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Biochemistry

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

ここで提示されるミオシン5aを発現および精製する手順は、その特徴付け、アンサンブルおよび単分子の両方を用いて蛍光顕微鏡ベースのアッセイ、およびこれらの方法を非筋筋筋筋2bの特徴付けのためにどのように修飾することができるかである。

Abstract

ミオシンタンパク質は、フィラメントアクチン(F-アクチン)と結合して相互作用し、系統樹全体の生物に見られる。その構造と酵素特性は、細胞内で実行される特定の機能に適合しています。ミオシン5aは、細胞内のメラノソームおよび小胞を輸送するためにF-アクチンをプロセス的に歩く。逆に、非筋筋筋筋2bは、約30分子を含む双極性フィラメントとして動作する。これは、フィラメントの中心に向かって反対極性のF-アクチンを移動し、そこでミオシン分子がアクチンを結合し、パワーストロークを与え、サイクルを繰り返す前に解震するために非同期的に働く。非筋筋筋筋2bは、その他の非筋筋筋2アイソフォームと共に、細胞接着、サイトカネシス、および張力維持を含む役割を有する。ミオシンのメカノケミストリーは、精製タンパク質を用いたインビトロ運動性アッセイを行うことで研究できる。滑空アクチンフィラメントアッセイでは、ミオシンは顕微鏡カバースリップ表面に結合し、蛍光標識されたF-アクチンを転写し、追跡することができます。しかし、単一分子/アンサンブル運動アッセイでは、F-アクチンはカバースリップに結合し、F-アクチン上の蛍光標識ミオシン分子の動きが観察される。本報告では、親和クロマトグラフィーを用いた Sf9 細胞からの組換えミオシン5aの精製について概説する。これに続いて、2つの蛍光顕微鏡ベースのアッセイ:滑空アクチンフィラメントアッセイと反転運動アッセイの概要を説明します。これらのアッセイから、画像解析ソフトウェアを用いてアクチン転位速度や単一分子の実行長さや速度などのパラメータを抽出することができます。これらの技術はまた、非筋筋ミオシン2イソフォームの単一フィラメントの動きを研究するために適用することができ、非筋筋筋2bの文脈で本明細書で議論される。このワークフローは、非筋肉ミオシンの単一分子およびアンサンブルダイナミクスを研究するために使用できるプロトコルと定量的ツールのセットを表します。

Introduction

ミオシンは、アデノシン三リン酸(ATP)加水分解に由来するエネルギーを用いてアクチンフィラメントに力を発揮する運動タンパク質である。ミオシンには頭、首、尾のドメインが含まれています。ヘッドドメインは、ATP結合および加水分解の部位と同様にアクチン結合領域を含む。首のドメインは、軽鎖、カルモジュリン、またはカルモジュリン様タンパク質2、3に結合するIQモチーフで構成されています。尾部領域は、ミオシンの各クラスに特有のいくつかの機能を有し、2つの重鎖の二量体化、貨物分子の結合、およびヘッドドメイン1との自己抑制相互作用によるミオシンの調節を含むがこれらに限定されない。

ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なります。これらの特性の一部は、義務比(ミオシンがアクチンに結合しているミオシンの機械的周期の割合)およびプロセス性(剥離前にそのトラック上で複数のステップを行うモーターの能力)を含む4。40以上のミオシンクラスは、配列解析5、6、7、8に基づいて決定された。クラス2ミオシンは、最初に研究されたので、「従来」に分類されます。したがって、ミオシンの他のすべてのクラスは、「型破り」に分類されます。

ミオシン5a(M5a)はクラス5ミオシンであり、プロセスモーターであり、解離する前にアクチンに沿って複数のステップを取ることができることを意味する。これは、高いデューティ比を有し、その機械的サイクルの大部分をアクチン9、10、11、12、13、14に結合して費やしていることを示している。他のミオシンと共通して、重鎖はアクチン結合およびATP加水分解部位の両方を含むN末端モータードメインを含み、続いてレバーアームとして機能する首領域を含み、本質的な軽鎖(ELC)およびカルモジュリン(CaM)15に結合する6つのIQモチーフを有する。尾部領域にはαらせんコイルコイルが含まれており、分子を二量体化し、続いて貨物を結合するための球状尾部領域が続きます。その運動論は、メラノサイトにおけるメラノソームの輸送およびプルキンジェニューロン16,17における小胞体の輸送への関与を反映している。M5aは原型貨物輸送モータ18と考えられている。

クラス2ミオシン、または従来のミオシンは、非筋筋ミオシン2(NM2)アイソフォームに加えて骨格、心臓、平滑筋の収縮に力を与えるミオシン、NM2a、2b、および2c19を含む。NM2アイソフォームは、全ての細胞の細胞質に見出され、サイトカネシス、接着、組織形態形成、および細胞遊マイグレーション19、20、21、22において役割を共有している。本論文では、非筋ミオシン2b(NM2b)23の文脈における従来のミオシンプロトコルについて論議する。NM2bは、M5aと比較して、低いデューティ比を有し、0.2 s-123のVmaxのVを有する酵素的に遅い≈18 s-124のM5aのVmaxと比較した。特に、2つのヘッドを持つ切り捨てられたNM2bコンストラクトは、アクチン上で処理的に容易に移動しません。むしろ、アクチンとの出会いのたびに、パワーストロークが発生し、その後に分子25が解離される。

NM2bには2つのミオシン重鎖が含まれ、それぞれに1つの球状頭ドメイン、1つのレバーアーム(ELCと1つの調節軽鎖(RLC))、およびαヘリカルコイルコイルロッド/テールドメイン(約1,100アミノ酸長)が含まれ、これら2つの重鎖を二量体化します。NM2bの酵素活性および構造状態は、RLC23のリン酸化によって調節される。非リン酸化NM2bは、ATPおよび生理的イオン強度(約150mM塩)の存在下で、2つの頭部が非対称相互作用に関与し、尾部が23の2箇所で頭の上に折り畳まれるコンパクトな立体構造を採用している。この状態では、ミオシンはアクチンと強く相互作用せず、酵素活性が非常に低い。カルモジュリン依存性ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)またはRho関連プロテインキナーゼによるRLCリン酸化の際、その分子は尾部を通して他のミオシンと結合して、約30個のミオシン分子23の双極性フィラメントを形成する。RLCの前述のリン酸化はまた、NM2bのアクチン活性化ATPase活性を約4倍の26、27、28に増加させる。このバイポーラフィラメントの配置は、各端に多くのミオシンモーターを搭載し、収縮および張力維持における役割に最適化されており、対立する極性を有するアクチンフィラメントを互いに23,29に対して相対的に移動させることができる。したがって、NM2bはアクチンと相互作用する際にモータのアンサンブルとして機能することが示されている。このフィラメント内の多数のモータにより、NM2bフィラメントはアクチンフィラメント上でプロセス的に移動でき、インビトロフィラメントの加工性を29を特徴付け可能にする。

細胞内のミオシンの役割を理解する上で進歩が見られましたが、タンパク質レベルで個々の特性を理解する必要があります。細胞内ではなく、単純なタンパク質とタンパク質相互作用レベルでのアクトミオシン相互作用を理解するために、インビトロ研究で使用するために組み換えミオシンを発現し、精製することができます。このような研究の結果は、メカノバイオスレーターに、最終的に複雑な細胞プロセスを駆動する特定のミオシンの生物物理学的性質について知らせる12,13,14,25,29.通常、これは、全長または切り捨てられたミオシンコンストラクトにアフィニティタグを追加し、アフィニティークロマトグラフィー29、30、31を介して精製することによって達成される。さらに、この構築物は、遺伝的にエンコエーブルなフルオロフォアまたは合成フルオロフォアでのタンパク質標識用のタグを含むように設計することができる。このような蛍光標識を添加することにより、ミオシン力学および運動学を観察する単一分子イメージング研究が行える。

精製後、ミオシンは、いくつかの方法で特徴づけることができる。ATPase活性は、異なる条件32の下でモータの全体的なエネルギー消費量とアクチン親和性についての洞察を提供する、色分け法によって測定することができる。その運動性のメカノケミストリーについて学ぶためには、さらなる実験が必要です。本論文では、精製ミオシンタンパク質の運動特性を特徴付けるために使用できる2つのin vitro蛍光顕微鏡ベースの方法について詳しく述べています。

これらの方法の第1は、滑空アクチンフィラメントアッセイであり、ミオシンモータのアンサンブル特性を定量的に研究し、精製タンパク質33のバッチの品質を定性的に研究することができる。本論文では、本アッセイに対する全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡の使用について論じるが、これらの実験は、多くの研究室34に広く見られるデジタルカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡を用いて効果的に行うことができる。このアッセイでは、ミオシンモータの飽和層がカバースリップに取り付けられています。これはニトロセルロース、抗体、膜、SiO2-誘導体化表面(トリメチルクロロシランなど)を用いて達成できるが、とりわけ29、33、35、36、37、38。蛍光標識アクチンフィラメントはカバースリップチャンバーを通過し、その上にアクチンが表面に付着したミオシンに結合する。ATP(およびNM2の研究におけるキナーゼ)を添加すると、チャンバーは、表面結合ミオシンによるアクチンフィラメントの転位を観察するために画像化される。トラッキングソフトウェアは、各滑空アクチンフィラメントの速度と長さを相関させるために使用することができます。解析ソフトウェアは、移動型および静止型アクチンフィラメントの数の測定値を提供することもできるため、所定のミオシン製剤の品質を判断するのに有用である可能性があります。失速したフィラメントの割合は、アクチンの表面テザリングによって他のタンパク質に対する意図的に変調し、ミオシン39の負荷依存性を決定するために測定することもできる。各アクチンフィラメントは多数の利用可能なモータによって推進できるため、このアッセイは非常に再現性が高く、最終的な測定速度は、開始ミオシン濃度の変化や溶液内の追加の因子の存在などの摂動に強い。これは、変化したリン酸化、温度、イオン強度、溶液粘度、表面テザーによって誘発される負荷の影響など、異なる条件下でミオシン活性を研究するために容易に変更できることを意味します。ATP加水分解ができない強結合ミオシン「デッドヘッド」などの要因は、アクチンフィラメントの停滞を引き起こす可能性がありますが、そのような問題を軽減し、正確な測定を可能にする複数の方法があります。ミオシンの運動特性はクラスによって大きく異なり、使用される特定のミオシンに応じて、このアッセイにおけるアクチンフィラメント滑空の速度は20 nm/s(ミオシン9)40、41、および60,000nm/s(シャラセアンミオシン11)42の下で変化する可能性がある。

第2アッセイは、滑空アクチンフィラメントアッセイ12の幾何学を反転させる。ここで、アクチンフィラメントはカバースリップ表面に付着しており、M5aの単一分子またはNM2bの個々の双極性フィラメントの動きが可視化される。このアッセイは、アクチン上の単一のミオシン分子またはフィラメントの実行長および速度を定量化するために使用することができる。カバースリップは、非特異的結合をブロックし、同時にビオチンポリエチレングリコール(ビオチン-PEG)などの表面を機能させる化学化合物でコーティングされています。修飾アビジン誘導体の添加は、表面を素数化し、ビオチン化アクチンがチャンバーを通過し、チャンバーの底に安定して結合したF-アクチンの層をもたらす。最後に、活性化および蛍光標識ミオシン(通常1-100 nM)がチャンバーを流れ、次いで静止したアクチンフィラメント上のミオシンの動きを観察するために画像化される。

これらのモダリティは、非筋肉と筋ミオシンの両方のダイナミクスを調べるために採用することができる迅速かつ再現可能な方法を表します。本報告書は、M5aとNM2bの両方を精製し、特徴付ける手順を概説し、それぞれ非伝統的なミオシンを表す。その後、ミオシン特異的な適応の一部について議論が行われ、2種類のアッセイで動きのキャプチャを成功させるために行うことができる。

発現・分子生物学
対象のミオシンのcDNAは、M5a-HMMを発現する場合はC末端FLAGタグ(DYKDDDK)、またはNM2b23、43、44、45、46の全長分子を発現する場合はN末端FLAGタグのために符号化する修正されたpFastBac1ベクターにクローン化されなければならない。NM2b上のC末端FLAGタグは、FLAG-アフィニティーカラムに対するタンパク質の親和性が弱くなります。対照的に、N末端FLAGタグ付きタンパク質は、通常、FLAGアフィニティーカラム23によく結合する。N末端にタグ付けされたタンパク質は、酵素活性、機械的活性およびリン酸化依存性調節23を保持する。

本論文では、フラグタグとミオシン重鎖のC末語との間にGFPを有する切り捨てられたマウスM5a重メロミオシン(HMM)様の構造を用いた。NM2bとは異なり、M5a-HMMはN端子またはC端子FLAGタグで正常にタグ付けおよび精製することができ、どちらの場合も結果として得られる構成体がアクティブになることに注意してください。M5a重鎖はアミノ酸1090で切り捨てられ、M5a47のGFPとコイルコイル領域との間に3つのアミノ酸リンカー(GCG)を含む。GFP と FLAG タグの間にリンカーが追加されなかった。M5a-HMMはカルモジュリンと共に発現した。全長ヒトNM2b構築物をELCおよびRLCと共に発現した。RLCのN末語を5アミノ酸のリンカーを介してGFPと融合した(SGLRS)。FLAGタグに直接アタッチされたのはハロタグでした。ハロタグとミオシン重鎖のN末語との間には、2つのアミノ酸(AS)からなるリンカーであった。

両方のミオシン製剤を、約2 x 106細胞/mLの密度でバキュロウイルスに感染したSf9細胞培養物の1リットルから精製した。各サブユニットのバキュロウイルスの量は、メーカーの指示によって決定されるウイルスの感染の多重度に依存した。M5aの場合、細胞はカルモジュリン用の2つの異なるバキュロウイルス1とM5a重鎖用の1つを共感染した。NM2bの場合、細胞はELC用の3つの異なるウイルス1、RLC用、NM2b重鎖用のウイルス1種と共感染した。多様なミオシン(または他の多複雑なタンパク質)を扱うラボでは、重鎖と軽鎖の多くの組み合わせを可能にし、カルモジュリンなどの一般的に使用される軽鎖は、多くの異なるミオシン重鎖と共にトランスフェクションすることができるので、このアプローチは効率的です。すべての細胞作業は、汚染を避けるために適切な滅菌技術を備えたバイオセーフティキャビネットで完了しました。

M5aおよびNM2bの両方の発現に関して、組換えミオシンを産生する Sf9 細胞を感染後2〜3日回収し、遠心分離を介して、−80°Cで保存した。 細胞ペレットは、2,800 x gで30分間4°CでコフェクトされたSf9細胞を遠心した。タンパク質精製プロセスについて、以下で詳しく説明します。

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Protocol

1. タンパク質精製

  1. 細胞のリシスとタンパク質抽出
    1. 表 1に基づいて 1.5 倍の抽出バッファを準備します。4 °Cでフィルターして保管します。
    2. 氷の上の細胞ペレットの解凍を開始します。ペレットが解凍されている間、1.2 mMジチオスレイトール(DTT)、5 μg/mLロイペプチン、0.5 μMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)および2つのプロテアーゼ阻害剤錠剤で抽出バッファーの100 mLを補います。氷の上に置いておきなさい。
    3. ペレットが解凍されたら、細胞培養の10 mLあたり1mLの補充抽出バッファーを加える。例えば、細胞ペレットを500mLの細胞培養から形成した場合、ペレットに50mLの補充抽出バッファーを加える。
    4. 細胞ペレットを氷の上に保ちながら超音波処理します。各ペレットに対して、5 s ON、5 s OFF、5 分の持続時間、4-5 の電源を使用します。
    5. すべての均質化溶解液をビーカーに集め、ATPの最終濃度が1mMになるようにATP(0.1 Mストック溶液;pH 7.0)を加えます。冷たい部屋で15分間かき混ぜます。ATPは活性ミオシンをアクチンから解離し、以下の遠心分離工程で分離することを可能にする。したがって、ATPの枯渇およびアクチンへの再結合の可能性を最小限に抑えるためには、直ちに次のステップに進む必要がある。
    6. 48,000xgで48,000xgでリセートを遠心分離する。 これが起こっている間、メーカーの指示に従って、抗FLAGアフィニティー樹脂(細胞の1 Lから形成されたペレットの場合)の50%スラリーの1〜5 mLを100 mLリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し始めます。例えば、5mLの樹脂については、50%スラリーの10mLを洗浄する。最終洗浄工程では、50%スラリーを作成するのに十分な量のPBSの1〜5 mLで樹脂を再懸濁します。
    7. 溶石遠心分離に続いて、上清と洗浄された樹脂スラリーを組み合わせ、冷たい部屋で1〜4時間静かに揺れる。待ち中に、 表1 に記載されているバッファーを作り、氷の上に保管します。
  2. フラグアフィニティー精製製剤
    1. ステップ1.7で4°Cで5分間5分間の 溶液を遠 心分離する。 樹脂はチューブの底部に詰め込まれます。樹脂を邪魔することなく、上清を取り除く。
    2. 表1に詳述したバッファーAの50mL、500xgの遠心分離機で4°Cで5分間再懸濁します。 樹脂を邪魔することなく、上清を取り除く。
    3. 表1に詳述したバッファーBの50mL、500xgの遠心分離機で4°Cで5分間再懸濁する。 このステップをもう一度繰り返し、20 mLのバッファーBで樹脂を再懸濁します。その後、チューブを手で約10回軽く反転させることにより、樹脂と緩衝液を十分に混ぜます。
  3. タンパク質の溶出と濃縮
    1. 表1に記載されているように溶出バッファーの30 mLを作り、氷の上で冷やします。
    2. 冷たい部屋に溶出列を設定します。樹脂スラリーを軽く柱に注ぎます。底面に樹脂パックとしてバッファーBの1〜2カラムの体積でカラムを洗浄し、樹脂が乾燥しないようにします。
    3. 樹脂を通して溶出バッファーの1 mLを流れ、1.5 mLの管の流れを集める。12,1mL分が集められるような繰り返しを行う。
    4. この時点で、分数に対して粗いブラッドフォード検定を実行して、最も濃縮された48の分数を定性的に判断します。96ウェルプレートの1列に、ピペット60 μL 1xブラッドフォード試薬。分数を収集すると、各分画の20 μLをウェルごとに混合します。濃い青色の色は、より濃い分数を示します。
    5. 50 mLチューブ内で、残りの溶出バッファーをカラムを通して静かにピペットして残りのタンパク質を回収し、カラムフロースルー中の樹脂に結合した残りのミオシンを放出する。このフロースルーは次のステップに集中します。再使用のために樹脂を再生成し、製造元の指示に従って保管してください。
    6. 3つの最も濃縮された分率をプールし、さらに100,000 MWの濃縮管を使用して、50 mLチューブにフロースルーを集中させ、残りの1mL画分を濃縮します。プールしたサンプルを濃縮チューブと遠心分離機に750 x g で4°Cで15分間ロードし、溶出したタンパク質がすべて約0.5〜1mLの最終体積になるまで繰り返します。
      注:この孔サイズは、分子量カットオフの数倍の質量を有するミオシン分子の保持を可能にする。この濃度の過程で、この時点で軽鎖は、最終製品に対してSDS-PAGEゲル電気泳動を行うことで検証されるように、モータドメインにしっかりと結合したままです。
  4. 透析とフラッシュフリーズ
    1. 表 1に記載されているように、透析バッファーの 2 L を作成します。冷たい部屋で一晩透析袋またはチャンバーにサンプルをロードし、透析します。なお、透析バッファーの組成は、NM2bとM5aで異なっている。
      注:NM2bの場合、この透析工程の目的は、低イオン強度バッファー内にミオシンフィラメントを形成することです。これらのフィラメントの沈降は、次に、追加の精製工程を提供し、サンプルの濃度を可能にします。したがって、翌日の透析室には可視の白色沈殿物が存在する。これらのフィラメントは、遠心分離によって回収され、ステップ5.1で脱重合される。M5a-HMMの場合、一晩透析後、タンパク質は、その後のアッセイで使用するために十分に純粋であろう。必要に応じて、ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーなどのさらなる精製工程を行うことができる。透析後のM5a回復については、ステップ5.2に進みます。
  5. 透析後のミオシンの回復
    1. NM2bの場合、サンプル全体を透析用バッグまたはチャンバーから4°Cで49,000 x g で15分間慎重にアンロードし、ミオシンフィラメントを収集します。上清を捨てて、 表1に記載されているように、ペレットにストレージバッファを徐々に加えて、溶解させます。穏やかな上下のピペットはペレットを可溶化するのに役立ちます。通常、これはチューブあたり500 μL以上を必要としません。ペレットが高イオン強度貯蔵バッファーに完全に溶解していることを確認した後、ミオシンが非重合され、上清に残るため、必要に応じて追加の遠心分離ステップ(49,000 x gで 15 分)を実行して不要な凝集体を除去することができます。
    2. M5a-HMMの場合、不要な凝集物が存在する場合に備えて、4°Cの透析チャンバーと遠心分離機からサンプル全体を49,000 x g で15分間慎重に回収してください。上清を取る。
  6. 濃度決定とフラッシュ凍結
    1. 製品の濃度を決定するには、波長260、280、290、および320nmの分光光度計を使用して吸光度を測定します。式1でmg/mL(cmg/mL)で濃度を計算し、A280は280nmでの吸収を表し、A320は320nmでの吸収を表します。mg/mLの結果として得られる濃度は、式2でミオシン分子のμMに変換することができ、Mはタンパク質全体の分子量(重鎖、軽鎖、フルオロフォア、およびすべてのタグを含む)である。
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      μM分子= 1000cmg/mL/M(2)
      注: 希釈が必要な場合は、高イオン強度バッファーで行う必要があります。絶滅係数(ε)は、タンパク質のアミノ酸配列をExPASyなどのプログラムにインポートすることによって決定することができる。M5a-HMMの典型的な収量は約0.5-1 mLの1-5 mg/mLタンパク質であり、全長NM2bの場合は0.5-2 mg/mLの0.5-1 mLです。本論文で用いたM5a-HMMの消光係数は0.671であった。本論文で用いたNM2bの消光係数は0.611であった。
    2. 精製したミオシンを2つの方法のいずれかで保管します。アリコートは、重合連鎖反応チューブなどの薄壁チューブに10〜20μLの間で、フラッシュ凍結のために液体窒素の容器にチューブをドロップします。あるいは、20~25μLのミオシンを液体窒素に直接ピペットし、凍結したタンパク質ビーズを無菌極低温管に保存します。いずれの場合も、得られたチューブは、将来の使用のために-80°Cまたは液体窒素で保存することができます。
      注:以下に説明する両方の運動性アッセイは、非常に少量のタンパク質を必要とするため、小さなアリコートでの貯蔵は、説明したように、経済的である。

2. グライダーアクチンフィラメントアッセイ

  1. カバースリップ準備
    1. アセテートアミルで1%ニトロセルロース溶液を作ります。
    2. ティッシュ培養皿(150 x 25 mm)を入手し、皿の底に円形のろ紙(直径125mm)を加えます。
    3. 8つのNo.1.5厚さ22mmの正方形のカバースリップをラックに積み込み、約2〜5mLの200プルーフエタノールで洗浄し、続いて蒸留水(dH2O)を2〜5 mLで洗浄します。水で終わるこの洗浄ステップを繰り返します。次に、フィルターエアラインまたはN2-ラインを使用してカバーリップを完全に乾燥させます。
    4. スリップの1つの端に沿って1%ニトロセルロース溶液の1カバースリップとゆっくりとピペット10 μLを取ります。次に、1つの滑らかな動きで、滑らかな側面の200 μLピペットチップの側面を使用してカバースリップの残りの部分に塗り付けます。ニトロセルロース側を上にして、このカバースリップを組織培養皿の上に置きます。残りのカバーリップについて繰り返し、残りの試薬を調製しながら乾燥させ、コーティング後24時間以内にカバースリップを使用します。
  2. チャンバー準備
    1. 光学レンズ紙で顕微鏡スライドを拭き取り、大きな破片を取り除きます。両面テープを2枚カットし、長さ約2cm。
    2. 顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1個を置きます。テープの端がスライドの端に合っていることを確認します。2枚目のテープをテープの最初の部分の約2mm下に置き、2枚が平行に整列するようにします。これにより、約 10 μL の溶液を保持できるフローチャンバが作成されます( 図 1を参照)。
    3. 第1部からニトロセルロースコーティングされたカバーリップの1つを取ります。ニトロセルロースでコーティングされた側面がテープと直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます( 図1を参照)。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェイスを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。スライドの端に掛かる余分なテープをカミソリの刃で切ります。
  3. アクチン製剤
    1. 20 μM F-アクチンを重合バッファー(50 mM KCl,2 mM MgCl2,1mM DTT,25 mM MOPS(pH 7.0))で重合して4°Cで作ります。
    2. F-アクチンを運動バッファーに5 μMに希釈します(20 mM MOPS、5mM MgCl 2、0.1 mM EGTA、1 mM DTT(pH 7.4))。ローダミン-ファロイジンの少なくとも1.2倍モル過剰の標識。氷の上に少なくとも2時間(アルミホイルで覆われている)を残します。これは氷の上に貯えられる1-2ヶ月まで使用することができる。
  4. ミオシン5aグライダーアクチンフィラメントアッセイを行う
    注: 本項では、ミオシン5a(HMM)のグライダーアッセイの詳細を提供します。
    1. 表2に記載のミオシン5aの溶液を調製し、氷の上に保管する。
    2. ミオシン5a(50-100 nM)の10μLで流れ、流れチャンバを通り、1分間待ちます。
    3. 1 mM DTT(低塩」バッファー)を用いた50 mM MB の 1 mg/mL BSA の 10 μL で流れます。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーのコーナーを使用して、流れチャンバー出口に紙の角をそっと置くことによって、流路を通して溶液を芯に入れます。
    4. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. 黒いアクチン溶液(5 μM F-actin、1 μMのカルモジュリン、1 mMのM M MBで1 mMのATP、1 mM DTT)の10 μLの流れは、 議論 のセクションで説明したように「死んだ頭部」を除去する。
      1. ピペット溶液を1mLシリンジと27G針で、アクチンフィラメントを剪断してからチャンバーに導入した。この手順をさらに 2 回繰り返し、3 回目の 1 分後に待機します。約20のピペットイベントで十分です。
      2. 「デッドヘッド」スピンを行う場合、500mMの塩濃度で1mM ATPと1 mMMgCl2 の存在下でミオシンにF-アクチンの量論量を加えます。その後、480,000 x g で4°Cで15分間超遠心分離機を使用します。 死んだミオシンはペレットになります。
    6. 50 μL の 50 μL の流量 50 mM MB 1 mM DTT と 1 mM ATP フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させます。
    7. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返して、任意のATPのチャンバーを枯渇します。
    8. 1 mM DTTを50mM MBに含む20nMローダミンアクチン(Rh-アクチン)溶液の10μLで流れ、1分間待って、カバースリップの表面に付着したミオシン5aにアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする。
    9. 1 mM DTTで10μLの50mM MBで洗浄し、表面に縛られていないRh-アクチンフィラメントを洗い流します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. 最終バッファの30 μLの流れ。
    11. 561 nmの励起波長を使用して蛍光顕微鏡で画像を記録し、Rh-アクチンを可視化します。適切な露出時間は、1.4 mWレーザーパワーで200 msで、合計取得時間は0.5〜1分です。
      注: 取得レートが移動するフィラメントの速度に合わせて適切にスケーリングされていることを確認します。トラッキングプログラムで使用するためにデータを収集する前に重要な考慮事項は、取得フレームレートです。フレーム間のサブピクセルの動きは速度の過大評価をもたらし、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。最適な取得レートは、フレーム間の少なくとも 1 ピクセルの距離に対して滑空を行う機能です。ここでのイメージングに使用されるTIRF顕微鏡の場合、この閾値は130 nmに変換されます。したがって、1μm/sの移動が予想されるミオシンは、200 nmの移動を達成するために5フレーム/秒(0.2秒間隔)の速度で画像化する必要がありますが、ミオシンは0.05フレーム/秒(20秒間隔)を必要とします。したがって、必要に応じてこの段階でデータをダウンサンプリングできます (詳細については 、「ディスカッション 」を参照)。
  5. 非マッスルミオシン2bグライダーアクチンフィラメントアッセイを行う
    注:本項では、全長非筋ミオシン2b滑空アッセイの詳細を提供する。非筋筋ミオシン2b滑空アクチンフィラメントアッセイプロトコルは、特定のステップでのミオシン5aプロトコルとは異なる。これらの各ステップに対して、正しいバッファーが使用されていることを確認してください。例えば、NM2bアッセイは高塩バッファー内のカバースリップへのミオシンの付着を必要とし、M5aは高塩バッファーまたは低塩バッファー内のカバースリップに取り付けることができます。さらに、M5aグライダーアクチンフィラメントアッセイは、取得中に分解アクチンフィラメントの頻度を軽減するために、ミオシンの低濃度を使用します。
    1. 表2に記載されているNM2bのソリューションを準備し、氷の上に保管します。
    2. 非筋2b(0.2μM)の10μLで、500 mM運動バッファー(MB)(高塩バッファー)および1 mMジチオスライトール(DTT)が流れチャンバーを通り、1分間待機します。
      注:高塩バッファーは、ミオシンフィラメントを解離し、表面への単一ミオシン分子の結合を可能にします, 非筋筋筋筋2bは、イオン濃度<150 mMでフィラメントに重合することができます.
    3. 表2に記載されているように1mM DTT(「高塩」緩衝液)を有する500mMMBの1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)の10μLの流れ。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    4. 表2に記載されているように、1mM DTTで10μLの500mM MBで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. 「デッドヘッド」を排除するために 表2 に記載されているように、黒いアクチン溶液の10 μLの流れは 、さらに議論 のセクションで説明したように。黒アクチン溶液には、5 μMの未ラベルF-アクチン、1-10 nM MLCK、1 mM ATP、0.2 mM CaCl2、1μM CaM、および1 mM DTTが50 mM NaCl運動バッファーに含まれ、非マッスルミオシン2bをチャンバ表面にリン酸化します。
      1. ピペット溶液を1mLシリンジと27G針で、アクチンフィラメントを剪断してからチャンバーに導入した。この手順をさらに 2 回繰り返し、3 回目の 1 分後に待機します。約20のピペットイベントで十分です。
    6. 50 μL の 50 μL の流量 50 mM MB 1 mM DTT と 1 mM ATP フリーアクチンフィラメントのチャンバーを枯渇させます。
    7. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返して、任意のATPのチャンバーを枯渇します。
    8. 1mM DTTを50mMMBに含む20nM Rh-Actin溶液の10μLで流れ、1分間待って、カバースリップの表面に付着した非筋肉筋2bにアクチンフィラメントの厳格な結合を可能にする。
    9. 1 mM DTTで10μLの50mM MBで洗浄し、表面に縛られていないRh-アクチンフィラメントを洗い流します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. 最終バッファの30 μLの流れ。非マッスルミオシン2b滑空アクチンフィラメントアッセイの場合、最終緩衝液には、ビデオイメージング中に非筋筋筋筋2bの完全なリン酸化を提供するカルモジュリン、CaCl2、およびミオシン軽鎖キナーゼも含まれる。0.7%メチルセルロースは、アクチンフィラメントが緩やかに結合しているか、表面に結合されていない場合、最終バッファに含めることもできます。これについては、「 ディスカッション」 セクションで詳しく説明します。
    11. 561 nmの励起波長を用いて蛍光顕微鏡で画像を記録します。適切な露出時間は、1.4 mWレーザーパワーで200 msで、合計取得時間は 0.5〜3分です。
      注: 取得レートが移動するフィラメントの速度に合わせて適切にスケーリングされていることを確認します。トラッキングプログラムで使用するためにデータを収集する前に重要な考慮事項は、取得フレームレートです。フレーム間のサブピクセルの動きは速度の過大評価をもたらし、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。最適な取得レートは、フレーム間の少なくとも 1 ピクセルの距離に対して滑空を行う機能です。ここでのイメージングに使用されるTIRF顕微鏡の場合、この閾値は130 nmに変換されます。したがって、1μm/sの移動が予想されるミオシンは、200 nmの移動を達成するために5フレーム/秒(0.2秒間隔)の速度で画像化する必要がありますが、ミオシンは0.05フレーム/秒(20秒間隔)を必要とします。したがって、必要に応じて、この段階でデータをダウンサンプリングできます (詳細については 、「ディスカッション 」を参照)。

3. 単一分子TIRFアッセイ

  1. カバースリップ準備
    1. ストックパウダーをメトキシペグシラン(mPEG)の10mgアリコート(1.5 mLチューブ)とビオチンペグシラン(bPEG)の10mgアリコートに分けます。密閉された、湿気のない容器に-20 °Cで保管し、6ヶ月以内に使用してください。
    2. 8 No.1.5H(高精度)の厚さ22mmの正方形のカバースリップをラックに積み込み、200mLの200プルーフエタノールで洗浄し、続いて2〜5mLの蒸留水を洗浄します。水で終わるこの洗浄ステップを繰り返します。次に、エアラインまたはN2 を使用してカバースリップを完全に乾燥させ、3分間アルゴンでプラズマクリーンにします。
    3. きれいなカバーリップを濾紙(90mm)の上に組織培養皿(100 x 20 mm)に入れ、70°Cのオーブンでインキュベートし、次の手順を実行します。
      注:プラズマ洗浄は、他の化学洗浄方法49に置き換えることができます。
    4. dH2Oで80%エタノール溶液を調製し、HClを使用してpHを2.0に調整し、mPEGの10mgアリコートに1mL、1mLを10mgのアリコートに加えます。溶解する渦は、30sを超える必要はない。
    5. bPEG溶液を100μLとし、80%エタノール(pH2.0)の900 μLを加えます。この溶液は1 mg/mL bPEGである。次に、両方のPEGの溶液を次のようにして、十分に混合します。
      1. 200 μL 10 mg/mL mPEG (最終濃度: 2 mg/mL)。
      2. 1 mg/mL bPEGの10 μL(最終濃度:10 μg/mL)。
      3. 790 μLの80%エタノール(pH 2.0)溶液。
    6. オーブンからカバーリップを取り出します。100 μLのPEG溶液を各カバースリップの中央に慎重に分配し、上部表面だけが濡れているか確認します。その後、スリップをオーブンに戻し、20〜30分間インキュベートします。
    7. カバーリップが表面全体に見える小さな円で穴のあいた外観を取り始めると、オーブンからそれらを取り除きます。
    8. 各カバースリップを100%エタノールで洗い、エアラインで乾燥させ、オーブンに戻します。ステップ2でチャンバーを作成するのに必要な時間だけインキュベートします。
  2. チャンバー準備
    1. チャンバーを作るのに使用するための顕微鏡のスライドをきれいにしなさい。両面テープを2枚カットし、長さ約2cm。
    2. 顕微鏡スライドの長い端の中央に沿って1個を置きます。テープの端がスライドの端に合っていることを確認します。2枚目のテープをテープの最初の部分の約2mm下に置き、2枚が平行に整列するようにします。
    3. オーブンから機能したカバーリップの1つを取ります(3.1で作成)。 図 1に示すように、PEG でコーティングされた側面が裏面下にしてテープに直接接触するように、カバースリップをテープに慎重に貼り付けます。ピペットチップを使用して、スライドテープインターフェイスを軽く押し下げて、カバースリップがスライドに正しく付着していることを確認します。
    4. スライドの上にぶら下がっている余分なテープをカミソリの刃で切ります。これらのチャンバはすぐに使用されるか、または50 mLの管に対に置かれ、将来の使用のために-80°Cのフリーザーに貯えられる。すぐに保存することが重要であるか、表面が劣化します。
  3. ミオシン5a TIRF顕微鏡測定の実施
    1. 表3に記載のミオシン5a逆運動性アッセイの溶液を調製し、氷の上に保管する。
    2. 1 mM DTTで50mM MBの10 μLでチャンバーを洗います。
    3. 1 mM DTT で 50 mM MB の 1 mg/mL BSA の 10 μL で流れます。この洗浄をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後1分待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    4. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    5. NeutrAvidin溶液の10 μLで1mM DTTで50 mM MBの流れ、1分間待ちます。
    6. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    7. 1 mM DTTを50mMMBに含むビオチン化ローダミンアクチン(bRh-アクチン)の10μLの流れで1分待ちます。このステップでは、大きな退屈なピペットチップを使用し、蛍光アクチンフィラメントの剪断を最小限に抑えるために上下にピペットを避け、長いアクチンフィラメントを表面(20〜30 μm以上)に取り付けられるようにします。効果的な代替手段は、標準的なピペットチップのコーンを切断することです(≈1-1.5 mmの開口部を有する)。
    8. 1 mM DTTで50mM MBの10μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    9. 10 nMミオシン5aを加えた最終バッファの30 μLの流れは、TIRFのイメージングモダリティに最適な焦点を見つけた後、TIRF顕微鏡に直ちにロードし、記録します。100〜200 msの間の暴露時間は、アクチンおよびGFP標識ミオシンに対して1.4 mWレーザーパワーで適切である。速度解析の適切な取得時間は3分です。
  4. 非筋筋ミオシン2b TIRF顕微鏡測定の実施
    注:本項では、ポリマー化およびリン酸化フィラメントを用いた非筋筋筋2b TIRFアッセイの詳細が提供される。チューブ内の非筋筋筋-2bをリン酸化および重合するための詳細なプロトコル(セクション4.1〜4.3)が含まれる。
    1. 精製したNM2bをリン酸化するには、2 mM CaCl2、1μM CaM、1-10 nM MLCK、および0.1 mM ATPの条件で10倍キナーゼミックスを作ります。これは10 mM DTTで500 mM MBのボリュームに持ち込むことができます。10xキナーゼミックスを1:10の体積比でミオシンに加え、室温で20〜30分間インキュベートします。通常、このステップのミオシン濃度は1μMである。
    2. リン酸化ミオシンをフィラメントに重合するには、NM2bの塩濃度を150 mM NaClに下げる。これを行うには、4x MBをdH2Oで4回希釈して塩を含み1x運動バッファー(1x MB)を作る。この1x MBは、NM2bを500mMの塩バッファーで凍結したため、塩濃度を下げるために使用することができる。
    3. 3 μLの在庫NM2bごとに、1x MBの7 μLを加えて塩濃度を150 mM NaClに下げ、氷上で20〜30分間インキュベートしてNM2bフィラメントを形成します。
      注: セクション 4.1-4.3 の順序は、NM2b がリン酸化され、最終的な塩濃度が 150 mM である限り、重要ではありません。30分-1時間の順序でインキュベーションは完全なリン酸化および重合のための十分な時間を可能にする。
    4. 非筋筋筋筋2bの逆運動性アッセイに対する溶液を 表3 に記載の準備し、氷の上に保管する。
    5. 1 mM DTTで150 mM MBの10 μLでチャンバーを洗浄します。
    6. 1 mM DTT 1 mM DTT で 1 mg/mL BSA の 10 μL の流れ 1mM MB この洗浄を 2 回繰り返し、3 回目の洗浄後 1 分間待ちます。ティッシュペーパーまたはフィルターペーパーの隅を使用して、チャネルを通して溶液を芯に入れる。
    7. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    8. 1 mM DTT で 150 mM MB の NeutrAvidin 溶液の 10 μL の流れ、1 分間待ちます。
    9. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    10. bRh-アクチンの10 μLで流れ、1分待ちます。このステップでは、大きな退屈なピペットチップを使用し、蛍光アクチンフィラメントのせん断を最小限に抑えるために上下にピペットを避け、長いアクチンフィラメントを表面(20〜30 μm以上)に取り付けることができるようにします。効果的な代替手段は、標準的なピペットチップのコーンを切断することです。
    11. 1mM DTTで150mM MBの10 μLで洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    12. 非筋筋ミオシン2b溶液(約30nM)の10μLで流れ、1分間待ちます。
    13. 1 mM DTT で 150 MB の 10 μL で洗浄します。この洗浄をもう2回繰り返します。
    14. 最終バッファの30 μLで流れ、TIRFの撮像モダリティに最適な焦点を見つけた後、TIRF顕微鏡に直ちに積み込んで記録します。100〜200 msの間の暴露時間は、アクチンおよびGFP標識ミオシンに対して1.4 mWレーザーパワーで適切である。速度解析の適切な取得時間は3分です。

4. 画像解析

  1. グライダーアクチンフィラメントアッセイの画像解析
    注: 画像は、資料一覧にリンクされているソフトウェアとマニュアルを使用して分析できます。ここで説明するプログラムには、分析に TIFF スタックが必要であることに注意してください。グライダーアクチンフィラメントアッセイを分析するプロセスは、以下の50.
    1. raw ムービースタックを指定したフォルダ構造にアップロードし、ムービーフォルダの最上位ディレクトリをプログラムに入力します。
      注: プログラムは、このディレクトリとサブディレクトリ全体のファイルを分析し、最下位レベルのディレクトリを複製として扱います。各レプリケート グループの平均統計が生成されます。この場合、ミオシンごとに1つの映画が使用されました。新しいミオシンを特徴付けたり、新しい実験条件を調査したりする場合、チャンバーあたり3つの視野(FOV)の映画を合計3つのチャンバーについて分析し、このワークフローを調査中のミオシンの3つの調製について繰り返すことを推奨します。
    2. スクリプト "stack2tifs" をユーザー入力フレームレートと組み合わせて使用すると、各 TIFF スタックを、一連の個々の TIFF ファイルと、各フレームの開始時刻を含む対応するメタデータ.txtファイルを含むフォルダに変換できます。TIFF スタック形式ではないデータの場合は、まず 、資料表に記載されているようなソフトウェアを使用して変換を適用する必要があります。
      注: このスクリプトは、ソフトウェア パッケージの一部です。スクリプトの情報は、ここで見つけることができます: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. 取得時のピクセル サイズ (nm 単位) である -px パラメーターを使用します。この場合、ピクセルサイズは130nmである。散布図出力の軸をスケーリングするには、-xmax パラメータと -ymax パラメータを使用します。これらは、プロットされたフィラメントの長さが最も長く、最大プロット速度(nm/s)に対応します。
      注: これらは推定値であり、データがプロットに含まれるように、予想より高い値に設定できます。分析後、生データをエクスポートして、他の統計ソフトウェアやグラフ作成ソフトウェアで表示および分析を行うこともできます。
    4. 最小速度カットオフ パラメータである -minv パラメータを使用して、移動しないフィラメントを定義し、したがって解析から除外することができます。NM2b のような遅いミオシンの場合、このパラメータは、真の滑空運動を切り取らないように低く(この例では 5 nm/s)必要があります。M5a のような高速ミオシンの場合、このパラメータはより高く(この例では 100 nm/s)、真の滑空速度分布を維持しながら、より厳しいフィルタを適用することができます。
    5. pt カットオフ パラメータを使用して、スムーズな移動を識別します。各サンプリングウィンドウでは、値は100×速度標準偏差/平均速度と同等に計算されます。カットオフより高い値を持つトラックは、より多くの可変速度を持ち、さらに解析から除外されます。この例では、カットオフ値 33 が使用されています。より高い値を持つトラックは、より多くの可変速度を持ち、さらに解析から除外されます。
    6. 最大値を使用して、フレーム間の最大許容リンク距離を設定します。これは、nm単位でフィラメントの中心によって移動される計算されたフレーム間距離である。これは、散発的な動きやフィラメント間の誤った結合を除外するのに有用であり得る。ここでの例では、パラメータはデフォルト値の 2,000 nm に残されています。
  2. TIRF顕微鏡測定のための画像解析
    注: 特に記載されているイメージングソフトウェア上の単一分子TIRFアッセイを分析するプロセス 資料表 以下の通りです29.
    1. 記録した顕微鏡ビデオをクリックしてソフトウェアのワークスペースにドラッグして、それを開きます 51.次に、取得チャネルを分割します。 [イメージ>カラー>スプリットチャンネル] をクリックします。
      注: 撮影中に非常に大きいなステージドリフトが発生した場合、画像を安定してイメージングプレーンのインストゥルメンタルドリフトを補正する必要があります。この場合、このデータを得るために使用される顕微鏡としてZ軸ドリフトの補償は使用されなかったため、Z-focusを良好に安定化させる。画像解析プログラムでイメージを安定させるためには、 材料リストにリンクされている適切なスタビライザープラグインをインストールします。イメージスタビライザーは、イメージ内のオブジェクトの固定位置を想定し、前のフレームのローリング平均を参照として使用します。したがって、推奨される手順は、ラベル付きアクチンの画像を含むチャネルから始めることです。
    2. プラグインをクリックし、イメージスタビライザーを見つける;[翻訳]が選択されていることを確認し、デフォルト設定を維持します。[変換係数のログ出力] の横にあるチェックボックスをオンにします。このログステップを適用すると、計算されたシフトパラメータを次のステップで他のチャネルに適用できます。プロセスを完了させます。
    3. 次に、ミオシンというラベルの付いたチャンネルを開き、 プラグイン>画像スタビライザーをクリックして安定化を適用します。単一チャネルでの高レートイメージングの要件により、同じ取得中にアクチンの画像を取得できない場合、ドリフトはビオチン化された受託者マーカーやフッ素を含む静的オブジェクトを含む領域をビオチン-PEG表面に非特異的に結合して選択することにより、画像のスタックを安定させます。この領域は、元のスタックから切り取って安定化し、その後、結果のシフト値を元のスタックに適用できます。
      注:実際には、運動性実験で観察されるドリフトは、数百nm/sで移動するミオシンの動きに比べて無視できますが、最も遅いミオシンにとっては重要な考慮事項になります。
    4. 次に、TrackMate を開き、 プラグインをクリックします。その後、ドロップダウンメニューで トラッキング をクリックし、最後に TrackMateをクリックします。この時点で、画像解析は、蛍光素およびアッセイ条件のパラメータに基づいて最適化を受ける。ただし、理想的な開始パラメータは以下の通りです。
      1. 調整設定: すべてのデフォルト値を保持します。
      2. 探知器:LoG検出器。
      3. 推定ブロブ直径: 0.5 -1.0 ミクロン。
      4. しきい値:25-200。(これは、検出されたスポットがムービーに一致するかどうかを確認する番号を選択した後に プレビュー をクリックして、適切に調整することによって決定することができます。
      5. 初期しきい値: 設定されていません。
      6. 表示: ハイパースタックディスプレイ。
      7. スポットにフィルタを設定する:設定しない。
      8. トラッカー:シンプルなLAPトラッカー。
        注: これらはフレームレートとミオシン速度に依存し、異なるパーティクル間の不要な接続を除外しながら、後続の位置を接続するのに十分な大きさである必要があります。
      9. リンク最大距離:1.0ミクロン。
      10. ギャップを閉じる最大距離:1.0ミクロン。
      11. ギャップを閉じる最大フレームギャップ: 1。
      12. トラックにフィルターを設定する:トラックの変位(>0.39-3ピクセル以上移動するスポットのみを含む)、トラック内のスポット(>3-3スポットを持つトラックのみを含む)。「最小速度」などの他のフィルターは、長期間失速するスポットを除外するために導入される場合があります。フィルタリングの結果は、アクチンに関連するトラックを保持しながら、スプリアストラック(すなわち、アクチントラックに沿っていないバックグラウンドでのミオシンの動き)が除去されることを確認するために、トラックの目視検査によってチェックする必要があります。
    5. [表示オプション]画面が表示されたら、関連する出力の[解析]をクリックします。生成された 3 つのテーブル ([統計の追跡]、[トラック統計内のリンク]、および [トラック統計] のスポット) を保存します。トラック統計表には、新しいタンパク質や特定の実験条件の影響などを特徴付けるために後で分析できる速度と変位データが含まれます。

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Representative Results

ミオシンの精製は、図2に示すようにドデシル硫酸ポリアクリルアミドナトリウム(SDS-PAGE)ゲル電気泳動を還元することによって評価することができる。この図は最終的な透析後ミオシンを表すが、SDS-PAGEは、上清に失われた製品を識別するために、精製手順の様々な段階からアリコートに対して行うことができる。ミオシン5aHMMは120-130 kDa範囲のバンドを有し、全長非筋筋筋2bは200−230kDa範囲でバンドを有し、重鎖29、44に対応する。ミオシン5aはまた、カルモジュリンをマーク、17 kDaマークの近くにバンドを持っています。非筋筋筋2bは、ELCを示す約17kDaでバンドを有する。この NM2b 準備では GFP タグ付き RLC が存在するため、RLC は約 47 kDa で表示されます。ただし、GFP でタグ付けされていない場合、ラベルなしの RLC は約 20 kDa に存在します。

ビデオ1と図3に示す滑空アクチンフィラメントアッセイは、理想的で追跡可能なムービーの特性を表しています。このグライディングアクチンフィラメントアッセイは、標識されたアクチンフィラメントの滑らかな動きを特徴としています。黒いアクチン洗浄は、死んだミオシンヘッドが測定フィールドから取り除かれ、アクチンフィラメントの全体的な滑らかな動きにさらに寄与することを保証します。蛍光標識されたフィラメントは、単一のフィラメントがそれ自体を横切らないほど短く、追跡プログラムに最適です。長すぎるアクチンフィラメントは他のフィラメントを横切り、グライダーアクチンフィラメントアッセイトラッキングプログラムに困難を提示する可能性があります。この問題は、カバースリップにロードする前にアクチンフィラメントをせん断するために10〜20回上下にピペットを作ることによって回避できます。

NM2bの場合、メチルセルロースを使用すると、撮影表面から離れたアクチンの拡散を減少させるため、記録された映画の品質を大幅に向上させることができます。M5aの高いデューティ比は、ミオシンコーティングされた表面へのアクチンのより強い付着を可能にするので、これは必要ありません。メチルセルロースを使用する場合、溶液が流れるようにチャンバーを通して溶液をウィッキングする必要があります。 ビデオ2に示すように、メチルセルロースの排除を除いて他のすべての条件が同一である場合、アクチンフィラメントはミオシンコーティングされた表面と密接に関連付けられたままではありません。

逆に、 ビデオ3 および 図4 に示す反転運動アッセイの目的は、ミオシンの動きを観察できる表面につながれた蛍光アクチンフィラメントを導入することです。逆アッセイの重要な要件は、図のように、FOV全体でミオシンの動きが一貫して観察されることを保証することです。DTT、グルコース、カタラーゼ、およびグルコースオキシダーゼの混合物を用いることが、より長い測定を可能にする光漂白を最小限に抑えることができる52。さらに、アッセイの取得率が低い場合、フレームを取得する間に照明光を遮断すると、過度の光の漂白に役立ちます。励起光のシャッターは、機械的シャッター、またはアユースト視チューナブルフィルター(AOTF)を介して行うことができます。

Figure 1
図1:機能性流動槽室の調製(A)洗浄された顕微鏡スライド、2枚の両面テープを約2cmにカットし、機能したカバースリップで始めます。(B)顕微鏡スライドの中央にテープを追加します。(C)カバースリップをコーティング(ニトロセルロース)を下に向けたテープに取り付け、プラスチックピペットチップを使用して重なり合う領域を軽く押し、カバースリップがチャンバーに付着していることを確認します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:発現したNM2bおよびM5a-HMMのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動。(A) 全長NM2b重鎖(≈230 kDa)およびGFP-RLC(≈47 kDa)およびELC(≈17 kDa)の代表的なSDSページゲル画像。Melliら(2018)29からゲル画像を再現・修正。(B) M5a-HMM様重鎖(≈120kDa)とカルモジュリン(≈17 kDa)の代表的なSDS PAGEゲル画像。この画像のゲルには、C端子端に GFP が挿入されていません。ミオシン重鎖に挿入されたGFPは、≈27kDaによって分子量を増加させる。ゲル画像を再現・修正したものは、もともと生物化学44誌に掲載されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:TIRF照明を介して得られたグライディングアクチンフィラメントアッセイ結果(A)30°Cで0.7%メチルセルロースの存在下で0.2μM NM2b上のローダミン-ファロイジン標識アクチンフィラメント(赤色)の転座を示す映画からのフレーム例。 スケールバー= 10μm(B)同じFOVに対するFASTrackプログラムからのフィラメント追跡画像出力(A)スケールバー= 10μm(C)acto-NM2b滑空速度の代表的なヒストグラムは、NM2bのこのサンプルが77±15nm/s平均の平均(±の平均値)のアクチングライディング速度を生成できることを示す。(D) ローダミン-ファロイジン標識アクチンフィラメント(赤色)を75 nM M5a-HMM上で転座させた映像からの例フレーム。スケールバー = 10 μm(E) 同じ FOV に対する M5a-HMM 用 FASTrack プログラムによるフィラメントトラッキング画像出力(D)スケールバー = 10 μm。 (F) このM5aのサンプルが515±165 nm/sのアクチン滑空速度を生成できることを示す、acto-M5a-HMM滑空速度の代表的なヒストグラム(平均±標準偏差;トラック数 = 25098)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:TIRF照明を介して取得した逆アッセイ結果(A)30°CでAF647-ファロイジン(青色で表示)で標識されたビオチン酸インフィラメント上のNM2bフィラメント(緑色で表示)の動きを示す2チャンネル結合画像スタックからの代表的なFOV。 ELCおよびGFP-RLCと共発現した組換え発現及び精製されたNM2bの重合フィラメントは、FOVにおいて緑色の細長い粒子として観察される。スケールバー= 10 μm(B) NM2bフィラメントの速度の代表的なヒストグラム。分析は、材料表に記載されている画像解析ソフトウェアを使用して実行しました。単一のNM2bフィラメントは、単一のアクチンフィラメントに沿って移動する場合、84±22 nm/s(平均±標準偏差;追跡される粒子の数= 133)の速度を有する。(C)単一アクチンフィラメントに沿ったNM2bフィラメント運動の例なお、粒子の領域の一部は、NM2bフィラメントの「回転」を示し、アクチンフィラメントに沿って、これは最も可能性の高い、Bipolar NM2bフィラメントの片側がアクチンフィラメントから剥離する時間を表す可能性が高い、Melliら.29に先に示したように。(D) ロダミン-ファロイジンで標識されたビオチン化アクチンフィラメント上のM5a-HMM(緑色で表示)の一分子運動の代表的なFOV(赤色で表示)スケールバー= 10 μm(E)M5a-HMMのラン長の代表的なヒストグラムは、単一の指数に適合します。解析は、「材料のリスト」に記載されている画像解析ソフトウェアを使用して実行しました。この例では、特徴的な走行長は1.3 μmで、95%の信頼区間は1.23~1.42μmです。(F)単一アクチンフィラメント上の単一分子M5a-HMM速度の代表的なヒストグラム。画像解析から出力されたデータ出力は、平均速度を668±258 nm/s(標準偏差±平均値、追跡された粒子数= 684)を示しています。(G)単一アクチンフィラメントに沿ったM5a-HMM運動の単分子のキモグラフ例この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:NM2bとM5a-HMMグライダーアクチンフィラメントアッセイの比較。 NM2bグライダーアクチンフィラメントアッセイは、メチルセルロース(左;ビデオパネルA)およびM5a−HMMの存在下で、メチルセルロース(右;ビデオパネルB)が30°Cで存在しない場合に行った。 NM2bビデオパネルではタイムスタンプが速く進み、M5a-HMMビデオパネルと比較して、ローダミン標識アクチンフィラメント(赤色)の動きがほぼ同じであることを示します。これは、NM2bの実際のアクチン転位速度がM5a-HMMのそれよりも7倍に近いためです(77 nm/s、対515 nm/s、それぞれ、ガウスピークから 抽出して図3のヒストグラムに合わせる)。スケールバー = 両方のビデオパネルで10 μm。NM2bデータは、200ミリ秒の露出で毎秒0.33フレームで取得しました。M5a-HMMデータは、200 msの露出(連続)で5フレーム/秒で取得し、その後1フレーム/秒にダウンサンプリングした。タイムスタンプは、 マテリアルのリストで説明されているプラグインを使用して追加されました。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオ2:メチルセルロースの不在時のNM2bのグライダーアクチンフィラメントアッセイ。 メチルセルロースの不在を除いて、他のすべての条件が同じである場合、アクチンフィラメントは0.2 μM NM2bでコーティングされたカバースリップにうまく付着しないことがあり、NM2bコーティングされたカバースリップの表面に近いアクチンフィラメント「フロッピング」で低品質の映画につながります。スケールバー= 10 μmこれは、ビデオ1(NM2b滑空アクチンフィラメントアッセイ)の左ビデオパネルに示すように、アクチンフィラメントの滑らかな動きを示すメチルセルロースを導入することによって解決することができる。別の代替は、NM2b濃度を≈1 μMに増加させることです。この映画は200ミリ秒の露出で毎秒0.33フレームで取得されました。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

ビデオ3:NM2bとM5a-HMMの反転運動アッセイの比較。 NM2b反転運動アッセイはメチルセルロースの存在下で行われ、シャッター(左;ビデオパネルA)を使用して毎秒0.33フレームのレートで記録され、ビデオパネルCはAと同じFOVを示すが、粒子は画像分析ソフトウェアを使用して識別および追跡される。同様に、メチルセルロースの不在時のM5a−HMMに対する反転運動アッセイは、毎秒5フレームの速度で記録された(右;ビデオパネルB)。ビデオパネルDはBと同じFOVを示しますが、画像解析ソフトウェアを使用して識別および追跡された粒子を使用します。スケールバー= すべてのビデオパネルで10 μm。2つのレーザーは、取得のための単一のカメラの使用と前後に切り替えられました。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

バッファ名 組成 使用するステップ コメント
M5a抽出バッファー 0.3 M ナクル 1.1 氷の上に置いておきなさい。
15 mM モップ、pH 7.2
15 mM MgCl2
1.5 mM EGTA
4.5 mM NaN3
NM2b 抽出バッファ 0.5 M ナクル 1.1 氷の上に置いておきなさい。
15 mM モップ、pH 7.2
15 mM MgCl2
1.5 mM EGTA
4.5 mM NaN3
バッファ A 0.5 M ナクル 2.2 氷の上に置いておきなさい。
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM DTT
5 mM MgCl2
バッファB 0.5 M ナクル 2.3 氷の上に置いておきなさい。
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM DTT
溶出バッファー 0.5 M ナクル 3.1 氷の上に置いておきなさい。
0.5 mg/mL フラグペプチド
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
pH 7.2
M5a透析バッファー 500 mM KCl 4.1 コールド dH2O を使用してボリュームを表示します。
10 mM MgCl2
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b透析バッファー 25 mM ナクル 4.1 コールド dH2O を使用してボリュームを表示します。
10 mM MgCl2
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
1 mM DTT
NM2b ストレージ バッファ 0.5 M ナクル 5.1 氷の上に置いておきなさい。
10 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3

表1:タンパク質精製に用いられる緩衝液。

バッファ名 コンポジション(M5a) 組成 (NM2b) ステップ使用済み(M5a/NM2b) コメント
4X運動バッファー(4X MB) 80 mM モップ、pH 7.2 80 mM モップ、pH 7.2 真空フィルターと4°Cで保管
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0.4 mM EGTA 0.4 mM EGTA
pH 7.4 pH 7.4
50 mM 塩運動バッファー (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB 真空フィルターと4°Cで保管
50 mM KCl 50 mM ナクル
dH2O でボリュームまで上げる dH2O でボリュームまで上げる
500 mM 塩運動バッファー (500 mM MB) 該当する 25% v/v 4X MB 真空フィルターと4°Cで保管
500 mM ナクル
dH2O でボリュームまで上げる
ミオシン 0.05-0.1 μM ミオシン 0.2 μM ミオシン 4.2/5.2 氷の上に置いておきなさい。
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB で希釈 500 mM MB で希釈
1 mg/mL 牛血清アルブミン (BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 4.3/5.3 氷の上に置いておきなさい。
50 mM MB で希釈 500 mM MB で希釈
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB(ブラックアクチン)で5 μMラベルなしF-アクチン 5 μM ラベルなし F-アクチン 5 μM ラベルなし F-アクチン 4.5/5.5 氷の上に置いておきなさい。5〜10回上下にピペットをピペット化するか、注射器を使用して、アクチンを剪断する。
1 μM カルモジュリン (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0.2 mM CaCl2
50 mM MB で希釈 1 μM CaM
1~10 nMミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)
50 mM MB で希釈
1 mM DTT および 1 mM ATP を搭載した MB 1 mM DTT 1 mM DTT 4.6/5.6 氷の上に置いておきなさい。
1 mM ATP 1 mM ATP
50 mM MB で希釈 50 mM MB で希釈
DTT を使用した MB 1 mM DTT 1 mM DTT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 氷の上に置いておきなさい。
50 mM MB で希釈 50 mM MB で希釈
20 nM ローダミン-ファロイジン F-アクチン (Rh-アクチン) 20 nM ローダミン-ファロイジン F-アクチン 20 nM ローダミン-ファロイジン F-アクチン 4.8/5.8 氷の上に置いておきなさい。渦を出さないで下ろしてください。
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB で希釈 50 mM MB で希釈
最終バッファ 50 mM KCl 0.7% メチルセルロース (オプション) 4.10/5.10 実験を行う直前にグルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼを加えます。氷の上に置いておきなさい。
20 mM モップ、pH 7.2 50 mM ナクル
5 mM MgCl2 20 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0.1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM カルモジュリン 50 mM DTT
2.5 mg/mLグルコース 1–10 nM MLCK
100 μg/mL グルコースオキシダーゼ 0.2 mM CaCl2
40 μg/mL カタラーゼ 1 μM カルモジュリン
2.5 mg/mLグルコース
100 μg/mL グルコースオキシダーゼ
40 μg/mL カタラーゼ

表2:滑空アッセイに使用されるバッファー。

バッファ名 コンポジション(M5a) 組成 (NM2b) ステップ使用済み(M5a/NM2b) コメント
4X運動バッファー(4X MB) 80 mM モップ、pH 7.2 80 mM モップ、pH 7.2 真空フィルターと4°Cで保管
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0.4 mM EGTA 0.4 mM EGTA
pH 7.4 pH 7.4
50 mM 塩運動バッファー (50 mM MB) 25% v/v 4X MB 25% v/v 4X MB 真空フィルターと4°Cで保管
50 mM KCl 50 mM ナクル
dH2O でボリュームまで上げる dH2O でボリュームまで上げる
150 mM 塩運動バッファー (150 mM MB) 25% v/v 4X MB 真空フィルターと4°Cで保管
150 mM ナクル
dH2O でボリュームまで上げる
ミオシン 30 nM ミオシン 「最終バッファ」のレシピ/4.12を参照してください。 氷の上に置いておきなさい。
1 mM DTT
150 mM MB で希釈
2 mg/mL ニュートラアビジン 2 mg/mL ニュートラアビジン 2 mg/mL ニュートラアビジン 3.5/4.8 氷の上に置いておきなさい。
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB で希釈 150 mM MB で希釈
1 mg/mL ウシ血清アルブミン(BSA) 1 mg/mL BSA 1 mg/mL BSA 3.3/4.6 氷の上に置いておきなさい。
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB で希釈 150 mM MB で希釈
200 nMローダミン-ファロイジンビオチン化F-アクチン(bRh-アクチン) 200 nMローダミン-ファロイジンビオチン化F-アクチン 200 nMローダミン-ファロイジンビオチン化F-アクチン 3.7/4.10 上下に渦やピペットを使用しないことによって、せん断を避けてください。混ぜるために、穏やかに反転します。
1 mM DTT 1 mM DTT
50 mM MB で希釈 150 mM MB で希釈
DTT を使用した MB 50 mM DTT 50 mM DTT 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 氷の上に置いておきなさい。
50 mM MB で希釈 150 mM MB で希釈
最終バッファ 50 mM KCl 0.7% メチルセルロース (オプション) 3.9/4.14 実験を行う直前にグルコース、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼを加えます。氷の上に置いておきなさい。
20 mM モップ、pH 7.2 50 mM ナクル
5 mM MgCl2 20 mM モップ、pH 7.2
0.1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0.1 mM EGTA
50 mM DTT 1 mM ATP
1 μM カルモジュリン 50 mM DTT
2.5 mg/mLグルコース 1–10 nM MLCK
100 μg/mL グルコースオキシダーゼ 0.2 mM CaCl2
40 μg/mL カタラーゼ 1 μM カルモジュリン
10 nM ミオシン 2.5 mg/mLグルコース
100 μg/mL グルコースオキシダーゼ
40 μg/mL カタラーゼ

表3:TIRFアッセイで使用される緩衝液。

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Discussion

ここで提示されるミオシン5aおよび非筋筋筋筋2bの精製およびインビトロ特徴付けのためのワークフローである。この実験は、精製ミオシン構築物のメカノケミカル特性を迅速かつ再現可能な方法で定量するのに有用である。ここに示す2つのミオシンは、多くの可能性のうち2つの具体例に過ぎませんが、条件と技術は、ほとんどのミオシンおよび他の多くの運動タンパク質に、いくつかの仕立てで適用することができます。

ここで説明するプロトコルは、ラボや実験の個々のニーズに応じて、さまざまな影響を受けます。例えば、発現と分子生物学のセクションで説明したように、この論文で使用されるタンパク質は、2つ以上のウイルスの共感染から生成された。しかし、p-FastBac二重発現ベクターやBiGBac発現システム53のような多発現ベクターを用いてタンパク質発現を成功に導くこともある。

いくつかの要因は、組換えタンパク質の成功の生産を妨げる可能性があります。タンパク質の分解を防ぐためには、タンパク質精製のすべてのステップが適切な温度で完了し、4°Cですべての遠心分離ステップが発生し、その他すべてのステップが氷上で行われることが不可欠です。過剰なバンドは、透析タンパク質産物のゲルに明らかである可能性があります。これは、劣化や汚染を示している可能性があります。サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによるその後の精製は、サンプル54の純度を高めることができる。その効果のために、ミオシンまたは疑わしいタンパク質汚染の低収率がある場合、トラブルシューティングのためのタンパク質精製プロセスの各ステップでアリコートを保存することが推奨されます。時には、ステップ1.8で樹脂へのライセートの結合が不十分であり、その後の遠心分離において上清へのミオシンの損失をもたらす可能性がある。これは、この工程中に樹脂結合の持続時間を変化させることによって解決することができ、必要に応じて一晩結合するように残すことさえできる。インキュベーション時間が長いと、タンパク質分解のリスクが高くなり、タンパク質分解性の高い領域を持つミオシンが悪影響を受けます。また、使用前後に樹脂を不適切に洗浄すると、望ましくないタンパク質製品が溶出する可能性があるため、FLAG-Affinity樹脂を使用する前後に適切なプロトコルを守ることが不可欠です。使用後すぐに洗浄し、適宜保存すれば、20回まで再利用できる。

タンパク質の分解は発現段階中にも起こり、発現時間の短縮は分解の点で有利であり得るが、これは総収量を犠牲にすることができる。プロトコルの異なる段階(すなわち、精製前、精製中、精製後)でタンパク質サンプルを監視するためにここで概説する手順に従って、最適化に必要な段階を決定するのに役立ちます。正常な発現と精製に繰り返し抵抗するミオシンの場合、一般的な問題は、不十分または不適切な軽鎖との共発現だけでなく、過剰発現中の不適切な折り畳みである可能性があります。適切な軽鎖は、可能な場合は既知の相互作用に基づいて選択する必要があり、最適な決定を下すために小規模な実験でテストする必要があります。溶解性活性物を凝集または全く得ないミオシンについては、シャペロンとの共発現が活性タンパク質54,55を正常に得るのに役立つ。

精製されたミオシン製品は、必然的に損傷したミオシンの少数の集団を含みます, 「死んだ頭」と呼ばれます, これは2つの方法で対処することができます.このプロトコルで概説されている1つの方法は、滑空アクチンフィラメントアッセイにおいてチャンバーを通して非標識、または「ブラック」アクチンを流す。その後、ATPで洗浄すると機能的なミオシンが黒いアクチンから解離され、死んだ頭部はATPを加水分解できないことと高い親和性のためにこのラベルなしアクチンに縛られたままになります。黒いアクチン洗浄を行っている間、シリンジを使用してアクチンを効果的に剪断することができる。結果として生じる気泡が遠心分離によって除去されるならば、追加の剪断は、渦によって達成することができる。別の方法は、ミオシンとF-actinとMg-ATPを高塩(0.5 M)濃度で混合し、テーブルトップの超遠心分離機で沈殿させることによって、ミオシンサンプルから死んだ頭部を選択的にペレット化することです。これらの条件下でATPを加水分解することができるミオシンは、これらの高塩条件下でのアクチンに対する親和性が低いためアクチンに結合したままではなく、上清に見られるが、ミオシン死死頭部はペレット56内のアクチンに結合したままである。同様に、ペレットのアクチンと再懸濁を伴う沈下は、ATPの不在時にアクチンに結合することができないミオシンを除去するためにも使用することができる。このタイプの死んだ頭部のごく一部は、これらのタイプのアッセイに対する影響が少なくなることに注意してください。ヌクレオチドフリーの沈下と再懸濁を行い、続いてATP結合遠心分離および再懸濁を行うことによって、アクチン結合およびATP依存性放離の両方に適したミオシンを単離することができる。

運動性アッセイは、いくつかの方法で変更することもできます。例えば、NM2bのグライダーアクチンフィラメントアッセイでは、NM2bは、黒いアクチンステップでMLCK、カルモジュリン、カルシウム、およびATPを添加し、最終バッファにリン酸化されます。しかし、NM2bは、アッセイを行う前に、チューブ中でリン酸化することもできる。そうすることにより、リン酸化NM2bのパーセントは、尿素含有サンプルバッファーを有する天然ゲルを実行するか、または質量分析57,58を行うことによって定量することができる。ミオシン活性に対する温度の影響も調べることができる。これは、フローセルが一定の温度で維持されるように、顕微鏡または環境エンクロージャに客観的な加熱システムを採用することによって達成することができます。イオン強度はもう一つの重要な考慮事項です。多くのミオシンでは、アクチン親和性と酵素活性は、より低いイオン強度で増加します。その他の場合、より高いイオン強度が必要です59.ミオシン機構に関する貴重な情報を提供することに加えて、イオン強度を低下させることで運動性を高め、多くのアッセイでミオシンをより使いやすくすることができます。一方、一部のモータは静電テザリング効果を発揮し、低いイオン強度で運動性を低下させます。最後に、NM2bフィラメントの動きをアッサンスする場合、イオン強度を狭い範囲(150~200 mMのイオン強度)に維持し、ほとんどの細胞タイプに見られるものに近似することが重要です。低いイオン強度の使用は、ミオシンフィラメントの凝集をもたらし、フィラメントは、より高いイオン強度で脱重的にします。

多くのミオシン、特に低関税比を持つものでは、M5aに与えられた最終的な緩衝液の条件は、蛍光標識されたアクチンフィラメントが表面に緩やかに結合されるか、または完全に解離される結果となる。これにより、定量化を複雑にする不安定な動きが生じます。より良い品質の動きは、多くの場合、最終バッファでメチルセルロース(0.7%)を使用して得ることができます。メチルセルロースは粘性の混み合わせ剤であり、アタッチされたミオシンモータの密度が60にまばらであってもアクチンフィラメントが表面に近いままであることを強制する。同様に、NM2aとの運動を観察するために、単一フィラメント運動アッセイの最終バッファにメチルセルロースを含めることが必要と観察されており、平滑筋筋ミオシンフィラメント29,61にも同様の現象が報告された。これにより、NM2bフィラメントの加工性も向上します。このアッセイでメチルセルロースを使用することの潜在的に望ましくない副作用の1つは、混雑剤の特性がミオシンフィラメントの横結束を束に促進することができるということです。メチルセルロースの代替策は、滑空アクチンフィラメントアッセイにおける動きの欠如または緩やかに結合したアクチンフィラメントのトラブルシューティングを行う場合に、運動性バッファー内の塩濃度を低下させるか、またはミオシン表面密度を高めることである。上述のように、運動性緩衝液中の高いイオン強度は、アクチン29、34、62に結合するミオシンの能力を低下させると示されている。

グライダーアクチンフィラメントアッセイのもう一つのバリエーションは、ガラスカバースリップにミオシンを固定するための抗体の使用です。例えば、ミオシン構築物のC末端にGFPが存在する場合、抗GFP抗体を用いて、GFP-ミオシンをカバースリップ36、63、64に固定することができる。これは、人工または短いレバーアーム54、64を試験する場合など、システムの幾何学がアクチン転座を妨げる可能性がある状況で運動性を成功させるのを助けることができる。さらに、転位速度に対する負荷の影響は、αアクチンまたはウトロフィン39、50、65などのアクチン結合タンパク質を採用することによって、滑空アクチンフィラメントアッセイにおいて調べることができる。このような測定は、光トラップアッセイ66,67を用いて測定できる単一ミオシンの負荷依存性運動学との間のミオシンのアンサンブルに対する負荷の影響を比較するのに有用であり得る。これは、最初のステップでミオシンと一緒にアクチン結合タンパク質の増加量を追加することによって達成することができます.アクチン結合タンパク質は、表面に結合し、ミオシンによって移動されているアクチンフィラメントに摩擦負荷を及ぼし、表面上のアクチン結合タンパク質の濃度が増加するにつれて段階的な速度をもたらす。

また、一分子/アンサンブル運動アッセイは、ミオシン運動に対する様々なアクチン構造の影響を調べるようにも適応することができる。例えば、単一アクチンフィラメントの上にミオシンの動きを観察するのではなく、ファシンまたはαアクチニン媒介アクチン束は、細胞68,69に見られるアクチンフィラメントネットワークのインビトロ再構成として研究することができる。トロポミオシンなどのアクチン結合タンパク質の効果は、65、70、71、72を調することもできる。

注目すべきは、単一分子/アンサンブル運動アッセイのラベルを選択する際の汎用性です。このレポートでは、M5a-HMM と NM2b の両方で GFP ラベルが使用されました。ただし、他の多くのラベルを使用できます。例としては、遺伝的にミオシンに融合し、合成染料を共有結合することができるHaloTagまたはSNAPタグが含まれる。HaloTag 技術の利点は、さまざまな色でラベルを付けたり、ビオチンアフィニティ タグ29,73を追加するなど、いくつかの実験的な適応に対する汎用性にあります。さらに、量子ドット技術の使用は、単一分子蛍光追跡の分解能を向上させるために使用することができ、これはまた、GFPの低輝度の制限と光漂白74の傾向に対処する。タグは、軽鎖11、75、76と同様に正常に取り付けることができます。

TIRF運動性アッセイで成功を収めるには、十分にブロックされ機能した表面を用いるための重要な要因です。適度なブロッキングを達成するための簡単な方法は、ニトロセルロース表面に結合したビオチン化BSAを使用することです。M5aを含む多くのモータを特徴付けるのに十分な機能を発揮しますが、このような表面上の非特異的結合のレベルは、NM2bなどのサンプルでクリーンな動きを再現するためには非常に重要です。この点での重要なブレークスルーは、機能化77のためにビオチン-PEGをドープされたPEGylateed表面への移行であった。PEG表面は表面のブロッキングのはるかに優秀なレベルを提供し、欠陥のないPEGylated表面は非常に長い期間の非特異結合の自由残すことができる。ここで詳述する特定のプロトコルは、数時間でビオチン化されたPEG表面の製造を可能にし、すぐに説明したように保存すれば、表面はほんのわずかの品質低下で数週間使用することができる。

追跡用のデータを収集する前に重要な考慮事項は、取得フレームレートです。後続のフレーム間の移動は、オーバーサンプリング エラーを回避するのに十分な大きさである必要があります。高いサンプリングレートは、ローカリゼーションエラーの分割により過大評価速度を得る時間間隔を短くし、測定の見かけの誤差を増加させます。生データが細かくサンプリングされる場合、N 番目のフレームごとに新しいスタックを作成し、結果として生じるフレーム レートの変化を考慮して、データをダウンサンプリングできます。フレーム間のサブピクセルの動きを避ける必要があり、正確な値を得るためには数百ナノメートルの動きが必要です。新しいサンプルが特徴付けられるすべての場合、自動分析によって生成された結果は、一貫性を保つために手動で追跡されたフィラメントの小さなデータセットと比較する必要があります。

単一分子運動性実験のデータを分析する場合、測定するパラメータ、データのフィルタリング方法、データの適合方法を選択する際には注意が必要です。前述のように、サンプリングレートは速度データを分析する際の重要な要素となります。多くのミオシンでは、プロセスランは短く、直線で近似されます。このような場合、トラックの開始から終点までの距離は、走行距離の良好な尺度を提供し、これは速度の良い推定値を得るためにトラックの持続時間で割ることができます。曲げられたフィラメントの周りにトラックが非常に長く、曲がったパスに従っている場合、この種の解析は不正確な結果をもたらし、連続したポイントをローカリゼーションに十分に間隔をあけてオーバーサンプリングエラーを避け、それらの間の直線距離がそれらのポイント間の曲線の近似値のままであるほど十分に間隔をあけることを可能にする取得率を使用する必要があります。さらに、トラックの長さに対して長い走行長を持つモータータンパク質については、走行長78を計算する際にカプランマイヤー推定器などの追加統計を作成する必要があります。同じことが、プロセス実行の終了前に光の消光が十分に発生する可能性が高い場合にも当てはまります。蛍光一分子研究で観察できるもう一つの現象は、蛍光体がオンとオフの状態を急速に切り替え、点滅するように見えるフォトブリンクです。これは通常、これらの運動性実験では起こりません。しかし、この場合、レーザー強度と露光時間を減少させ、効果を最小限に抑えることができます。β-メルカプトエタノール、トロロックス、クロクロクテクテアレン、n-プロピルガレート、4-ニトロベンジルアルコール、および1,4-ジアザビシクロクロ[2.2.2]オクタンを含むいくつかの化学物質もこれを軽減するために利用することができる79。

要約すると、この記事では、アクチン転座速度、ミオシン転位速度、ミオシンラン長などのメカノケミカル特性を定量化する能力に強い詳細なプロトコルを紹介します。これらのアッセイは再現性があり、モタイル特性が研究の特定の最終目標ではない状況でも精製ミオシンの品質を決定するために使用することができます。さらに、pH、温度、化学レギュレータなどの変化をこれらのアッセイに導入して、研究したミオシンのメカノケミストリーがどのように影響を受けるかを調べることができます。一緒に考えて、アクチンの滑空と逆運動アッセイは、ミオシンアンサンブルの挙動と分子運動力学と運動学における分子間変動のより良い理解を可能にする。ここで説明する蛍光顕微鏡ベースのアッセイは、細胞骨格研究に対する還元主義者のアプローチをサポートし、インビトロでタンパク質タンパク質のダイナミクスを理解するための強力なツールとなり得ます。これらの高度に制御された実験から収集されたデータを組み合わせて、細胞生物学的レベル以降に関連する可能性のある主要なアクトミオシン挙動のメカノ生物学者に助言することができます。

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Disclosures

著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

このデータ収集に使用する試薬の製造に関する技術的支援に関して、ファン・ザン博士に感謝します。この研究は、NHLBI/NIHイントラウォールリサーチプログラムがHL001786からJ.R.S.に資金を提供することで支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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