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Biochemistry

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62180
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Présenté ici est une procédure pour exprimer et purifier la myosine 5a suivie d’une discussion sur sa caractérisation, en utilisant à la fois des essais in vitro de microscopie à fluorescence in vitro à molécule unique et comment ces méthodes peuvent être modifiées pour la caractérisation de la myosine 2b nonmuscle.

Abstract

Les protéines de myosine se lient et interagissent avec l’actine filamenteuse (F-actine) et se trouvent dans les organismes à travers l’arbre phylogénétique. Leur structure et leurs propriétés enzymatiques sont adaptées à la fonction particulière qu’ils exécutent dans les cellules. La myosine 5a marche processivement sur la F-actine pour transporter les mélanosomes et les vésicules dans les cellules. Inversement, la myosine 2b nonmuscle fonctionne comme un filament bipolaire contenant environ 30 molécules. Il déplace la F-actine de polarité opposée vers le centre du filament, où les molécules de myosine travaillent de manière asynchrone pour lier l’actine, donner un coup de puissance et se dissocier avant de répéter le cycle. La myosine 2b non musculaire, ainsi que ses autres isoformes de myosine 2 non musculaires, ont des rôles qui incluent l’adhésion cellulaire, la cytocinèse et le maintien de la tension. La mécanochimie des myosines peut être étudiée en effectuant des tests de motilité in vitro à l’aide de protéines purifiées. Dans le test du filament d’actine planant, les myosines sont liées à une surface de couverture de microscope et transloquent de la F-actine étiquetée par fluorescence, qui peut être suivie. Dans le test de motilité d’une molécule unique / ensemble, cependant, la F-actine est liée à un couvercle et le mouvement des molécules de myosine étiquetées par fluorescence sur la F-actine est observé. Dans ce rapport, la purification de la myosine 5a recombinante à partir de cellules Sf9 par chromatographie d’affinité est décrite. Ensuite, nous décrivons deux essais basés sur la microscopie à fluorescence: le test du filament d’actine glissant et le test de motilité inversée. À partir de ces essais, des paramètres tels que les vitesses de translocation de l’actine et les longueurs et vitesses d’exécution d’une seule molécule peuvent être extraits à l’aide du logiciel d’analyse d’images. Ces techniques peuvent également être appliquées pour étudier le mouvement de filaments simples des isoformes de la myosine 2 nonmuscle, discutées ici dans le contexte de la myosine 2b nonmuscle. Ce flux de travail représente un protocole et un ensemble d’outils quantitatifs qui peuvent être utilisés pour étudier la molécule unique et la dynamique d’ensemble des myosines nonmuscles.

Introduction

Les myosines sont des protéines motrices qui exercent une force sur les filaments d’actine en utilisant l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP)1. Les myosines contiennent un domaine de la tête, du cou et de la queue. Le domaine principal contient la région de liaison à l’actine ainsi que le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP. Les domaines du cou sont composés de motifs IQ, qui se lient à des chaînes légères, à la calmoduline ou à des protéines de type calmoduline2,3. La région de la queue a plusieurs fonctions spécifiques à chaque classe de myosines, y compris, mais sans s’y limiter, la dimérisation de deux chaînes lourdes, la liaison des molécules de cargaison et la régulation de la myosine via des interactions auto-inhibitoires avec les domaines de la tête1.

Les propriétés mobiles de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre. Certaines de ces propriétés comprennent le rapport de service (la fraction du cycle mécanique de la myosine dans laquelle la myosine est liée à l’actine) et la processivité (la capacité d’un moteur à effectuer plusieurs pas sur sa voie avant le détachement)4. Les plus de 40 classes de myosines ont été déterminées sur la base d’analyses deséquences 5,6,7,8. Les myosines de classe 2 sont classées comme « conventionnelles » puisqu’elles ont été les premières à être étudiées ; toutes les autres classes de myosines sont donc classées comme « non conventionnelles ».

La myosine 5a (M5a) est une myosine de classe 5 et est un moteur processif, ce qui signifie qu’elle peut prendre plusieurs étapes le long de l’actine avant de se dissocier. Il a un rapport de service élevé, indiquant qu’il passe une grande partie de son cycle mécanique lié à l’actine9,10,11,12,13,14. Comme d’autres myosines, la chaîne lourde contient un domaine moteur N-terminal qui comprend à la fois un site d’hydrolyse de liaison à l’actine et un site d’hydrolyse de l’ATP, suivi d’une région du cou qui sert de bras de levier, avec six motifs IQ qui se lient aux chaînes légères essentielles (ELC) et à la calmoduline (CaM)15. La région de la queue contient des bobines enroulées α-hélicoïdales, qui dimérisent la molécule, suivies d’une région de queue globulaire pour la liaison de la cargaison. Sa cinétique reflète son implication dans le transport des mélanosomes dans les mélanocytes et du réticulum endoplasmique dans les neurones de Purkinje16,17. M5a est considéré comme le prototype du moteur de transport demarchandises 18.

Les myosines de classe 2, ou les myosines conventionnelles, comprennent les myosines qui alimentent la contraction des muscles squelettiques, cardiaques et lisses en plus des isoformes de myosine 2 (NM2) non musculaires, NM2a, 2b et 2c19. Les isoformes NM2 se trouvent dans le cytoplasme de toutes les cellules et ont des rôles partagés dans la cytocinèse, l’adhésion, la morphogenèse tissulaire et la migration cellulaire19,20,21,22. Cet article traite des protocoles conventionnels de myosine dans le contexte de la myosine 2b (NM2b)non musculclée 23. NM2b, par rapport à M5a, a un faible rapport de service et est enzymatiquement plus lent avec un Vmax de 0,2 s-123 par rapport au Vmax de M5a de ≈18 s-124. Notamment, les constructions NM2b tronquées avec deux têtes ne se déplacent pas facilement de manière processive sur l’actine; au contraire, chaque rencontre avec l’actine entraîne un coup de puissance suivi d’une dissociation de la molécule25.

NM2b contient deux chaînes lourdes de myosine, chacune avec un domaine de tête globulaire, un bras de levier (avec un ELC et une chaîne légère régulatrice (RLC)), et un domaine de tige / queue enroulée α-hélicoïdale, d’environ 1 100 acides aminés de long, qui dimérise ces deux chaînes lourdes. L’activité enzymatique et l’état structurel du NM2b sont régulés par phosphorylation du RLC23. Le NM2b non phosphorylé, en présence d’ATP et de forces ioniques physiologiques (environ 150 mM de sel), adopte une conformation compacte dans laquelle les deux têtes font participer à une interaction asymétrique et la queue se replie sur les têtes en deux endroits23. Dans cet état, la myosine n’interagit pas fortement avec l’actine et a une très faible activité enzymatique. Lors de la phosphorylation RLC par la kinase à chaîne légère de la myosine dépendante de la calmoduline (MLCK) ou la protéine kinase associée à rho, la molécule s’étend et s’associe à d’autres myosines à travers la région de la queue pour former des filaments bipolaires d’environ 30 molécules de myosine23. La phosphorylation susmentionnée du RLC entraîne également une augmentation de l’activité de l’ATPase activée par l’actine de NM2b d’environ quatre fois26,27,28. Cet arrangement de filament bipolaire, avec de nombreux moteurs de myosine à chaque extrémité, est optimisé pour les rôles de contraction et de maintien de la tension, où les filaments d’actine avec des polarités opposées peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres23,29. En conséquence, il a été démontré que le NM2b agit comme un ensemble de moteurs lorsqu’il interagit avec l’actine. Le grand nombre de moteurs à l’intérieur de ce filament permet aux filaments NM2b de se déplacer de manière processive sur les filaments d’actine, ce qui rend la processivité du filament in vitro possible pour caractériser29.

Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension du rôle des myosines dans la cellule, il est nécessaire de comprendre leurs caractéristiques individuelles au niveau des protéines. Pour comprendre les interactions de l’actomyosine à un niveau d’interaction protéine-protéine simple, plutôt qu’à l’intérieur d’une cellule, nous pouvons exprimer et purifier les myosines recombinantes pour une utilisation dans des études in vitro. Les résultats de telles études informent ensuite les mécanobiologistes sur les propriétés biophysiques de myosines spécifiques qui conduisent finalement des processus cellulaires complexes12,13,14,25,29. Typiquement, cela est accompli en ajoutant une étiquette d’affinité à une construction de myosine pleine longueur ou tronquée et en purifiant par chromatographie d’affinité29,30,31. De plus, la construction peut être modifiée pour inclure un fluorophore génétiquement codé ou une étiquette pour le balisage des protéines avec un fluorophore synthétique. En ajoutant une telle étiquette fluorescente, des études d’imagerie à molécule unique peuvent être effectuées pour observer la mécanique et la cinétique de la myosine.

Après la purification, la myosine peut être caractérisée de plusieurs façons. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par des méthodes colorimétriques, fournissant un aperçu de la consommation d’énergie globale et de l’affinité actine du moteur dans différentes conditions32. Pour en savoir plus sur la mécanochimie de sa motilité, d’autres expériences sont nécessaires. Cet article détaille deux méthodes basées sur la microscopie à fluorescence in vitro qui peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés mobiles d’une protéine de myosine purifiée.

La première de ces méthodes est le test du filament d’actine planant, qui peut être utilisé pour étudier quantitativement les propriétés d’ensemble des moteurs de myosine, ainsi que pour étudier qualitativement la qualité d’un lot de protéine purifiée33. Bien que cet article traite de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) pour ce test, ces expériences peuvent être réalisées efficacement à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique, que l’on trouve couramment dans de nombreux laboratoires34. Dans ce test, une couche saturante de moteurs à myosine est attachée à un couvercle. Cela peut être accompli en utilisant de la nitrocellulose, des anticorps, des membranes, des surfaces dérivatisées enSiO2(telles que le triméthylchlorosilane), entre autres29,33,35,36,37,38. Les filaments d’actine marqués par fluorescence sont passés à travers la chambre de couverture, sur laquelle l’actine se lie à la myosine attachée à la surface. Lors de l’ajout d’ATP (et de kinases dans l’étude de NM2), la chambre est imagée pour observer la translocation des filaments d’actine par les myosines liées à la surface. Un logiciel de suivi peut être utilisé pour corréler la vitesse et la longueur de chaque filament d’actine planant. Un logiciel d’analyse peut également fournir une mesure du nombre de filaments d’actine mobiles et stationnaires, ce qui peut être utile pour déterminer la qualité d’une préparation de myosine donnée. La proportion de filaments bloqués peut également être intentionnellement modulée par attache de surface de l’actine à d’autres protéines et mesurée pour déterminer la dépendance à la charge de la myosine39. Étant donné que chaque filament d’actine peut être propulsé par un grand nombre de moteurs disponibles, ce test est très reproductible, la vitesse finale mesurée étant robuste aux perturbations telles que les altérations de la concentration de myosine de départ ou la présence de facteurs supplémentaires dans la solution. Cela signifie qu’il peut être facilement modifié pour étudier l’activité de la myosine dans différentes conditions, telles que la phosphorylation altérée, la température, la force ionique, la viscosité de la solution et les effets de la charge induite par les attaches de surface. Bien que des facteurs tels que les « têtes mortes » de myosine à forte liaison incapables d’hydrolyse de l’ATP puissent provoquer des filaments d’actine bloqués, de multiples méthodes existent pour atténuer ces problèmes et permettre des mesures précises. Les propriétés cinétiques de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre et, selon la myosine spécifique utilisée, la vitesse de glissement du filament d’actine dans ce test peut varier de moins de 20 nm / s (myosine9) 40,41, et jusqu’à 60 000 nm / s (myosine characée 11)42.

Le second essai inverse la géométrie du test du filament d’actine glissant12. Ici, les filaments d’actine sont attachés à la surface de couverture et le mouvement de molécules uniques de M5a ou de filaments bipolaires individuels de NM2b est visualisé. Ce test peut être utilisé pour quantifier les longueurs et les vitesses d’exécution de molécules ou de filaments de myosine simples sur l’actine. Un couvercle est recouvert d’un composé chimique qui bloque la liaison non spécifique et fonctionnalise simultanément la surface, tel que la biotine-polyéthylène glycol (biotine-PEG). L’ajout de dérivés d’avidine modifiés amorce ensuite la surface et l’actine biotinylée est passée à travers la chambre, ce qui donne une couche de F-actine liée de manière stable au fond de la chambre. Enfin, la myosine activée et étiquetée par fluorescence (généralement 1-100 nM) est acheminée à travers la chambre, qui est ensuite imagée pour observer le mouvement de la myosine sur les filaments d’actine stationnaires.

Ces modalités représentent des méthodes rapides et reproductibles qui peuvent être utilisées pour examiner la dynamique des myosines non musculaires et musculaires. Ce rapport décrit les procédures pour purifier et caractériser à la fois M5a et NM2b, représentant respectivement les myosines non conventionnelles et conventionnelles. Ceci est suivi d’une discussion de certaines des adaptations spécifiques à la myosine, qui peuvent être effectuées pour obtenir une capture réussie du mouvement dans les deux types de test.

Expression et biologie moléculaire
L’ADNc de la myosine d’intérêt doit être cloné sur un vecteur pFastBac1 modifié qui code soit pour une balise FLAG terminale C (DYKDDDDK) si elle exprime M5a-HMM, soit pour une balise FLAG N-terminale si elle exprime la molécule pleine longueur de NM2b23,43,44,45,46. Les marqueurs FLAG C-terminal sur NM2b entraînent une affinité affaiblie de la protéine pour la colonne d’affinité FLAG. En revanche, la protéine marquée N-terminally FLAG se lie généralement bien à la colonne d’affinité FLAG23. La protéine marquée N-terminale conserve l’activité enzymatique, l’activité mécanique et la régulation dépendante de la phosphorylation23.

Dans cet article, une construction de type M5a de type Mromyosine lourde (HMM) de souris tronquée avec un GFP entre l’étiquette FLAG et le terminus C de la chaîne lourde de myosine a été utilisée. Notez que contrairement à NM2b, M5a-HMM peut être étiqueté et purifié avec succès avec des balises FLAG N ou C-terminal et dans les deux cas, la construction résultante sera active. La chaîne lourde M5a a été tronquée à l’acide aminé 1090 et contient un tritrateur d’acides aminés (GCG) entre le GFP et la région de la bobine enroulée du M5a47. Aucun éditeur de liens supplémentaire n’a été ajouté entre le GFP et la balise FLAG. M5a-HMM a été co-exprimé avec la calmoduline. La construction NM2b humaine pleine longueur a été co-exprimée avec ELC et RLC. Le N-termini du RLC a été fusionné avec un GFP via un linker de cinq acides aminés (SGLRS). Directement attaché à la balise FLAG était un HaloTag. Entre le HaloTag et le N-terminus de la chaîne lourde de la myosine se trouvait un linker composé de deux acides aminés (AS).

Les deux préparations de myosine ont été purifiées à partir d’un litre de culture cellulaire Sf9 infectée par le baculovirus à une densité d’environ 2 x 106 cellules / mL. Les volumes du baculovirus pour chaque sous-unité dépendaient de la multiplicité d’infection du virus telle que déterminée par les instructions du fabricant. Dans le cas de M5a, les cellules ont été co-infectées par deux baculovirus différents, l’un pour la calmoduline et l’autre pour la chaîne lourde M5a. Dans le cas du NM2b, les cellules ont été co-infectées par trois virus différents: un pour ELC, un pour RLC et un pour nm2b chaîne lourde. Pour les laboratoires travaillant avec une diversité de myosines (ou d’autres protéines multi-complexes), cette approche est efficace car elle permet de nombreuses combinaisons de chaînes lourdes et légères et les chaînes légères couramment utilisées telles que la calmoduline peuvent être co-transfectées avec de nombreuses chaînes lourdes de myosine différentes. Tous les travaux cellulaires ont été effectués dans une armoire de biosécurité avec une technique stérile appropriée pour éviter la contamination.

Pour l’expression de M5a et NM2b, les cellules Sf9 produisant les myosines recombinantes ont été collectées 2 à 3 jours après l’infection, par centrifugation, et stockées à -80 °C. Les pastilles cellulaires ont été obtenues en centrifugant les cellules Sf9 co-infectées à 4 °C pendant 30 min à 2 800 x g. Le processus de purification des protéines est détaillé ci-dessous.

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Protocol

1. Purification des protéines

  1. Lyse cellulaire et extraction de protéines
    1. Préparez un tampon d’extraction 1,5x basé sur le tableau 1. Filtrer et conserver à 4 °C.
    2. Commencez à décongeler les granulés de cellules sur la glace. Pendant que les granulés sont en train de décongeler, complétez 100 mL de tampon d’extraction avec 1,2 mM de dithiothréitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptine, 0,5 μM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et deux comprimés inhibiteurs de protéase. Restez sur la glace.
    3. Une fois la pastille décongelée, ajouter 1 mL du tampon d’extraction complété par 10 mL de culture cellulaire. Par exemple, si les pastilles cellulaires ont été formées à partir de 500 mL de culture cellulaire, ajoutez 50 mL de tampon d’extraction complété à la pastille.
    4. Soniquez les pastilles cellulaires tout en les gardant sur la glace. Pour chaque pastille, utilisez les conditions suivantes: 5 s ON, 5 s OFF, durée de 5 min, puissance 4-5.
    5. Recueillir tout le lysate homogénéisé dans un bécher et ajouter de l’ATP (solution mère de 0,1 M; pH 7,0) de telle sorte que la concentration finale d’ATP soit de 1 mM. Remuer pendant 15 min dans une chambre froide. L’ATP dissocie la myosine active de l’actine, ce qui lui permet d’être séparée dans l’étape de centrifugation suivante. Il est donc essentiel de passer immédiatement à l’étape suivante afin de minimiser la possibilité d’épuisement et de reconnexion de l’ATP à l’actine.
    6. Centrifuger les lysates à 48 000 x g pendant 1 h à 4 °C. Pendant ce temps, commencez à laver 1 à 5 mL d’une boue à 50% de résine d’affinité anti-FLAG (pour une pastille formée de 1 L de cellules) avec 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), conformément aux instructions du fabricant. Par exemple, pour 5 mL de résine, laver 10 mL d’une boue à 50 %. Lors de la dernière étape de lavage, resuspendez la résine avec 1 à 5 mL de PBS avec un volume suffisant pour créer une boue de 50%.
    7. Après la centrifugation du lysate, mélanger le surnageant avec la boue de résine lavée et bercer doucement dans la chambre froide pendant 1 à 4 h. En attendant, faites les tampons décrits dans le tableau 1 et gardez-les sur la glace.
  2. Préparation de purification d’affinité FLAG
    1. Centrifuger la solution à l’étape 1.7 à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. La résine sera emballée au fond du tube. Sans déranger la résine, retirez le surnageant.
    2. Resuspendre la résine dans 50 mL de tampon A comme indiqué dans le tableau 1 et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Sans déranger la résine, retirez le surnageant.
    3. Resuspendre la résine dans 50 mL de tampon B comme indiqué dans le tableau 1 et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Répétez cette étape une fois de plus et ressuspendez la résine dans 20 mL de tampon B. Ensuite, mélangez soigneusement la résine et le tampon en inversant doucement le tube à la main environ 10 fois.
  3. Élution et concentration des protéines
    1. Préparez 30 mL de tampon d’élution comme décrit dans le tableau 1 et laissez-le refroidir sur la glace.
    2. Installez la colonne d’élution dans une chambre froide. Versez doucement la boue de résine dans la colonne. Lavez la colonne avec 1-2 volumes de colonne de Buffer B comme les emballages de résine sur le fond, en s’assurant que la résine ne sèche pas.
    3. Faire circuler 1 mL du tampon d’élution à travers la résine et recueillir l’écoulement dans un tube de 1,5 mL. Répétez de telle sorte que 12, 1 mL de fractions sont collectées.
    4. À ce stade, effectuez un test de Bradford brut sur les fractions pour déterminer qualitativement quelles fractions sont les plus concentrées48. Sur une rangée d’une plaque de 96 puits, pipette 60 μL 1x réactif Bradford. Au fur et à mesure que les fractions sont collectées, mélanger 20 μL de chaque fraction par puits. Une coloration bleu plus foncé indique les fractions les plus concentrées.
    5. Dans un tube de 50 mL, recueillir la protéine restante en pipetant doucement le tampon d’élution restant à travers la colonne, pour libérer toute myosine restante liée à la résine dans le flux de la colonne. Ce flux sera concentré à l’étape suivante. Assurez-vous que la résine est ensuite régénérée pour être réutilisée et stockée conformément aux instructions du fabricant.
    6. Regrouper les trois fractions les plus concentrées et concentrer davantage l’écoulement dans le tube de 50 mL ainsi que les fractions restantes de 1 mL à l’aide d’un tube de concentration de 100 000 MWCO. Charger l’échantillon regroupé sur le tube de concentration et centrifuger à 750 x g pendant 15 min à 4 °C et répéter jusqu’à ce que toutes les protéines éluées aient été concentrées dans un volume final d’environ 0,5 à 1 mL.
      REMARQUE: Cette taille de pore permet la rétention des molécules de myosine, qui ont des masses plusieurs fois supérieures à la coupure de poids moléculaire. Les chaînes légères restent étroitement liées aux domaines moteurs pendant ce temps de concentration, comme vérifié en effectuant une électrophorèse sur gel SDS-PAGE sur le produit final.
  4. Dialyse et congélation éclair
    1. Faire 2 L de tampon de dialyse, comme décrit dans le tableau 1. Chargez l’échantillon dans un sac ou une chambre de dialyse et dialysez pendant la nuit dans la chambre froide. Notez que la composition des tampons de dialyse diffère pour NM2b et M5a.
      REMARQUE: Dans le cas du NM2b, le but de cette étape de dialyse est de former des filaments de myosine dans le tampon de faible force ionique. La sédimentation de ces filaments fournit alors une étape de purification supplémentaire et permet la concentration de l’échantillon. Il y aura donc un précipité blanc visible dans la chambre de dialyse le lendemain. Ces filaments seront collectés par centrifugation et dépolymérisés à l’étape 5.1. Dans le cas de M5a-HMM, après la dialyse de nuit, la protéine sera suffisamment pure pour être utilisée dans les essais ultérieurs. D’autres étapes de purification telles que la filtration sur gel ou la chromatographie par échange ionique peuvent être effectuées, si nécessaire. Pour la récupération M5a après dialyse, passez à l’étape 5.2.
  5. Récupération de la myosine après dialyse
    1. Pour le NM2b, décharger soigneusement l’échantillon entier du sac ou de la chambre de dialyse et centrifuger à 4 °C pendant 15 min à 49 000 x g pour prélever les filaments de myosine. Jetez le surnageant et ajoutez progressivement le tampon de stockage à la pastille comme décrit dans le tableau 1 jusqu’à ce qu’il se soit dissous. Un pipetage doux de haut en bas aide à solubiliser la pastille. Normalement, cela ne nécessite pas plus de 500 μL par tube. Après s’être assuré que la pastille est complètement dissoute dans le tampon de stockage à haute résistance ionique, une étape de centrifugation supplémentaire (15 min à 49 000 x g)peut être effectuée pour éliminer les agrégats indésirables si nécessaire, car la myosine sera maintenant non plomérisée et restera dans le surnageant.
    2. Pour M5a-HMM, prélever soigneusement l’échantillon entier de la chambre de dialyse et centrifuger à 4 °C pendant 15 min à 49 000 x g en cas de présente d’agrégats indésirables. Prenez le surnageant.
  6. Détermination de la concentration et congélation éclair
    1. Pour déterminer la concentration du produit, mesurez l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre aux longueurs d’onde 260, 280, 290 et 320 nm. Calculer la concentration en mg/mL(cmg/mL)à l’avec l’équation 1, où A280 représente l’absorption à 280 nm et A320 représente l’absorption à 320 nm. La concentration résultante en mg/mL peut être convertie en μM de molécules de myosine avec l’équation 2, où M est le poids moléculaire de la protéine entière (y compris les chaînes lourdes, les chaînes légères, les fluorophores et toutes les étiquettes).
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε (1)
      Molécules μM = 1000cmg/mL/M(2)
      REMARQUE: Si une dilution est nécessaire, elle doit être effectuée dans un tampon à haute résistance ionique. Le coefficient d’extinction (ε) peut être déterminé en important la séquence d’acides aminés de la protéine dans un programme tel que ExPASy. Le rendement typique pour le M5a-HMM est d’environ 0,5-1 mL de protéines 1-5 mg/mL et pour le NM2b sur toute la longueur est de 0,5-1 mL de 0,5-2 mg/mL. Le coefficient d’extinction du M5a-HMM utilisé dans cet article était de 0,671. Le coefficient d’extinction du NM2b utilisé dans cet article était de 0,611.
    2. Conservez la myosine purifiée de l’une des deux façons. Aliquote entre 10 et 20 μL dans un tube à paroi mince, tel qu’un tube de réaction en chaîne de polymérisation, et déposer le tube dans un récipient d’azote liquide pour la congélation éclair. Alternativement, pipetez directement entre 20-25 μL de myosine dans l’azote liquide et stockez les billes de protéines congelées dans des tubes cryogéniques stériles. Dans les deux cas, les tubes résultants peuvent être stockés dans -80 °C ou dans de l’azote liquide pour une utilisation future.
      REMARQUE: Étant donné que les deux tests de motilité décrits ci-dessous nécessitent de très petites quantités de protéines, le stockage dans de petites aliquotes, comme décrit, est économique.

2. Dosage du filament d’actine glissant

  1. Préparation du couvercle
    1. Faire une solution de nitrocellulose à 1% dans l’acétate d’amyle.
    2. Obtenez un plat de culture tissulaire (150 x 25 mm) et ajoutez un papier filtre circulaire (125 mm de diamètre) au fond du plat.
    3. Charger huit couvercles carrés de 22 mm d’épaisseur n° 1,5 sur une grille et laver avec environ 2 à 5 mL d’éthanol à l’épreuve des 200, suivi de 2 à 5 mL d’eau distillée (dH2O). Répétez cette étape de lavage, en terminant par de l’eau. Ensuite, séchez complètement les couvercles à l’aide d’une ligne d’air filtrée ou d’une ligne N2.
    4. Prenez un couvercle et pipetez lentement 10 μL de la solution de nitrocellulose à 1% le long d’un bord du glissement. Ensuite, en un seul mouvement lisse, étalez-le sur le reste du couvercle à l’aide du côté d’une pointe de pipette lisse de 200 μL. Placez ce couvercle sur le plat de culture tissulaire avec le côté nitrocellulose vers le haut. Répétez l’opération pour les couvercles restants et laissez-les sécher pendant la préparation des réactifs restants et utilisez des couvercles dans les 24 heures suivant le revêtement.
  2. Préparation de la chambre
    1. Essuyez une lame de microscope avec un papier à lentille optique pour nettoyer les gros débris. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ 2 cm de long.
    2. Placez une pièce au milieu du long bord de la lame du microscope. Assurez-vous que le bord de la bande s’aligne sur le bord de la diapositive. Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ 2 mm en dessous du premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles et alignés. Cela crée une chambre d’écoulement qui peut contenir environ 10 μL de solution (voir Figure 1).
    3. Prenez l’un des couvercles recouverts de nitrocellulose de la partie 1. Collez soigneusement le couvercle sur le ruban adhésif de manière à ce que le côté recouvert de nitrocellulose entre en contact direct avec le ruban (voir figure 1). À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface glissière-ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle a bien adhéré à la glissière. Coupez l’excès de ruban adhésif suspendu sur le bord de la glissière avec une lame de rasoir.
  3. Préparation de l’actine
    1. Fabriquer 20 μM de F-actine en polymérisant de l’actine globulaire (G-actine) dans un tampon de polymérisation (50 mM KCl, 2 mM MgCl2,1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0)) à 4 °C pendant la nuit.
    2. Diluer la F-actine à 5 μM dans un tampon de motilité (20 mM MOPS, 5 mM MgCl2,0,1 mM EGTA, 1 mM TNT (pH 7,4)). Étiquette avec au moins 1,2x excès molaire de rhodamine-phalloïdine. Laisser (recouvert de papier d’aluminium) pendant au moins 2 h sur de la glace. Cela peut être utilisé jusqu’à 1-2 mois, stocké sur de la glace.
  4. Réalisation du test du filament d’actine planante de myosine 5a
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du test de glissement de la myosine 5a (HMM) sont fournis.
    1. Préparer les solutions pour la myosine 5a décrites dans le tableau 2 et les conserver sur la glace.
    2. Faire circuler 10 μL de myosine 5a (50-100 nM) dans la chambre d’écoulement et attendre 1 min.
    3. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 50 mM MB avec 1 mM TNT (tampon « faible teneur en sel »). Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.
    4. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Écoulement dans 10 μL de la solution d’actine noire (5 μM de F-actine, 1 μM de calmoduline et 1 mM d’ATP dans 50 mM MB avec 1 mM de TNT) pour éliminer les « têtes mortes », comme discuté dans la section Discussion.
      1. Pipeter la solution avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 27 G pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire la solution dans la chambre. Répétez cette étape deux fois de plus et attendez 1 min après la troisième fois. Environ 20 événements de pipetage suffisent.
      2. Pour effectuer le spin « tête morte », ajouter une quantité stœchiométrique de F-actine à la myosine en présence de 1 mM d’ATP et de 1 mM deMgCl2 à une concentration de sel de 500 mM. Puis ultracentrifugeuse à 480 000 x g pendant 15 min à 4 °C. La myosine morte sera dans la pastille.
    6. Écoulement dans 50 μL de 50 mM MB avec 1 mM TNT et 1 mM ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres.
    7. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus pour épuiser la chambre de tout ATP.
    8. Écoulement dans 10 μL de solution d’actine rhodamine (Rh-Actine) de 20 nM contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min pour permettre la liaison rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 5a fixée à la surface du couvercle.
    9. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM de TNT pour éliminer les filaments de Rh-Actine non liés à la surface. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débit dans 30 μL de tampon final.
    11. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nm pour visualiser Rh-Actin. Un temps d’exposition approprié est de 200 ms à une puissance laser de 1,4 mW pour une durée totale d’acquisition de 0,5-1 min.
      REMARQUE: Assurez-vous que le taux d’acquisition est mis à l’échelle de manière appropriée à la vitesse des filaments en mouvement. Une considération importante avant de collecter des données à utiliser avec des programmes de suivi est la fréquence d’images d’acquisition. Les mouvements de sous-pixels entre les images entraîneront une surestimation de la vitesse, et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Un taux d’acquisition optimal offre un glissement d’actin sur au moins une distance de pixel entre les images. Dans le cas du microscope TIRF utilisé pour l’imagerie ici, ce seuil se traduit par 130 nm; par conséquent, une myosine censée se déplacer à 1 μm/s doit être imagée à une vitesse de 5 images/s (intervalle de 0,2 s) pour atteindre 200 nm de mouvement tandis qu’une myosine censée se déplacer à 10 nm/s nécessite 0,05 image/s (intervalles de 20 s). Les données peuvent donc être sous-échantillonnées à ce stade si nécessaire (voir Discussion pour plus de détails).
  5. Réalisation du test du filament d’actine glissante de la myosine 2b non-musculaire
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du test de glissement de la myosine 2b non musculaire sur toute la longueur sont fournis. Le protocole de dosage du filament d’actine planante de la myosine 2b non dumuscle est différent du protocole de la myosine 5a à certaines étapes. Assurez-vous que les tampons appropriés sont utilisés pour chacune de ces étapes. Par exemple, le test NM2b nécessite la fixation de la myosine au couvercle dans un tampon à haute teneur en sel, tandis que le M5a peut être fixé au glissement de couverture dans des tampons à sel élevé ou faible. De plus, le test du filament d’actine plané M5a utilise une concentration plus faible de myosine pour atténuer la fréquence de rupture des filaments d’actine lors de l’acquisition.
    1. Préparez les solutions pour nm2b comme décrit dans le tableau 2 et conservez-les sur la glace.
    2. Débit dans 10 μL de la myosine 2b non musculclée (0,2 μM) dans un tampon de motilité (MB) de 500 mM (« tampon à haute teneur en sel ») et de 1 mM de dithiothréitol (DTT) à travers la chambre d’écoulement et attendez 1 min.
      REMARQUE: Les tampons riches en sel dissocient les filaments de myosine et permettent la fixation de molécules de myosine simples à la surface, car la myosine 2b non pulmonaire peut polymériser en filaments à une concentration ionique <150 mM.
    3. Débit dans 10 μL de l’albumine sérique bovine (BSA) de 1 mg/mL dans 500 mM MB avec 1 mM de TNT (tampon « à haute teneur en sel ») tel que décrit dans le tableau 2. Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    4. Laver avec 10 μL de 500 mM MB avec 1 mM TNT comme décrit dans le tableau 2. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Écoulement dans 10 μL de la solution d’actine noire tel que décrit dans le tableau 2 pour éliminer les « têtes mortes », comme discuté plus loin dans la section Discussion. La solution d’actine noire contient 5 μM de F-actine non étiquetée, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mMCaCl2,1 μM CaM et 1 mM DTT dans un tampon de motilité NaCl de 50 mM pour phosphoryler la myosine 2b non musclée à la surface de la chambre.
      1. Pipeter la solution avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 27 G pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire la solution dans la chambre. Répétez cette étape deux fois de plus et attendez 1 min après la troisième fois. Environ 20 événements de pipetage suffisent.
    6. Écoulement dans 50 μL de 50 mM MB avec 1 mM TNT et 1 mM ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres.
    7. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus pour épuiser la chambre de tout ATP.
    8. S’écouler dans 10 μL de solution de Rh-Actine de 20 nM contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min pour permettre la fixation rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 2b non musculclée fixée à la surface du couvercle.
    9. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM de TNT pour éliminer les filaments de Rh-Actine non liés à la surface. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débit dans 30 μL de tampon final. Pour le dosage du filament d’actine planante de la myosine 2b non dumuscle, le tampon final comprend également de la calmoduline, du CaCl2et de la kinase à chaîne légère de la myosine myosine 2b pour fournir une phosphorylation complète de la myosine 2b non musclée pendant l’imagerie vidéo. 0,7% de méthylcellulose peut également être inclus dans le tampon final si les filaments d’actine ne sont que faiblement liés ou ne sont pas liés à la surface. Cette question est abordée plus en détail dans la section Discussion.
    11. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nm. Un temps d’exposition approprié est de 200 ms à une puissance laser de 1,4 mW pour une durée totale d’acquisition de 0,5 à3 min.
      REMARQUE: Assurez-vous que le taux d’acquisition est mis à l’échelle de manière appropriée à la vitesse des filaments en mouvement. Une considération importante avant de collecter des données à utiliser avec des programmes de suivi est la fréquence d’images d’acquisition. Les mouvements de sous-pixels entre les images entraîneront une surestimation de la vitesse, et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Un taux d’acquisition optimal offre un glissement d’actin sur au moins une distance de pixel entre les images. Dans le cas du microscope TIRF utilisé pour l’imagerie ici, ce seuil se traduit par 130 nm; par conséquent, une myosine censée se déplacer à 1 μm/s doit être imagée à une vitesse de 5 images/s (intervalle de 0,2 s) pour atteindre 200 nm de mouvement tandis qu’une myosine censée se déplacer à 10 nm/s nécessite 0,05 image/s (intervalles de 20 s). Les données peuvent donc être sous-échantillonnées à ce stade, si nécessaire (voir Discussion pour plus de détails).

3. Essai TIRF à molécule unique

  1. Préparation du couvercle
    1. Diviser la poudre sous-stock en aliquotes de 10 mg (dans des tubes de 1,5 mL) de méthoxy-peg-silane (mPEG) et en aliquotes de 10 mg de biotine-peg-silane (bPEG). Conserver à -20 °C dans un récipient scellé et sans humidité et utiliser dans les 6 mois.
    2. Chargez huit couvercles carrés de 22 mm d’épaisseur n° 1,5H (haute précision) sur une grille et lavez-les avec 2 à 5 mL d’éthanol résistant à 200, suivis de 2 à 5 mL d’eau distillée. Répétez cette étape de lavage, en terminant par de l’eau. Ensuite, séchez complètement les couvercles à l’aide d’une ligne d’air ou N2 et nettoyez le plasma avec de l’argon pendant 3 min.
    3. Placez les couvercles propres sur du papier filtre (90 mm) dans un plat de culture tissulaire (100 x 20 mm) et incubés dans un four à 70 °C tout en effectuant les étapes suivantes.
      REMARQUE: Le nettoyage au plasma peut être remplacé par d’autres méthodes de nettoyage chimique49.
    4. Préparer une solution d’éthanol à 80 % avec dH2O et ajuster le pH à 2,0 à l’aide de HCl. Ajouter 1 mL de cette solution à une aliquote de 10 mg de mPEG et 1 mL à une aliquote de 10 mg de bPEG. Vortex à dissoudre, ce qui ne devrait pas prendre plus de 30 s.
    5. Prendre 100 μL de la solution de bPEG et ajouter 900 μL d’éthanol à 80 % (pH 2,0). Cette solution est de 1 mg/mL de bPEG. Ensuite, faites une solution des deux PÉG comme suit, en mélangeant soigneusement.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentration finale : 2 mg/mL).
      2. 10 μL du bPEG de 1 mg/mL (concentration finale : 10 μg/mL).
      3. 790 μL de la solution d’éthanol à 80 % (pH 2,0).
    6. Sortez les couvercles du four. Distribuer soigneusement 100 μL de la solution de PEG sur le centre de chaque couvercle, en veillant à ce que seule la surface supérieure soit humide. Ensuite, replacez les feuillets au four et incubez pendant 20 à 30 min.
    7. Lorsque les couvercles commencent à prendre un aspect troué, avec de petits cercles apparents sur la surface, retirez-les du four.
    8. Lavez chaque couvercle avec 100% d’éthanol, séchez-le avec une ligne d’air et replacez-le dans le four. Incuber uniquement pendant le temps nécessaire à la création des chambres à l’étape 2.
  2. Préparation de la chambre
    1. Nettoyez une lame de microscope pour l’utiliser dans la fabrication de la chambre. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ 2 cm de long.
    2. Placez une pièce au milieu du long bord de la lame du microscope. Assurez-vous que le bord de la bande s’aligne sur le bord de la diapositive. Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ 2 mm en dessous du premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles et alignés.
    3. Prenez l’un des couvercles fonctionnalisés du four (créés en 3.1). Collez soigneusement le couvercle sur le ruban adhésif de manière à ce que le côté recouvert de PEG soit face vers le bas et en contact direct avec le ruban adhésif, comme illustré à la figure 1. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface glissière-ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle a bien adhéré à la glissière.
    4. Coupez l’excès de ruban adhésif suspendu au-dessus de la glissière avec une lame de rasoir. Ces chambres peuvent être utilisées immédiatement ou placées par paires dans un tube de 50 mL et stockées dans un congélateur à -80 °C pour une utilisation future. Il est important de stocker immédiatement ou la surface se dégradera.
  3. Réalisation du test de microscopie TIRF à la myosine 5a
    1. Préparer les solutions pour le test de motilité inversée de la myosine 5a décrit dans le tableau 3 et les conserver sur la glace.
    2. Laver la chambre avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT.
    3. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 50 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    4. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    5. Débit dans 10 μL de la solution NeutrAvidin dans 50 mM MB avec 1 mM TNT et attendre 1 min.
    6. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    7. Débit dans 10 μL d’actine rhodamine biotinylée (bRh-Actine) contenant 1 mM de TNT dans 50 mM MB et attendre 1 min. Pour cette étape, utilisez une pointe de pipette à grand alésage et évitez de pipeter de haut en bas pour minimiser le cisaillement des filaments d’actine fluorescents afin de vous assurer que de longs filaments d’actine peuvent être attachés à la surface (20-30 μm ou plus). Une alternative efficace consiste à couper le cône d’une pointe de pipette standard (avec une ouverture de ≈1-1,5 mm).
    8. Laver avec 10 μL de 50 mM MB avec 1 mM DTT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    9. Débiter dans 30 μL de tampon final avec 10 nM de myosine 5a ajoutée, puis charger immédiatement sur le microscope TIRF et enregistrer après avoir trouvé la mise au point optimale pour la modalité d’imagerie TIRF. Les temps d’exposition compris entre 100 et 200 ms sont appropriés à une puissance laser de 1,4 mW pour l’actine et la myosine étiquetée GFP. Un temps d’acquisition approprié pour l’analyse de la vitesse est de 3 min.
  4. Réalisation du test de microscopie TIRF à la myosine 2b non dumuscle
    REMARQUE: Dans cette section, les détails du dosage de la myosine 2b TIRF non du champignon utilisant des filaments polymérisés et phosphorylés sont fournis. Un protocole détaillé (sections 4.1-4.3) pour la phosphorylation et la polymérisation de la myosine 2b nonmuscle dans un tube est inclus.
    1. Pour phosphoryler le NM2b purifié, faites un mélange de kinases 10x avec les conditions suivantes: 2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK et 0,1 mM ATP. Cela peut être porté au volume avec 500 mM MB avec 10 mM DTT. Ajouter le mélange de kinases 10x à la myosine à un rapport volumétrique de 1:10 et laisser incuber pendant 20-30 min à température ambiante. Typiquement, la concentration de myosine pour cette étape est de 1 μM.
    2. Pour polymériser la myosine phosphorylée en filaments, abaissez la concentration en sel du NM2b à 150 mM de NaCl. Pour ce faire, faites un tampon de motilité 1x (1x MB) sans sel en diluant le 4x MB quatre fois dans dH2O. Ce 1x MB peut être utilisé pour abaisser la concentration de sel parce que le NM2b a été congelé dans un tampon de sel de 500 mM.
    3. Pour chaque 3 μL de NM2b de base, ajouter 7 μL de 1x MB pour abaisser la concentration de sel à 150 mM de NaCl et incuber sur de la glace pendant 20 à 30 min pour former des filaments NM2b.
      NOTE: L’ordre des sections 4.1 à 4.3 n’est pas crucial tant que le NM2b est phosphorylé et que la concentration finale en sel est de 150 mM. L’incubation de l’ordre de 30 min-1 h laisse suffisamment de temps pour une phosphorylation et une polymérisation complètes.
    4. Préparer les solutions pour le test de motilité inversée de la myosine 2b non dumuscle décrite au tableau 3 et les conserver sur la glace.
    5. Lavez la chambre avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT.
    6. Débit dans 10 μL du BSA de 1 mg/mL dans 150 mM MB avec 1 mM TNT Répétez ce lavage deux fois de plus et attendez 1 min après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal.
    7. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    8. Débit dans 10 μL de la solution NeutrAvidin dans 150 mM MB avec 1 mM TNT et attendre 1 min.
    9. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    10. Débiter dans 10 μL de bRh-Actin et attendre 1 min. Pour cette étape, utilisez une pointe de pipette à grand alésage et évitez de pipeter de haut en bas pour minimiser le cisaillement des filaments d’actine fluorescents, afin de vous assurer que de longs filaments d’actine peuvent être attachés à la surface (20-30 μm ou plus). Une alternative efficace consiste à couper le cône d’une pointe de pipette standard.
    11. Laver avec 10 μL de 150 mM MB avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    12. Débiter dans 10 μL de la solution de myosine 2b non muscululique (environ 30 nM) et attendre 1 min.
    13. Laver avec 10 μL de 150 Mo avec 1 mM TNT. Répétez ce lavage deux fois de plus.
    14. Débitez 30 μL de tampon final, puis chargez immédiatement sur le microscope TIRF et enregistrez après avoir trouvé la mise au point optimale pour la modalité d’imagerie TIRF. Les temps d’exposition compris entre 100 et 200 ms sont appropriés à une puissance laser de 1,4 mW pour l’actine et la myosine étiquetée GFP. Un temps d’acquisition approprié pour l’analyse de la vitesse est de 3 min.

4. Analyse d’images

  1. Analyse d’image pour le dosage du filament d’actine glissant
    REMARQUE: Les images peuvent être analysées à l’aide du logiciel et des manuels liés dans la liste des matériaux. Il est important de noter que le programme décrit ici nécessite des piles TIFF pour l’analyse. Le processus d’analyse du test du filament d’actine planant est le suivant50.
    1. Téléchargez des piles de films bruts dans une structure de dossiers spécifiée et entrez le répertoire le plus haut des dossiers de films dans le programme.
      REMARQUE: Le programme analyse les fichiers dans ce répertoire et sous-répertoires, en traitant les répertoires de niveau inférieur comme des répliques. Des statistiques moyennes pour chaque groupe de répétitions seront produites. Dans ce cas, un seul film a été utilisé pour chaque myosine. Lors de la caractérisation d’une nouvelle myosine ou de l’étude d’une nouvelle condition expérimentale, il est recommandé d’analyser des films à partir de trois champs de vision (FOV) par chambre pour un total de trois chambres et de répéter ce flux de travail pour trois préparations de la myosine étudiée.
    2. Utilisez le script « stack2tifs » en conjonction avec la fréquence d’images saisie par l’utilisateur pour convertir chaque pile TIFF en un dossier contenant une série de fichiers TIFF individuels et un fichier de métadonnées.txt correspondant contenant l’heure de début de chaque image. Pour les données qui ne sont pas au format de pile TIFF, une conversion doit d’abord être appliquée à l’aide d’un logiciel tel que ceux répertoriés dans la table des matériaux.
      REMARQUE : Ce script est la partie du progiciel. Les informations du script peuvent être trouvées ici: « https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs »
    3. Utilisez le paramètre -px, qui est la taille du pixel (en nm) lors de l’acquisition. Dans ce cas, la taille des pixels est de 130 nm. Utilisez les paramètres -xmax et -ymax pour mettre à l’échelle les axes des sorties du nuage de points. Ceux-ci correspondent à la plus longue longueur de filament tracée et à la vitesse maximale tracée (en nm/s).
      REMARQUE : Il s’agit de valeurs estimées qui peuvent être définies sur des valeurs plus élevées que prévu pour s’assurer que les données sont contenues dans le graphique. Après l’analyse, les données brutes peuvent également être exportées pour être utilisées dans d’autres logiciels statistiques ou graphiques pour la visualisation et l’analyse.
    4. Utilisez le paramètre -minv, qui est un paramètre de coupure de vitesse minimale, pour définir les filaments qui ne bougent pas et qui peuvent donc être exclus de l’analyse. Pour une myosine lente telle que NM2b, ce paramètre doit être faible (dans cet exemple, 5 nm/s) pour éviter de couper les mouvements de glissement réels. Pour une myosine rapide telle que M5a, ce paramètre peut être plus élevé (dans cet exemple, 100 nm/s) pour appliquer un filtre plus strict, tout en conservant la distribution réelle de la vitesse de glisse.
    5. Utilisez le paramètre de coupure -pt pour identifier les mouvements fluides. Pour chaque fenêtre d’échantillonnage, une valeur équivalente à 100 x l’écart type de vitesse/vitesse moyenne est calculée. Les pistes avec des valeurs plus élevées que la coupure, ont des vitesses plus variables et sont exclues d’une analyse plus approfondie. Dans cet exemple, une valeur seuil de 33 a été utilisée. Les pistes avec des valeurs plus élevées ont des vitesses plus variables et sont exclues d’une analyse plus approfondie.
    6. Utilisez -maxd pour définir une distance de liaison maximale autorisée entre les images. Il s’agit d’une distance d’image à image calculée déplacée par le centroïde du filament en unités de nm. Il peut être utile pour exclure les mouvements sporadiques ou la liaison incorrecte entre les filaments. Dans les exemples ici, le paramètre a été laissé sur la valeur par défaut de 2 000 nm.
  2. Analyse d’images pour le test de microscopie TIRF
    REMARQUE: Le processus d’analyse du test TIRF à molécule unique sur le logiciel d’imagerie spécifiquement répertorié dans le Tableau des matériaux est le suivant29.
    1. Cliquez et faites glisser la vidéo de microscopie enregistrée vers l’espace de travail du logiciel pour l’ouvrir51. Ensuite, divisez les canaux d’acquisition. Cliquez sur Image > Color > Split Channels.
      REMARQUE: En cas de dérive d’étage appréciable pendant l’acquisition, les images doivent être stabilisées pour corriger la dérive instrumentale sur le plan d’imagerie. Dans ce cas, aucune compensation pour la dérive de l’axe Z n’a été utilisée car le microscope utilisé pour obtenir ces données stabilise bien le foyer Z. Pour stabiliser l’image sur le programme d’analyse d’image, installez le plug-in stabilisateur approprié qui est lié à la Liste des matériaux. Le stabilisateur d’image prend des positions fixes pour les objets de l’image et utilise une moyenne mobile des images précédentes comme référence. La procédure recommandée est donc de commencer par le canal contenant des images d’actine étiquetée, car il est dans une position fixe.
    2. Cliquez sur Plugins, puis trouvez Stabilisateur d’image; assurez-vous que l’option Traduction est sélectionnée et conservez les paramètres par défaut. Cochez la case en regard de Log Transformation Coefficients. L’application de cette étape journal permet d’appliquer les paramètres de décalage calculés à l’autre canal à l’étape suivante. Laissez le processus se terminer.
    3. Ensuite, ouvrez le canal avec la myosine étiquetée et appliquez la stabilisation en cliquant sur Plugins > Image Stabilizer Log Applier. Si les images d’actine ne peuvent pas être acquises au cours de la même acquisition en raison de la nécessité d’une imagerie à plus haut débit dans un seul canal, la dérive stabilise la pile d’images en sélectionnant une région qui contient des objets statiques tels qu’un marqueur fiduciaire biotinylé ou des fluorophores liés non spécifiquement à la surface de la biotine-PEG. Cette région peut être recadrée à partir de la pile d’origine et stabilisée, suivie de l’application des valeurs de décalage résultantes à la pile d’origine.
      NOTE: En pratique, la dérive observée dans les expériences de motilité sera négligeable par rapport au mouvement des myosines qui se déplacent à plusieurs centaines de nm / s, mais pour les myosines les plus lentes, cela devient une considération importante.
    4. Ensuite, ouvrez TrackMate, cliquez sur Plugins; puis, dans son menu déroulant, cliquez sur Tracking et enfin sur TrackMate. À ce stade, l’analyse de l’image est sujette à une optimisation basée sur les paramètres du fluorophore et des conditions de dosage. Cependant, les paramètres de départ idéaux sont les suivants.
      1. Paramètres d’étalonnage : conservez toutes les valeurs par défaut.
      2. Détecteur: Détecteur LoG.
      3. Diamètre estimé de la tache: 0,5-1,0 micron.
      4. Seuil: 25-200. (Cela peut être déterminé en cliquant sur Aperçu après avoir choisi un nombre pour voir si les taches détectées correspondent au film et en les ajustant de manière appropriée.)
      5. Seuil initial : non défini.
      6. Affichage : HyperStack Displayer.
      7. Définir des filtres sur les spots: pas défini.
      8. Tracker: Tracker LAP simple.
        REMARQUE: Ceux-ci dépendent de la fréquence d’images et de la vitesse de la myosine et doivent être suffisamment grands pour connecter les positions suivantes tout en excluant les connexions indésirables entre différentes particules.
      9. Distance maximale de liaison: 1,0 micron.
      10. Distance maximale de fermeture de l’espace: 1,0 micron.
      11. Espace maximal de fermeture de l’espace de trame: 1.
      12. Définissez des filtres sur les pistes : Déplacement des pistes (>0,39- pour inclure uniquement les taches se déplaçant de plus de 3 pixels), Taches dans les pistes (>3- pour inclure uniquement les pistes avec au moins 3 points). D’autres filtres tels que la vitesse minimale peuvent être introduits pour exclure les taches qui calent pendant de longues périodes. Les résultats du filtrage doivent être vérifiés par inspection visuelle des pistes pour s’assurer que les traces fallacieuses (c.-à-d. le mouvement de la myosine en arrière-plan qui n’est pas le long d’une piste d’actine) sont enlevées tout en conservant les traces associées à l’actine.
    5. Une fois que l’écran Options d’affichage apparaît, cliquez sur Analyse pour les résultats pertinents. Enregistrez les trois tables produites (Statistiques de piste, Liens dans Statistiques de piste et Spots dans Statistiques de piste). Le tableau Track Statistics contiendra les données de vitesse et de déplacement qui pourront ensuite être analysées pour caractériser une nouvelle protéine ou les effets d’une certaine condition expérimentale, par exemple.

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Representative Results

La purification de la myosine peut être évaluée en effectuant une électrophorèse sur gel-polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) réductrice comme le montre la figure 2. Bien que cette figure représente la myosine finale post-dialysée, SDS-PAGE peut être effectuée sur des aliquotes des différentes étapes de la procédure de purification pour identifier les produits perdus par le surnageant. Myosin 5a HMM a une bande dans la gamme 120-130 kDa et la myosine 2b non musclée pleine longueur a une bande dans la gamme 200-230 kDa, correspondant à des chaînes lourdes29,44. La myosine 5a a également une bande proche de la marque 17 kDa, marquant la calmoduline. La myosine 2b nonmuscle a une bande à environ 17 kDa, désignant l’ELC. Étant donné qu’un RLC marqué GFP est présent dans cette préparation NM2b, le RLC apparaît à environ 47 kDa; toutefois, un RLC non étiqueté sera présent à environ 20 kDa s’il n’est pas étiqueté avec un GFP.

Le test de filament d’actine planant montré dans la vidéo 1 et la figure 3 représente les caractéristiques d’un film idéal et traçable. Ce test de filament d’actine glissant présente le mouvement en douceur des filaments d’actine marqués. Le lavage à l’actine noire garantit que les têtes de myosine mortes sont retirées du champ de mesure, contribuant ainsi au mouvement global en douceur des filaments d’actine. Les filaments marqués par fluorescence sont suffisamment courts pour qu’un seul filament ne se croise pas sur lui-même, ce qui est plus optimal pour le programme de suivi. Les filaments d’actine trop longs se croiseront sur d’autres filaments, ce qui peut présenter des difficultés pour le programme de suivi des essais de filaments d’actine glissants. Ce problème peut être évité en pipetant de haut en bas 10 à 20 fois pour cisailler les filaments d’actine avant de les charger sur le couvercle.

Dans le cas du NM2b, l’utilisation de méthylcellulose peut améliorer considérablement la qualité des films enregistrés car elle réduit la diffusion de l’actine loin de la surface d’imagerie. Ceci n’est pas nécessaire pour M5a car son rapport de service plus élevé permet une fixation plus forte de l’actine à la surface recouverte de myosine. Si de la méthylcellulose est utilisée, il est nécessaire d’évacuer la solution à travers la chambre pour s’assurer que la solution circule. Comme le montre la vidéo 2, lorsque toutes les autres conditions sont identiques, à l’exception de la méthylcellulose, les filaments d’actine ne restent pas aussi étroitement associés à la surface recouverte de myosine.

Inversement, l’objectif du test de motilité inversé montré dans la vidéo 3 et la figure 4 est d’introduire des filaments d’actine fluorescents attachés à la surface sur lesquels le mouvement de la myosine peut être observé. Une exigence importante du test inversé est de s’assurer que le mouvement de la myosine est systématiquement observé dans tout le champ de vision, comme indiqué. L’utilisation d’un mélange de TNT, de glucose, de catalase et de glucose oxydase peut minimiser le photobleachage pour permettre des mesures plus longues52. De plus, si le taux d’acquisition pour le test est faible, la fermeture de la lumière d’éclairage entre les cadres d’acquisition peut aider à un photobleachage excessif. Le coffrage de la lumière d’excitation peut se faire via un obturateur mécanique ou un filtre accordable acousto-optique (AOTF).

Figure 1
Figure 1: Préparation des chambres à cellules d’écoulement fonctionnalisées. (A) Commencez par une lame de microscope nettoyée, deux morceaux de ruban adhésif double face coupés à environ 2 cm et un couvercle fonctionnalisé. (B) Ajouter la bande au centre de la lame du microscope. (C) Fixez le couvercle au ruban avec le revêtement (c.-à-d. nitrocellulose) vers le bas et appuyez doucement sur les zones qui se chevauchent avec le ruban à l’aide d’une pointe de pipette en plastique pour vous assurer que le couvercle a adhéré à la chambre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS de NM2b et M5a-HMM exprimés. (A) Image de gel SDS PAGE représentative pour une chaîne lourde NM2b pleine longueur (≈230 kDa) et GFP-RLC (≈47 kDa) et ELC (≈17 kDa). Image de gel reproduite et modifiée à partir de Melli et al. (2018)29. (B) Image de gel SDS PAGE représentative pour une chaîne lourde de type M5a-HMM (≈120 kDa) et de la calmoduline (≈17 kDa). Notez que le gel dans cette image n’a pas de GFP inséré à l’extrémité C-terminal. Un GFP inséré dans la chaîne lourde de la myosine augmente le poids moléculaire de ≈27 kDa. L’image de gel reproduite et modifiée a été publiée à l’origine dans le Journal of Biological Chemistry44. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Résultats du test defilament d’actine glissant acquis par éclairage TIRF. (A) Exemple d’image d’un film montrant la translocation de filaments d’actine marqués rhodamine-phalloïdine (en rouge) sur 0,2 μM NM2b en présence de 0,7% de méthylcellulose à 30 °C. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Sortie d’image de suivi de filament du programme FASTrack pour NM2b pour le même champ de vision que celui indiqué dans (A) Barre d’échelle = 10 μm. (C) Histogramme représentatif de la vitesse de glissement acto-NM2b, montrant que cet échantillon de NM2b peut générer une vitesse de glissement d’actine de 77 ± 15 nm/s (écart type moyen ±; nombre de pistes = 550). (D) Exemple d’image d’un film montrant la translocation de filaments d’actine marqués rhodamine-phalloïdine (en rouge) sur 75 nM M5a-HMM. Barre d’échelle = 10 μm. (E) Sortie d’image de suivi de filament par le programme FASTrack pour M5a-HMM pour le même champ de vision que celui indiqué dans (D) Barre d’échelle = 10 μm. (F) Un histogramme représentatif de la vitesse de glissement acto-M5a-HMM, montrant que cet échantillon de M5a peut générer une vitesse de glissement d’actine de 515 ± 165 nm/s (écart type moyen ±; nombre de pistes = 25098). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Résultats d’essais inversés obtenus par éclairage TIRF. (A) Un champ de vision représentatif d’une pile d’images fusionnées à deux canaux montrant le mouvement des filaments NM2b (affichés en vert) sur des filaments d’actine biotinylé marqués avec AF647-phalloïdine (affichés en bleu) à 30 °C. Des filaments polymérisés de NM2b recombinantement exprimés et purifiés co-exprimés avec ELC et GFP-RLC sont observés comme les particules vertes et allongées dans le FOV. Barre d’échelle = 10 μm. (B) Histogramme représentatif de la vitesse des filaments NM2b. L’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel d’analyse d’images décrit dans la Table des matériaux. Les filaments NM2b simples ont une vitesse de 84 ± 22 nm/s (écart type moyen ±; nombre de particules suivies = 133), lorsqu’ils se déplacent le long de filaments d’actine simples. (C) Exemple de kymographe du mouvement du filament NM2b le long d’un seul filament d’actine. Notez que certaines des régions de la particule montrent une « rotation » du filament NM2b, le long du filament d’actine, ce qui représente très probablement le moment où un côté du filament bipolaire NM2b se détache du filament d’actine, comme montré précédemment dans Melli et al.29. (D) Un FOV représentatif du mouvement de molécule unique M5a-HMM (affiché en vert) sur des filaments d’actine biotinylé marqués avec de la rhodamine-phalloïdine (affiché en rouge). Barre d’échelle = 10 μm. (E) Histogramme représentatif de la longueur d’exécution de M5a-HMM, ajusté à une seule exponentielle. L’analyse a été effectuée à l’aide du logiciel d’analyse d’images décrit dans la Liste des matériaux. La longueur d’exécution caractéristique est de 1,3 μm avec un intervalle de confiance à 95 % de 1,23-1,42 μm dans cet exemple. (F) Histogramme représentatif de la vitesse M5a-HMM d’une seule molécule sur des filaments d’actine simples. Les données analysées issues de l’analyse d’images montrent une vitesse moyenne de 668 ± 258 nm/s (écart-type moyen ±; nombre de particules suivies = 684). (G) Exemple de kymographe de molécules uniques de mouvement M5a-HMM le long d’un seul filament d’actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Comparaison du test du filament d’actine planant NM2b et M5a-HMM. Le dosage du filament d’actine glissant NM2b a été effectué en présence de méthylcellulose (à gauche; panneau vidéo A) et du M5a-HMM en l’absence de méthylcellulose (à droite; panneau vidéo B) à 30 °C. Notez que l’horodatage avance plus rapidement dans le panneau vidéo NM2b, par rapport au panneau vidéo M5a-HMM pour montrer le mouvement des filaments d’actine marqués à la rhodamine (rouge) qui est à peu près le même. En effet, la vitesse réelle de translocation de l’actine de NM2b est proche de 7 fois plus lente que celle du M5a-HMM (77 nm/s, contre 515 nm/s, respectivement, extraite du pic gaussien adapté à l’histogramme de la figure 3). Barre d’échelle = 10 μm dans les deux panneaux vidéo. Données NM2b acquises à 0,33 image par seconde avec une exposition de 200 ms. Données M5a-HMM acquises à 5 images par seconde avec une exposition de 200 ms (continue) et ensuite sous-échantillonnées à 1 image par seconde. Les horodatages ont été ajoutés à l’aide du plugin décrit dans la liste des matériaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Essai de filament d’actine glissant de NM2b en l’absence de méthylcellulose. Lorsque toutes les autres conditions sont les mêmes, à l’exception de l’absence de méthylcellulose, les filaments d’actine ne collent parfois pas bien à la lèvre de couverture recouverte de 0,2 μM NM2b, ce qui conduit à des films de qualité inférieure avec des filaments d’actine « flopping » près de la surface de la couverture enduite de NM2b. Barre d’échelle = 10 μm. Cela peut être résolu en introduisant de la méthylcellulose pour montrer le mouvement lisse des filaments d’actine, comme indiqué dans le panneau vidéo de gauche de la vidéo 1 (test de filament d’actine glissant NM2b). Une autre alternative consiste à augmenter la concentration de NM2b à ≈1 μM. Ce film a été acquis à 0,33 image par seconde avec une exposition de 200 ms. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Comparaison du test de motilité inversé NM2b et M5a-HMM. Le test de motilité inversée NM2b a été effectué en présence de méthylcellulose et enregistré à une vitesse de 0,33 image par seconde à l’aide d’un obturateur (à gauche; panneau vidéo A), le panneau vidéo C montre le même champ de vision que A, mais avec des particules sont identifiées et suivies à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. De même, le test de motilité inversée pour M5a-HMM en l’absence de méthylcellulose a été enregistré à une vitesse de 5 images par seconde (à droite; panneau vidéo B). Le panneau vidéo D montre le même champ de vision que B, mais avec des particules identifiées et suivies à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Barres d’échelle = 10 μm dans tous les panneaux vidéo. Les deux lasers ont été basculés d’avant en arrière à l’utilisation d’une seule caméra pour l’acquisition. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Nom de la mémoire tampon Composition Étape(s) utilisée(s) Commentaires
Tampon d’extraction M5a 0,3 M NaCl 1.1 Restez sur la glace.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mM MgCl2
1,5 mM EGTA
4,5 mM NaN3
Tampon d’extraction NM2b 0,5 M NaCl 1.1 Restez sur la glace.
15 mM MOPS, pH 7,2
15 mM MgCl2
1,5 mM EGTA
4,5 mM NaN3
Tampon A 0,5 M NaCl 2.2 Restez sur la glace.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM TNT
5 mM MgCl2
Tampon B 0,5 M NaCl 2.3 Restez sur la glace.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM TNT
Tampon d’élution 0,5 M NaCl 3.1 Restez sur la glace.
0,5 mg/mL de peptide FLAG
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3
pH 7,2
Tampon de dialyse M5a 500 mM KCl 4.1 Utilisez dH2O froid pour porter au volume.
10 mM MgCl2
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
1 mM TNT
Tampon de dialyse NM2b 25 mM de NaCl 4.1 Utilisez dH2O froid pour porter au volume.
10 mM MgCl2
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
1 mM TNT
Tampon de stockage NM2b 0,5 M NaCl 5.1 Restez sur la glace.
10 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA
3 mM NaN3

Tableau 1 : Tampons utilisés dans la purification des protéines.

Nom de la mémoire tampon Composition (M5a) Composition (NM2b) Étape(s) utilisée(s) (M5a/NM2b) Commentaires
Tampon de motilité 4X (4X Mo) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Filtrer sous vide et stocker à 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH 7,4 pH 7,4
Tampon de motilité au sel de 50 mM (50 mM MB) 25 % v/v 4X Mo 25 % v/v 4X Mo Filtrer sous vide et stocker à 4°C
50 mM KCl 50 mM de NaCl
Augmenter au volume avec dH2O Augmenter au volume avec dH2O
Tampon de motilité au sel de 500 mM (500 mM MB) N/A 25 % v/v 4X Mo Filtrer sous vide et stocker à 4°C
500 mM NaCl
Augmenter au volume avec dH2O
Myosine 0,05-0,1 μM de myosine 0,2 μM de myosine 4.2/5.2 Restez sur la glace.
1 mM TNT 1 mM TNT
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 500 mM MB
1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) 1 mg/mL de BSA 1 mg/mL de BSA 4.3/5.3 Restez sur la glace.
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 500 mM MB
1 mM TNT 1 mM TNT
5 μM F-actine non étiquetée dans 50 mM MB (actine noire) 5 μM de F-actine non étiquetée 5 μM de F-actine non étiquetée 4.5/5.5 Restez sur la glace. Cisaillez l’actine en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois ou en utilisant une seringue.
1 μM de calmoduline (CaM) 1 mM ATP
1 mM ATP 0,2 mM CaCl2
Diluer dans 50 mM MB 1 μM CaM
Kinase à chaîne légère de la myosine 1–10 nM (MLCK)
Diluer dans 50 mM MB
Mo avec 1 mM TNT et 1 mM ATP 1 mM TNT 1 mM TNT 4.6/5.6 Restez sur la glace.
1 mM ATP 1 mM ATP
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 50 mM MB
Mo avec TNT 1 mM TNT 1 mM TNT 4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9 Restez sur la glace.
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 50 mM MB
20 nM Rhodamine-Phalloidine F-actine (Rh-Actine) 20 nM Rhodamine-phalloïdine F-actine 20 nM Rhodamine-phalloïdine F-actine 4.8/5.8 Restez sur la glace. Ne pas vortex.
1 mM TNT 1 mM TNT
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 50 mM MB
Tampon final 50 mM KCl 0,7 % de méthylcellulose (facultatif) 4.10/5.10 Ajouter le glucose, la glucose oxydase et la catalase immédiatement avant d’effectuer l’expérience. Restez sur la glace.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM de NaCl
5 mM MgCl2 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0,1 mM EGTA
TNT 50 mM 1 mM ATP
1 μM de calmoduline TNT 50 mM
2,5 mg/mL de glucose 1 à 10 nM MLCK
100 μg/mL de glucose oxydase 0,2 mM CaCl2
40 μg/mL catalase 1 μM de calmoduline
2,5 mg/mL de glucose
100 μg/mL de glucose oxydase
40 μg/mL catalase

Tableau 2 : Tampons utilisés dans le test de glisse.

Nom de la mémoire tampon Composition (M5a) Composition (NM2b) Étape(s) utilisée(s) (M5a/NM2b) Commentaires
Tampon de motilité 4X (4X Mo) 80 mM MOPS, pH 7,2 80 mM MOPS, pH 7,2 Filtrer sous vide et stocker à 4°C
20 mM MgCl2 20 mM MgCl2
0,4 mM EGTA 0,4 mM EGTA
pH 7,4 pH 7,4
Tampon de motilité au sel de 50 mM (50 mM MB) 25 % v/v 4X Mo 25 % v/v 4X Mo Filtrer sous vide et stocker à 4°C
50 mM KCl 50 mM de NaCl
Augmenter au volume avec dH2O Augmenter au volume avec dH2O
Tampon de motilité au sel de 150 mM (150 mM MB) 25 % v/v 4X Mo Filtrer sous vide et stocker à 4°C
150 mM NaCl
Augmenter au volume avec dH2O
Myosine 30 nM de myosine Voir « Final Buffer » Recipe/4.12 Restez sur la glace.
1 mM TNT
Diluer dans 150 mM MB
2 mg/mL de NeutrAvidin 2 mg/mL de NeutrAvidin 2 mg/mL de NeutrAvidin 3.5/4.8 Restez sur la glace.
1 mM TNT 1 mM TNT
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 150 mM MB
1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) 1 mg/mL de BSA 1 mg/mL de BSA 3.3/4.6 Restez sur la glace.
1 mM TNT 1 mM TNT
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 150 mM MB
200 nM rhodamine-phalloidine biotinylée F-actine (bRh-Actine) 200 nM rhodamine-phalloïdine biotinylée F-actine 200 nM rhodamine-phalloïdine biotinylée F-actine 3.7/4.10 Évitez le cisaillement en ne tourbillonnant pas ou en ne pipetant pas de haut en bas. Pour mélanger, inverser doucement.
1 mM TNT 1 mM TNT
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 150 mM MB
Mo avec TNT TNT 50 mM TNT 50 mM 3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13 Restez sur la glace.
Diluer dans 50 mM MB Diluer dans 150 mM MB
Tampon final 50 mM KCl 0,7 % de méthylcellulose (facultatif) 3.9/4.14 Ajouter le glucose, la glucose oxydase et la catalase immédiatement avant d’effectuer l’expérience. Restez sur la glace.
20 mM MOPS, pH 7,2 50 mM de NaCl
5 mM MgCl2 20 mM MOPS, pH 7,2
0,1 mM EGTA 5 mM MgCl2
1 mM ATP 0,1 mM EGTA
TNT 50 mM 1 mM ATP
1 μM de calmoduline TNT 50 mM
2,5 mg/mL de glucose 1 à 10 nM MLCK
100 μg/mL de glucose oxydase 0,2 mM CaCl2
40 μg/mL catalase 1 μM de calmoduline
10 nM de myosine 2,5 mg/mL de glucose
100 μg/mL de glucose oxydase
40 μg/mL catalase

Tableau 3 : Tampons utilisés dans les essais TIRF.

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Discussion

Présenté ici est un flux de travail pour la purification et la caractérisation in vitro de la myosine 5a et de la myosine 2b nonmuscle. Cet ensemble d’expériences est utile pour quantifier les propriétés mécanochimiques des constructions de myosine purifiée de manière rapide et reproductible. Bien que les deux myosines présentées ici ne soient que deux exemples spécifiques parmi les nombreuses possibilités, les conditions et les techniques peuvent être appliquées, avec une certaine adaptation, à la plupart des myosines et à de nombreuses autres protéines motrices.

Les protocoles discutés ici sont sujets à des variations en fonction des besoins individuels du laboratoire et des expériences. Par exemple, comme nous l’avons vu dans la section Expression et biologie moléculaire, les protéines utilisées dans le présent article ont été générées à partir d’une co-infection de deux virus ou plus; cependant, une expression protéique réussie peut également être obtenue avec des vecteurs multi-expression tels que le vecteur d’expression double p-FastBac ou le système d’expression BiGBac53.

Plusieurs facteurs peuvent entraver la production réussie de la protéine recombinante. Pour prévenir la dégradation des protéines, il est impératif que chaque étape de la purification des protéines soit terminée à la température appropriée, toutes les étapes de centrifugation se produisant à 4 °C et toutes les autres étapes étant effectuées sur la glace. Un excès de bandes peut être apparent dans le gel du produit protéique dialysé. Cela pourrait indiquer une dégradation ou une contamination. Une purification ultérieure par exclusion de taille ou chromatographie par échange ionique peut améliorer la pureté des échantillons54. À cet effet, il est recommandé d’économiser des aliquotes à chaque étape du processus de purification des protéines pour le dépannage, en cas de faible rendement en myosine ou de suspicion de contamination protéique. Parfois, il peut y avoir une liaison inadéquate du lysate à la résine à l’étape 1.8, ce qui peut entraîner la perte de la myosine au surnageant lors de centrifugations ultérieures. Cela peut être résolu en faisant varier la durée de liaison de la résine au cours de cette étape, même en la laissant se lier pendant la nuit, si nécessaire. Des temps d’incubation plus longs introduisent un plus grand risque de dégradation des protéines si les protéases contaminantes ne sont pas suffisamment inhibées, et les myosines avec des régions protéolytiquement sensibles seront affectées négativement. De plus, un mauvais lavage de la résine avant et après utilisation peut entraîner l’élution d’un produit protéique indésirable, il est donc impératif que les protocoles appropriés soient suivis avant et après l’utilisation de la résine d’affinité FLAG. Si la résine est lavée immédiatement après utilisation et stockée de manière appropriée, elle peut être réutilisée jusqu’à 20 fois.

Il est important de noter que la dégradation des protéines se produit également pendant la phase d’expression et que le raccourcissement des temps d’expression peut être avantageux en termes de dégradation, bien que cela puisse se faire au détriment du rendement total. Suivre les procédures décrites ici pour surveiller l’échantillon de protéines à différentes étapes du protocole (c.-à-d. avant, pendant et après la purification) aidera à déterminer les étapes nécessaires à l’optimisation. Pour les myosines qui résistent à plusieurs reprises à une expression et à une purification réussies, les problèmes courants peuvent être la co-expression avec des chaînes légères insuffisantes ou inappropriées ainsi qu’un pliage inapproprié lors de la surexpression. Les chaînes légères appropriées doivent être sélectionnées en fonction des interactions connues lorsque cela est possible et les rapports chaîne lourde/baculovirus à chaîne légère doivent être testés dans des expériences à petite échelle pour déterminer l’optimum. Pour les myosines qui agrègent ou produisent peu ou pas de produit actif soluble, la co-expression avec des chaperons peut aider à obtenir avec succès la protéine active54,55.

Les produits de myosine purifiés contiennent inévitablement une petite population de myosine endommagée, appelée « têtes mortes », qui peuvent être traitées de deux manières. Une méthode, décrite dans ce protocole, consiste à faire circuler de l’actine non étiquetée, ou « noire », à travers la chambre dans le test du filament d’actine glissant. Par la suite, le lavage à l’ATP provoque la dissociation des myosines fonctionnelles de l’actine noire tandis que les têtes mortes resteront liées à cette actine non étiquetée en raison de leur incapacité à hydrolyser l’ATP et de leur forte affinité. Lors du lavage de l’actine noire, une seringue peut être utilisée pour cisailler efficacement l’actine. Un cisaillement supplémentaire peut être effectué par vortex, à condition que toutes les bulles résultantes soient éliminées par centrifugation. Une autre méthode consiste à granuler sélectivement les têtes mortes de l’échantillon de myosine en mélangeant la myosine avec de la F-actine et du Mg-ATP à des concentrations élevées de sel (0,5 M) et en sédimentant dans une ultracentrifugeuse de table. Les myosines capables d’hydrolyser l’ATP dans ces conditions ne restent pas liées à l’actine en raison de leur faible affinité pour l’actine dans ces conditions de sel élevé et se trouvent dans le surnageant, tandis que les têtes mortes de myosine restent liées à l’actine dans la pastille56. De même, une sédimentation avec de l’actine et une remise en retrait de la pastille peuvent également être utilisées pour éliminer les myosines qui sont incapables de se lier à l’actine en l’absence d’ATP. Notez qu’une petite proportion de ce type de têtes mortes aura moins d’impact sur ces types d’essais. En effectuant une sédimentation et une remise en charge sans nucléotides, suivies d’une centrifugation et d’une remise en charge liées à l’ATP, les myosines qui sont compétentes à la fois pour la liaison à l’actine et la libération dépendante de l’ATP par l’actine peuvent être isolées.

Les tests de motilité peuvent également être modifiés de plusieurs manières. Par exemple, dans le test du filament d’actine glissant pour le NM2b, le NM2b est phosphorylé dans la chambre via l’ajout de MLCK, de calmoduline, de calcium et d’ATP dans l’étape d’actine noire, ainsi que dans le tampon final. Cependant, le NM2b peut également être phosphorylé dans un tube, avant d’effectuer le test. Ce faisant, le pourcentage de NM2b phosphorylé peut être quantifié en exécutant un gel natif avec un tampon d’échantillon contenant de l’urée ou en effectuant une spectrométrie de masse57,58. L’effet de la température sur l’activité de la myosine peut également être étudié. Cela peut être accompli en utilisant un système de chauffage objectif sur le microscope ou une enceinte environnementale, de sorte que la cellule d’écoulement est maintenue à température constante. La force ionique est une autre considération importante. Pour de nombreuses myosines, l’affinité de l’actine et l’activité enzymatique seront augmentées à une force ionique inférieure; pour d’autres, une force ionique plus élevée est nécessaire59. En plus de fournir des informations précieuses sur le mécanisme de la myosine, l’abaissement de la force ionique peut améliorer la motilité et rendre la myosine plus accessible à l’investigation avec de nombreux tests. En revanche, certains moteurs présenteront des effets d’attache électrostatiques, ce qui ralentira la motilité à des forces ioniques plus faibles. Enfin, lors du dosage du mouvement des filaments NM2b, il est crucial de maintenir la force ionique dans une plage étroite (force ionique de 150 à 200 mM), en approximant celles trouvées dans la plupart des types de cellules. L’utilisation de forces ioniques plus faibles entraîne l’agrégation des filaments de myosine, tandis que les filaments se dépolymérent à des forces ioniques plus élevées.

Avec de nombreuses myosines, en particulier celles à faible rapport de service, les conditions du tampon final donné pour M5a feraient en sorte que les filaments d’actine marqués par fluorescence ne seraient que faiblement liés à la surface ou se dissocieraient complètement. Il en résulte des mouvements erratiques qui compliquent la quantification. Un mouvement de meilleure qualité peut souvent être obtenu en utilisant de la méthylcellulose (0,7%) dans le tampon final. La méthylcellulose est un agent d’encombrement visqueux et force les filaments d’actine à rester près de la surface même lorsque la densité des moteurs de myosine attachés est clairsemée60. De même, il a été observé que l’inclusion de méthylcellulose dans le tampon final du test de motilité à filament unique est nécessaire pour observer le mouvement avec NM2a, et le même phénomène a été rapporté pour les filaments de myosine musculaire lisse29,61. Cela augmente également la processivité des filaments NM2b. Un effet secondaire potentiellement indésirable de l’utilisation de méthylcellulose dans ce test est que les propriétés de l’agent d’encombrement peuvent favoriser l’association latérale des filaments de myosine en faisceaux. Les alternatives à la méthylcellulose lors du dépannage d’un manque de mouvement ou de filaments d’actine faiblement liés dans le test du filament d’actine glissant sont d’abaisser la concentration de sel dans les tampons de motilité ou d’augmenter la densité de surface de la myosine. Comme indiqué ci-dessus, il a été démontré qu’une force ionique élevée dans les tampons de motilité réduit la capacité de certaines myosines à se lier à l’actine29,34,62.

Une autre variante du test du filament d’actine planant est l’utilisation d’anticorps pour ancrer la myosine sur le couvercle en verre. Par exemple, si un GFP est présent à l’extrémité C-terminale de la construction de la myosine, un anticorps anti-GFP peut être utilisé pour fixer le GFP-myosine au couvercle36,63,64. Cela peut aider à obtenir une motilité réussie dans des situations où la géométrie du système peut autrement entraver la translocation de l’actine, comme dans le cas de l’essai de bras de levier artificiels ou courts54,64. De plus, l’effet de la charge sur les vitesses de translocation peut être étudié dans le test du filament d’actine planant en utilisant des protéines de liaison à l’actine telles que la α-actinine ou l’utrophine39,50,65. Une telle mesure peut être utile pour comparer l’effet de la charge sur un ensemble de myosines par rapport à la cinétique dépendante de la charge d’une seule myosine qui peut être mesurée à l’aide d’un test de piégeage optique66,67. Cela peut être accompli en ajoutant des quantités croissantes d’une protéine de liaison à l’actine avec la myosine dans l’étape initiale. La protéine de liaison à l’actine se lie à la surface et exerce une charge de friction sur les filaments d’actine qui sont déplacés par les myosines, ce qui entraîne une vitesse graduée lorsque la concentration de protéine de liaison à l’actine à la surface est augmentéede 39.

Le test de motilité d’une seule molécule / ensemble peut également être adapté pour étudier l’effet de diverses structures d’actine sur le mouvement de la myosine. Par exemple, plutôt que d’observer le mouvement de la myosine sur des filaments d’actine simples, les faisceaux d’actine médiés par la fascine ou la α-actinine peuvent être étudiés comme une reconstitution in vitro du réseau de filaments d’actine trouvé dans les cellules68,69. L’effet des protéines de liaison à l’actine telles que la tropomyosine peut également être étudié65,70,71,72.

Il convient de noter la polyvalence dans le choix d’une étiquette pour le test de motilité d’une seule molécule / ensemble. Dans le présent rapport, une étiquette GFP a été utilisée sur le M5a-HMM et le NM2b; cependant, de nombreuses autres étiquettes peuvent être utilisées. Les exemples incluent HaloTag ou SNAP-tag, qui peuvent être génétiquement fusionnés à la myosine et lier de manière covalente un colorant synthétique. L’avantage de la technologie HaloTag réside dans sa polyvalence pour plusieurs adaptations expérimentales, telles que l’étiquetage avec différentes couleurs ou l’ajout d’une étiquette d’affinité de biotine29,73. En outre, l’utilisation de la technologie des points quantiques peut être utilisée pour améliorer la résolution du suivi de fluorescence d’une seule molécule, ce qui répond également à la limitation de la faible luminosité de GFP et à la tendance au photobleaching74. Les étiquettes peuvent être attachées avec succès aux chaînes légères ainsi qu’à la chaîne lourde11,75,76.

Pour réussir le test de motilité TIRF à molécule unique, un facteur clé consiste à utiliser une surface bien bloquée et fonctionnalisée. Une méthode simple pour obtenir un blocage modéré consiste à utiliser du BSA biotinylé lié à une surface de nitrocellulose. Bien que cela fonctionne assez bien pour caractériser de nombreux moteurs, y compris M5a, le niveau de liaison non spécifique sur une telle surface est prohibitif pour reproduire un mouvement propre avec des échantillons tels que NM2b. Une percée clé à cet égard a été la transition vers des surfaces PEGylées dopées avec de la biotine-PEG pour la fonctionnalisation77. Les surfaces PEG offrent un niveau de blocage de surface bien supérieur et une surface PEGylated sans défaut peut rester exempte de liaison non spécifique pendant de très longues périodes de temps. Le protocole spécifique détaillé ici permet la production de surfaces PEG biotinylées en quelques heures et si elles sont immédiatement stockées comme décrit, les surfaces peuvent être utilisées pendant plusieurs semaines avec seulement une baisse marginale de la qualité.

Une considération clé avant de collecter des données pour le suivi est la fréquence d’images d’acquisition. Le mouvement entre les images suivantes doit être suffisamment important pour éviter les erreurs de suréchantillonnage. Des taux d’échantillonnage élevés donneront des vitesses surestimées en raison de la division des erreurs de localisation par un petit intervalle de temps et augmenteront l’erreur apparente de la mesure. Dans les cas où les données brutes sont trop finement échantillonnées, les données peuvent être sous-échantillonnées en prenant chaque nième image pour créer une nouvelle pile et en tenant compte du changement de fréquence d’images qui en résulte. Les mouvements de sous-pixels entre les images doivent être évités et des mouvements de plusieurs centaines de nanomètres sont nécessaires pour obtenir des valeurs précises. Dans tous les cas où un nouvel échantillon est caractérisé, les résultats générés par l’analyse automatisée doivent être comparés à un petit ensemble de données de filaments suivis manuellement pour plus de cohérence.

Lors de l’analyse des données issues d’expériences de motilité d’une seule molécule, il faut faire attention au choix des paramètres à mesurer, de la manière de filtrer les données et de l’ajustement des données. Comme indiqué ci-dessus, le taux d’échantillonnage peut être un facteur important lors de l’analyse des données de vitesse. Pour de nombreuses myosines, les courses processives seront courtes et bien approchées par une ligne droite. Dans de tels cas, la distance de départ à l’extrémité de la piste peut fournir une bonne mesure de la longueur de la course et celle-ci peut être divisée par la durée de la piste pour donner une bonne estimation de la vitesse. Dans les cas où les pistes sont très longues et suivent des trajectoires courbes autour de filaments courbés, ce type d’analyse donnera des résultats inexacts et une distance totale parcourue doit être utilisée, en utilisant un taux d’acquisition qui permet aux points de localisation successifs d’être suffisamment bien espacés pour éviter les erreurs de suréchantillonnage décrites ci-dessus, tout en étant suffisamment proches les unes des autres pour que la distance en ligne droite entre eux reste une bonne approximation de la courbe entre ces points. En outre, pour les protéines motrices avec des longueurs de long terme par rapport à la longueur de la piste, des statistiques supplémentaires telles que l’estimateur de Kaplan-Meier doivent être effectuées lors du calcul des longueurs de course78. Il en va de même pour les situations dans lesquelles le photobleachage est suffisamment susceptible de se produire avant la fin d’un processus. Un autre phénomène qui peut être observé dans les études de fluorescence à molécule unique est le photoblinking, dans lequel les fluorophores basculent rapidement entre l’état marche et arrêt et semblent cligner des yeux. Cela ne se produit généralement pas dans ces expériences de motilité; cependant, si cela se produit, l’intensité du laser et les temps d’exposition peuvent être diminués, ce qui devrait minimiser l’effet. Plusieurs produits chimiques, dont le β-mercaptoéthanol, le Trolox, le cyclooctatérène, le gallate de n-propyle, l’alcool 4-nitrobenzylique et le 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane peuvent également être utilisés pour atténuer ce problème79.

En résumé, cet article présente des protocoles détaillés qui sont robustes dans leur capacité à quantifier les propriétés mécanochimiques telles que la vitesse de translocation de l’actine, la vitesse de translocation de la myosine et la longueur d’exécution de la myosine. Ces tests sont reproductibles et peuvent être utilisés pour déterminer la qualité de la myosine purifiée même dans des situations où les caractéristiques mobiles ne sont pas l’objectif final spécifique de l’étude. En outre, des changements tels que le pH, la température et les régulateurs chimiques peuvent être introduits dans ces tests pour examiner comment la mécanochimie de la myosine étudiée est affectée. Pris ensemble, les essais de vol plané de l’actine et de motilité inversée peuvent permettre de mieux comprendre le comportement de l’ensemble de la myosine et les variations intermoléculaires de la mécanique motrice moléculaire et de la cinétique. Les tests basés sur la microscopie à fluorescence décrits ici soutiennent l’approche d’un réductionniste de la recherche sur le cytosquelette et peuvent être un outil puissant pour comprendre la dynamique protéine-protéine in vitro. Ensemble, les données recueillies à partir de ces expériences hautement contrôlées peuvent être utilisées pour informer les mécanobiologistes des comportements clés de l’actomyosine qui peuvent être pertinents au niveau biologique cellulaire et au-delà.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Fang Zhang pour son assistance technique dans la préparation des réactifs utilisés pour la collecte de ces données. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros NHLBI/NIH HL001786 à J.R.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309628
2 M CaCl2 Solution VWR 10128-558
2 M MgCl2 Solution VWR 10128-298
27 Gauge Needle Becton Dickinson 309623
5 M NaCl Solution KD Medical RGE-3270
Acetic Acid ThermoFisher Scientific 984303
Amyl Acetate Ladd Research Industries 10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel Millipore Sigma A2220 https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP Millipore Sigma A7699
Biotinylated G-Actin Cytoskeleton, Inc. AB07
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma 5470
bPEG-silane Laysan Bio, Inc Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006
Calmodulin PMID: 2985564
Catalase Millipore Sigma C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM ThermoFisher Scientific 11496015 http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay Millipore Sigma WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay Millipore Sigma WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets Millipore Sigma 5056489001 This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO) EMD Millipore Corporation UFC910024 The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye ThermoFisher Scientific 20278
Coverslip Rack Millipore Sigma Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay VWR International 48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay Azer Scientific ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO) Fischer Scientific 08-670-5A The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol Millipore Sigma D0632
Double-Sided Tape Office Depot 909955
DYKDDDDK Peptide GenScript RP10586 This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTA Millipore Sigma E4378
Elution Column Bio-Rad 761-1550 These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol Fischer Scientific A4094
G-actin PMID: 4254541 G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose Millipore Sigma G8270
Glucose Oxidase Millipore Sigma G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-295018
HaloTag Promega G100A
HCl Millipore Sigma 320331
KCl Fischer Scientific P217-500
Large-Orifice Pipet Tips Fischer Scientific 02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 78435
Mark12 Unstained Standard Ladder ThermoFisher Scientific LC5677
Methanol Millipore Sigma MX0482
Methylcellulose Millipore Sigma M0512
Microscope Slides Fischer Scientific 12-553-10
MOPS Fischer Scientific BP308-100
mPEG-silane Laysan Bio, Inc MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase PMID: 23148220 FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3 Millipore Sigma S8032
NeutrAvidin ThermoFisher Scientific 31050
Nitrocellulose Ladd Research Industries 10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well ThermoFisher Scientific NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
PMSF Millipore Sigma 78830 PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor Blades Office Depot 397492
Rhodamine-Phalloidin ThermoFisher Scientific R415 Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media ThermoFisher Scientific 12658-027 This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay Corning 353025 Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay Corning 353003 Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips Thomas Scientific 1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75006590
Microscope Nikon Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera Andor Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box Tokai HIT Custom Thermobox
Microscope Laser Unit Nikon LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge ThermoFisher Scientific Model: CR3i
Misonix Sonicator Misonix XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
Plasma-Cleaner Diener electronic GmbH + Co. KG System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm) Qsonica 4418
Standard Incubator Binder Model: 56
Waverly Tube Mixer Waverly TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01) http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software NIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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Biochimie numéro 168 myosine filaments d’actine purification des protéines microscopie à fluorescence essai de motilité dosage à molécule unique filaments bipolaires microscopie à fluorescence à réflexion interne totale
Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro
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Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J.… More

Tripathi, A., Bond, C., Sellers, J. R., Billington, N., Takagi, Y. Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays. J. Vis. Exp. (168), e62180, doi:10.3791/62180 (2021).

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