binde sig til at actin i mangel af ATP. Bemærk, at en lille del af denne type døde hoveder vil have mindre indflydelse på disse typer af assays. Ved at foretage en nukleotidfri sedimentering og genopståen efterfulgt af en ATP-bundet centrifugering og genopståen, kan myosiner, der er kompetente til både actin-binding og ATP-afhængig frigivelse fra actin, isoleres.

Motilitet assays kan også ændres på flere måder. For eksempel i den glidende actin filament assay for NM2b, er NM2b fosforyleret i kammeret via tilsætning af MLCK, calmodulin, calcium og ATP i det sorte actin-trin såvel som i den endelige buffer. NM2b kan dog også fosforeres i et rør, før analysen udføres. Ved at gøre dette, kan procentdelen af fosforilateret NM2b kvantificeres ved at køre en indfødt gel med en urinstof-holdige prøve buffer eller udfører massespektrometri57,58. Effekten af temperatur på myosin aktivitet kan også undersøges. Dette kan opnås ved at anvende et objektivt varmesystem på mikroskopet eller et miljøkabinet, så flowcellen opretholdes ved konstant temperatur. Ionisk styrke er en anden vigtig overvejelse. For mange myosiner, actin affinitet og enzymatisk aktivitet vil blive øget ved lavere ionisk styrke; for andre er højere ionisk styrke nødvendig59. Ud over at give værdifulde oplysninger om myosin mekanisme, sænke den ioniske styrke kan øge motilitet og gøre myosin mere tilgængelig for undersøgelse med mange assays. I modsætning hertil vil nogle motorer udvise elektrostatiske tøjringseffekter, hvilket vil bremse motiliteten ved lavere ioniske styrker. Endelig, når man analyserer bevægelsen af NM2b filamenter, er det afgørende at opretholde ionstyrke inden for et smalt område (150-200 mM ionisk styrke), der nærmer sig dem, der findes i de fleste celletyper. Brugen af lavere ioniske styrker resulterer i sammenlægning af myosin filamenter, mens filamenter depolymerisere ved højere ioniske styrker.

Med mange myosiner, især dem med lav told nøgletal, betingelserne for den endelige buffer givet for M5a ville resultere i fluorescerende mærket actin filamenter er kun løst bundet til overfladen eller dissociating helt. Dette resulterer i uregelmæssige bevægelser, der komplicerer kvantificeringen. Bedre kvalitet bevægelse kan ofte opnås ved hjælp af methylcellulose (0,7%) i den endelige buffer. Methylcellulose er et tyktflydende fortrængningsmiddel og tvinger actin filamenter til at forblive tæt på overfladen, selv når tætheden af vedhæftede myosinmotorer er sparsom60. Tilsvarende er det blevet observeret, at optagelsen af methylcellulose i den endelige buffer af enkeltglødevandhedsanalysen er nødvendig for at observere bevægelse med NM2a, og det samme fænomen blev rapporteret for glatte muskel myosin filamenter29,61. Dette øger også processiviteten af NM2b filamenter. En potentielt uønsket bivirkning ved at bruge methylcellulose i denne analyse er, at fortrængningsmidlets egenskaber kan fremme den laterale tilknytning af myosinfilamenter til bundter. Alternativer til methylcellulose ved fejlfinding af manglende bevægelse eller løst bundne aktinfilamenter i den glidende actin filament assay er at sænke saltkoncentrationen i motilitetsbufferne eller at øge myosinoverfladetætheden. Som nævnt ovenfor, en høj ionisk styrke i motilitet buffere har vist sig at sænke muligheden for nogle myosiner at binde sig til actin29,34,62.

En anden variation af den glidende actin filament assay er brugen af antistoffer til at forankre myosin på glasset coverslip. For eksempel, hvis en GFP er til stede i C-terminal slutningen af myosin konstruere, en anti-GFP antistof kan bruges til at fastsætte GFP-myosin til coverslip36,63,64. Dette kan hjælpe med at opnå vellykket motilitet i situationer, hvor systemets geometri ellers kan hæmme actin translokation, som i tilfælde af test af kunstige eller korte håndtagsarme54,64. Derudover kan virkningen af belastning på translokation hastigheder undersøges i glidende actin filament assay ved at anvende actin-bindende proteiner såsom α-actinin eller utrophin39,50,65. En sådan måling kan være nyttig til at sammenligne effekten af belastning på et ensemble af myosiner versus belastningsafhængige kinetik af en enkelt myosin, der kan måles ved hjælp af en optisk fældefangstanalyse66,67. Dette kan opnås ved at tilføje stigende mængder af en actin-bindende protein sammen med myosin i det første skridt. Det actin-bindende protein binder sig til overfladen og udøver en friktionsbelastning på actin filamenter, der flyttes af myosiner, hvilket resulterer i en gradueret hastighed, da koncentrationen af actin-bindende protein på overfladen øges39.

Enkelt molekyle / ensemble motilitet assay kan også tilpasses til at undersøge effekten af forskellige actin strukturer på myosin bevægelse. For eksempel, snarere end at observere myosin bevægelse på toppen af enkelt actin filamenter, fascin- eller α-actinin-medieret actin bundter kan studeres som en in vitro rekonstituering af actin filament netværk findes i celler68,69. Effekten af actin-bindende proteiner som tropomyosin kan også studeres65,70,71,72.

Af note er alsidigheden i at vælge en etiket til enkelt molekyle / ensemble motilitet assay. I denne rapport blev der anvendt en GFP-etiket på både M5a-HMM og NM2b. Mange andre etiketter kan dog bruges. Som eksempler kan nævnes HaloTag eller SNAP-tag, som kan genetisk smeltes til myosin og kovalent binde et syntetisk farvestof. Fordelen ved HaloTag teknologi ligger i sin alsidighed for flere eksperimentelle tilpasninger, såsom mærkning med forskellige farver eller tilføje en biotin affinitet tag29,73. Derudover kan brugen af kvante prik teknologi anvendes til at forbedre opløsningen af enkelt molekyle fluorescens tracking, som også omhandler begrænsningen af GFP's lave lysstyrke og tendensen til photobleaching74. Tags kan fastgøres til lyskæder samt den tunge kæde11,75,76.

For at opnå succes i det enkelte molekyle TIRF motilitet assay, en nøglefaktor er ved hjælp af en godt blokeret og funktionaliseret overflade. En simpel metode til at opnå moderat blokering er at bruge biotinyleret-BSA bundet til en nitrocellulose overflade. Selvom dette vil fungere godt nok til at karakterisere mange motorer, herunder M5a, er niveauet af uspecifik binding på en sådan overflade uoverkommeligt til reproduktion af ren bevægelse med prøver som NM2b. Et vigtigt gennembrud i denne henseende var overgangen til PEGylated overflader oversået med biotin-PEG til funktionalisering77. PEG-overfladerne giver et langt højere niveau af overfladeblokering, og en defektfri PEGylated overflade kan forblive fri for uspecifik binding i meget lange perioder. Den specifikke protokol, der er beskrevet her, tillader produktion af biotinylerede PEG-overflader i løbet af få timer, og hvis de straks opbevares som beskrevet, kan overfladerne bruges i flere uger med kun et marginalt fald i kvaliteten.

En vigtig overvejelse, før der indsamles data til sporing, er anskaffelsesrammehastigheden. Bevægelsen mellem efterfølgende rammer skal være stor nok til at undgå oversampling fejl. Høje prøvetagningsprocenter vil give overvurderede hastigheder på grund af opdelingen af lokaliseringsfejl med et lille tidsinterval og øge den tilsyneladende fejl i målingen. I tilfælde, hvor de rå data er for fint samplet, kan dataene ned-stikprøven ved at tage hver Nth ramme for at skabe en ny stak og overvejer ændringen i billedhastighed, der resulterer. Subpixel bevægelser mellem rammer skal undgås, og bevægelser af flere hundrede nanometer er nødvendige for at opnå nøjagtige værdier. I alle tilfælde, hvor en ny prøve karakteriseres, skal resultaterne genereret af automatiseret analyse sammenlignes med et lille datasæt af manuelt sporede filamenter for konsistens.

Når du analyserer data fra eksperimenter med enkeltmolekylemotilitet, skal man være forsigtig, når du vælger, hvilke parametre der skal måles, hvordan data filtreres, og hvordan data skal tilpasses. Som nævnt ovenfor kan samplingfrekvensen være en vigtig faktor ved analyse af hastighedsdata. For mange myosiner, vil proceslystne kører være kort og godt tilnærmet af en lige linje. I sådanne tilfælde kan sporets start- og slutpunktsafstand give et godt mål for løbelængden, og dette kan divideres med sporets varighed for at give et godt skøn over hastigheden. I tilfælde, hvor sporene er meget lange og følger buede stier omkring bøjede filamenter, vil denne type analyse give unøjagtige resultater, og der skal anvendes en samlet tilbagelagt afstand ved hjælp af en anskaffelseshastighed, der gør det muligt at foretage en tilstrækkelig god afstand mellem disse punkter ved at skifte lokaliseringspunkter til at undgå oversamplingsfejl som beskrevet ovenfor, samtidig med at de er tæt nok sammen til, at den lige linjeafstand mellem dem forbliver en god tilnærmelse af kurven mellem disse punkter. For motorproteiner med lange kørelængder i forhold til sporets længde skal der desuden laves yderligere statistikker såsom Kaplan-Meier-estimatoren ved beregning af løbelængder78. Det samme gælder for situationer, hvor der er tilstrækkelig sandsynlighed for, at fotobleaching finder sted inden afslutningen af en proceskørsel. Et andet fænomen, der kan observeres i enkelt molekyle fluorescens undersøgelser er photoblinking, hvor fluorophores skifte mellem til og fra tilstand hurtigt og synes at blinke. Dette forekommer typisk ikke i disse motilitetseksperimenter; Hvis dette sker, kan laserintensiteten og eksponeringstiderne dog reduceres, hvilket skulle minimere effekten. Flere kemikalier, herunder β-mercaptoethanol, Trolox, cyclooctateraene, n-propyl gallat, 4-nitrobenzyl alkohol, og 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan kan udnyttes til at afbøde dette samt79.

Sammenfattende præsenterer denne artikel detaljerede protokoller, der er robuste i deres evne til at kvantificere mekanokemiske egenskaber såsom actin translokationshastighed, myosintranslokationshastighed og myosin løbelængde. Disse assays er reproducerbare og kan bruges til at bestemme kvaliteten af den rensede myosin selv i situationer, hvor de bevægelige egenskaber ikke er det specifikke endelige mål for undersøgelsen. Derudover kan ændringer som pH, temperatur og kemiske regulatorer introduceres til disse assays for at undersøge, hvordan mekanokemien af den undersøgte myosin påvirkes. Tilsammen kan actin glidende og omvendt motilitet assays give mulighed for en bedre forståelse af myosin ensemble adfærd og intermolekylære variationer i molekylær motorisk mekanik og kinetik. De fluorescensmikroskopibaserede assays, der er beskrevet her, understøtter en reduktionists tilgang til cytoskeletal forskning og kan være et kraftfuldt værktøj til at forstå proteinproteindynamik in vitro. Sammen kan data indsamlet fra disse stærkt kontrollerede eksperimenter bruges til at rådgive mekanobiologer om nøgleakomyosinadfærd, der kan være relevante på cellebiologiniveau og videre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Fang Zhang for teknisk bistand med forberedelsen af de reagenser, der anvendes til indsamling af disse data. Dette arbejde blev støttet af NHLBI / NIH Intramural Research Program midler HL001786 til JRS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032 (2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903 (2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936 (2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554 (2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

Tags

Biokemi myosin actin filamenter proteinrensning fluorescensmikroskopi motilitetsanalyse enkeltmolekyleanalyse bipolar filamenter total intern refleksion fluorescensmikroskopi
Myosin-specifikke tilpasninger af In vitro Fluorescens Mikroskopi-Baserede Motilitet Assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter