Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן

Published: July 10, 2021 doi: 10.3791/62219
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Cell and Molecular Biology of Trypanosomatids, Department of Cellular and Molecular Biology and Pathogenic Bioagents, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
* These authors contributed equally

Summary

כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו מין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן. כמו כן, הוא יכול לכלול את הנוגדן השלישי ממארח אחר בפרוטוקול זה. גישה זו יכולה להתבצע בכל סוג תא ופתוגנים.

Abstract

כיום, ניתן למצוא מגוון רחב של כלים מולקולריים הזמינים לחקר אינטראקציות תא טפיל-מארח. עם זאת, קיימות מגבלות מסוימות כדי להשיג נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים המזהים מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים. חוץ מזה, יש כמה נוגדנים מסחריים זמינים לתייג טריפנוסומטידים. בדרך כלל, נוגדנים פוליקלונליים נגד טפילים מוכנים בתוך הבית ויכולים להיות מאתגרים יותר לשימוש בשילוב עם נוגדנים אחרים המיוצרים באותו מין. כאן, הפרוטוקול מדגים כיצד להשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים שגדלו באותו מין כדי לבצע תיוג כפול immunofluorescence לחקור אינטראקציות תא מארח ופתוגן. כדי להשיג את התיוג הכפול immunofluorescence, זה חיוני כדי לדגור תחילה את הנוגדן הפוליקלונלי עכבר ולאחר מכן בצע את הדגירה עם העכבר המשני IgG נוגדן מצומד לכל פלואורוכרום. לאחר מכן, יש צורך בצעד חסימה נוסף כדי למנוע כל זכר לנוגדן העיקרי להיות מוכר על ידי הנוגדן המשני הבא. לאחר מכן, נוגדן מונוקלונלי של עכבר ונוגדן המשני הספציפי של IgG התת-מחלקה שלו מצומדים לפלורוכרום שונה מתווספים לדגימה בזמנים המתאימים. בנוסף, ניתן לבצע תיוג משולש immunofluorescence באמצעות נוגדן שלישי שגדל במין אחר. כמו כן, מבנים כגון גרעינים ו actin יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם תרכובות ספציפיות שלהם או תוויות. לכן, גישות אלה המוצגות כאן ניתן להתאים עבור כל תא שמקורות הנוגדנים העיקריים שלו מוגבלים.

Introduction

כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן עם התא המארח ברמה התאית מספק מידע חיוני על הגורמים הבסיסיים של המחלה מאז קבוצות שונות, כגון וירוסים, חיידקים, פרוטוזואה, יכול להדביק את רוב סוגי התא המארח1,2,3,4. זה יכול גם לעזור לפתח ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות שיכולות להאט או לעכב את הצמיחה של הפתוגן. בתנאים חיים, הנוגדנים המיוצרים אחראים לזיהוי רכיבים עצמיים, אנטיגנים מווירוסים, רכיבים או מוצרים חיידקיים, פטריות, טפילים ואחרים5.

לשם כך, נוגדנים הם כלים בשימוש נרחב, בעיקר להבנת המיקום והתפקוד של מבנים וחלבונים תאיים. מספר מחקרים באמצעות תיוג נוגדנים מרובים מדגימים כי צעדי חסימה נוספים תורמים לספציפיות של האימונולוקליזציה. בנוסף, רוב הפרוטוקולים המתוארים משתמשים בנוגדנים חד שבטיים מסחריים ספציפיים, כולל נוגדנים מאותו מין מארח6,7,8,9,10,10,11,12,13,14.

בדרך כלל, תיוג כפול immunofluorescence משתמש בשני נוגדנים שגדלו במינים שונים כדי להכתים את מבני התא של עניין או את הפתוגנים ואת התאים המארחים כדי לראות את האינטראקציה ביניהם. עם זאת, זו יכולה להיות בעיה כאשר אין נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים ספציפיים עבור פתוגנים מסוימים זמינים לביצוע התיוג הכפול. כמו כן, ישנן ערכות הטיות נוגדנים זמינות מסחרית, וניתן להטות את הנוגדנים העיקריים ישירות לפלואורופור על ידי תגובת אסתר סוצ'ינימידיל15. הבעיה היא כי ערכות אלה הם לעתים קרובות יקרים, ויש צורך מספיק נוגדנים כדי לתייג אותם. בידיעה זו, פיתחנו בהצלחה שיטה אימונופלואורסצנטית כפולה באמצעות שני נוגדנים שונים שגדלו באותו מין כדי לחקור לוקליזציה של חלבון ב- Trypanosoma brucei16. עם זאת, עבור טפילים תאיים, כולל טריפנוסומה קרוזי, גישה זו לא הודגמה. כאן, אנו מראים כיצד לבצע תיוג כפול immunofluoreorescence ללמוד טפילים תאיים T. cruzi ואת התא המארח באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו המין ללא תגובות צולבות. מלבד שיטה זו, תיוג אימונופלואורסצנטי משולש הוקם עם הוספת הנוגדן השלישי ממין אחר. גישות אלה מסייעות כאשר מקור הנוגדנים מוגבל וניתן להשתמש בהן בכל סוג תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרביות תאים וטפילים

  1. לגדל LLC-MK2 (רזוס קוף אפיתל הכליות) תאים מאוסף תרבית סוג אמריקאי (CCL-7) בבקבוק תרבית תאים 25 cm2 cm2 המכיל במדיום RPMI בתוספת 10% FBS מושבת בחום (סרום בקר עוברי) ואנטיביוטיקה (100 U / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) ב 37 °C ב 5% CO2 17.
  2. להדביק תאי LLC-MK2 עם טריפנוסומה קרוזי (זן Y) על פי פרוטוקול קודם 18.
  3. לאסוף את supernatant של LLC-MK2 תאים נגועים (5 מ"ל) בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה חרוטית תרבית תא 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 10 דקות ו 22 °C (5 °F) כדי להוריד את פסולת התא. שמור את הצינור במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F) כדי לאפשר trypomastigotes לשחות אל supernatant.
  4. לאסוף את supernatant בצינור חרוטי חדש צנטריפוגה ב 2500 x g במשך 15 דקות ב 22 °C (60 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את הכדור המכיל את הטפילים במדיום RPMI מלא כדי לקבוע את צפיפות התאים על ידי ספירת תאים בתא Neubauer.

2. שליטה בפרוטוקול אימונופלואורסצנטיות

הערה: לאחר התיקון, ניתן לאחסן צלחות המכילות כיסויים בטמפרטורה של 4 °C ב- 1x PBS (pH 7.2) למשך שבוע אחד. כדי להיות מאוחסן, חשוב כי התאים לא עברו את שלב חדירות.

  1. ייחוס תאי LLC-MK2 (2 x 104) ב -24 לוחות היטב המכילים כיסויים מעוגלים מעוקרים UV במדיה RPMI במשך 16 שעות.
  2. עבור תאים נגועים, להוסיף supernatant המכיל T. cruzi (פריט 1.4) לכל באר בפרופורציה (MOI 10:1) ולהשאיר עבור 6 שעות של זיהום. לשטוף כיסויים המכילים תאים נגועים ולא נגועים חמש פעמים עם פתרון PBS קבוע עם 2% paraformaldehyde ב 1x PBS (pH 7.2) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS (pH 7.2).
  4. חלחלו את כיסויי הכיסוי עם 0.2% IGEPAL CA-630 ב 1x PBS (PH 7.2) במשך 10 דקות ב RT.
  5. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  6. דגירה מכסה במשך 30 דקות ב RT עם פתרון החסימה (2% BSA ב 1x PBS, pH 7.2).
  7. דגירה מכסה במשך 30 דקות ב RT או עם עכבר חד שבטי אנטי-rnPA1 (דילול 1:200) או עם עכבר פוליקלונלי אנטי TcFAZ (דילול 1:100) נוגדנים מדוללים בפתרון חסימה.
  8. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  9. דגירה את כיסויים במשך 30 דקות ב RT עם עז נגד עכבר IgG F (ab')2 (ab')2 (H +L) מצומד לאלכסה פלואור 488 (1:600) יחד עם פאלואידין מצומד לאלקסה 594 (1:300) כדי להכתים חוטי אקטין (F-actin) בתא המארח מדולל בתמיסת החסימה.
  10. לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחד.
  11. החל כמות קטנה של ריאגנט הרכבה Antifade זהב ProLong עם מדיום DAPI על פני השטח של השקופית.
  12. באמצעות מלקחיים, הטה בעדינות את כיסוי הכיסוי במדיום ההרכבה כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר הייבוש, לאטום את כיסוי אם תרצה.

3. תיוג כפול פרוטוקול immunofluorescence באמצעות נוגדנים חד שבטיים ופוליקלונליים שגדלו באותו מארח

  1. חזור על שלבים 2.1 עד 2.6 שתוארו לעיל.
  2. Incubate מכסה כתמים המכילים תאים נגועים ולא נגועים עם נוגדן פוליקלונלי נגד TcFAZ עכבר בתוך הבית (1:100) מדולל בתמיסת חסימה במשך 30 דקות ב RT.
  3. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  4. דגירה מכסה סלטות במשך 30 דקות ב RT עם עז נגד עכבר IgG F (ab')2 (ab')2 (H +L) מצומד לאלכסה פלואור 647 (1:600) מדולל בפתרון החסימה.
  5. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  6. בצע את שלב החסימה השני עם ארנב AffiniPure אנטי עכבר IgG (H + L) מדולל (0.12 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חסימה במשך 30 דקות ב RT.
  7. לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחד. לאחר מכן לדגור עם עכבר חד שבטי אנטי hnRNP A1 IgG2b נוגדן (1:200) במשך 30 דקות ב RT.
  8. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  9. דגור על כיסויים במשך 30 דקות עם עז אנטי עכבר IgG2b נוגדן מצומד לאלכסה פלואור 488 (1:600) ועם phalloidin מצומד לאלקסה 594 (1:300) מדולל בתמיסת החסימה.
  10. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  11. חזור על שלבים 2.8 עד 2.10 שתוארו לעיל.

4. תיוג משולש פרוטוקול immunofluorescence עם תוספת של הנוגדן הפוליקלונלי השלישי ממינים מארחים שונים

הערה: עבור תיוג נוסף, שים לב למחלקות המשנה של IgG, איזוטיפים נוגדנים, ובצע את סדר הנוגדנים: 1. פוליקלונלי עכבר, 2. פוליקלונלי ארנב, 3. בלוק שני, ו 4. מונוקלונלי עכבר. שקול את סוג הלייזרים הזמינים במיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לבחור את הנוגדן המשני המצומד הפלורופור הנכון.

  1. חזור על שלבים 2.1 עד 2.6 שתוארו לעיל.
  2. לאחר שלבים 3.2 עד 3.5 (שלב כביסה), התחל דגירה חדשה עם נוגדן פוליקלונלי ארנב בחסימת פתרון במשך 30 דקות ב RT.
  3. לשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחד.
  4. דגירה את כיסויים עם עיזים נגד ארנב נוגדן IgG מצומדים Alexa 647 (1:600) בתמיסת חסימה במשך 30 דקות.
  5. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  6. בצע שלב חסימה עם ארנב AffiniPure אנטי עכבר IgG (H +L) מדולל (0.12 מ"ג / מ"ל) בתמיסת חסימה במשך 30 דקות ב RT.
  7. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS (pH 7.2) במשך 5 דקות כל אחד ודגור עם כל עכבר חד שבטי IgG נוגדן מתחת למחלקה מדולל בתמיסת חסימה במשך 30 דקות.
  8. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.
  9. דגירה את כיסויים במשך 30 דקות עם זוג ספציפי של עיזים נגד עכבר IgG תת מחלקה נוגדן מצומד Alexa 594 (1:600) בתמיסת חסימה במשך 30 דקות.
  10. לשטוף את כיסויים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 1x PBS.

5. רכישת הדמיה קונפוקלית

  1. נתח את דגימות האימונופלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, עם מטרת טבילה בשמן פי 63 וזיהה את הפלואורסצנטיות באמצעות שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) וגלאי היברידי (HyD).
    הערה: השתמשנו בהתקנה מהמעבדה הרב-משתמשת של מיקרוסקופיה קונפוקלית - LMMC, בית הספר לרפואה ריבייראו פרטו, אוניברסיטת סאו פאולו.
  2. השג את כל התמונות הקונפוקליות עם ערוצים מופרדים. בצעו עיבוד תמונה באמצעות Adobe Photoshop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מראים כיצד לחקור אינטראקציות מארח-טפיל על ידי immunofluorescence כאשר מקור הנוגדנים מוגבל בשל חוסר זמינות של נוגדנים מסחריים המזהים מבנים וחלבונים ספציפיים טריפנוסומטידים.

בין טריפאנוסומטידים, T. cruzi יש אחד ממחזורי החיים המורכבים ביותר מעורבים שלבי התפתחות שונים בין בעלי חוליות ומארחים חסרי חוליות 19. במהלך מחזור החיים T. cruzi, בשלב מוקדם של זיהום יונקים, טריפומפסטיגוטים מטציקלים פולשים לתאים בתהליך הכולל מגוון רחב של מולקולות הנמצאות בטפילים ובתאים המארחים בעלי החוליות 19,20. כדי לחקור תהליכים אלה, המעבדה שלנו מייצרת באופן שגרתי נוגדנים פוליקלונליים פנימיים נגד חלבונים של T. cruzi, T. brucei, ו Leishmania sp16,21,22,23 לשימוש יחד עם נוגדנים חד שבטיים עכבר מסחרי ו / או עם נוגדני ארנב.

באיור 1, תמונות מיקרוסקופיה קונפוקליות מציגות את התוצאות בניסויי הבקרה של תאים נגועים ולא נגועים, ומדגישות את הספציפיות של הנוגדנים בתא המארח ואת הטפיל המופנם. הנוגדן הפוליקלונלי של העכבר (anti-TcFAZ) שגדל במעבדה שלנו זיהה רק חלבון ענק מסוג T. cruzi ב-FAZ ב-FAZ בקלאלום הטפיל, אך לא בתא המארח (איור 1A). ההפצה של ריבונוקלאופרוטאין גרעיני הטרוגני A124 בגרעינים נצפתה באמצעות נוגדן אנטי-hnRNP A1 חד שבטי עכבר מסחרי המזהה רק את תאי היונקים המארחים אך לא את הטפיל (איור 1B). כמו כן, גרעיני הפונדקאי והטפילים והקינטופלסטים הטפילים הוכתמו ב-DAPI, וה-F-אקטין המארח היה מוכתם בפאלאואידין המצומד לאלכסה 594 (איור 1). תוצאות בקרה אלה מראות את הספציפיות של הנוגדנים, ולאחר מכן, אנו יכולים להפעיל את פרוטוקול האימונופלואורסצנטיות הכפול (איור 2).

באיור 2, תיוג כפול של אימונופלואורסצנטיות מראה את התפלגות החלבון בפונדקאי ואת הטפיל המנותח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לא מתרחשות תגובות צולבות בין נוגדנים המשתמשים במתודולוגיה זו. היעילות של שלב החסימה השני באמצעות ארנב מטוהר אנטי עכבר IgG מספיק כדי לפגוע תיוג לא ספציפי על ידי הנוגדנים המשניים. תיוג זה מאפשר ללמוד את האינטראקציה בין הטפיל לבין החלבונים המארחים ואת התנהגותם במהלך ההדבקה.

Figure 1
איור 1: מיקרוסקופיה קונפוקלית המציגה את הלוקליזציה של חלבון הענק T. cruzi (TcFAZ) ומארחת hnRNP A1 בתאים שאינם נגועים (NI) ונדבקים (INF) LLC-MK2 עם T. cruzi. (A) T. cruzi חלבון ענק (TcFAZ) מקומי ב T. cruzi flagellum מסומן עם נוגדן פוליקלונלי עכבר אנטי TcFAZ ודמיינו עם עז אנטי עכבר IgG נוגדן משני מצומד Alexa 488 (ירוק). (B) מארח גרעיני hnRNP A1 ב LLC-MK2 מסומן עם עכבר חד שבטי נגד hnRNP A1 IgG2b נוגדן ודמיינו על ידי עיזים נגד עכבר IgG2b נוגדן מצומד Alexa 488 (ירוק). Phalloidin מצומד לאלכסה 594 כתמי F-actin (אדום). גרעינים וקינטופלסטים מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. כל הניסויים נעשו בשלושה משולשים ביולוגיים. חצים לבנים מצביעים על טפילים תאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תיוג כפול immunofluorescence מראה תגובה לא צולבת בין נוגדנים שגדלו באותם מינים מארחים בתאים שאינם נגועים (NI) ונגועים (INF) LLC-MK2 עם T. cruzi שנותח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. חלבון ענק המותאם לוקליזציה באזור ההתקשרות עם הפלגלום (FAZ) מסומן בנוגדן נגד TcFAZ פוליקלונלי של העכבר ומומחז על ידי נוגדן IgG נגד עכבר עזים המצומד לאלקסה 647 (אדום). מארח גרעיני hnRNP A1 מסומן עם עכבר חד שבטי אנטי-hnRNP A1 IgG2b נוגדן ודמיינו על ידי עז נגד עכבר IgG2b נוגדן מצומד Alexa 488 (ירוק). Phalloidin מצומד לאלכסה 594 כתמי F-actin (אפור). גרעינים וקינטופלסטים מוכתמים ב- DAPI (כחול). תמונות ממוזגות מוצגות כמצוין. Inset מתאים לאזור המוגדל של הגרעין המארח. בר = 5 מיקרומטר. כל הניסויים נעשו בשלושה משולשים ביולוגיים. החץ הלבן מראה את נוכחותו של הטפיל ליד גרעין התא המארח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: איור סכמטי של חיסון כפול רציף עם נוגדנים ראשוניים שמקורם באותו מין. הדיאגרמה מציגה את סדר הנוגדנים כדי להבטיח את היעילות של פרוטוקול זה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע חיסונים כפולים בתאים נגועים טריפנוסומה קרוזי באמצעות שני נוגדנים שונים מאותו מין מארח. כדי ללמוד, בפירוט רב יותר, את ההשלכות של הזיהום, מבנים בתא המארח כגון הגרעין או אברונים ציטוטוסוליים ניתן לתייג באמצעות פרוטוקול זה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בשיטת התוויות החיסונית של החלק הדק שלאחר ההטבעה. גישה זו מסייעת להתגבר על המכשול שיש מעט נוגדנים זמינים ללמוד trypanosomatids וטפילים אחרים.

בנוסף, הפרוטוקול שלנו הראה טפיל תאי מסומן יחד עם התא המארח, שני eukaryotes באותה immunofluorescence, שונה מאותם פרוטוקולים שהתממשו בסוגים שונים של רקמות7,8,9,10,11,12,13,14 . הפרוטוקול שלנו מראה כי לא ניתן לזהות את הנוגדן הפוליקלונלי העיקרי על ידי הנוגדן המשני השני (שלב 3.9), המבטיח שלא יתרחשו תגובות צולבות בין הנוגדנים (איור 3). ההצלחה של מתודולוגיה זו נובעת מהיעילות של שלב החסימה (שלב 3.6) באמצעות ארנב מטוהר אנטי עכבר IgG. פרוטוקול דומה שתואר על ידי Ansorg ואח ' (2015) יש שתי חסימות נוספות, שבו הראשון משתמש סרום מאותו מארח כמו הנוגדן העיקרי והשני מתממש עם שברי Fab-6 unconjugateed6. כמו כן, ללא החסימה השנייה, תיוג חיובי כוזב יכול להתרחש, כפי שהוסבר על ידי מחברים אלה 6.

יתר על כן, עבור חיסונים משולשים, ניתן להוסיף את הנוגדן השלישי של מין מארח ארנב לפני שלב החסימה השני המתואר לעיל בפרוטוקול (שלב 4.2). כמו כן, ניתן להשתמש ביותר מנוגדן חד שבטי אחד מכיוון שיש להם תת-מחלקות IgG שונות. לשם כך, הנוגדנים המשניים המתאימים צריכים להיות מאוד ספיחה כדי למזער את התגובה הצולבת ביניהם. השימוש במחלקות משנה שונות של IgG מאפשר ניצול של אותם נוגדנים מארחים ללא תגובה צולבת. פרוטוקולים אלה פועלים היטב, אך קבוצות בקרה נחוצות כדי להימנע מתוצאות חיוביות שגויות. הספציפיות של מחלקות המשנה של IgG והמאפיינים שלהן מאפשרת לבצע תיוג כפול ומשולש. דווח כי תת-מחלקות IgG שונות זו מזו בהפעלה המשלימה ובקולטני Fc בקשרי השרשרת הבין-כבדים, חומצות אמינו באזור הציר, המסה המולקולרית (kDa), והשפע היחסי (באחוזים) בתגובה לחלבונים, סכרידים ואלרגנים 25. יש להם הבדלים קלים בחומצות האמינו של מבנה הציר, המשפיעים על היציבות והגמישות של כל תת-מחלקה של IgG. IgG2 יש את הציר הקצר ביותר ואפילו נוקשה יותר של כל מחלקות המשנה IgG בשל אזור CH2 עם מחיקת חומצת אמינו אחת וגשר דיסולפיד שרשרת בין כבד נוסף 25.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן מציג טכניקה בסיסית ומורחבת המותאמת לכל שילוב של נוגדנים. גישה זו הופכת את immunofluorescence חסכוני והוא יכול לעזור כאשר מקור הנוגדנים מוגבל. הפרוטוקול יכול לזהות בו זמנית פתוגנים וחלבוני התא המארח בתאים מארחים נגועים; זה יכול להיות מיושם גם על כל סוג התא ואורגניזמים חיים חופשיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) to MMAB, by Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA to MMAB and by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - קוד פיננסי 001. CG-C קיבל מלגת תואר שני ודוקטורט מ- CAPES ו- LAMT-S קיבל מלגת דוקטורט מ- CNPq. אנו מודים לאליזבטה ר. מילאני על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית וד"ר דריו זמבוני על אספקת תאי LLC-MK2 (בית הספר לרפואה ריבייראו פרטו, USP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 - IgG2b antibody Life technologies, USA A21141 Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch, USA 315-005-003 Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A11017 Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody Life technologies, USA A21125 Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 - IgG F (ab')2 (H+L) antibody Life technologies, USA A21237 Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b Sigma-Aldrich, USA R4528 Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody Our lab In-house Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, USA A2153-10G Albumin protein
Detergent Igepal CA-630 Sigma-Aldrich, USA I3021 Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco, Thermo fisher scientific, USA 12657-029 Serum
Penicillin Streptomycin Gibco, Thermo fisher scientific, USA 15140-122 Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594 Life technologies, USA A12381 Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI Life technologies, USA P36935 Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine Corning, USA 10-040-CV Cell culture media
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich, USA T4049-100ML Bioreagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
  4. Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
  5. Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
  6. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
  7. Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
  8. Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
  9. Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
  10. Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
  11. McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
  12. Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
  13. Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
  14. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  15. Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
  16. Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. dS., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. Méndez-Vilas, A. 7, 374-378 (2016).
  17. Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
  18. Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
  19. de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
  20. Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
  21. Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
  22. Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
  23. Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
  24. Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
  25. Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 173 אימונולבלינג תיוג כפול אותם נוגדנים מארחים אינטראקציה מארחת-פתוגן
תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. … More

Gachet-Castro, C., Trajano-Silva, L. A. M., Baqui, M. M. A. Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (173), e62219, doi:10.3791/62219 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter