Summary
在这里，该协议描述了如何使用在同一物种中培养的一抗来研究宿主 - 病原体相互作用来执行双重标记免疫荧光。此外，它可以包括来自该协议中不同宿主的第三种抗体。这种方法可以在任何细胞类型和病原体中进行。
Abstract
如今，有可能找到广泛的分子工具可用于研究寄生虫 - 宿主细胞相互作用。然而，获得识别寄生虫中特定细胞结构和蛋白质的商业单克隆或多克隆抗体存在一些局限性。此外，很少有商业抗体可用于标记锥虫。通常，针对寄生虫的多克隆抗体是内部制备的，与同一物种中产生的其他抗体结合使用可能更具挑战性。在这里，该协议展示了如何使用在同一物种中培养的多克隆和单克隆抗体来执行双标记免疫荧光以研究宿主细胞和病原体的相互作用。为了实现双标记免疫荧光，首先孵育小鼠多克隆抗体至关重要，然后与与任何荧光染料偶联的二级小鼠IgG抗体一起孵育。之后，需要一个额外的阻断步骤，以防止任何痕量的一抗被下一个二抗识别。然后，在适当的时间将小鼠单克隆抗体及其与不同荧光染料偶联的特异性IgG亚类二抗添加到样品中。此外，可以使用在不同物种中培养的第三种抗体进行三重标记免疫荧光。此外，核和肌动蛋白等结构随后可以用其特定的化合物或标记物染色。因此，这里提出的这些方法可以针对一抗来源有限的任何细胞进行调整。
Introduction
为了在细胞水平上研究病原体与宿主细胞的相互作用，提供了有关疾病根本原因的基本信息，因为不同的群体，如病毒，细菌和原生动物，可以感染大多数宿主细胞类型1，2，3，4。它还可以帮助开发和识别可以减缓或抑制病原体生长的潜在治疗靶点。在活体条件下，产生的抗体负责识别自身成分、病毒中的抗原、细菌成分或产品、真菌、寄生虫等5。
为此，抗体是广泛使用的工具，主要用于了解细胞结构和蛋白质的位置和功能。几项使用多抗体标记的研究表明，额外的阻断步骤有助于免疫定位的特异性。此外，大多数描述的方案使用特定的商业单克隆抗体，包括来自同一宿主物种的抗体6，7，8，9，10，11，12，13，14。
通常，双标记免疫荧光使用在不同物种中培养的两种抗体来染色感兴趣的细胞结构或病原体与宿主细胞以查看它们之间的相互作用。然而，当没有针对某些病原体的特异性商业单克隆或多克隆抗体可用于执行双重标记时，这可能是一个问题。此外，还有市售的抗体偶联试剂盒，并且可以通过琥珀酰亚胺酯反应将一抗直接偶联到荧光团15。问题在于，这些试剂盒通常很昂贵，并且有必要有足够的抗体来标记它们。知道了这一点，我们成功地开发了一种双免疫荧光方法，使用在同一物种中培养的两种不同抗体来研究布鲁氏锥虫中的蛋白质定位16。然而，对于细胞内寄生虫，包括克氏锥虫，这种方法尚未得到证实。在这里，我们展示了如何进行双重标记免疫荧光，以使用在同一物种中培养的一抗来研究细胞内克氏锥虫寄生虫和宿主细胞，而不会发生交叉反应。除了这种方法之外，还建立了三重免疫荧光标记，并添加了来自不同物种的第三种抗体。当抗体来源有限且可用于任何细胞类型时，这些方法会有所帮助。
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Protocol
1. 细胞和寄生虫培养
- 在37°C下在37°C下在5%CO2 17中加入RPMI培养基的25 cm2细胞培养瓶中培养来自美国型培养物（CCL-7）的LLC-MK2（恒河猴肾上皮）细胞，该培养瓶中含有10%热灭活FBS（胎牛血清）和抗生素（100 U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素）。
- 根据先前的方案用 克氏锥虫 （Y菌株）感染LLC-MK2细胞 18。
- 将LLC-MK2感染细胞（5mL）的上清液收集在15mL细胞培养锥形离心管中，并在500×g下离心10分钟和22°C以降低细胞碎片。将试管在37°C下保持10分钟，以使锥孢菌游到上清液。
- 将上清液收集在新的锥形管中，并在22°C下以2500×g离心15分钟。 弃去上清液并将含有寄生虫的沉淀重悬于完整的RPMI培养基中，通过在Neubauer室中计数细胞来确定细胞密度。
2. 控制免疫荧光方案
注意：固定后，可以将含有盖玻片的板在4°C下储存在1x PBS（pH 7.2）中一周。要储存，重要的是细胞没有经过透化步骤。
- 将LLC-MK2细胞（2 x 104）沉淀在24个孔板中，该孔板含有RPMI培养基中的UV灭菌圆形盖玻片16小时。
- 对于受感染的细胞，按比例向每个孔中加入含有 克氏锥虫 （项目1.4）的上清液（MOI 10：1），并保持感染6小时。用PBS溶液洗涤含有感染和未感染细胞的盖玻片五次，并在室温（RT）下用2%多聚甲醛固定在1x PBS（pH 7.2）中10分钟。
- 用1x PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
- 在室温下用0.2%IGEPAL CA-630在1x PBS（PH 7.2）中透化盖玻片10分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 用封闭溶液（2%BSA在1x PBS，pH 7.2）室温下孵育盖玻片30分钟。
- 将盖玻片在室温下孵育30分钟，用小鼠单克隆抗hnRNPA1（稀释1：200）或用小鼠多克隆抗TcFAZ（稀释1：100）抗体稀释在封闭溶液中。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 将盖玻片在室温下孵育 30 分钟，山羊抗小鼠 IgG F （ ab ' ） 2 （ H + L ）与 Alexa Fluor 488 （ 1 ： 600 ）偶联，苷与 Alexa 594 （ 1 ： 300 ）偶联，以染色在封闭溶液中稀释的宿主细胞中的肌动蛋白丝（ F - 肌动蛋白）。
- 用1x PBS（pH 7.2）洗涤三次，每次5分钟。
- 将少量ProLong Gold抗淬灭安装试剂与DAPI培养基一起涂抹到载玻片表面。
- 使用镊子轻轻倾斜安装介质中的盖玻片，以防止形成气泡。干燥后，如果需要，请密封盖玻片。
3. 使用在同一宿主中培养的单克隆和多克隆抗体的双标记免疫荧光方案
- 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
- 用室内小鼠多克隆抗TcFAZ抗体（1：100）在室温下在封闭溶液中稀释30分钟，孵育含有受感染和未感染细胞的盖玻片。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 在室温下孵育盖玻片30分钟，山羊抗小鼠IgG F（ab'）2（H + L）与Alexa Fluor 647（1：600）偶联在封闭溶液中稀释。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 用阿芬尼纯兔抗小鼠IgG（H + L）稀释（0.12mg / mL）在封闭溶液中在室温下30分钟执行第二个封闭步骤。
- 用1x PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次5分钟。然后用小鼠单克隆抗hnRNP A1 IgG2b抗体（1：200）在室温下孵育30分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 用山羊抗小鼠IgG2b抗体与Alexa Fluor 488（1：600）偶联，并与在封闭溶液中稀释的与Alexa 594（1：300）偶联的鬼脒环蛋白孵育盖玻片30分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 重复上述步骤 2.8 至 2.10。
4. 三重标记免疫荧光方案，加入来自不同宿主物种的第三种多克隆抗体
注意：对于额外的标记，请注意IgG亚类，抗体同种型，并遵循抗体的顺序：1.小鼠多克隆，2.兔多克隆，3.第二块和4.小鼠单克隆。考虑共聚焦显微镜中可用的激光器类型，以选择正确的荧光团偶联二抗。
- 重复上述步骤 2.1 至 2.6。
- 在步骤3.2至3.5（洗涤步骤）之后，开始与家兔多克隆抗体在封闭溶液中在室温下孵育30分钟。
- 用1x PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次5分钟。
- 用山羊抗兔抗体IgG在封闭溶液中与Alexa 647（1：600）偶联孵育盖玻片30分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 在室温下，用阿菲尼纯兔抗小鼠IgG（H + L）稀释（0.12mg / mL）在封闭溶液中执行封闭步骤30分钟。
- 用1x PBS（pH 7.2）洗涤盖玻片三次，每次5分钟，并与在封闭溶液中稀释的任何小鼠单克隆IgG亚类抗体孵育30分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
- 用一对特定的山羊抗小鼠IgG亚类抗体在封闭溶液中与Alexa 594（1：600）偶联，将盖玻片孵育30分钟30分钟。
- 用1x PBS清洗盖玻片三次，每次5分钟。
5. 共聚焦成像采集
- 使用共聚焦显微镜（具有63X油浸物镜）分析免疫荧光样品，并使用光电倍增管（PMT）和混合检测器（HyD）检测荧光。
注意：我们使用了圣保罗大学里贝朗普雷托医学院共聚焦显微镜多用户实验室 - LMMC的设置。 - 使用分离通道采集所有共聚焦图像。使用 Adobe Photoshop 执行图像处理。
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Representative Results
在这里，我们展示了当抗体的来源由于无法识别锥虫体中特定结构和蛋白质的商业抗体而受到限制时，如何通过免疫荧光研究宿主 - 寄生虫相互作用。
在锥虫中，克氏锥虫具有最复杂的生命周期之一，涉及脊椎动物和无脊椎动物宿主之间的不同发育阶段19。在克氏锥虫生命周期中，在哺乳动物感染的早期阶段，变环锥体突变体通过涉及寄生虫和脊椎动物宿主细胞中存在的各种分子的过程侵入细胞19，20。为了研究这些过程，我们的实验室定期生产针对克氏锥虫，布鲁氏锥虫和利什曼原虫sp16，21，22，23蛋白的内部多克隆抗体，与商业小鼠单克隆抗体和/或兔抗体一起使用。
在图1中，共聚焦显微镜图像显示了受感染和未感染细胞的对照实验的结果，突出了宿主细胞中抗体和内化寄生虫的特异性。在我们实验室中培养的小鼠多克隆抗体（抗TcFAZ）仅识别寄生虫鞭毛处FAZ中的克氏锥虫巨蛋白，而未在宿主细胞中识别（图1A）。使用商业小鼠单克隆抗hnRNP A1抗体观察核糖核蛋白A124在细胞核中的异质性核糖核蛋白A124的分布，该抗体仅识别宿主哺乳动物细胞而不识别寄生虫（图1B）。此外，用DAPI染色宿主和寄生虫核以及寄生虫动力学母体，并用与Alexa 594偶联的Phalloidin染色宿主F-肌动蛋白（图1）。这些对照结果显示了抗体的特异性，然后，我们可以运行双标记免疫荧光方案（图2）。
在图2中，双标记免疫荧光显示了宿主中的蛋白质分布和通过共聚焦显微镜分析的寄生虫。使用这种方法的抗体之间不会发生交叉反应。使用纯化的兔抗小鼠IgG的第二个阻断步骤的效率足以损害二抗的非特异性标记。这种标记允许研究寄生虫与宿主蛋白之间的相互作用及其在感染过程中的行为。
图1：共聚焦显微镜显示克氏锥虫巨蛋白（TcFAZ）和宿主hnRNP A1在非感染（NI）和感染（INF）LLC-MK2细胞中的定位与克氏锥虫。 （A）克氏锥虫巨蛋白（TcFAZ）定位于克氏锥虫鞭毛中，用小鼠多克隆抗TcFAZ抗体标记，并与山羊抗小鼠IgG二抗偶联到Alexa 488（绿色）可视化。（B）LLC-MK2中的宿主核hnRNP A1用小鼠单克隆抗hnRNP A1 IgG2b抗体标记，并通过山羊抗小鼠IgG2b抗体与Alexa 488偶联（绿色）可视化。Phalloidin与Alexa 594染色F-肌动蛋白（红色）。细胞核和动力学质体用DAPI（蓝色）染色。比例尺 = 5 μm。所有实验均采用生物一式三份。白色箭头表示细胞内寄生虫。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：双标记免疫荧光显示，在未感染（NI）和受感染（INF）LLC-MK2细胞中，在同一宿主物种中升高的抗体之间没有交叉反应 ，并用共聚焦显微镜分析了克氏锥虫。定位在鞭毛附着区（FAZ）的巨蛋白用小鼠多克隆抗TcFAZ抗体标记，并通过山羊抗小鼠IgG抗体与Alexa 647偶联（红色）可视化。宿主核 hnRNP A1 用小鼠单克隆抗 hnRNP A1 IgG2b 抗体标记，并通过山羊抗小鼠 IgG2b 抗体与 Alexa 488 偶联（绿色）进行可视化。与Alexa 594偶联的磷脂素染色剂F-肌动蛋白（灰色）。细胞核和动力学质体用DAPI（蓝色）染色。合并的图像按指示显示。插图对应于宿主核的扩大区域。棒=5微米。所有实验均采用生物一式三份。白色箭头显示宿主细胞核附近寄生虫的存在。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用来自同一物种的一抗进行顺序双重免疫染色的示意图。图中显示了确保该协议效率的抗体顺序。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了一种方案，使用来自同一宿主物种的两种不同抗体在 克氏锥虫 感染的细胞中进行双重免疫标记。为了更详细地研究感染的影响，可以使用该协议标记宿主细胞中的结构，例如细胞核或细胞质细胞器。此外，它可用于后包埋薄片免疫金标记方法。这种方法有助于克服可用于研究锥虫和其他寄生虫的抗体很少的障碍。
此外，我们的方案显示细胞内寄生虫与宿主细胞一起标记，两个真核生物在同一免疫荧光中，不同于在不同种类的组织中实现的那些方案7，8，9，10，11，12，13，14.我们的方案显示，第二抗无法识别一级多克隆抗体的表位（步骤3.9），确保抗体之间不会发生交叉反应（图3）。该方法的成功是由于使用纯化的兔抗小鼠IgG的阻断步骤（步骤3.6）的效率。Ansorg等人（2015）描述的类似方案具有两个额外的阻断，其中第一个使用来自与一抗相同的宿主的血清，第二个使用未结合的Fab片段6实现。此外，如果没有第二个阻塞，可能会发生误报标记，正如这些作者6所解释的那样。
此外，对于三重免疫标记，可以在方案中上述第二个阻断步骤（步骤4.2）之前添加兔宿主物种的第三种抗体。此外，可以使用多种单克隆抗体，因为它们具有不同的IgG亚类。为此，应高度吸附相应的二抗，以尽量减少它们之间的交叉反应性。使用不同的IgG亚类允许使用相同的宿主抗体而不会发生交叉反应。这些方案效果很好，但对照组是必要的，以避免假阳性结果。IgG子类及其性质的特异性使得进行双重和三重标记成为可能。据报道，IgG亚类在补体活化和Fc受体在重链间二硫键，铰链区氨基酸，分子量（kDa）和相对丰度（百分比）中对蛋白质，糖类和过敏原的反应中有所不同 25。它们在铰链结构氨基酸上略有不同，影响每个IgG亚类的稳定性和柔韧性。在所有IgG亚类中，IgG2具有最短，甚至更刚性的铰链，因为CH2区域具有一个氨基酸缺失和一个额外的重链二硫化物桥 25。
总之，这里描述的用于研究宿主 - 病原体相互作用的方案提出了一种适用于任何抗体组合的基本和精心设计的技术。这种方法使免疫荧光具有成本效益，并且可以在抗体来源有限时提供帮助。该方案可以同时检测受感染宿主细胞中的病原体和宿主细胞蛋白;它也可以应用于任何细胞类型和自由生物体。
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Disclosures
作者声明没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了圣保罗保护儿童基金会（FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5）向MMAB，由Apoio ao Ensino基金会，Pesquisa e Assistência-FAEPA到MMAB以及由巴西高级国家福利协会（CAPES）支持 - 财务代码001。CG-C获得了CAPES的硕士和博士奖学金，LAMT-S获得了CNPq的博士奖学金。我们感谢Elizabete R. Milani的共聚焦显微镜协助和Dario Zamboni博士提供LLC-MK2细胞（Ribeirao Preto医学院，USP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
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